一種以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物以及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物以及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從基因的角度對(duì)腫瘤進(jìn)行治療成為目前腫瘤研宄的熱點(diǎn)。RNA干擾技術(shù)(RNAi)作為一種新興的基因阻斷技術(shù)，在后基因組時(shí)代的功能基因研宄和特異性基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。這個(gè)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默過程可以由短小干擾RNA(SiRNA)誘發(fā)。利用RNA干擾技術(shù)沉默致病基因，可實(shí)現(xiàn)快速、高效、特異的基因治療，為腫瘤的基因治療提供了具有潛力的新手段。近年來，RNA干擾技術(shù)用于肝癌治療的研宄越來越多，有望為肝癌的診斷和治療提供新的措施。
[0003]基因治療包括RNAi技術(shù)等都需要將外源的基因?qū)肽康募?xì)胞并且高效表達(dá)，從而達(dá)到治療的目的。理想的基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)應(yīng)該具有良好的靶向性和生物安全性、較好的穩(wěn)定性、較高的基因轉(zhuǎn)染效率及生物可降解性。目前，基因載體主要包括病毒型基因載體和非病毒型基因載體兩大類。病毒型載體由于生物安全性等問題，限制了其應(yīng)用。非病毒型載體，比如納米載體，逐漸成為了基因治療的研宄重點(diǎn)。納米載體可以提高所包載的寡核苷酸或DNA的穩(wěn)定性，使被包裹的寡核苷酸免受核酸酶的降解。納米顆粒子體積小，能夠隨血液參與血液循環(huán)，從而較容易透過細(xì)胞屏障進(jìn)入生物機(jī)體的細(xì)胞，能夠高效介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染，并使其在細(xì)胞內(nèi)高水平和長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，為功能基因的研宄和疾病的基因治療提供了新的技術(shù)和手段。
[0004]殼聚糖(chitosan，CS)是一種來源于海洋生物的天然高分子多糖，具有良好的生物安全性，生物可降解性，在組織工程支架材料、藥物緩釋載體材料等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。其分子結(jié)構(gòu)中的氨基帶有正電荷，可以與帶負(fù)電荷的核酸通過靜電相互作用形成復(fù)合物，使DNA被壓縮為結(jié)構(gòu)相對(duì)致密的納米級(jí)粒子。但是殼聚糖作為基因載體的主要問題之一是殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率較低。因此近年來很多研宄者在殼聚糖上接枝一些如蛋白質(zhì)或多肽的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)之類的特征性基團(tuán)，增強(qiáng)基因的穩(wěn)定性、構(gòu)建長(zhǎng)循環(huán)并增加其靶向性等。改性殼聚糖納米載體已成為基因傳遞中一種主要的載體材料。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于殼聚糖納米基因運(yùn)載系統(tǒng)的研宄已有較多報(bào)到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明提供一種以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物，殼聚糖分子經(jīng)化學(xué)修飾引入聚乙二醇和半乳糖基配體合成mPEG-Gal-CS，所述mPEG-Gal-CS的納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合而制備出所述以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物。
[0008]本發(fā)明還提供一種所述的以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物的方法，所述方法包括以下步驟:
[0009]步驟一:制備mPEG-Gal-CS納米顆粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成醋酸溶液；取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成CS溶液；用NaOH溶液調(diào)節(jié)所述CS的pH ;稱取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取兩只燒杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中緩慢滴加所述TPP溶液，直至出現(xiàn)乳光現(xiàn)象為止，然后將出現(xiàn)所述乳光現(xiàn)象的溶液在磁力攪拌器上攪拌；
[0010]步驟二:制備出以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物:先使所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl混勾，然后使混勾的所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl在一定溫度下保溫一定時(shí)間，或者先將所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl分別在一定溫度下保溫一定時(shí)間，然后將在所述溫度下保溫所述時(shí)間后的所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl混勻。
[0011]本發(fā)明還提供一種所述的以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物的方法，本方法包括以下步驟:
[0012]步驟一 AljgmPEG-Gal-CS納米顆粒:取冰乙酸加入四蒸水中，混勾制成的醋酸溶液；稱取CS粉末溶于所述醋酸溶液中制成的CS溶液；稱取TPP粉末加入四蒸水中制成TPP溶液；取兩只干凈的燒杯盛放所述CS溶液，向所述CS溶液中緩慢滴加所述TPP溶液，直至出現(xiàn)乳光現(xiàn)象為止，然后將出現(xiàn)所述乳光現(xiàn)象的溶液在超聲儀中超聲處理；
[0013]步驟二:制備出以殼聚糖為母體的納米基因復(fù)合物:先使所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl混勾，然后使混勾的所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl在一定溫度下保溫一定時(shí)間，或者先將所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl分別在一定溫度下保溫一定時(shí)間，然后將在所述溫度下保溫所述時(shí)間后的所述mPEG-Gal-CS納米顆粒與所述質(zhì)粒pEGFP-Nl混勻。
[0014]進(jìn)一步的，所述TPP溶液的濃度為0.5?2g/L，所述pH為3?5，所述所述醋酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為2%，并且所述CS溶液的濃度為2g/L。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明通過化學(xué)修飾，在殼聚糖(chitosan，CS)分子中引入PEG和半乳糖(Galactose，Gal)基配體，增加殼聚糖的水溶性、緩釋性和肝靶向性，提高基因轉(zhuǎn)染效率，從而獲得一種高效、緩釋、肝靶向的基因載體系統(tǒng)。
【附圖說明】
[0016]圖1所示為根據(jù)本發(fā)明的mPEG-Gal-CS納米顆粒紅外光譜結(jié)構(gòu)表征圖；
[0017]圖2A與圖2B示意性示出不同pH、不同TPP濃度對(duì)mPEG-Gal-CS納米顆粒粒徑的影響；
[0018]圖3示出根據(jù)不同復(fù)合方法的mPEG-Gal-CS納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合物的凝膠電泳結(jié)果;
[0019]圖4示出不同pH下mPEG-Gal-CS納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合物的凝膠電泳結(jié)果；
[0020]圖5示出根據(jù)不同體積比的mPEG-Gal-CS納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合物的凝膠電泳結(jié)果;
[0021]圖6示出mPEG-Gal-CS納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合物的DnaseI抗性實(shí)驗(yàn)的凝膠電泳結(jié)果；
[0022]圖7A與圖7B示出mPEG-Gal-CS納米顆粒與質(zhì)粒復(fù)合物的血清穩(wěn)定性試驗(yàn)的凝膠電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下文將結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
[0024]以下將結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0025]mPEG-Gal-CS 的合成
[0026]通過化學(xué)修飾，在殼聚糖(chitosan，CS)分子中引入聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)和半乳糖(Galactose，Gal)基配體合成mPEG-Gal-CS，用于納米顆粒的制備。
[0027]Gal-CS的制備:殼多糖通過活性醋中間體在1_乙基_3_ (3_ 二甲氛基丙基)_碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的催化下與乳糖酸(LA)進(jìn)行在CS分子上接枝Gal基團(tuán)的反應(yīng)。CS(130mg)溶解于40ml of0.6% (v/v)醋酸溶液中。具體操作如下:將LA(260mg)溶解于1ml蒸餾水中，加入NHS (120mg)/EDC (280mg)以活化LA的羧基基團(tuán)。然后將活化的LA溶液加入至上述CS溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)72hr。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用透析袋(MWC0 = 8000)進(jìn)行透析72hr，期間經(jīng)常更換蒸餾水。最后將透析液進(jìn)行冷凍干燥，獲得純化的Gal-CS，用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0028]mPEG-Gal-CS的制備:首先通過DMSO/醋酸酐氧化mPEG法制備單甲氧基聚乙二醇醛(mPEG-CHO)，然后將mPEG_CH0和Gal-CS以一定摩爾比例加入到少量的雙蒸水中，在氮?dú)夥諊袛嚢杌靹?，溶液粘稠渾濁，然后向其中加?%的乙酸，溶液呈淡黃色，再加入甲醇(乙酸/甲醇=2/lv/v)后反應(yīng)體系變成白色渾濁粘稠狀并有大量氣泡產(chǎn)生，測(cè)pH值為3，于室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)攪拌反應(yīng)40min至溶液變澄清，此后用lmol/L的NaOH調(diào)pH至4.6?5.6后，將適量的NaCNBH3溶于5ml雙蒸水中逐滴緩慢加入到反應(yīng)體系中(NaCNBH3/mPEG的摩爾比例為20/1)，室溫下攪拌反應(yīng)22hr。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液透析干燥，獲得純化的mPEG-Gal-CS，用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0029]在圖1中，橫軸表示波數(shù)(cnT1)，縱軸表示透射率(％ )。如圖1所示，比較CS與Gal-CS可以發(fā)現(xiàn)大概在CS的1630cm-l的位置處為-NH2的剪刀振動(dòng)吸收峰而在Gal-CS的紅外光譜中發(fā)現(xiàn)該波長(zhǎng)處無吸收峰，說明-NH2收到了破壞，而在1400cm-l，IlOOcm-1的位置處波長(zhǎng)明顯尖銳，是因?yàn)镚al接枝到CS上，引入了 -OH的緣故。再看mPEG-CHO的紅外圖譜，在3500cm的位置處出現(xiàn)了寬而平坦的吸收峰，是因?yàn)?OH存在的而且形成氫鍵的緣故，在2820cm，2735cm的位置處為-CHO的伸縮振動(dòng)吸收峰。在1727cm的位置處為C = O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1390cm處為CHO的彎曲振動(dòng)吸收峰。這幾處吸收峰的存在均能證明mPEG已經(jīng)被醛基化了。比較Gal-CS與mPEG-Gal-CS可以發(fā)現(xiàn)在mPEG-Gal-CS的紅外圖譜上在以上描述的3500cm，2820cm，2735cm，1727cm的位置處均出現(xiàn)了 -CHO的特征吸收峰。由此判斷mPEG-CHO已經(jīng)成功接枝到Gal-CS上，從而形成了 mPEG-Gal-CS納米顆粒。
[0030]mPEG-Gal-CS納米顆粒的制備
[0031](l)mPEG-Gal-CS納米顆粒的制備方法
[0032]①配制溶液:用量桶量取2ml的冰乙酸加入98ml的四蒸水中，混勻制成體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸(HAC)溶液；稱取0.04g的mPEG-Gal-CS粉末溶于2% HAC溶液中制成2g/L的CS溶液，用lmol/L的NaOH溶液將配制好CS溶液調(diào)節(jié)成不同pH的溶液，非別為3.0和5.0 ;稱取0.5g的TPP粉末加入500ml的四蒸水制成lg/L的多聚磷酸鈉(TPP)溶液。
[0033]②取兩只刷洗干凈的50ml的燒杯盛放殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中緩慢滴加TPP溶液，直至出現(xiàn)乳光現(xiàn)象為止；兩杯殼聚糖溶液中的一者在磁力攪拌器上攪拌15min(磁力攪拌法)。另外一者放在超聲儀中超聲處理15min (超聲波法)。
[0034]③分別取出經(jīng)步驟2處理過的殼聚糖溶液進(jìn)行粒徑測(cè)定。
[0035](2)不同pH、不同TPP濃度對(duì)mPEG-Gal-CS納米顆粒粒徑的影響
[0036]如圖2A中所示，在pH為3.0的情況下，濃度分別為0.5g/L、lg/L與2g/L的TPP溶液對(duì)應(yīng)的磁力攪拌法制備的mPEG-Gal-CS納米顆粒粒徑分別為約270mm、440mm與560mm ；在pH為5.0的情況下，濃度分別為0.5g/L、lg/L與2g/L的TPP溶液對(duì)應(yīng)的磁力攪拌法制備的mPEG-Gal-CS納米顆粒粒徑分別為約200mm、190mm與350mm。
[0037]如圖2B中所示，在pH為3.0的情況下，濃度分別為0.5g/L、lg/L與2g/L的TPP溶液對(duì)應(yīng)的超聲