本發(fā)明屬于材料制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
三維多孔納米支架能夠模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長提供支持，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、組織工程學(xué)等研究領(lǐng)域。幾乎所有的組織細(xì)胞在體內(nèi)都是在三維條件下生長，細(xì)胞被包裹在由膠原纖維作為主要成分組成的納米纖維水凝膠之中，此外，細(xì)胞外基質(zhì)中還含有大量的不溶性基質(zhì)蛋白和可溶性生長因子。但目前研究中細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中所采用的大多都是二維培養(yǎng)，即細(xì)胞在培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)，這與體內(nèi)生長環(huán)境相差較大，影響細(xì)胞生長，甚至?xí)鸺?xì)胞基因或者功能變化。如何體外構(gòu)建具有模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的人工支架材料，為細(xì)胞提供三維生長環(huán)境一直是生物、醫(yī)學(xué)以及材料工程領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開發(fā)的熱點(diǎn)。自組裝短肽RADA16-I是4個(gè)重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸序列，即（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4，當(dāng)其水溶液調(diào)節(jié)至pH=7時(shí)會(huì)形成由納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的水凝膠，與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)很相似，作為組織工程支架、藥物載體和止血材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是自組裝短肽水凝膠材料的典型代表。但是一個(gè)顯著的缺點(diǎn)是該材料水溶液具有明顯的酸性(pH=3～4)，不能與細(xì)胞懸液和活性分子直接混合原位成凝膠，即很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞包埋在RADA16-I水凝膠中進(jìn)行三維生長。目前關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道仍是采用先制備水凝膠然后在其表面種植細(xì)胞的二維培養(yǎng)模式，不能實(shí)現(xiàn)真正的三維細(xì)胞培養(yǎng)。而將該材料直接注射體內(nèi)修復(fù)損傷和用于止血時(shí)較低的pH會(huì)對宿主組織造成損害。自1993年首次報(bào)道該材料以來，人們對RADA16-I進(jìn)行了大量的研究，但是對于其酸性的缺點(diǎn)仍不能有效解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明根據(jù)目前自組裝水凝膠材料中的不足，提供了一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料。本發(fā)明的另一目的在于提供上述多肽材料的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，包括在RADA16-I序列上分別連接多個(gè)酸性氨基酸和多個(gè)堿性氨基酸，以此形成兩種帶相反電荷的短肽，混合后自組裝形成所述水凝膠的多肽材料。本發(fā)明是以低分子量自組裝短肽為基礎(chǔ)的水凝膠，為細(xì)胞三維生長提供空間，用于構(gòu)建組織工程支架。本材料可在常溫中性pH條件下形成納米纖維水凝膠，模仿了天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有良好的理化性能和生物相容性，支持細(xì)胞三維生長，滿足組織工程支架的要求，而且可負(fù)載活性分子藥物，例如生長因子、短肽藥物?？蓮V泛應(yīng)用于軟骨、血管、神經(jīng)、皮膚等人工器官的再生和損傷的修復(fù)。優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為序列1：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸；序列2：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸。優(yōu)選地，所述兩種帶相反電荷的短肽序列分別為序列3：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-（賴氨酸）n；序列4：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；其中，n為1~10內(nèi)任意一個(gè)自然數(shù)。申請人發(fā)現(xiàn)，在（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4上接枝賴氨酸，并且與序列4進(jìn)行混合，賴氨酸的接枝數(shù)量可以為1~10中任意一個(gè)自然數(shù)，這樣形成的兩對短肽混合后均可以實(shí)現(xiàn)中性pH下自組裝的能力。優(yōu)選地，將所述兩種帶相反電荷的短肽分別配置成5~15mg/mL的水溶液，按照1：1的體積比混合，調(diào)節(jié)pH至中性，即得所述多肽材料。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：在短肽（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4序列上通過化學(xué)共價(jià)鍵連接多個(gè)酸性氨基酸為主的序列，例如如天冬氨酸和谷氨酸，或者連接多個(gè)堿性氨基酸為主的序列，例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸。最終得到在中性pH條件下分別帶有凈正電荷和凈負(fù)電荷的兩條短肽序列，溶于水后調(diào)整其pH至7，兩者混合后形成三維納米多孔水凝膠。該水凝膠保持中性pH值，三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本發(fā)明兩對短肽序列的合成是采用了現(xiàn)有的接枝方向獲得，由于目前未有成型的理論支持何種改性（即接枝序列和接枝位置）能夠獲得真正在中性條件下合成的自組裝多肽水凝膠，不同的序列排列方式不同，電荷分布也不同，同時(shí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部自組裝方式均會(huì)影響最終的接枝效果，因此，上述接枝物的具體接枝位點(diǎn)和接枝序列排布，對最終效果影響非常大。與現(xiàn)有多肽自組裝水凝膠相比，本發(fā)明在生理?xiàng)l件下（pH為7-7.4）即可形成三維多孔水凝膠，由直徑約20nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可為細(xì)胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。將含有功能性氨基酸序列引入，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、粘附，同時(shí)也可負(fù)載活性分子藥物，如生長因子、短肽藥物，獲得控制釋放。也可注射使用，操作簡便，是非常理想的生物材料。本發(fā)明所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料，并且使用過程都是中性的，不會(huì)對細(xì)胞核宿主組織產(chǎn)生危害，能夠用于真正的三維培養(yǎng)細(xì)胞，方法為將細(xì)胞懸液分別與所述兩種帶相反電荷的短肽進(jìn)行混合，然后將兩者混合，得到包埋細(xì)胞的水凝膠/細(xì)胞復(fù)合體，并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步地，所述的中性pH下自組裝成水凝膠的多肽材料在運(yùn)用于軟骨、血管、神經(jīng)或皮膚的再生和損傷修復(fù)中，具有極大的應(yīng)用前景。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供了一種可在常溫中性pH條件，即在人體生理?xiàng)l件自組裝形成三維多孔納米纖維水凝膠。利用本發(fā)明技術(shù)制備的材料具有更好的生物相容性，可實(shí)現(xiàn)原位負(fù)載細(xì)胞/活性分子以及體內(nèi)原位注射，在細(xì)胞三維培養(yǎng)、組織工程生物支架材料和藥物載體領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為兩種修飾改性后的短肽（P1、P2），混合后形成的水凝膠材料（P1+P2），向水凝膠擴(kuò)散的細(xì)胞培養(yǎng)基未改變顏色，說明形成的水凝膠呈中性pH；原子力顯微鏡顯示納米纖維形貌，說明所形成的水凝膠是由納米纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)。圖2為三種材料的流變性能對比圖，P1，P2為改性短肽，P1+P2為兩者混合物。G’為儲(chǔ)能模量，G”為損耗模量。P1和P2混合后G’大大升高，說明形成了穩(wěn)定的水凝膠。圖3為神經(jīng)干細(xì)胞球在不同納米纖維水凝膠中三維生長形貌。A為本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠；B為RADA16-I納米纖維水凝膠；從圖中可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，并長出較長的軸突，而在RADA16-I水凝膠中則沒有任何軸突長出。圖4為利用活死細(xì)胞檢測試劑盒檢測神經(jīng)干細(xì)胞在不同三維支架中的存活，綠色代表活細(xì)胞，紅色代表死細(xì)胞。A為本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠；B為RADA16-I納米纖維水凝膠；從圖中可以看出神經(jīng)干細(xì)胞在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中大量存活，存活率達(dá)到100%，并可以三維生長，并長出較長的軸突，而在RADA16-I水凝膠中則大量死亡，層圓球狀，沒有任何軸突長出。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。實(shí)施例1：水凝膠的多肽材料制備：序列1(P1):（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸溶于超純水后，配置成濃度為5~15ml/mL的溶液，用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7，可得到帶正電荷的短肽水溶液。序列2(P2):（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸溶于超純水后，，配置成濃度為5~15ml/mL的溶液，用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7，可得到帶負(fù)電荷的短肽水溶液。之后將兩者溶液以1：1的體積比混合，靜置后迅速形成凝膠，形狀穩(wěn)定后即可投入使用（見圖1）。如圖1所示，兩者混合后形成水凝膠，流動(dòng)性失去。原子力顯微鏡顯示納米纖維形貌，由直徑約20nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，說明所形成的水凝膠是由納米纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，且凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可為細(xì)胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。實(shí)施例2：水凝膠的多肽材料制備：制備方法同實(shí)施例1，序列3(P1’):（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-（賴氨酸）1-10；n為1~10內(nèi)任意一個(gè)自然數(shù)均可。序列4(P2’):（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸。實(shí)施例3：三維細(xì)胞培養(yǎng)以超純水為溶劑，配成濃度為5-15mg/mL的P1及P2溶液，將細(xì)胞懸液分別與調(diào)整至中性pH的P1和P2混合，得到均勻的細(xì)胞/短肽混合物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，之后以1:1混合得到包埋有細(xì)胞的三維水凝膠，靜置后迅速形成凝膠，加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例3中包埋細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞球，如圖3和4所示，可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，達(dá)到了100%的存活率，并長出較長的軸突，而在RADA16-I水凝膠中則沒有任何軸突長出。實(shí)施例4：三維細(xì)胞培養(yǎng)以超純水為溶劑，配成濃度為5-15mg/mL的P1’及P2’溶液，將細(xì)胞懸液分別與調(diào)整至中性pH的P1和P2混合，得到均勻的細(xì)胞/短肽混合物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，之后以1:1混合得到包埋有細(xì)胞的三維水凝膠，靜置后迅速形成凝膠，加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)施例4包埋細(xì)胞為為神經(jīng)干細(xì)胞球，其檢測后的現(xiàn)象同實(shí)施例3的結(jié)果相同，與RADA16-I水凝膠相比，本發(fā)明提供的納米纖維水凝膠中可以三維生長，達(dá)到了100%的存活率，并長出較長的軸突，而在RADA16-I水凝膠中則沒有任何軸突長出。實(shí)施例:5：體內(nèi)原位注射成凝膠在體內(nèi)缺損部位依次注射P1和P2，即可形成凝膠。凝膠成中性，不會(huì)對周圍組織造成傷害。在體內(nèi)缺損部位依次注射P1’和P2’，即可形成凝膠。凝膠成中性，不會(huì)對周圍組織造成傷害。