新型基于抗體偶聯(lián)化療藥物納米adc及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于抗體偶聯(lián)新技術(shù)的抗體化療藥物如阿霉素和美登素(DOX，DM1)的納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。實驗結(jié)果表明抗體偶聯(lián)化藥偶聯(lián)物通過自組裝成的納米粒子與單獨(dú)的抗體和單獨(dú)的藥物相比，其靶向性顯著增強(qiáng)，對機(jī)體的藥物毒副作用顯著降低；形成的納米粒子復(fù)合利用腫瘤組織的增強(qiáng)滲透保持滯留效應(yīng)(EPR)增強(qiáng)瘤內(nèi)富集，增強(qiáng)藥物的生物利用率的同時降低藥物的使用劑量，為腫瘤的靶向治療提供一種高效低毒的納米治療方式。
【專利說明】新型基于抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC及制備方法和應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種新型基于抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC及制備方法和應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一。我國的腫瘤發(fā)病率已達(dá)千分之二，死亡率為千分之一點(diǎn)五，其中，肺癌的死亡率最高，肝癌位居第二，胃癌第三。惡性胃癌治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后多不佳。目前臨床上多采用的常規(guī)治療方法如放療、化療和手術(shù)治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長了生存時間；但是化療或放療不能改變患者的生存期，即便是對首次化療敏感的癌癥患者來說，也很容易復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥。而且復(fù)發(fā)后再次進(jìn)行化療或放療時，療效則明顯降低。因此，對多數(shù)復(fù)發(fā)無法避免、治愈率極低的患者而言，低毒性、更有效的靶向治療就顯得非常必要。近年來，針對細(xì)胞表面分子的抗體靶向性治療已取得了巨大進(jìn)展。在抗腫瘤治療過程中，由于抗體靶向治療具有特異性高、副作用小、半衰期長等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種非常有發(fā)展前途的腫瘤生物治療的方法。但是單克隆抗體存在對腫瘤殺傷效果低，分子量大，免疫原性強(qiáng)，體內(nèi)滯留時間長不易穿透組織，血管通透性差等缺點(diǎn)，使得單克隆抗體在臨床實際應(yīng)用存在一定的局限性。而抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugates，ADC)的出現(xiàn)在一定程度上既克服了抗體殺傷不足的同時，也明顯降低了化療藥物對正常組織的毒副作用。
[0003]抗體-藥物偶聯(lián)物是新一代抗體靶向治療藥物，主要用于癌癥和腫瘤的治療。從結(jié)構(gòu)上，ADC藥物由“彈頭”藥物(細(xì)胞毒藥物)、抗體以及偶聯(lián)抗體和藥物的偶聯(lián)鏈3部分組成，通過化學(xué)偶聯(lián)的方法將細(xì)胞毒性藥物連接到抗體蛋白上。得益于穩(wěn)定結(jié)合子型的ADCs能夠確切的將藥物攜帶至細(xì)胞內(nèi)，而在外周血和細(xì)胞表面很少降解；在同等給藥劑量下，使用穩(wěn)定型ADCs更像緩釋劑一樣能夠長時間在體保持有效的殺傷濃度而不釋放出多余的毒素，從而使得ADCs在抗腫瘤中具有更高效的殺傷效應(yīng)和更小的不良反應(yīng)。如人源化IgGl抗⑶19單抗huB4通過一種含有二硫鍵的橋梁分子IV—琥珀酰亞氨基.4-(2-吡啶二硫代)丁酸(STOB)與具有強(qiáng)效細(xì)胞毒作用的類美登醇(maytansinoid)衍生物DM4相，得到的抗體-藥物偶聯(lián)物SAR3419在血漿及水溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生斷裂釋放DM4。SAR3419經(jīng)給藥進(jìn)入機(jī)體后，huB4單抗可特異結(jié)合至表達(dá)⑶19的腫瘤細(xì)胞，連接于單抗分子的DM4由此釋放出來并殺死腫瘤細(xì)胞。臨床前藥理研宄顯示:SAR3419活性強(qiáng)于huB4單抗和游離的DM4。
[0004]盡管抗體-藥物偶聯(lián)物相對于單一的抗體和化療藥物在殺傷效果和降低化療藥物毒性上具有一定的優(yōu)勢，但是由于不同細(xì)胞表面表達(dá)不同豐度的抗原，就會使得單一的抗體-藥物偶聯(lián)在抗原表達(dá)相對不足的細(xì)胞治療效果上不盡如人意；且研宄表明，偶聯(lián)到ADC上的效應(yīng)分子的數(shù)目影響ADC的聚合、抗原的結(jié)合活性、血液循環(huán)中的清除率、活性及耐受性，偶聯(lián)的效應(yīng)分子數(shù)目過少，降低了 ADC的活性；相反，過多則降低ADC藥物在血液中的半衰期及耐受性、同時影響抗體與抗原的有效結(jié)合；此外單個的抗體-藥物偶聯(lián)物在腫瘤內(nèi)富集低，化學(xué)偶聯(lián)的藥物在血液循環(huán)中不夠穩(wěn)定，釋放出來的細(xì)胞毒分子對細(xì)胞產(chǎn)生的毒副作用也使得抗體-藥物偶聯(lián)物達(dá)不到臨床預(yù)期目標(biāo)。
[0005]本發(fā)明的基于抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC旨在利用抗體的親水性和化療藥物阿霉素的疏水性，在液相環(huán)境中自組裝成內(nèi)部是疏水性化療藥物內(nèi)核，外部是親水性抗體的外殼，形成免疫-化療納米體系；該納米免疫-化療體系不僅保留了單個抗體的靶向性和單獨(dú)化療藥物對腫瘤的強(qiáng)殺傷性，免疫-化療納米體系以多價形式靶向腫瘤細(xì)胞，還顯著增強(qiáng)了其抗原抗體親和力，使大量的阿霉素有效富集到腫瘤部位，減少藥物的使用劑量，從而降低藥物對正常組織的殺傷，降低藥物的毒副作用，而目前關(guān)于這類藥物還未見報道。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供由抗體與藥物偶聯(lián)技術(shù)及其偶聯(lián)物所自組裝成的納米粒子。
[0007]本發(fā)明的再一的目的是，提供所述納米粒子的制備方法。
[0008]本發(fā)明的另一的目的是，提供所述納米粒子的用途。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0010]抗體與藥物偶聯(lián)技術(shù)及其偶聯(lián)物所自組裝成的納米粒子，所述納米粒子是由巰基化的抗體與帶有雙硫鍵的化療藥物在液相環(huán)境中自組裝形成的，具有下的結(jié)構(gòu):
[0011](Drug)n—mAb
[0012]其中mAb代表單克隆抗體，drug代表化療藥物，η為偶聯(lián)上的藥物數(shù)目，η值為1-80 ;所述納米粒子為膠束狀核殼結(jié)構(gòu)，疏水性的化療藥物包裹在膠束內(nèi)核中，親水性抗體形成膠束狀外殼；所述膠束粒徑大小為20-1000nm ;所述每個納米粒子中化療藥物的分子數(shù)目為1-10000。
[0013]所述化療藥物為阿霉素或美登素。
[0014]所述單克隆抗體為Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13 或 CD22 ;優(yōu)選為 Her2 或CD20。
[0015]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0016]所述的納米粒子的制備方法包括下述步驟，
[0017]第一步:化療藥物與帶有雙硫鍵的交聯(lián)劑，溶于甲醇后，室溫下避光攪拌反應(yīng)6天，得到帶有雙硫鍵的化療藥物；所述的交聯(lián)劑為肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)、SMCC、SPDP、VCP ;優(yōu)選為 PDPH ；
[0018]第二步:用2-1T(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽)與抗體在pH = 7.4的PBS下反應(yīng)，將抗體進(jìn)彳T疏基化；
[0019]第三步:將巰基化的抗體用PBS稀釋，加入雙硫鍵的化療藥物的甲醇溶液，通N2,密封，室溫?fù)u床下反應(yīng)4h，置于4°C冰箱24h，離心純化；
[0020]第四步:取5ml離心純化的產(chǎn)物加入到50ml的旋蒸瓶中，通入氮?dú)?，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備抗體包裹化療藥物的納米粒子，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的優(yōu)選條件為:轉(zhuǎn)速60rpm，溫度25°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為3.5h，氮?dú)饬魉贋?0mL/min。
[0021]所述的化療藥物為阿霉素或美登素；所述的抗體為Her2、⑶20、⑶40、⑶34、⑶28、CD13 或 CD22，優(yōu)選為 Her2 或 CD20。
[0022]所述第一步化療藥物與帶有雙硫鍵的交聯(lián)劑質(zhì)量比為27.25:11.78，攪拌速度為100rpm、500rpm、1000rpm、5000rpm ;優(yōu)選為 lOOrpm。
[0023]所述第二步抗體與2-1T的質(zhì)量比為1000:75 ;所述巰基化后每個抗體結(jié)合7_8個疏基。
[0024]所述第三步巰基化的抗體與帶有雙硫鍵的化療藥物的質(zhì)量比為1:1 ;所述離心純化條件優(yōu)選為:離心溫度20°C，離心速度1500rpm，離心時間lOmin。
[0025]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0026]所述納米粒子在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。
[0027]所述納米粒子在制備抑制胃癌細(xì)胞N87生長的藥物中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明以化療藥物、抗體作為基本材料制備出一種既具有抗體主動靶向又可以將具有毒性的疏水性藥物包裹進(jìn)納米粒子內(nèi)核中的免疫-藥物納米體系。本發(fā)明的主要技術(shù)方案是:首先將阿霉素與帶有雙硫鍵的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)反應(yīng)生成帶有雙硫鍵的阿霉素化合物；接著用2-1T(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽)與抗體在pH = 7.4的PBS下反應(yīng)，將抗體進(jìn)行巰基化，得到抗體上帶有一定數(shù)目的巰基；帶有巰基的抗體與帶有雙硫鍵的阿霉素化合物進(jìn)行反應(yīng)，通過抗體上的巰基與阿霉素雙硫鍵進(jìn)行還原反應(yīng)，一定數(shù)目疏水性阿霉素連接到抗體上；最后，通過旋蒸法制備得到內(nèi)核包裹阿霉素，外殼連有親水性抗體的納米免疫體系。
[0029]本發(fā)明制備的抗體-藥物免疫納米體系具有如下特點(diǎn):
[0030](I)改載體以抗體和阿霉素為基本材料形成膠束狀核殼結(jié)構(gòu)，疏水性的阿霉素被包裹進(jìn)膠束內(nèi)核中，而親水性抗體形成膠束的外殼，膠束粒徑大小在(nm);這種帶有雙硫鍵的抗體-藥物免疫納米膠束利用腫瘤組織的EPR效應(yīng)實現(xiàn)藥物在腫瘤內(nèi)的富集。
[0031](2)借助膠束表面大量數(shù)目的抗體能更好的被腫瘤細(xì)胞表面的抗原所識別，增強(qiáng)抗原抗體之間的親和力更有利于被腫瘤細(xì)胞所內(nèi)吞；帶有雙硫鍵的偶聯(lián)鏈部分在胞內(nèi)較高水平還原型谷胱甘肽的還原作用下，釋放出細(xì)胞毒藥物，從而達(dá)到專一性殺滅癌細(xì)胞而不損傷正常組織細(xì)胞的作用。所述的納米載藥體系與游離藥物和單一抗體相比具有更長的半衰期，更好的靶向作用以及瘤內(nèi)顯著的富集效應(yīng)，從而顯著提高藥物的生物利用率。
[0032]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
[0033]1、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC膠束狀核殼結(jié)構(gòu)，納米級的膠束粒徑更有利于藥物在腫瘤內(nèi)的富集。
[0034]2、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC具有高效低毒的特點(diǎn)，能夠?qū)Ｒ恍詺绨┘?xì)胞而不損傷正常組織細(xì)胞。
[0035]3、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)化療藥物納米ADC與游離藥物和單一抗體相比具有更長的半衰期，更好的靶向作用以及瘤內(nèi)顯著的富集效應(yīng)，從而顯著提高藥物的生物利用率。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0036]附圖1是帶有雙硫鍵阿霉素(DOX-PDPH)合成示意圖。
[0037]附圖2是抗體巰基化標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0038]附圖3是納米偶聯(lián)化療藥物納米ADC合成示意圖。
[0039]附圖4是抗體-藥物納米免疫體系自組裝示意圖。
[0040]附圖5是抗體藥物納米粒子的粒徑分布圖。
[0041 ]附圖6是抗體藥物納米粒子透射電子顯微鏡圖。
[0042]附圖7是ADC與納米ADC的抗體結(jié)合實驗。
[0043]附圖8是細(xì)胞內(nèi)吞實驗。
[0044]附圖9是細(xì)胞毒性實驗。
[0045]附圖10是抗體藥物納米粒子體內(nèi)抑瘤效果示意圖。
[0046]附圖11是抗體藥物納米粒子殺傷腫瘤細(xì)胞示意圖。
【【具體實施方式】】
[0047]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0048]實施例1帶有雙硫鍵阿霉素(DOX-PDPH)的合成
[0049]稱取質(zhì)量為27.25mg的阿霉素(ADR) ,11.78mg的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)，溶于3ml的甲醇；室溫下避光攪拌反應(yīng)6天，在不同的攪拌速度下(lOOrpm，500rpm，100rpm, 3000rpm)反應(yīng)；減半速度快可防止阿霉素的沉淀，從而有利于ADR-PDPH的合成。反應(yīng)結(jié)束后，可得到橘黃色的產(chǎn)物。ADR-PDPH的合成示意圖見圖1。
[0050]實施例2巰基化Her2的制備
[0051]按I mg 的 her2 和 75 μ g 2-1T (2_iminoth1lane.HCI (Traut，s reagent，上海前塵生物科技有限公司))的比例(Ant1-Her2-Fab和2-1T的摩爾比為1:100或根據(jù)實際情況提高兩者的比例)將兩者混合。用封口膜封口，防止2-1T被氧化。在室溫條件下反應(yīng)2ho反應(yīng)體系可以按比例擴(kuò)大。巰基化的Her2通過透析(PBS，5mM EDTA, pH = 7.4)來除去多余的Traut試劑。6-8小時更換一次透析液，透析2?3次。
[0052]實施例3抗體巰基化標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0053]ElIman? s測試測定巰基化抗體的-SH量，DTNB為Ellman試劑。它用于比色法測定生物樣品中巰基。它易溶于水。在巰基化合物的存在下，無色的DTNB將被轉(zhuǎn)變成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸。由于5-巰基-2-硝基苯甲酸在412nm處具有最大吸收，DTNB的吸收光譜并不干擾巰基的測定。
[0054]試劑的配置:
[0055](I)Tris-HCl 緩沖液(0.25M):DDff (deuterium depleted water)準(zhǔn)確的配制后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH = 8.3，配置300ml。
[0056](2)半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(ImM):準(zhǔn)確稱取0.017563g L-半胱氨酸(分子量:175.63)，用Iml甲酸溶解，以DDW定容至10ml0
[0057](3) DTNB (分子量:396.35)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mM):準(zhǔn)確的稱取 0.198175gDTNB，用 50mMNa2HPO4 (pH = 7.0)配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0058](4) DTNB分析溶液(0.1mM):由I體積1mM的DTNB標(biāo)準(zhǔn)液加99體積0.25M的Tris緩沖液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0059]半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:
[0060](a)25°C條件下，用Tris-HCl緩沖液稀釋半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液配成的梯度稀釋液各5.0ml，其濃度分別為:0.0OmM,0.025mM、0.05mM、0.lmM、0.15mM、0.2mM。[0061 ] (b)取上述各濃度溶液Iml分別加入到5ml預(yù)先恒溫于25 V水中的DTNB分析溶液，搖勻，準(zhǔn)確靜止lOmin，立即于波長412nm處測定吸光度值。
[0062](c)由此可以得到吸光度對半胱氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示.根據(jù)此合成方法檢測出來一個抗體可見結(jié)合7-8個巰基，為后續(xù)巰基化的抗體與ADR-PDPH反應(yīng)提供條件。
[0063]實施例4抗體-ADR偶聯(lián)物的制備
[0064]將Img巰基化的Her2用PBS稀釋至1.2ml后，加入Img的ADR-PDPH(0.4ml甲醇溶液)，混勻后，緩慢通入2min左右的N2 (以防止抗體上的巰基被氧化)，用封口膜將瓶口封死，室溫?fù)u床下反應(yīng)4h后，置于4°C冰箱過夜；24h后，可觀察到反應(yīng)瓶底部僅有少許ADR沉淀，表明大部分的ADR已連接到親水性抗體上，此時可觀察到溶液仍為橘紅色。采用離心的方法將未接上抗體游離的ADR從體系中分離出去，由于離心的速度和離心的時間和溫度均對合成得到的產(chǎn)物有影響，因此我們對以上三個因素進(jìn)行了一系列的優(yōu)化；離心時間設(shè)置為5min，1min, 20min，30min ;離心溫度設(shè)置為4°C，20°C，37°C ;離心速度設(shè)置為lOOOrpm，1500rpm，2000rpm, 2500rpm和3000rpm，來找出最優(yōu)的除去游離阿霉素的條件。實驗結(jié)果表明離心時間lOmin，溫度20°C，離心速度1500rpm條件下，離心純化效果最好。
[0065]實施例5抗體偶聯(lián)化療藥物阿霉素形成納米粒子
[0066]采用旋蒸方法制備抗體包裹ADR納米粒子。將上述離心純化后得到的抗體-ADR偶聯(lián)物5ml加入到50ml的旋蒸瓶中；由于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶旋轉(zhuǎn)的速度、通入氮?dú)獾乃俣纫约皶r間和溫度對最終所制備的納米粒子均有影響，因此我們對以上幾種因素進(jìn)行了一系列的研宄。旋轉(zhuǎn)瓶的轉(zhuǎn)速設(shè)置為30，60，90，120;溫度設(shè)置為4°0，25°0，37°0以及42°0 ;通入氮?dú)獾牧魉僭O(shè)置為緩慢(2mL/min)，較快(10mL/min)和快速(20mL/min)三個等級，以優(yōu)化得到最佳制備納米粒子的條件。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)速60rpm，溫度25°C，氮?dú)饬魉贋?0mL/min條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為3.5h，納米粒子形成效果最好。根據(jù)最優(yōu)參數(shù)，將液體倒進(jìn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3-4h后待瓶底溶劑完全蒸干后，可見到瓶底有一薄層紅色的薄膜。停止通入氮?dú)夂螅蒙倭康娜ルx子水進(jìn)行洗脫。抗體偶聯(lián)化療藥物阿霉素形成納米粒子如圖3，4所示。
[0067]實施例6抗體藥物納米粒子中ADR濃度檢測
[0068]對實施例5制備得到抗體藥物納米粒子中ADR濃度檢測。ADR的紫外吸收在495nm，采用紫外分光光度計來檢測ADR濃度。取20ul的抗體藥物納米粒子加入20ul的有機(jī)試劑乙腈混合后，反應(yīng)30min徹底將納米粒子打破，釋放出包裹在納米粒子中的阿霉素；然后加入360ul的去離子水，稀釋20倍在495nm處進(jìn)行檢測。阿霉素的濃度計算公式為:C(ADR)= A (495nm) X20X62.5ug/ml，經(jīng)計算，抗體藥物納米粒子中阿霉素的濃度為C_) =62.5ug/mLX 20 X 0.085 = 106.5ug/mL。
[0069]實施例7抗體藥物納米粒子的表征
[0070]利用動態(tài)光散射法來檢測制備得到的抗體藥物納米粒子的粒徑分布和大小。取實施例5所制備的樣品用Mi 11 1-Q水稀釋成濃度為0.lmg/ml后，然后用0.45 μ m的Mi 11 ipore濾器過濾，過濾后加入樣品池測定，每個樣品重復(fù)測定3次。測量條件為:90°散射角，25°C，結(jié)果如圖5所示。使用TEM(透射電子顯微鏡)對制備的納米粒子進(jìn)行表征。取實施例5制備的樣品5 μ I (樣品的濃度為0.5mg/ml)滴到規(guī)格為200-網(wǎng)格線自由碳涂層的銅網(wǎng)薄片(Ted Pella Type-A型號)上，于室溫靜置，待溶液干了后，用2%磷鎢酸(PTA)溶液染色2min，結(jié)果如圖6所不。
[0071]實施例8
[0072]對與細(xì)胞表面相互作用的研宄是評價單獨(dú)化療藥物阿霉素(ADR)和抗體偶聯(lián)化療藥物(ADC，Her-ADR)以及納米抗體連接藥物(Nano ADC，實施例5制備)的重要衡量指標(biāo)。通過對與細(xì)胞表面的相互作用的研宄評價，可以推測出納米載體在體內(nèi)的靶向并富集的效果，進(jìn)而評價其潛在應(yīng)用價值。具體實驗過程如下:
[0073](I)細(xì)胞鋪板:取對數(shù)生長期的N87細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞，上海盈公生物科技有限公司)消化、離心后計數(shù)，在24孔板中鋪細(xì)胞密度為2 X 15/孔，每孔加入500 μ I含血清培養(yǎng)液，周圍一圈空白細(xì)胞孔每個均用500 μ I PBS補(bǔ)足，放置在7% C02，37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。
[0074](2)分別取游離的阿霉素(ADR)、單獨(dú)的抗體偶聯(lián)阿霉素ADC、以及抗體包裹ADR納米粒子(NanoADC，實施例5制備)，加入細(xì)胞孔中，與N87細(xì)胞進(jìn)行孵育，在7% C02，37°C孵育6ho
[0075](3)孵育6h后，ADR組，ADC組和抗體包裹ADR納米組分別用培養(yǎng)基輕輕洗2遍，并將細(xì)胞消化離心于15ml離心管中，然后用PBS洗2遍(800rpmX 5min)，濃度為IXlO6/ml，各lml，上流式檢測阿霉素的紅色熒光強(qiáng)度。
[0076]實驗結(jié)果如7、8示:其中黑色線表示不要任何藥物的空白組，橘紅色線表示游離藥ADR物組，紅色的線表示ADC組，綠色的線表示抗體藥物納米粒子組，從圖中數(shù)據(jù)可以表明抗體與藥物形成納米粒子后，其表面有大量能夠與細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體，能夠增強(qiáng)納米粒子與細(xì)胞之間的相互作用，從圖中顯示出其ADR的熒光強(qiáng)度最大；其次是抗體偶聯(lián)ADR,與游離ADR相比，其抗體的靶向性促進(jìn)了細(xì)胞對其內(nèi)吞，但是較之抗體藥物納米粒子來說，其熒光強(qiáng)度明顯要低，這歸咎于抗體藥物納米粒子表面大量的抗體。
[0077]實施例9細(xì)胞毒性試驗
[0078]制備得到的抗體藥物納米粒子，游離的藥物ADR，單純的抗體偶聯(lián)化療藥物(ADC)以及抗體連ADR納米組裝體(Nano ADC，實施例5制備)對細(xì)胞的毒性進(jìn)行評價。細(xì)胞鋪板:取對數(shù)生長期的N87細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞)消化、離心后計數(shù)，在24孔板中鋪細(xì)胞密度為2X 15/孔，每孔加入500 μ I含血清培養(yǎng)液，周圍一圈空白細(xì)胞孔每個均用500 μ I PBS補(bǔ)足，放置在7% C02，37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。
[0079]分別取游離的阿霉素(ADR)、單獨(dú)的抗體偶聯(lián)阿霉素ADC、以及抗體包裹ADR納米粒子，加入細(xì)胞孔中，濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.08，0.1，0.2，0.4 μ g/ml與N87細(xì)胞進(jìn)行孵育，在7% C02，37°C孵育24h后，棄去舊的培養(yǎng)基，加入PBS洗板2次后，每孔加入10ul含有1ul CCK-8的細(xì)胞培養(yǎng)液在7% CO2, 37°C下孵育2.5h，使用ΒΙ0-ΤΕΚ Elx800全自動酶標(biāo)儀在450nm波長處，讀取樣品孔的吸光值，并計算細(xì)胞生存率；細(xì)胞生存率計算方法:
[0080]surviving rat1 = (OD450scan-OD450nc)/(OD450pc-OD450nc) X 100%
[0081]其中，0045(|_:實驗組在450nm波長下的吸光值；
[0082]OD450no:陰性對照組在450nm波長下的吸光值；
[0083]OD450pc:陽性對照組在450nm波長下的吸光值。
[0084]實驗結(jié)果如圖9所示:圖中表明，游離ADR，ADC組以及抗體藥物納米組(Nano ADC)均隨著藥物濃度的增大，其細(xì)胞存活率依次降低；這三種藥對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為 0.48±0.05ug/mL，0.14±0.0lug/mL 和 0.09±0.075ug/mL ；由此可見抗體藥物納米組對細(xì)胞的抑制效果最好，其對細(xì)胞的抑制效果明顯要好于ADC組和ADR組；比較ADR和ADC組可以發(fā)現(xiàn)，ADC組抑制效果要好于ADR組。
[0085]實施例10體內(nèi)抑瘤效果實驗
[0086]首先建立了 Her2高表達(dá)小鼠腫瘤模型(N87)，然后將接種了 N87細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞)的Balb/c裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分組為3組，包括PBS對照組(Contool)、Her2_ADR組，及Nano-ADC組。每組Balb/c裸鼠為5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠每次注射按照阿霉素的劑量為5mg/kg，注射5次，平均每3天注射一次(防止單純阿霉素注射組荷瘤裸鼠副作用導(dǎo)致裸鼠在未完成實驗前死亡)。在第一天藥物注射時開始記錄并隨時觀察并記錄每組接種了 N87細(xì)胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情況，每2天測量器腫瘤大小并對其進(jìn)行體重稱量。腫瘤體積計算方法如下:
[0087]腫瘤體積計算公式:長X寬X寬/2
[0088]對荷瘤Balb/c裸鼠進(jìn)行藥物注射后第30天對全部荷瘤的Balb/c裸鼠進(jìn)行解剖，取出其腫瘤組織，并測量每組荷瘤Balb/c裸鼠的腫瘤組織的質(zhì)量與體積，并對其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果如圖10所示，表明實施例5制備的新型Nano-ADC能實現(xiàn)對腫瘤組織的良好治療。
[0089]該實驗進(jìn)一步證明本方法合成的新型Nano-ADC得到提高于臨床腫瘤的治療。這些都得益于抗體藥物納米組中大量的抗體靶向性以及納米粒子在腫瘤細(xì)胞的富集效應(yīng)，使得其對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果最好。其基本機(jī)制如圖11所示:相比于游離的ADC，nano ADC無論是在靶向性、藥物遞送量，還是瘤組織內(nèi)的抗體計量上都得到明顯的提高，因此，nanoADC無疑是更具有市場前景的新型抗體-化療復(fù)合治療的藥物劑型。
[0090]實施例11⑶20-美登素納米粒子的制備
[0091](I)稱取質(zhì)量為27.25mg的美登素，11.78mg的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)，溶于3ml的甲醇；室溫下避光攪拌反應(yīng)6天，攪拌速度為lOOOrpm，3000。反應(yīng)結(jié)束后，得到帶有雙硫鍵的美登素。
[0092](2)按I mg的CD20 (上?？泼羯锟萍加邢薰?和75 μ g2_IT (2-1minoth1lane *HCI (Traut’s reagent，上海前塵生物科技有限公司))的比例(Ant1-Her2_Fab和2-1T的摩爾比為1:100或根據(jù)實際情況提高兩者的比例)將兩者混合。用封口膜封口，防止2-1T被氧化。在室溫條件下反應(yīng)2h。反應(yīng)體系可以按比例擴(kuò)大。巰基化的CD20通過透析(PBS，5mM EDTA，pH = 7.4)來除去多余的Traut試劑。6_8小時更換一次透析液，透析2?3次。分離得到巰基化的CD20。通過Ellman’ s測試測定巰基化CD20的巰基數(shù)量，實驗方法同實施例3，結(jié)果顯示，每個⑶20抗體結(jié)合了 7-8個巰基。
[0093](3)將Img巰基化的CD20用PBS稀釋至1.2ml后，加入Img帶有雙硫鍵的美登素(0.4ml甲醇溶液)，混勻后，緩慢通入2min左右的N2 (以防止抗體上的巰基被氧化)，用封口膜將瓶口封死，室溫?fù)u床下反應(yīng)4h后，置于4°C冰箱過夜；24h后，通過觀察，反應(yīng)瓶底部殘余微量美登素沉淀，表明大部分的美登素已連接到親水性抗體上。采用離心的方法將未接上抗體游離的美登素從體系中分離出去；離心條件為:離心時間lOmin，溫度20°C，離心速度2000rpm，在此條件下，離心純化效果最好。
[0094](4)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法制備納米粒子。取第3步制備得到的⑶20-美登素偶聯(lián)物5ml加入到50ml的旋蒸瓶中；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)參數(shù)設(shè)置為:轉(zhuǎn)速90rpm，溫度25°C，氮?dú)饬魉贋?0mL/min,將液體倒進(jìn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3_4h后待瓶底溶劑完全蒸干后，用少量的去離子水進(jìn)行洗脫，得到最終產(chǎn)物CD20-美登素納米粒子。
[0095]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.抗體與藥物偶聯(lián)技術(shù)及其偶聯(lián)物所自組裝成的納米粒子，其特征在于，所述納米粒子是由巰基化的抗體與帶有雙硫鍵的化療藥物在液相環(huán)境中自組裝形成的，具有下的結(jié)構(gòu):
(Drug) n—mAb 其中mAb代表單克隆抗體，drug代表化療藥物，η為偶聯(lián)上的藥物數(shù)目，η值為1_80 ；所述納米粒子為膠束狀核殼結(jié)構(gòu)，疏水性的化療藥物包裹在膠束內(nèi)核中，親水性抗體形成膠束狀外殼；所述膠束粒徑大小為20-1000nm ;所述每個納米粒子中化療藥物的分子數(shù)目為 1-10000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒子，其特征在于，所述化療藥物為阿霉素或美登素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒子，其特征在于，所述單克隆抗體為Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13 或 CD22 ;優(yōu)選為 Her2 或 CD20。
4.權(quán)利要求書I所述的納米粒子的制備方法，其特征在于，包括下述步驟: 第一步:化療藥物與帶有雙硫鍵的交聯(lián)劑，溶于甲醇后，室溫下避光攪拌反應(yīng)6天，得到帶有雙硫鍵的化療藥物；所述的交聯(lián)劑為肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)、SMCC,SPDP、VCP ;優(yōu)選為 PDPH ; 第二步:用2-1T(2-亞氨基硫烷鹽酸鹽)與抗體在pH = 7.4的PBS下反應(yīng)，將抗體進(jìn)行疏基化； 第三步:將巰基化的抗體用PBS稀釋，加入雙硫鍵的化療藥物的甲醇溶液，通N2，密封，室溫?fù)u床下反應(yīng)4h，置于4°C冰箱24h，離心純化； 第四步:取5ml離心純化的產(chǎn)物加入到50ml的旋蒸瓶中，通入氮?dú)?，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備抗體包裹化療藥物的納米粒子，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的優(yōu)選條件為:轉(zhuǎn)速60rpm，溫度25°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為3.5h，氮?dú)饬魉贋?0mL/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的化療藥物為阿霉素或美登素；所述的抗體為 Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13 或 CD22 ;優(yōu)選為 Her2 或 CD20。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述第一步化療藥物與帶有雙硫鍵的交聯(lián)劑質(zhì)量比為27.25:11.78，攪拌速度為100rpm、500rpm、1000rpm、5000rpm ;優(yōu)選為10rpm0
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述第二步抗體與2-1T的質(zhì)量比為1000:75 ;所述巰基化后每個抗體結(jié)合7-8個巰基。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述第三步巰基化的抗體與帶有雙硫鍵的化療藥物的質(zhì)量比為1:1 ;所述離心純化條件優(yōu)選為:離心溫度20°C，離心速度1500rpm，離心時間 lOmin。
9.權(quán)利要求1或4所述的納米粒子在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或4所述的納米粒子在制備抑制胃癌細(xì)胞N87生長的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K47/38GK104491868SQ201410696189
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】李威 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)