)所述降解抗CD20抗體通過 胃蛋白酶降解實(shí)現(xiàn)。
[0033] 優(yōu)選地，步驟（1)所述還原使用的還原劑為β-巰基乙胺。
[0034] F(ab'）2片段在β-巰基乙胺的還原作用下，還原為鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離巰基的 Fab'片段，游離的巰基能夠與A-PEG-藥物分子的A端共價(jià)偶聯(lián)，獲得抗體偶聯(lián)藥物（I)，并 能夠保證藥物分子與Fab'片段的定量偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)藥物分子的定量負(fù)載。
[0035] 優(yōu)選地，所述還原劑加入還原體系后的濃度為5-20mM，例如5mM、6mM、7mM、8mM、 9mM、10mM、I ImM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM 或 20mM。
[0036] 通過對還原劑濃度的選擇，能夠使還原反應(yīng)保持合適的反應(yīng)速率，還原劑濃度過 低，反應(yīng)動力不足，容易殘存較多原料F (ab'）2，而還原劑濃度過高，則反應(yīng)動力過大，容易 使得？(&13'） 2片段內(nèi)部二硫鍵斷裂后形成輕重鏈片段產(chǎn)物，而選擇本發(fā)明所述濃度，可以使 得F(ab'）2片段更多地還原為鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離巰基的Fab'片段，避免由于過多副產(chǎn)物 的生成而造成后續(xù)分離純化極其困難。
[0037] 優(yōu)選地，步驟⑴所述還原的反應(yīng)時(shí)間為5_35min，例如5min、lOmin、15min、 20min、25min、30min 或 35min，優(yōu)選為 30min〇
[0038] 還原反應(yīng)時(shí)間的控制也對反應(yīng)有很大影響，反應(yīng)時(shí)間過短，反應(yīng)不充分，容易殘存 較多原料，反應(yīng)時(shí)間過長，容易使F(ab'） 2片段內(nèi)部二硫鍵斷裂后產(chǎn)生內(nèi)部二硫鍵也被還原 的產(chǎn)物，進(jìn)而無法保證藥物分子的定點(diǎn)定量負(fù)載。將反應(yīng)時(shí)間控制在本發(fā)明所述范圍內(nèi)，可 以達(dá)到控制F(ab'） 2片段更高效地還原為鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離巰基的Fab'片段的目的。
[0039] 優(yōu)選地，步驟（1)所述還原的反應(yīng)溫度為(TC -37°C，例如0°C、5°C、10°C、15°C、 20°C、25°C、30°C或37°C，優(yōu)選為25°C。本發(fā)明使用較溫和的反應(yīng)溫度進(jìn)行還原反應(yīng)，避免 了苛刻的反應(yīng)條件對反應(yīng)操作以及儀器的特殊要求。
[0040] 在本發(fā)明所述的抗體偶聯(lián)藥物的制備方法中，步驟（3)所述Fab'片段與中間產(chǎn)物 A-PEG-藥物分子的投料量摩爾比為 1:2-1:10,例如 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9 或 1:10,優(yōu)選為1:5。
[0041] 在本發(fā)明所述的Fab'片段的制備方法中，步驟⑴得到的鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離 巰基的Fab'片段與中間產(chǎn)物A-PEG-藥物分子共價(jià)偶聯(lián)過程中，F(xiàn)ab'片段的兩個(gè)巰基分別 與中間產(chǎn)物A-PEG-藥物分子發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)，使得生成的抗體偶聯(lián)藥物中Fab'片段與藥物 分子的摩爾比為1:2,因此本發(fā)明的抗體偶聯(lián)藥物具有載藥比固定、載藥位點(diǎn)結(jié)構(gòu)明確的特 點(diǎn)。
[0042] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明抗體偶聯(lián)藥物的制備方法，具體包括以下步驟：
[0043] (1)用胃蛋白酶降解抗-CD20抗體，得到F(ab'）2片段，反應(yīng)式如下所示：
[0044]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述抗體偶聯(lián)藥物由異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇共 價(jià)偶聯(lián)藥物分子和Fab'片段得到，結(jié)構(gòu)如式I所示： Fab'-異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇-藥物分子（I) 其中，F(xiàn)ab'為抗CD20抗體的片段，藥物分子為細(xì)胞毒性藥物分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述Fab'片段為鉸鏈區(qū)帶有兩 個(gè)游離巰基的Fab'片段； 優(yōu)選地，所述Fab'片段為抗CD20抗體降解并將鉸鏈區(qū)二硫鍵還原所得的抗體片段； 優(yōu)選地，所述抗CD20抗體為人鼠嵌合型抗體或全人源化抗體，優(yōu)選為全人源化抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述異端基雙官能團(tuán)聚乙二 醇具有式II所示的結(jié)構(gòu)： A-PEG-B(II) 其中，A為能與巰基反應(yīng)的活性官能團(tuán)，B為能與氨基或羰基反應(yīng)的活性官能團(tuán)； 優(yōu)選地，A選自馬來酰亞胺基、乙烯基砜基、疏基、鹵代乙酰胺基、二硫化鄰吡啶基或硫 代磺酸酯基中的任意一種； 優(yōu)選地，B選自琥珀酰亞胺酯基、醛基、二氯三嗪基、三氟乙基磺酸酯基、苯并三唑碳酸 酯基、三氯苯基碳酸酯基、羰基咪唑基、氨基、氧氨基、酰肼基中的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述異端基雙官能 團(tuán)聚乙二醇的分子量為1000Da-20000Da，優(yōu)選為2000Da-5000Da。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述細(xì)胞毒性藥物 分子為抗腫瘤藥物分子，優(yōu)選為美登素、卡其霉素、阿里他汀及其同系物、絲裂霉素、倍癌霉 素或阿霉素中的任意一種； 優(yōu)選地，所述阿里他汀的同系物為monomethylauristatinE和/或Monomethyl auristatinF0
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物，其特征在于，所述Fab'與藥物分 子的摩爾比為1:2 ; 優(yōu)選地，所述聚乙二醇與Fab'的連接鍵為硫醚鍵或二硫鍵； 優(yōu)選地，所述聚乙二醇與藥物分子的連接鍵為酰胺鍵、酰腙鍵或胺鍵。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物的制備方法，其特征在于，所述方 法包括以下步驟： (1) 降解抗CD20抗體得到F(ab'）2片段，將F(ab'）2片段還原，得到鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè) 游離巰基的Fab'片段，之后分離純化備用； (2) 將藥物分子與異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇的B端共價(jià)偶聯(lián)，得到中間產(chǎn)物A-PEG-藥 物分子； (3) 將步驟（1)得到的鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離巰基的Fab'片段與步驟（2)得到的中間產(chǎn) 物A-PEG-藥物分子的A端共價(jià)偶聯(lián)得到所述抗體偶聯(lián)藥物（I)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述降解抗CD20抗體通過 胃蛋白酶降解實(shí)現(xiàn)； 優(yōu)選地，步驟（1)所述還原使用的還原劑為e-巰基乙胺； 優(yōu)選地，所述還原劑加入還原體系后的濃度為5-20mM; 優(yōu)選地，步驟（1)所述還原的反應(yīng)時(shí)間為5-35min，優(yōu)選為30min; 優(yōu)選地，步驟（1)所述還原的反應(yīng)溫度為〇°C-37°C，優(yōu)選為25°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)所述Fab'片段與中間 產(chǎn)物A-PEG-藥物分子的投料量摩爾比為1:2-1:10,優(yōu)選為1:5。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物在制備用于治療非霍奇金氏淋巴 瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗體偶聯(lián)藥物及其制備方法和應(yīng)用，所述抗體偶聯(lián)藥物由異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)藥物分子和Fab’片段得到，結(jié)構(gòu)如式I所示：Fab’-異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇-藥物分子(I)其中，F(xiàn)ab’為抗CD20抗體的片段，藥物分子為細(xì)胞毒性藥物分子。本發(fā)明通過將抗CD20抗體降解得到的F(ab’)2片段還原為鉸鏈區(qū)帶有兩個(gè)游離巰基的Fab’片段，而后通過異端基雙官能團(tuán)聚乙二醇將其與藥物分子共價(jià)偶聯(lián)得到所述抗體偶聯(lián)藥物。本發(fā)明制備的抗體偶聯(lián)藥物具有載藥比固定、載藥位點(diǎn)結(jié)構(gòu)明確的特點(diǎn)，保留了抗CD20抗體對于CD20蛋白的結(jié)合能力，對CD20陽性細(xì)胞具有靶向能力，可用于非霍奇金氏淋巴瘤的治療。
【IPC分類】A61K47-48, A61P35-00
【公開號】CN104758946
【申請?zhí)枴緾N201510160703
【發(fā)明人】張競, 周展, 蘇志國, 馬光輝
【申請人】中國科學(xué)院過程工程研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月7日