本發(fā)明涉及含有RIP3表達(dá)誘導(dǎo)劑作為活性成分的用于抗癌輔劑的組合物和與抗癌藥物聯(lián)合施用所述組合物的方法。此外，本發(fā)明涉及篩選通過(guò)促進(jìn)RIP3表達(dá)增強(qiáng)抗癌藥物敏感性的抗癌輔劑的方法和基于RIP3表達(dá)監(jiān)測(cè)對(duì)抗癌藥物的敏感性的方法。此外，本發(fā)明提供用于診斷抗癌藥物敏感性的生物標(biāo)志物組合物，其含有RIP3基因或從所述基因表達(dá)的蛋白，并且提供用于提供診斷抗癌藥物敏感性的預(yù)后所需的信息的方法。

背景技術(shù)：

受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3或RIPK3)是細(xì)胞死亡中重要的蛋白，并且在死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡或其他細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮其作用。已知這些細(xì)胞死亡信號(hào)通過(guò)與具有磷酸化-或脫乙?；?依賴性RIP1和混合的譜系激酶(lineage kinase)結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)的復(fù)合體結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)，并且存在于線粒體中的任何蛋白參與該信號(hào)。該信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制由細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞的發(fā)育、以及細(xì)胞死亡和免疫應(yīng)答。此外，調(diào)節(jié)的壞死在退化、免疫和很多病因?qū)W過(guò)程如傳染病和缺血損傷中發(fā)揮其作用。

公開(kāi)內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑作為活性成分的用于抗癌輔劑的藥物組合物，和增強(qiáng)癌細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括與抗癌藥物聯(lián)合施用用于抗癌輔劑的藥物組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供篩選通過(guò)促進(jìn)RIP3(受體相互作用蛋白激酶-3)表達(dá)增強(qiáng)對(duì)抗癌藥物敏感性的抗癌輔劑的方法，和基于RIP3表達(dá)監(jiān)測(cè)抗癌藥物敏感性的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于診斷抗癌藥物敏感性的生物標(biāo)志物組合物，其含有RIP3基因或從所述基因表達(dá)的蛋白。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于診斷抗癌藥物敏感性的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增RIP3基因的引物或特異結(jié)合從所述基因表達(dá)的蛋白的抗體或適體，以及能夠預(yù)測(cè)和診斷組織中的癌癥的試劑盒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于提供診斷抗癌藥物敏感性和抗癌藥物反應(yīng)的預(yù)后所需的信息的方法。所述方法包括測(cè)量來(lái)自癌癥患者樣品的RIP3的表達(dá)水平。

技術(shù)方案

為了完成上述目的，本發(fā)明提供含有受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑作為活性成分的用于抗癌輔劑的藥物組合物.

本發(fā)明還提供用于增強(qiáng)癌細(xì)胞死亡的方法，其包括將受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑與抗癌藥物聯(lián)合施用于癌細(xì)胞。

本發(fā)明還提供篩選抗癌輔劑的方法，其包括：使測(cè)試物質(zhì)與癌細(xì)胞接觸；測(cè)量與測(cè)試物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中RIP3(受體相互作用蛋白激酶-3)蛋白的表達(dá)或活性水平；并且選擇與對(duì)照樣品相比顯示RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平增加的測(cè)試物質(zhì)。

本發(fā)明還提供監(jiān)測(cè)抗癌藥物敏感性的方法，其包括：測(cè)量癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；測(cè)量正常組織細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；和如果測(cè)量的癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平低于測(cè)量的正常組織細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平，確定所述癌細(xì)胞具有抗癌藥物耐藥性。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)抗癌藥物敏感性的方法，其包括：用RIP3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑處理癌細(xì)胞；測(cè)量處理的癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；并且，如果處理后RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平比處理前的對(duì)照樣品高50-100％，確定抗癌藥物敏感性增強(qiáng)。

本發(fā)明還提供用于診斷抗癌藥物敏感性的生物標(biāo)志物組合物，其包含RIP3基因或從所述基因表達(dá)的蛋白。生物標(biāo)志物組合物還可以用于預(yù)測(cè)和診斷組織中的癌癥。

本發(fā)明還提供用于診斷抗癌藥物敏感性的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增RIP3基因的引物或特異結(jié)合從所述基因表達(dá)的蛋白的抗體或適體。試劑盒的用途可以提供預(yù)測(cè)和診斷組織中的癌癥所需的信息。

本發(fā)明還提供用于提供診斷抗癌藥物敏感性的預(yù)后所需的信息的方法，其包括：測(cè)量癌癥患者樣品中RIP3的表達(dá)水平；測(cè)量正常對(duì)照樣品中RIP3的表達(dá)水平；并且，如果測(cè)量的癌癥患者樣品中的RIP3蛋白表達(dá)水平低于測(cè)量的正常對(duì)照樣品中的RIP3蛋白表達(dá)水平，確定癌癥患者樣品具有抗癌藥物耐藥性。

有益效果

本發(fā)明涉及含有RIP3表達(dá)誘導(dǎo)劑作為活性成分的用于抗癌輔劑的組合物和與抗癌藥物聯(lián)合施用所述組合物的方法。目前，在90％的在癌癥治療中有問(wèn)題的三陰性(ER，PR，Her2陰性)患者中，發(fā)現(xiàn)低RIP3表達(dá)。與同一患者的正常組織相比，癌組織中RIP3表達(dá)的顯著減少提示，在腫瘤的發(fā)育和生長(zhǎng)期間，RIP3選擇性減少。因此，在缺乏RIP3表達(dá)的患者的情形中，預(yù)期在用去甲基化劑預(yù)處理誘導(dǎo)RIP3表達(dá)后使用常規(guī)化療劑可以是有效的治療策略。此外，本發(fā)明涉及用于篩選通過(guò)促進(jìn)RIP3表達(dá)增強(qiáng)抗癌藥物敏感性的抗癌輔劑的方法和基于RIP3表達(dá)監(jiān)測(cè)抗癌藥物敏感性的方法。目前，在90％的在癌癥治療中有問(wèn)題的三陰性(ER，PR，Her2陰性)患者中，發(fā)現(xiàn)低RIP3表達(dá)，并且觀察到，RIP3表達(dá)的調(diào)節(jié)影響抗癌細(xì)胞的抗癌藥物耐藥性。尤其是發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制RIP3表達(dá)時(shí)，癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物具有耐藥性，并因此抑制抗癌藥物的活性，而當(dāng)表達(dá)RIP3時(shí)，癌細(xì)胞的死亡依賴于抗癌藥物的濃度增加。預(yù)期RIP3的表達(dá)或活性水平的分析可以是監(jiān)測(cè)抗癌治療中對(duì)抗癌藥物敏感性和篩選增強(qiáng)抗癌藥物敏感性的抗癌輔劑的有效策略。

附圖描述

圖1顯示分析正常乳腺和乳腺癌細(xì)胞系中RIP3表達(dá)的結(jié)果。

圖2顯示去甲基化劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-AD)誘導(dǎo)的RIP3表達(dá)。

圖3顯示去甲基化劑5-氮雜胞苷(5-AZA)誘導(dǎo)的RIP3表達(dá)。

圖4顯示通過(guò)用去甲基化劑(5-AD)和抗癌藥物聯(lián)合治療使癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞死亡敏感。

圖5顯示通過(guò)用去甲基化劑(5-AD和5-AZA)和抗癌藥物聯(lián)合治療使癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞死亡敏感。

圖6顯示通過(guò)抑制RIP3表達(dá)抑制去甲基化劑(5-AD)-誘導(dǎo)的癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞死亡的致敏作用。

圖7顯示典型正常乳腺組織和乳腺癌組織中RIP3的免疫染色圖像。

圖8和9顯示典型正常乳腺組織和乳腺癌組織中RIP3免疫染色的H-得分。

圖10顯示根據(jù)各種濃度的抗癌藥物的RIP3-沉默的HT-29細(xì)胞的生存力。

圖11顯示根據(jù)各種濃度的抗癌藥物的RIP3-沉默的T47D細(xì)胞的生存力。

圖12是顯示分析1,166名乳腺癌癥患者的10年無(wú)轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)存活的結(jié)果的圖表。

最佳方式

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RIP3-依賴性細(xì)胞死亡可以影響化療劑的細(xì)胞毒性?？赡馨l(fā)現(xiàn)，很多癌細(xì)胞系中RIP3表達(dá)被抑制，并且該RIP3表達(dá)抑制不僅導(dǎo)致對(duì)死亡受體-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性，而且導(dǎo)致對(duì)化療劑的耐藥性，特別是對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療劑如DNA損傷藥物或紫杉烷的耐藥性。可能發(fā)現(xiàn)，RIP3表達(dá)由本發(fā)明中使用的去甲基化劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-AD)恢復(fù)，并且對(duì)化療劑的敏感性由去甲基化劑增加。從該結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，在缺乏RIP3表達(dá)的患者的情形中，在用去甲基化劑預(yù)處理誘導(dǎo)RIP3表達(dá)后使用常規(guī)化療劑可以是有效的治療策略?；谠撗芯拷Y(jié)果，完成本發(fā)明。

此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，RIP3表達(dá)的調(diào)節(jié)影響癌細(xì)胞系對(duì)抗癌藥物的耐藥性，并且特別是發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制RIP3表達(dá)時(shí)，癌細(xì)胞具有對(duì)抗癌藥物的耐藥性，并且因此抑制抗癌藥物的活性，而當(dāng)表達(dá)RIP3時(shí)，癌細(xì)胞死亡依賴于抗癌藥物濃度增加，從而完成本發(fā)明。

本發(fā)明提供含有受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑作為活性成分的用于抗癌輔劑的藥物組合物。

特別是，RIP3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑可以選自化合物、肽、肽模擬物、適體、抗體和天然物質(zhì)，其特異結(jié)合RIP3基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域。特別是，所述組合物可以誘導(dǎo)RIP3蛋白的去甲基化。

優(yōu)選地，所述癌癥可以是乳腺癌癥、宮頸癌、肝癌或結(jié)直腸癌，但不限于此。

優(yōu)選地，RIP3蛋白可以是來(lái)自所有具有RIP3的真核生物的蛋白，所述真核生物包括哺乳動(dòng)物，如人、牛、山羊、綿羊、豬、小鼠、兔等。例如，其可以是人RIP3(NCBI登記號(hào)NP_006862.2)。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)″肽模擬物″是指抑制RIP3蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)RIP3活性的肽或非肽。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)″適體″是指具有穩(wěn)定的3維結(jié)構(gòu)并且可以以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)的單鏈核酸(DNA、RNA或修飾的核酸)。因?yàn)檫m體針對(duì)靶分子具有獨(dú)特的高親和力(一般是pM水平)和特異性，其與單克隆抗體相當(dāng)，并且特別是，其用作替代性抗體的可能性高，以致適體常稱為“化學(xué)抗體”。

用于本發(fā)明的″抗體″可以是通過(guò)RIP3注射產(chǎn)生的抗體或可商購(gòu)的抗體。此外，抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和能夠結(jié)合表位的片段。多克隆抗體可以如下產(chǎn)生。將RIP3注射入動(dòng)物；從所述動(dòng)物采集血液樣品；并且隨后從血液分離含有抗體的血清。該多克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法純化，并且可以從任何動(dòng)物宿主產(chǎn)生，包括山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛、狗等。單克隆抗體可以使用任何通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系提供抗體分子的生產(chǎn)的技術(shù)產(chǎn)生。該技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞系雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)。

作為活性成分，本發(fā)明的藥物組合物可以含有化學(xué)物質(zhì)、核苷酸、反義、siRNA、寡核苷酸和天然提取物。除了活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物或聯(lián)合制劑可以使用藥學(xué)適用的和生理學(xué)可接受的輔劑制備。輔劑可以包括賦形劑、崩解劑、甜味劑、粘合劑、包衣劑、膨脹劑(expander)、潤(rùn)滑劑、助流劑、香味劑、增溶劑等。為了給藥，除活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以優(yōu)選地使用至少一種藥用載體配制。當(dāng)組合物配制為液體溶液時(shí)，其可以含有至少一種選自以下各項(xiàng)的藥用載體：鹽水溶液、無(wú)菌水、林格溶液、緩沖鹽水、可注射白蛋白溶液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其混合物。如果需要，可以加入其他常規(guī)添加劑，包括抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑等。此外，可以進(jìn)一步加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑以制備可注射制劑(如水溶液、懸浮液或乳狀液等)、丸劑、膠囊、顆粒劑或片劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以以活性化合物的顆粒、粉末、包衣片劑、片劑、膠囊、栓劑、糖漿、果汁、混懸劑、乳劑、滴劑、可注射液體或緩釋制劑的形式配制。本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)常規(guī)方法通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、吸入、局部、直腸、口服、眼內(nèi)或皮內(nèi)途徑施用。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的活性成分有效量意為預(yù)防或治療疾病所需的量。因此，有效量可以根據(jù)各種因素確定，包括疾病的類型、疾病的嚴(yán)重度、活性成分和組合物中含有的其他成分的類型和含量、制劑的類型、患者的年齡、重量、一般健康狀況、性別和膳食、施用時(shí)間、施用途徑、組合物的分泌率、治療期和同時(shí)使用的藥物。對(duì)于成人，組合物可以每天施用一次或數(shù)次。當(dāng)每天施用一次或數(shù)次時(shí)，施用劑量可以是對(duì)于化合物0.1ng/kg-10g/kg，對(duì)于多肽、蛋白或抗體0.1ng/kg-10g/kg，和對(duì)于反義核苷酸、siRNA、shRNAi或miRNA 0.01ng/kg-10g/kg，但本發(fā)明的范圍不限于此。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)癌細(xì)胞死亡的方法，其包括將受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑與抗癌藥物聯(lián)合施用于癌細(xì)胞。

特別是，所述方法可以包括：用受體相互作用蛋白激酶-3(RIP3)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑處理癌細(xì)胞；和將抗癌藥物施用于經(jīng)處理的癌細(xì)胞。

優(yōu)選地，癌細(xì)胞可以是乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或結(jié)直腸癌細(xì)胞，并且抗癌藥物可以是多柔比星(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)，但本發(fā)明的范圍不限于此。

本發(fā)明還提供用于篩選抗癌輔劑的方法，其包括：使測(cè)試物質(zhì)與癌細(xì)胞接觸；測(cè)量與測(cè)試物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中RIP3(受體相互作用蛋白激酶-3)蛋白的表達(dá)或活性水平；和選擇與對(duì)照樣品相比顯示RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平增加的測(cè)試物質(zhì)。

優(yōu)選地，RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平可以通過(guò)選自由以下各項(xiàng)組成的組的任一項(xiàng)測(cè)量：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，免疫組織化學(xué)，蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)，但本發(fā)明的范圍不限于此。

特別是，抗癌輔劑可以增強(qiáng)對(duì)抗癌藥物的敏感性。更特別是，抗癌藥物可以優(yōu)選是多柔比星、依托泊苷或紫杉醇，但本發(fā)明的范圍不限于此。

關(guān)于本文中的篩選方法使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試物質(zhì)”意為用于篩選以檢測(cè)其是否影響基因的表達(dá)水平或其是否影響蛋白的表達(dá)或活性的未知候選物質(zhì)。樣品可以包括化學(xué)物質(zhì)、核苷酸、反義-RNA、siRNA(小干擾RNA)或天然提取物，但不限于此。

本發(fā)明還提供用于監(jiān)測(cè)抗癌藥物敏感性的方法，其包括：測(cè)量癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；測(cè)量的正常組織細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；和如果測(cè)量的癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平低于測(cè)量的正常組織細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平，則確定所述癌細(xì)胞具有抗癌藥物耐藥性。

優(yōu)選地，癌細(xì)胞可以是乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或結(jié)直腸癌細(xì)胞，并且所述抗癌藥物可以是多柔比星、依托泊苷或紫杉醇，但本發(fā)明的范圍不限于此。

本發(fā)明還提供用于增強(qiáng)抗癌藥物敏感性的方法，其包括：用RIP3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑或激活劑處理癌細(xì)胞；測(cè)量處理的癌細(xì)胞中RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平；并且如果處理后RIP3蛋白的表達(dá)或活性水平比處理前的對(duì)照樣品高50-100％，則確定抗癌藥物敏感性增強(qiáng)。

本發(fā)明還提供用于診斷抗癌藥物敏感性的生物標(biāo)志物組合物，其包含RIP3基因或從該基因表達(dá)的蛋白。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“診斷”包括確定受試者對(duì)某種疾病或病癥的易感性；確定受試者是否患有某種疾病或病癥；確定患有某種疾病或病癥的受試者的預(yù)后；或rametrics(例如，監(jiān)測(cè)受試者的狀況以提供關(guān)于治療效力的信息)。

本發(fā)明還提供用于診斷抗癌藥物敏感性的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增RIP3基因的引物或特異結(jié)合從所述基因表達(dá)的蛋白的抗體或適體。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)″引物″是指具有短的游離3′-末端羥基的核酸序列，其是短的核酸序列，可以與互補(bǔ)模板形成堿基對(duì)并用作模板鏈復(fù)制的起始點(diǎn)。在合適的緩沖液在合適的溫度在存在用于聚合的試劑(例如，DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)和四種三磷酸核苷的情況下，引物可以起始DNA合成。PCR條件和有義和反義引物的長(zhǎng)度可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知技術(shù)適當(dāng)選擇。

本發(fā)明的試劑盒可以包含特異結(jié)合標(biāo)志物成分的抗體、具有通過(guò)與底物反應(yīng)顯色的標(biāo)記的第二抗體綴合物、要與標(biāo)記反應(yīng)的底物溶液、洗滌緩沖液和酶反應(yīng)終止緩沖液等。此外，試劑盒可以由包括使用的試劑成分的多個(gè)包裝或隔室制成。

第二抗體綴合物的標(biāo)記可以優(yōu)選地是顯色的常規(guī)顯色材料。其可以選自熒光素如HRP(辣根過(guò)氧化物酶)、堿性磷酸酶、膠體金、FITC(聚L-賴氨酸-熒光素異硫氰酸酯)，RITC(羅丹明-B-異硫氰酸酯)等、和染料。

本發(fā)明還提供為診斷抗癌藥物敏感性的預(yù)后提供所需的信息的方法，其包括：測(cè)量癌癥患者樣品中RIP3的表達(dá)水平；測(cè)量正常對(duì)照樣品中RIP3的表達(dá)水平；并且如果測(cè)量的癌癥患者樣品中RIP3蛋白的表達(dá)水平低于測(cè)量的正常對(duì)照樣品中RIP3蛋白的表達(dá)水平，則確定所述癌癥患者樣品具有抗癌藥物耐藥性。

特別是，RIP3的表達(dá)水平可以通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)測(cè)量。更特別是，抗原-抗體反應(yīng)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的定量或定性免疫測(cè)定方案進(jìn)行。免疫測(cè)定形式可以包括，但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫測(cè)定(RIA)、夾心測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)、熒光輔助的細(xì)胞分選(FACS)、酶底物顯色測(cè)定和抗原-抗體聚集。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“患者樣品”可以意為樣品，包括顯示與正常對(duì)照中的相比RIP3(其是用于診斷抗癌藥物敏感性的生物標(biāo)志物)表達(dá)水平的差異的組織、細(xì)胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、腦脊液和尿，但本發(fā)明的范圍不限于此。

發(fā)明的模式

下文中，將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，要理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的而不意在限制本發(fā)明的范圍。提供本發(fā)明的實(shí)施例，從而本公開(kāi)將徹底和完全，并且將本發(fā)明的范圍完全傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例提供通常用于本發(fā)明的實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例。

1.試劑

RIP3抗體購(gòu)自Abcam。肌動(dòng)蛋白抗體、多柔比星、依托泊苷、5-AD和5-AZA購(gòu)自Sigma-Aldrich。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

各種癌細(xì)胞系在ATCC建議的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。DLD1、HeLa和MCF7在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HCC1937、BT-549、MDA-MB231、MDA-MB468、SK-BR3、ZR75-1和T47D在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素的RPMI中培養(yǎng)。

3.正常人細(xì)胞

乳腺上皮細(xì)胞(HMEs)獲自Clonetics Corp.(San Diego，CA)。正常乳腺上皮細(xì)胞的HMLE用hTERT永生化，并且還用具有SV40大和小T抗原的反轉(zhuǎn)錄病毒感染。

4.人乳腺癌組織的制備

人乳腺癌癥和對(duì)照正常樣品獲自Yonsei大學(xué)醫(yī)學(xué)院(首爾，韓國(guó))。在所有情況中，從所有參與者獲得書(shū)面知情同意書(shū)，并且該研究在Yonsei大學(xué)的工業(yè)評(píng)述委員會(huì)(Institutional Review Board，IRB)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。

5.慢病毒shRNA實(shí)驗(yàn)

靶向hRIP3 mRNA(NM_006871)的編碼區(qū)域或3′UTR的MISSION短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒或非靶標(biāo)對(duì)照序列(NM-027088)獲自Sigma-Aldrich。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668019)將慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞(System Biosciences，LV900A-1)。在轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒后2天收集假病毒顆粒并在聚凝胺(10μg/mL)的存在下感染入各種癌細(xì)胞。在感染后2天，用嘌呤霉素選擇感染的細(xì)胞，并通過(guò)免疫印跡確認(rèn)RIP3敲低。之后將沒(méi)有內(nèi)源性RIP3的細(xì)胞用5-AD處理4天并通過(guò)免疫印跡分析。

6.蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)

將細(xì)胞在M2緩沖液中裂解。通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析等量的細(xì)胞提取物，并且印跡通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham)顯現(xiàn)。

7.細(xì)胞毒性測(cè)定

使用四唑鎓染料比色試驗(yàn)(MTT測(cè)定)在570nm確定細(xì)胞存活力。

8.免疫組織化學(xué)測(cè)定

使用UltraVision LP Detection System TL-060-HD(Thermo Scientific，Bioanalytica)根據(jù)制造商的使用說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)。薄的石蠟切片(4.5μm)在二甲苯中脫蠟并在分級(jí)系列的乙醇-水溶液中再水合?？乖迯?fù)(antigen retrieval)通過(guò)在微波爐中在10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中加熱切片15min進(jìn)行。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性通過(guò)在TBS中的3％過(guò)氧化氫中溫育10min阻斷，并且然后將切片在4℃在1∶300稀釋的抗-RIP3抗體中溫育過(guò)夜。用3，3′-二氨基聯(lián)苯(TL-015-HD，Thermo Scientific，Bioanalytica，Greece)溶液使色原體顯色5min并且用Meyer′s蘇木精復(fù)染?；谌旧募?xì)胞的比例和免疫染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)免疫組織化學(xué)染色。將染色的細(xì)胞的比例(％)乘以分級(jí)為0(陰性)、1(弱)、2(中等)、或3(強(qiáng))的染色強(qiáng)度獲得H-得分。H-得分范圍從0至300。對(duì)于每個(gè)樣品對(duì)腫瘤和正常組織進(jìn)行染色相同的時(shí)間。由對(duì)臨床數(shù)據(jù)不知情的有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家解釋染色。

9.統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)由平均值±S.D表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用ANOVA和未配對(duì)Student′s t-檢驗(yàn)進(jìn)行。0.01或以下的P-值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。統(tǒng)計(jì)計(jì)算使用用于Windows版本12.0的SPSS軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)進(jìn)行。

實(shí)施例1：乳腺癌細(xì)朐系中RIP3表達(dá)的分析

裂解癌細(xì)胞系以分離蛋白，其隨后使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。分析乳腺癌細(xì)胞系中的RIP3表達(dá)樣式，并且結(jié)果表明，在60％以上的細(xì)胞系中不表達(dá)RIP3。發(fā)現(xiàn)RIP3在癌細(xì)胞系中由特定機(jī)制導(dǎo)致沉默(圖1)。

實(shí)施例2：分析通過(guò)去甲基化劑的RIP3表達(dá)

在將癌細(xì)胞系接種至10-20％匯合，并且然后用5-AD處理兩次達(dá)4天后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析細(xì)胞系中RIP3表達(dá)模式。表明，當(dāng)將不表達(dá)RIP3的三種癌細(xì)胞系(HeLa、MDA-MB231、BT549)用去甲基化劑(5-AD，2uM)處理時(shí)，5-AD誘導(dǎo)RIP3表達(dá)。該結(jié)果提示，癌細(xì)胞系中的RIP3表達(dá)被甲基化抑制(圖2)。

此外，在將癌細(xì)胞系接種至10-20％匯合，并隨后用5-AZA處理兩次達(dá)4天時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析細(xì)胞系中的RIP3表達(dá)模式。表明，當(dāng)將不表達(dá)RIP3的DLD-1結(jié)直腸癌細(xì)胞系用各種濃度的5-AZA(類似于5AD的物質(zhì))處理時(shí)，誘導(dǎo)RIP3表達(dá)。該結(jié)果表明，癌細(xì)胞系中的RIP3表達(dá)被甲基化抑制(圖3)。

實(shí)施例3：通過(guò)去甲基化劑和抗癌藥物聯(lián)合治療致敏癌細(xì)胞死亡

將癌細(xì)胞系接種至10-20％匯合，并隨后用5-AD或5-AZA處理兩次達(dá)4天以誘導(dǎo)RIP3表達(dá)。接種相同數(shù)量的5-AD處理的HeLa和未處理的HeLa細(xì)胞系，并隨后用相同濃度的抗癌藥物的處理。分析去甲基化劑對(duì)細(xì)胞死亡致敏的影響。

結(jié)果表明，在由5-AD誘導(dǎo)RIP3表達(dá)后進(jìn)行利用抗癌藥物的處理時(shí)，使得用5-AD處理的表達(dá)RIP3的癌細(xì)胞系對(duì)抗癌藥物敏感。這提示，RIP3參與抗癌藥物導(dǎo)致的癌細(xì)胞系死亡(圖4)。

此外，除了5-AD的情況，表明，在由5-AZA誘導(dǎo)RIP3表達(dá)后進(jìn)行抗癌藥物處理時(shí)，獲得使癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞死亡敏感的效應(yīng)(圖5)。

實(shí)施例4：在抑制RIP3表達(dá)的條件下去甲基化劑對(duì)使癌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞死亡敏感的效應(yīng)

使用慢病毒系統(tǒng)，制備了在宮頸癌細(xì)胞系(HeLa細(xì)胞系)中連續(xù)抑制RIP3表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞。不像非靶標(biāo)細(xì)胞系，在shRIP3細(xì)胞系的情形中，盡管細(xì)胞系用5-AD處理，但是細(xì)胞系中的RIP3表達(dá)被shRNA抑制。因此，可以證實(shí)RIP3對(duì)用抗癌藥物和去甲基化劑聯(lián)合治療導(dǎo)致細(xì)胞系致敏的效應(yīng)。最初將非靶標(biāo)細(xì)胞系和shRIP3細(xì)胞系中的每種接種至10-20％匯合，并隨后用5-AD處理兩次達(dá)4天，并且檢查RIP3是否表達(dá)。此外，在接種相同數(shù)量的細(xì)胞后，使用細(xì)胞存活力測(cè)定(MTT測(cè)定)分析用抗癌藥物聯(lián)合治療導(dǎo)致的致敏作用(圖6)。

因?yàn)槿ゼ谆瘎?5-AD或5-AZA)不是特異性針對(duì)某種蛋白的藥物，其可以引起除RIP3之外的多種蛋白的表達(dá)。因此，為了確定通過(guò)用抗癌藥物和去甲基化劑聯(lián)合治療導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞死亡的致敏作用是否是由除RIP3之外的蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)，使用特異抑制RIP3表達(dá)的shRIP3細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在非靶標(biāo)細(xì)胞系中，當(dāng)癌細(xì)胞系用5-AD處理時(shí)，用抗癌藥物聯(lián)合治療顯示由RIP3表達(dá)導(dǎo)致的使癌細(xì)胞死亡致敏的效應(yīng)，但在其中RIP3表達(dá)被特異抑制的shRIP3細(xì)胞系中，即使細(xì)胞系用5-AD處理，shRNA體系也不表達(dá)RIP3。當(dāng)基于該結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞存活力測(cè)定時(shí)，能夠觀察到，在不表達(dá)RIP3的shRIP3細(xì)胞系的情況下，致敏作用被抑制，提示RIP3是用去甲基化劑和抗癌藥物聯(lián)合治療誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡的致敏中的重要分子。此外，其提示，促進(jìn)RIP3表達(dá)是新的抗癌策略，其可以增加癌細(xì)胞的死亡。

實(shí)施例5：正常乳腺組織和乳腺癌組織的免疫染色測(cè)定

腫瘤組織和非腫瘤組織分離自132名乳腺癌癥患者，并制備石蠟塊。將制備的石蠟塊切片至4.5μm的厚度，并且然后置于載玻片上。將切片在二甲苯中脫蠟并在分級(jí)系列的乙醇-水溶液中再水合，并且隨后用過(guò)氧化氫處理以消除非特異性酶反應(yīng)，接著用檸檬酸溶劑處理以解離潛在的抗原。然后，將其與稀釋的正常血清溫育20分鐘以阻斷非特異反應(yīng)，并且隨后與RIP3(1∶300)反應(yīng)24小時(shí)。在用水洗滌后，將溫育的物質(zhì)與生物素綴合的第二抗體溫育30分鐘，接著用水洗滌。在將其與親和素-生物素復(fù)合體溫育30分鐘，并隨后用水洗滌后，將其用DAB顯色溶液處理5分鐘。接著，用蘇木精染核，用水洗滌，并且隨后進(jìn)行封固過(guò)程。

DAB的顯色強(qiáng)度分級(jí)為0(無(wú)顯色)、1(弱顯色)、2(中等)、或3(強(qiáng)顯色)，并且通過(guò)將染色的細(xì)胞的比例(％)乘以染色強(qiáng)度獲得H-得分。染色由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家解釋。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，將典型正常乳腺組織和乳腺癌組織中的RIP3成像，并且結(jié)果顯示為H-得分(圖7、8和9)。可以看出，RIP3的表達(dá)水平在癌組織中顯著低于正常乳腺組織中。

實(shí)施例6：用各種濃度的抗癌藥物處理的RIP3-沉默的HT-29細(xì)胞的存活力測(cè)定

將HT-29細(xì)胞(美國(guó)組織培養(yǎng)物收集中心(American Tissue Culture Collection))在37℃培養(yǎng)箱中使用補(bǔ)充有青霉素-鏈霉素(10IU/ml)和10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。本發(fā)明中使用的shRNAi雙鏈由Sigma-Aldrich商業(yè)合成。設(shè)計(jì)本發(fā)明中使用的shRNA從而靶向人RIPK3 mRNA序列(NCBI參考序列NM_006871)的編碼區(qū)。

首先，將培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞以2×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度分配到3S-mm培養(yǎng)皿中。在次日，根據(jù)方案說(shuō)明將細(xì)胞用shRNA顆粒連同聚凝胺(10ug/ml)感染。作為對(duì)照，使用不靶向特定蛋白的shRNA(NCBI參考序列NM_027088)。

為了測(cè)量感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的RIP3蛋白的量，在將感染的HT-29細(xì)胞用PBS清洗，并隨后用裂解緩沖液裂解以收集上清后，使用蛋白質(zhì)印跡試劑盒(BIO-RARD)分離蛋白。將分離的蛋白與合適的抗體(抗-β-肌動(dòng)蛋白(1∶5,000，Sigma)、抗-RIP3(1∶1,000，Abcam)和第二HRP-綴合抗體(Jackson)溫育，并隨后使用Immunobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物試劑盒(Thermo)檢測(cè)HRP。

結(jié)果，如圖10所示，在RIP3 shRNA感染的HT-29細(xì)胞中基本上檢測(cè)不到RIP3蛋白。這提示，感染的RIP3 shRNA有效敲低RIP3基因。

在本發(fā)明中，為了檢查RIP3基因是否與抗癌藥物敏感性相關(guān)，將RIP3shRNA感染的HT-29細(xì)胞用不同濃度的多柔比星和依托泊苷處理，并隨后測(cè)量癌細(xì)胞的細(xì)胞存活力。特別是，將RIP3 shRNA感染的HT-29細(xì)胞用2.5uM和5uM的多柔比星以及50uM和100uM的依托泊苷處理，并隨后溫育48小時(shí)。在將培養(yǎng)基更換為含有0.1mg的MTT(3-([4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的新鮮培養(yǎng)基，再將細(xì)胞溫育2小時(shí)。在通過(guò)將四唑鎓鹽(活細(xì)胞溶解于其中)還原成紫色甲(formazan)晶體獲得的沉淀上進(jìn)行比色分析。接著，去除培養(yǎng)基，并且將產(chǎn)生的甲晶體溶解在500ul DMSO中，并且使用ELISA讀數(shù)器在570nm測(cè)量吸光度。細(xì)胞存活力表示為相對(duì)于視為100％存活力的對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。

結(jié)果，如圖10(右側(cè))所示，在對(duì)照組中，細(xì)胞存活力依賴于多柔比星和依托泊苷的濃度降低，而在RIP3用shRNA敲低的測(cè)試組中，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活力增加。

實(shí)施例7：用各種濃度的抗癌藥物處理導(dǎo)致的RIP3-沉默的T47D細(xì)朐的存活力測(cè)定

為了檢查RIP3是否還對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有效應(yīng)，使用表達(dá)RIP3的T47D細(xì)胞。首先，以與實(shí)施例6中所述相同的方式用RIP3感染細(xì)胞。

蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果表明，在RIP3 shRNA感染的T47D細(xì)胞中基本上檢測(cè)不到RIP3，并且RIP3基因被有效敲低(圖11)。為了檢查RIP3是否增加T47D乳腺癌細(xì)胞中的抗癌藥物敏感性，進(jìn)行MTT測(cè)定。將對(duì)照組和RIP3-敲低測(cè)試組與圖11(右側(cè))所示濃度的多柔比星、依托泊苷和紫杉醇溫育48小時(shí)。MTT測(cè)定的結(jié)果表明，對(duì)照組的細(xì)胞依賴于抗癌藥物的濃度被殺傷，而與對(duì)照組相比，RIP3細(xì)胞系，特別是依托泊苷-處理的測(cè)試組的抗癌藥物耐藥性顯著增加。

從上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，RIP3表達(dá)的調(diào)節(jié)影響癌細(xì)胞系的抗癌藥物耐藥性。特別是，能夠發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RIP3表達(dá)被抑制時(shí)，癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物具有耐藥性，并且因此抗癌藥物的活性被抑制，而當(dāng)RIP3表達(dá)時(shí)，癌細(xì)胞的死亡依賴于抗癌藥物的濃度增加。

實(shí)施例8：乳腺癌癥患者的10-年無(wú)轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)存活的分析

圖12是顯示1,166名乳腺癌癥患者的10-年無(wú)轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)存活的圖表。RIP3基因的表達(dá)水平分為兩部分(高于和低于50％)，并且分析患者的存活率。結(jié)果，具有高于50％RIP3表達(dá)的患者顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(p＜0.0085)，這提示RIP3的表達(dá)水平影響患者的存活率。結(jié)果使用Jezequel等人設(shè)計(jì)的乳腺癌癥基因-表達(dá)Miner v3.0軟件(Breast Cancer Research and Treatment 2012；131：765-75)進(jìn)行分析。

盡管已經(jīng)參考具體特征詳細(xì)描述了本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，該描述僅是其優(yōu)選的實(shí)施方案，并且不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求和其等效形式限定。