原花青素在制備治療畜禽生殖相關(guān)疾病藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原花青素在制備治療畜禽生殖相關(guān)疾病藥物的應(yīng)用，特別是制備治療雄性畜禽生殖系統(tǒng)衰老綜合征藥物的應(yīng)用，拓寬了其應(yīng)用范圍，也為雄性畜禽生殖系統(tǒng)衰老損傷的治療和改善提供了新的途徑。
【專利說明】原花青素在制備治療畜禽生殖相關(guān)疾病藥物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及原花青素的新用途，具體為原花青素在制備提高 雄性畜禽生殖能力藥物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 雄性衰老損傷是指機體發(fā)育成熟以后，由于自由基的大量蓄積，雄性生殖系統(tǒng)的 功能逐漸下降，體內(nèi)激素水平變化，下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)生退行性改變，并最終走向死 亡的不可避免的過程。雄性生殖系統(tǒng)的衰老損傷會嚴重影響雄性生殖功能、引起睪丸炎、不 孕不育等疾病。自由基的堆積是引起雄性生殖系統(tǒng)衰老的主要因素，此外，遺傳因素、生活 無節(jié)、濫用藥物、情志失調(diào)等均可增加雄性生殖系統(tǒng)損傷的風(fēng)險。雄性畜禽生殖系統(tǒng)衰老表 現(xiàn)為性欲降低、遺精、滑精、早泄，精子減少或精子活動力減低、不育等。
[0003] 原花青素，英文名字Oligomeric Proantho Cyanidins (0PC)，是一種有著特殊分 子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，具有非常強的體內(nèi)活性，是目前國際上公認的清除人體內(nèi)自由基最 有效的天然抗氧化劑。能有效的改善血液循環(huán)、治療眼睛疾病、消除身體水腫、滋潤皮膚、分 解膽固醇、緩解心血管疾病、治療過敏發(fā)炎、改善靜脈曲張等疾病或癥狀。原花青素一般為 紅棕色粉末，氣微、味澀，溶于水和大多有機溶劑。一般為葡萄籽提取物或法國海岸松樹皮 提取物。OPC的抗自由基氧化能力是維生素 E的50倍，維生素 C的20倍，并吸收迅速完全， 口服20分鐘即可達到最高血液濃度，代謝半衰期達7小時之久。
[0004] 目前，尚未發(fā)現(xiàn)原花青素應(yīng)用于治療雄性衰老損傷及相關(guān)方面的文獻公開及實際 應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種原花青素在制備治療畜禽生殖相關(guān)疾病藥物的新應(yīng) 用。
[0006] 所述藥物的給藥方式為口服、注射用藥或透皮給藥。
[0007] 所述藥物劑型選自粉劑、丸劑、片劑、針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊和口服液。
[0008] 所述相關(guān)疾病為雄性畜禽的包含睪丸炎、不孕不育等疾病在內(nèi)的生殖系統(tǒng)衰老綜 合征。
[0009] 所述藥物還能用于提高雄性畜禽的生殖能力。
[0010] 所述藥物通過清除自由基，能有效的緩解和治療自由基蓄積帶來的雄性生殖系統(tǒng) 衰老損傷，改善衰老雄性畜禽陰莖、睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高精子數(shù)量、存活率和活動度，調(diào)節(jié) 性激素分泌水平，進而提高雄性畜禽生殖能力。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供了原花青素在提高雄性畜禽生殖能力方面的應(yīng)用 及作為提高雄性畜禽生殖能力方面藥物成分的應(yīng)用，拓寬了其應(yīng)用范圍，也為雄性畜禽生 殖系統(tǒng)衰老損傷的治療和改善提供了新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是試驗中大鼠的定位航行試驗PNT潛伏期； 圖2是試驗中大鼠的血清超氧化物歧化酶SOD活力比較； 圖3是試驗中大鼠的丙二醛MDA含量比較； 圖4是試驗中各組附睪尾精子數(shù)量比較； 圖5是試驗中各組附睪尾精子存活率比較； 圖6是試驗中各組附睪尾精子活動度比較； 圖7是試驗中各組血清黃體生成激素 LH濃度變化； 圖8是試驗中各組血清卵泡刺激素 FSH濃度變化； 圖9是試驗中各組血清睪酮濃度變化； 圖10是試驗中各組血清下丘腦促性腺激素釋放激素 GnRH濃度變化； 圖11是試驗中睪丸細胞中類胰島素增長因子IGF-I的mRM表達百分比。

【具體實施方式】
[0013] 以下結(jié)合具體試驗來驗證本發(fā)明所述的原花青素在治療雄性畜禽生殖系統(tǒng)衰老 損傷方面的應(yīng)用，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 實施案例 材料與方法 (1)主要試劑 原花青素：美國sigma公司生產(chǎn)，以0. 06mol/L的鹽酸配制成儲備液，4?保存?zhèn)溆?，?用前用2mol/L NaOH滴定至近中性；D-半乳糖購自北京化學(xué)試劑公司；SOD試劑盒購自南京 建成生物工程公司；MDA試劑盒購自南京建成生物工程公司；APES購自北京中杉金橋生物 有限公司；Poly-L-Lysine Solution購自北京中杉金橋生物有限公司；DAB試劑盒購自北 京中杉金橋生物有限公司；放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；IGF-I原 位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
[0015] (2)主要儀器 Morris水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；分光光度計UV2450購自日本島津公 司；SM-F124制冰機產(chǎn)自日本三洋；RM2125石蠟切片機產(chǎn)自德國Leica公司；TGL-16G臺式 離心機購自上海醫(yī)用分析儀器廠；可調(diào)定量移液器（2-1000yL)購自德國Labsystems公 司；-80°C MDF-382E型超低溫冰箱產(chǎn)自日本SANYO公司；LE-80K型低溫超速離心機產(chǎn)自美 國BECKMAN COULTER ;2000D型超純水器購自北京市長風(fēng)儀器儀表公司；DHX-9143B型電熱 恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；SZ-97自動三重純水蒸餾器購自上海亞 榮生化儀器廠；YXQG02型電熱式蒸汽消毒器購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SZX-B 水浴振蕩器購自哈爾濱市東方電控開關(guān)廠；ESJ200-4電子分析天平產(chǎn)自中國上海；BH-2型 OLRMPU顯微鏡及攝像裝置購自日本OLRMPU公司；Motic6. 0數(shù)據(jù)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)廈門麥 克奧迪公司。
[0016] (3)試驗方法 ①衰老動物模型建立 選用8周齡清潔級雄性SD大鼠105只，體重180?220g，隨機選取15只作為正常對照 組(腹腔注射等量的生理鹽水)，其余大鼠均采用生理鹽水配制的6% D-半乳糖溶液（300mg/ kg/d)連續(xù)腹腔注射60d。然后所有大鼠進行Morris水迷宮行為學(xué)實驗；并于造模的第 60d經(jīng)內(nèi)目此眶后靜脈取血約I. 5mL，離心取上清，檢測血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD)、丙二醒（malondialdehyde, MDA)含量，判斷造模是否成功。
[0017] ②Morris水迷宮行為測試 水迷宮：為直徑120cm，高50cm的圓形水池，水深30cm，盛水后加適量奶粉，使水成不透 明乳白色，水溫保持（26±1)°C，水面高于平臺2cm。在池壁上標4個入水點，它們將水池等 分為1、2、3、4四個象限，在其中1象限正中處放一個直徑為10cm、高25cm的圓形平臺。
[0018] 定位航行試驗（Place navigation test, PNT)用于測試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能 力。連續(xù)訓(xùn)練5d，每天訓(xùn)練4次，每次隨機選擇一個象限作為入水點，觀察并記錄大鼠爬上 平臺的軌跡圖、游泳速度及所需時間（潛伏期）。如果大鼠在60s內(nèi)未找到平臺，需將其引 導(dǎo)至平臺并在平臺上站20s，此時潛伏期記為60s。每只大鼠的訓(xùn)練間隔為lh。
[0019] 空間探索試驗（Spatial probe test, SPT)測量大鼠學(xué)會尋找平臺后對原平臺的 記憶能力。訓(xùn)練第6d上午撤除平臺，將大鼠隨機從某一象限池壁中點面向池壁放入水中， 記錄60s穿越平臺部位的次數(shù)。
[0020] ③血清SOD活力和MDA含量檢測 大鼠用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)內(nèi)眥眶后靜脈取血約1.5mL，離心取上清。分別采用黃嘌 呤酶法和TAB法檢測血清SOD的活力和MDA含量。
[0021] ④分組 將造模成功的大鼠分為模型組、原花青素低、中、高劑量組、陰性對照組（自然恢復(fù) 組），每組均為15只。模型組不再作任何處理，原花青素低、中、高劑量組分別給予原花青素 (10、20、40mg/kg/d)灌胃，陰性對照組灌胃等量的生理鹽水，60d。每日稱重調(diào)整用藥劑量。
[0022] ⑤收集血清 大鼠在處死前，用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)內(nèi)眥眶后靜脈取血約I. 5mL，離心取上 清，用放射免疫法檢測血清黃體生成激素 （Luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone ,FSH)和睪酮（Testosterone)的濃度。
[0023] ⑥標本處理 在25°C?28°C室溫下，大鼠用10%水合氯醛麻醉，隨機抽取只大鼠，取一側(cè)附睪頭（每 只取材的重量保持一致），放入盛有5mL生理鹽水并在37°C水浴中預(yù)熱的小培養(yǎng)皿中，剪碎 成精子懸液。其中5只用于HE和免疫組織化學(xué)檢測，5只用于原位雜交檢測。其余大鼠取 新鮮標本，動物斷頭處死，取出全腦和雙側(cè)睪丸后迅速投入液氮中，保存待用。
[0024] A :用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色的動物處理 大鼠麻醉取血后，開胸，經(jīng)左心室插入主動脈，快速灌注生理鹽水，待沖干凈血液后，灌 注4%多聚甲醛，然后取雙側(cè)睪丸，并放入4%多聚甲醛中4°C冰箱過夜；將固定好的組織塊 經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。
[0025] B :用于原位雜交的動物處理 大鼠麻醉取血后，開胸，經(jīng)左心室插入主動脈，快速灌注生理鹽水，待沖干凈血液后，灌 注含有1:1000 DEPC的4%多聚甲醛，然后取雙側(cè)睪丸，放入4%多聚甲醛固定2h，常規(guī)石蠟 包埋。
[0026] ⑦精子數(shù)量、活動度和存活率分析 A :精子活動度 37°C水浴中靜置20 min后，吸取0. ImL立即滴于37°C預(yù)熱的血細胞計數(shù)板上，顯微鏡 下快速觀察，參照精子活動度的分級標準，記錄200個精子中各級活動精子的數(shù)量，求出其 百分率。
[0027] 精子活動度的分級標準為： I級精子活動良好，呈直線游動； II級活動一般，精子比較活潑，但游泳方向不定，不呈直線運動； III級活動不良，精子活動遲緩，原地打轉(zhuǎn)； IV級有精子形態(tài)，但無活動力。
[0028] B :精子計數(shù) 按紅細胞計數(shù)法計數(shù)。
[0029] C :精子存活率 取精子懸液lmL，加0. 4%臺盼藍0. lmL，在顯微鏡下觀察深染者為死精子，計算100個 精子中活精子的比例。
[0030] ⑧血清LH、FSH、睪酮和下丘腦GnRH的濃度 采用北京北方生物技術(shù)研究所提供的放射免疫分析試劑盒檢測血清LH、FSH、睪酮濃 度。
[0031] 從液氮中取出全腦，用直徑2. 5mm的套管刀在大鼠腦腹側(cè)視交叉后方打孔取下丘 腦，組織柱長約5mm，取一半迅速稱重(約15mg)后于0. 5mL 100°C的生理鹽水(沸水浴)中煮 沸3min，加0. IM鹽酸0. 5mL于勻漿器中制成勻漿，置4°C 1?2h，再用0. IM的NaOH 0. 5mL 中和（PH在6. 9?8. 4之間），用4°C離心機離心3000rpm 30min，取上清液。用放射免疫法 檢測GnRH。
[0032] ⑨HE染色 連續(xù)切片，片厚5 μ m，貼附于用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APES)浸泡過的載玻片上，常 規(guī)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色)，脫水、透明、封片，顯微鏡下 觀察。
[0033] ⑩原位雜交法 IGF-I探針合成序列： 上游引物 5' -GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC-3' 下游引物 5' -GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC-3' A :檢測方法 石蠟包塊連續(xù)切片，片厚7 μ m，貼附于用多聚賴氨酸浸泡過的載玻片上。切片脫蠟 至水，置打孔液中室溫l〇min，使探針快速穿透細胞膜。0. lmol/L PBS (磷酸鹽緩沖液， phosphate buffer saline)沖洗3次。3· 3%H202 1份和蒸饋水10份混合，室溫滅活5min。 0. lmol/L PBS沖洗3次。暴露mRNA核酸片斷：切片上滴加復(fù)合消化工作液，37°C消化 20min，0. lmol/L PBS 沖洗 3 次，室溫 0.2XSSC( saline sodium citrate)緩沖液洗漆 3min, 1次。后固定：1%多聚甲醛/O.lmol/L PBS(pH7.4)，含有1:1000DEPC，室溫固定lOmin，蒸 餾水沖洗3次。預(yù)雜交：干雜交盒底部加20%甘油2mL保濕，每張切片加預(yù)雜交液20 μ L， 恒溫37°C1.5h。去掉蓋玻片，室溫0.2XSSC洗滌5min，3次。雜交：每張切片20yL雜交 液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，恒溫箱37°C雜交3h。雜交后洗 滌：去掉蓋玻片，371：2\55(：洗滌51^11，3次，371：0.2\55(：洗滌5 1^11，3次，371：0.1111〇1/ L TBS (Tris-HCl緩沖液）洗滌5min，4次。滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液， 37°C 45min，0. lmol/L PBS沖洗5min，3次。滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復(fù)合物工作液， 37°C45min，0. lmol/L PBS沖洗5min，3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明， 封片。
[0034] B :結(jié)果判定 以PBS替代一抗作為陰性對照，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。每組選5只動 物的組織，每個標本取3張切片，光鏡下放大400倍，隨機選取組織結(jié)構(gòu)比較完整的部位，通 過光學(xué)顯微鏡和Motic 6.0數(shù)據(jù)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定每張切片中10個視野陽性細胞的 平均光密度（MOD)值，并計算其平均值，代表IGF-I mRNA的表達。
[0035] 11統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19. 0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以（ 云土s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差，均數(shù)間兩兩比較行SNK法Q檢驗，均以P < 0. 05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。
[0036] 結(jié)果 (1)衰老模型建立標準判斷 如圖1所示，PNT表明，前2d各組的潛伏期成績無顯著性差異（P > 0. 05)，隨學(xué)習(xí) 時間的延長各組潛伏期均逐漸縮短，模型大鼠的潛伏期成績與正常大鼠比較明顯延長（P <0.05)。SPT表明，模型大鼠穿越平臺的次數(shù)（2. 36± 1.08)次/min，明顯低于正常大鼠 (7. 11 ±2. 36)次/min。圖2和3顯示，模型大鼠血清SOD活力明顯下降，MDA含量明顯上 升，與正常大鼠比較差異顯著（P< 0.01)。
[0037] (2 )大鼠一般狀況觀察 實驗前，各組大鼠體重?zé)o明顯差別，活潑好動，毛色光澤，大便正常，呈褐色軟便，飲食 正常。隨著實驗的進展，各組大鼠體重逐漸增加，但模型組大鼠增長比例低于正常組，模型 組大鼠毛色逐漸發(fā)黃，色澤暗淡，掉毛現(xiàn)象逐漸明顯，反應(yīng)遲緩，攝食量減少，大多數(shù)大鼠大 便稀溏。原花青素延緩衰老組隨著用藥時間的延長，體重增長較自然恢復(fù)組明顯，毛色、活 動、飲食等情況均得到改善。
[0038] (3) HE染色結(jié)果 HE染色顯示正常組大鼠睪丸生精小管飽滿，管壁厚，生精細胞豐富，腔內(nèi)有大量精子， 提示生精活躍；模型組大鼠睪丸生精小管管壁上皮變薄，管間間隙增寬，間質(zhì)細胞稀少，生 精細胞層次減少，排列紊亂，腔內(nèi)出現(xiàn)脫落退化細胞，提示生精功能低下。原花青素高劑量 組生精小管管壁增厚，可見各級生精細胞。
[0039] (4)原花青素對衰老大鼠精子數(shù)量和功能的影響 如圖4-6所示，模型組精子的活動度、存活率和精子數(shù)量均比正常對照組顯著降低（P <〇.〇5);模型組與自然恢復(fù)組無顯著差異（P> 0.05)。原花青素可以不同程度的改善睪 丸的生精功能，精子數(shù)量均高于模型組和自然恢復(fù)組（P < 0. 05)，但各用藥組之間無顯著 性差異（P > 0. 05);各用藥組均能不同程度的提高精子的活動度和存活率（P < 0. 01)，其 中原花青素高劑量組要好于其他各組（P < 〇. 05)。
[0040] (5)大鼠血清LH、FSH、睪酮和下丘腦GnRH濃度的變化 如圖7-10所示，模型組大鼠血清LH、FSH和下丘腦GnRH濃度明顯升高，睪酮濃度明顯 下降，與正常組比較差異有顯著性（P < 〇. 05)，與自然恢復(fù)組無顯著差異（P > 0. 05)，原花 青素組均能不同程度降低血清LH、FSH和下丘腦GnRH濃度，提高睪酮濃度（P < 0. 05);原 花青素高劑量組療效最佳（P < 〇. 05)。
[0041] (6) IGF-I mRNA在睪丸的表達 如圖11所示，IGF-I mRNA在睪丸間質(zhì)細胞、精母細胞、精子細胞均有表達，免疫陽性產(chǎn) 物分布在細胞質(zhì)，呈棕黃色的彌散顆粒狀。模型組與正常組相比明顯降低（P<〇. 05);模型 組與自然恢復(fù)組無差異（P > 〇. 05);用藥組均能提高睪丸IGF-I mRNA的表達（P < 0. 01)， 原花青素高劑量組明顯好于其他各組（P < 〇. 05)。
[0042] 結(jié)論 實驗結(jié)果表明，原花青素能明顯改善D-半乳糖所致亞急性衰老雄性畜禽睪丸的形態(tài) 結(jié)構(gòu)，提高精子數(shù)量、存活率和活動度，從而改善衰老雄性畜禽精子數(shù)量和精子功能。原花 青素能提高睪丸細胞局部調(diào)節(jié)因子IGF-I mRNA的表達水平，從而改善衰老雄性畜禽生精功 能。原花青素能提高雄性畜禽血清雄性激素（睪酮）的水平，降低促性腺激素（LH、FSH)和 促性腺激素釋放激素（GnRH)的水平，從下丘腦-垂體-性腺軸的整體水平調(diào)控雄性生殖能 力。通過該實驗可以證明原花青素具有提高雄性生殖能力的作用。
【權(quán)利要求】
1. 原花青素在制備治療畜禽生殖相關(guān)疾病藥物的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生殖相關(guān)疾病為雄性畜禽的生殖系 統(tǒng)衰老綜合征。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的給藥方式為口服、注射用藥或 透皮給藥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物劑型選自粉劑、丸劑、片劑、 針劑、沖劑、膏劑、納米乳劑、膠囊和口服液。
【文檔編號】A61P15/08GK104274439SQ201410561446
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】孫江宏, 阮心潔 申請人:河南牧翔動物藥業(yè)有限公司