一種抗體偶聯(lián)藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗體偶聯(lián)藥物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等手 段。手術(shù)治療后的高復(fù)發(fā)率、腫瘤轉(zhuǎn)移以及相應(yīng)并發(fā)癥是導(dǎo)致手術(shù)治療失敗的主要原因。而 對于放療與化療，其在殺傷腫瘤細胞的同時也不可避免的對人體正常組織細胞造成損傷， 導(dǎo)致嚴重副作用的產(chǎn)生，因此，放/化療的無差別殺傷作用也嚴重限制了他們在臨床上的 應(yīng)用。
[0003] 在腫瘤治療中使用的阿霉素等廣譜抗腫瘤藥物，雖然能夠通過抑制細胞DNA的合 成、破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能、抑制蛋白質(zhì)合成或者抑制細胞有絲分裂來干擾或阻斷細胞的 增殖過程，從而達到殺滅腫瘤細胞的效果。但是抗腫瘤藥物分子在治療癌癥時，不具有對癌 細胞的靶向作用，在治療的同時也會對正常細胞產(chǎn)生毒性作用，從而引發(fā)各種副作用，因此 期望對藥物分子進行改造使得其具有靶向作用，從而降低其毒副作用。
[0004] 鑒于抗腫瘤單克隆抗體對腫瘤細胞表面抗原的特異性，抗體藥物已經(jīng) 成為腫瘤治療的新方向，但單獨使用時療效經(jīng)常不盡如人意。抗體藥物偶聯(lián)物 (antibody drug conjugate，ADC)是將單克隆抗體與細胞毒性藥物偶聯(lián)（Sievers，E. L.,Senterj P. D. Antibody-drug conjugates in cancer therapy.Annual Review of Medicine. 2013, 64:15-29.)，充分結(jié)合了前者靶向選擇性強和后者活性高的特點，不僅可 以將細胞毒性藥物特異性地靶向于腫瘤細胞，降低細胞毒性藥物對于正常細胞的殺傷作 用，同時還具備緩釋、提高藥物抗腫瘤活性等效果，是未來腫瘤治療的發(fā)展方向之一。
[0005] ADC由抗體、偶聯(lián)劑和效應(yīng)分子三個部分組成。通過靶向特定抗原，ADC能夠有效 地滲透到腫瘤組織，并被腫瘤細胞吞噬進入酶溶體，釋放效應(yīng)分子。
[0006] 目前，已經(jīng)有三種ADC藥物通過美國FDA批準上市，其中，在2013年通過的用 于治療 HER2 陽性乳腺癌患者的 Kadcyla (Antibody-drug con jugate against breast cancer approved. Bioengineered，2013,4:121.)，是具有里程碑意義的治療實體腫瘤的 ADC藥物，引發(fā)了新一輪的研宄熱潮。盡管ADC新藥的開發(fā)已經(jīng)獲得前所未有的成功，技 術(shù)上仍然有待進一步優(yōu)化。目前大多數(shù)ADC研宄采用載藥量不可控的無選擇性偶聯(lián)模式 (Sammet, B. , Steinkuhler, C. , Sewald, N. Antibody-drug conjugates in tumor therapy. Pharmaceutical Patent Analyst. 2012, 1:65-73·)，導(dǎo)致無法獲得載藥位點確定、載藥比 明確的ADC產(chǎn)物，嚴重影響ADC藥物的藥效藥代評價及臨床應(yīng)用。另外，現(xiàn)在常用的完整抗 體分子量較大，通常在IOOkDa以上，過大的分子體積使ADC很難有效抵達腫瘤細胞，從而導(dǎo) 致有效給藥率過低。偶聯(lián)劑也大多是短鏈的剛性疏水分子，這對于藥物本身的水溶性與免 疫原性也存在一定的影響。
[0007] 因此，在本領(lǐng)域中，需要開發(fā)一種能夠獲得載藥位點確定、載藥比明確的抗體偶聯(lián) 藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗體偶聯(lián)藥物及其制備方法和 應(yīng)用。
[0009] 為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一方面，本發(fā)明提供了一種抗體偶聯(lián)藥物，所述抗體偶聯(lián)藥物由異端基雙官能團 聚乙二醇共價偶聯(lián)藥物分子和Fab'片段得到，結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0011] Fab' -異端基雙官能團聚乙二醇-藥物分子（I)
[0012] 其中，F(xiàn)ab'為抗CD20抗體的片段，藥物分子為細胞毒性藥物分子。
[0013] 本發(fā)明將Fab'片段通過異端基雙官能團聚乙二醇與藥物分子偶聯(lián)來達到對藥物 分子進行修飾的目的，在得到的偶聯(lián)抗體偶聯(lián)藥物中，F(xiàn)ab'片段保留有抗CD20抗體對于非 霍奇金淋巴瘤的靶向活性，同時結(jié)合了小分子細胞毒性藥物對于腫瘤細胞的殺傷作用，能 夠靶向性將藥物遞送至非霍奇金淋巴瘤以達到治療目的。
[0014] 在本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物中，所述Fab'片段為鉸鏈區(qū)帶有兩個游離巰基的Fab' 片段。
[0015] 優(yōu)選地，所述Fab'片段為抗CD20抗體降解并將鉸鏈區(qū)二硫鍵還原所得的抗體片 段。
[0016] 優(yōu)選地，所述抗⑶20抗體為人鼠嵌合型抗體或全人源化抗體，優(yōu)選為全人源化抗 體。
[0017] 在本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物中，所述異端基雙官能團聚乙二醇具有式II所示的結(jié) 構(gòu)：
[0018] A-PEG-B(II)
[0019] 其中，A為能與巰基反應(yīng)的活性官能團，B為能與氨基或羰基反應(yīng)的活性官能團。
[0020] 優(yōu)選地，A選自馬來酰亞胺基、乙烯基砜基、巰基、鹵代乙酰胺基、二硫化鄰吡啶基 或硫代磺酸酯基中的任意一種。
[0021] 優(yōu)選地，B選自琥珀酰亞胺酯基、醛基、二氯三嗪基、三氟乙基磺酸酯基、苯并三唑 碳酸酯基、三氯苯基碳酸酯基、羰基咪唑基、氨基、氧氨基、酰肼基中的任意一種。
[0022] 在本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物中，所述異端基雙官能團聚乙二醇的分子量為 1000Da_20000Da，例如 1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、 9000Da、lOOOODa、IlOOODa、12000Da、13000Da、14000Da、15000Da、16000Da、17000Da、 18000Da、19000Da 或 20000Da，優(yōu)選為 2000Da-5000Da。
[0023] 在本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物中，所述細胞毒性藥物分子為抗腫瘤藥物分子，優(yōu)選為 美登素（Maytansine)、卡其霉素（Calicheamicin)、阿里他?。ˋuristatin)及其同系物、絲 裂霉素（Mitomycin)、倍癌霉素（Duocarmycin)或阿霉素（DOX)中的任意一種。
[0024] 優(yōu)選地，所述阿里他汀的同系物為monomethyl auristatin E(MMAE)和/或 Monomethyl auristatin F(MMAF)〇
[0025] 在本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物中，所述Fab'與藥物分子的摩爾比為1:2。這是利用 Fab'片段鉸鏈區(qū)帶有的兩個游離巰基可通過異端基雙官能團聚乙二醇與兩分子藥物偶聯(lián) 而實現(xiàn)的。
[0026] 優(yōu)選地，所述聚乙二醇與Fab'的連接鍵為硫醚鍵或二硫鍵。
[0027] 優(yōu)選地，所述聚乙二醇與藥物分子的連接鍵為酰胺鍵、酰腙鍵或胺鍵。
[0028] 另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述抗體偶聯(lián)藥物的制備方法，所述方法包括以 下步驟：
[0029] (1)降解抗CD20抗體得到F(ab'）2片段，將F(ab'）2片段還原，得到鉸鏈區(qū)帶有 兩個游離巰基的Fab'片段，之后分離純化備用；
[0030] (2)將藥物分子與異端基雙官能團聚乙二醇的B端共價偶聯(lián)，得到中間產(chǎn)物 A-PEG-藥物分子；
[0031] (3)將步驟⑴得到的鉸鏈區(qū)帶有兩個游離巰基的Fab'片段與步驟⑵得到的中 間產(chǎn)物A-PEG-藥物分子的A端共價偶聯(lián)得到所述抗體偶聯(lián)藥物（I)。
[0032] 在本發(fā)明所述的抗體偶聯(lián)藥物的制備方法中，步驟（1