一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，先設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將模型逐一等距分層，制造各層的光掩膜板；然后將細胞與膠原溶液混合均勻，注入光固化水凝膠和光引發(fā)劑，得到光固化復(fù)合溶液；將光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上，蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；向支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體。本發(fā)明能夠解決軟組織大塊缺損修復(fù)中大塊組織工程軟組織支架內(nèi)細胞的存活問題，以及軟組織支架血管網(wǎng)絡(luò)制造和血管化的問題。
【專利說明】一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明人工軟組織體制備領(lǐng)域，具體涉及一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軟組織在機體中發(fā)揮非常重要的作用，而遺傳、創(chuàng)傷、疾病和衰老等往往造成軟組織的缺失或功能喪失，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，功能性軟組織的再生一直是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的重要問題。組織工程的發(fā)展為軟組織的損傷和功能缺失帶來了新的治療希望，它應(yīng)用工程學(xué)和生物學(xué)原理，聯(lián)合或單獨使用生物材料、細胞和生長因子等，研究開發(fā)能夠維持、修復(fù)甚至替代受損的軟組織的組織工程替代物。
[0003]面向皮膚組織工程支架，皮膚的表皮層薄而堅韌，微結(jié)構(gòu)用于呼吸與排汗，皮下真皮組織具有立體微觀血管管道結(jié)構(gòu)，用于輸送營養(yǎng)，因此在制造皮膚組織工程支架時，要結(jié)合水凝膠與血管支架制造工藝；面向肌肉組織工程支架制造，考慮肌肉組織構(gòu)造復(fù)雜，由大量相同極向的肌纖維細胞組成，其中密布血管和神經(jīng)組織，在細胞之間存在少量致密結(jié)締組織。高密度、高分化的肌細胞呈單軸向分布結(jié)構(gòu)，有利于通過神經(jīng)的支配對響應(yīng)的刺激做出反應(yīng)，完成肌肉組織的收縮和舒張運動，實現(xiàn)人體運動整體協(xié)調(diào)。實現(xiàn)肌肉組織運動功能，首先要在結(jié)構(gòu)上實現(xiàn)細胞生長單軸定向，并且考慮細胞生長的營養(yǎng)和氧氣供給問題。
[0004]而現(xiàn)有的軟組織組織工程支架在制造水凝膠支架中存在修復(fù)體積小、支架血管化、細胞生長氧氣和營養(yǎng)供給等方面的不足。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)在制造水凝膠支架中存在的修復(fù)體積小，及支架血管化、細胞生長氧氣和營養(yǎng)供給等方面不足的問題。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，包括以下步驟:
[0008]I)利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板；
[0009]2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液；
[0010]3)將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；
[0011]4)向帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體。
[0012]所述步驟I)中根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果來設(shè)計帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m,血管直徑為800 μ m~Imm ;軟組織支架模型的分層厚度為800 μ m~1mm。
[0013]所述步驟I)中各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板。
[0014]所述步驟2)中的細胞為成肌細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或衛(wèi)星細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為I X 15~I X 17個/ml，混合液中膠原的濃度為lmg/ml~5mg/ml,混合液的pH值為7.3~7.5。
[0015]所述步驟2)中的光固化水凝膠為聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)或聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma);光引發(fā)劑為2-羥基-4’-(2-羥乙基)_2_對羥基苯甲酸甲酯(12959)、1-羥基苯基酮(1184)或2，2-二甲氧基-1，2-二苯基甲烷1-1(1651);光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度 為10%~30%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為1%。(上述光引發(fā)劑購買自西格瑪奧德里奇公司，括號內(nèi)為相應(yīng)的商品型號。)
[0016]所述步驟3)中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為150mW~300mW，激光波長為355nm。
[0017]所述的層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作。
[0018]所述步驟4)中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含血管內(nèi)皮細胞的溶液，讓血管內(nèi)皮細胞貼附在血管結(jié)構(gòu)表面，或著向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含有血管內(nèi)皮細胞的動物血液。
[0019]所述步驟4)中靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~3天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ；
[0020]動態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的常規(guī)動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:注射器運行分4~10個階段進行，每階段注射I~5ml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為5~60min。
[0021]當(dāng)面向肌肉組織工程制備人工軟組織體時，為滿足光固化水凝膠軟組織支架內(nèi)細胞定向生長的要求，在體外培養(yǎng)過程中給予預(yù)定刺激，促進細胞沿單軸方向定向生長，所述的預(yù)定刺激包括電刺激、力刺激和或流體動力刺激。
[0022]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0023]本發(fā)明針對現(xiàn)有的軟組織工程支架在制造水凝膠支架中存在修復(fù)體積小，及支架血管化、細胞生長氧氣和營養(yǎng)供給等方面不足的問題，采用光固化水凝膠與膠原微球均勻復(fù)合的方式制造光固化水凝膠軟組織支架，并在該支架中制造血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以制造大塊的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體，用以解決大缺損軟組織的修復(fù)問題。本發(fā)明在制造附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體時綜合考慮了膠原微球與細胞的復(fù)合工藝，膠原微球與光固化水凝膠的成型工藝，以及水凝膠血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)制造問題。本發(fā)明在制造光固化水凝膠軟組織支架時選擇的材料為可光固化的材料，其在制造工藝上適用性強，針對所選擇組織的不同，所要求的力學(xué)強度也不同，對光固化材料的選擇性范圍廣泛。選擇光掩模法制造光固化水凝膠軟組織支架，其工藝方法能夠達到一定的制造精度，滿足支架的結(jié)構(gòu)精度要求。本發(fā)明考慮到細胞的生存影響因素，用膠原作為細胞的載體，將細胞包裹在膠原中，解決了在細胞生長空間限制的問題，膠原不僅給細胞提供足夠的粘附、爬行、生存空間，也為細胞的生存提供營養(yǎng)；然后與光固化水凝膠均勻混合，利用可光固化的水凝膠，通過光掩模法在支架內(nèi)部制造出血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在血管網(wǎng)絡(luò)中種植血管內(nèi)皮細胞，促進支架的血管化，血管結(jié)構(gòu)通入培養(yǎng)液為細胞的生存提供營養(yǎng)和氧氣，植入體內(nèi)能夠更好地與體內(nèi)軟組織血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)合，促進體內(nèi)軟組織的修復(fù)與再生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1附帶血管網(wǎng)的人工軟組織體結(jié)構(gòu)，其中(a)為三層的軟組織支架結(jié)構(gòu)，(b)為單層支架內(nèi)血管結(jié)構(gòu)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0026]附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造，是將包埋有細胞的膠原小球與光致水凝膠復(fù)合，經(jīng)光固化成型為多孔立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)體外細胞培養(yǎng)實現(xiàn)人工軟組織體的功能化與血管化，該支架制造過程是:首先，根據(jù)軟組織血管結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散性原理，利用CAD設(shè)計軟件仿生設(shè)計具有三維血管網(wǎng)的人工軟組織結(jié)構(gòu)并進行等距分層(如圖1所示)；再根據(jù)人工軟組織各個分層結(jié)構(gòu)制造出光掩膜板，安裝在曝光機上；配制膠原溶液并與肌細胞、干細胞等混合制成懸液，制備包埋細胞的膠原小球，再與光致水凝膠材料混合；將其與光引發(fā)劑混合獲得的復(fù)合溶液注射到光掩膜板下工作臺，然后進行面曝光，層層累加獲得附帶血管網(wǎng)流道的水凝膠支架。之后，向支架血管結(jié)構(gòu)種植血管內(nèi)皮細胞，使細胞附著在支架血管管道表面。經(jīng)體外靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)多細胞共培養(yǎng)進行組織分化。根據(jù)不同軟組織的需求，為實現(xiàn)人工軟組織(如面向肌肉組織的組織工程支架)內(nèi)細胞形態(tài)的定向性生長要求，在體外給予一定的刺激，實現(xiàn)細胞的定向生長，最終得到具有一定功能的人工軟組織體。
[0027]實施例1
[0028]I)根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果，利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板； [0029]其中設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m，考慮水凝膠的成型工藝，設(shè)計血管直徑為800 μ m ;模型分層厚度與水凝膠成型工藝有關(guān)和血管孔徑大小有關(guān)，設(shè)計軟組織支架模型的分層厚度為800 μ m ;
[0030]各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板；
[0031 ] 2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液；
[0032]其中細胞為成肌細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為I X 15個/ml，混合液中膠原的濃度為lmg/ml，混合液呈中性，其pH值為7.3 ;光固化水凝膠為聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA);光引發(fā)劑為2-羥基-4’ -(2-羥乙基)-2-對羥基苯甲酸甲酯(12959)(購買自西格瑪奧德里奇公司)；光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度為10%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為1% ；
[0033]3)采用打印技術(shù)用注射泵將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，注射的體積是根據(jù)設(shè)計的每層支架的體積決定，注射的體積由程序控制，注射后蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；
[0034]其中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為150mW，激光波長為355nm ；
[0035]層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作；
[0036]4)向帶血管結(jié) 構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體；
[0037]其中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含血管內(nèi)皮細胞的溶液，讓血管內(nèi)皮細胞貼附在血管結(jié)構(gòu)表面；
[0038]靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ；
[0039]動態(tài)培養(yǎng)是將常規(guī)的動態(tài)系統(tǒng)連接起來(包括注射泵、注射器、三通閥、培養(yǎng)液、注射泵控制面板等)，將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)(除注射泵控制面板外)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:選擇注射器為20ml，注射器運行分4個階段進行，每階段注射Iml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為5min。
[0040]實施例2
[0041]I)根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果，利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板；
[0042]其中設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m，考慮水凝膠的成型工藝，設(shè)計血管直徑為1mm ;模型分層厚度與水凝膠成型工藝有關(guān)和血管孔徑大小有關(guān)，設(shè)計軟組織支架模型的分層厚度為1mm ；[0043]各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板；
[0044]2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液；
[0045]其中細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為5X 16個/ml，混合液中膠原的濃度為3mg/ml，混合液呈中性，其pH值為7.4 ;光固化水凝膠為聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma);光引發(fā)劑為1_羥基苯基酮(1184)(購買自西格瑪奧德里奇公司)；光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度為25%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為1% ;
[0046]3)采用打印技術(shù)用注射泵將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，注射的體積是根據(jù)設(shè)計的每層支架的體積決定，注射的體積由程序控制，注射后蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；
[0047]其中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為200mW，激光波長為355nm ；
[0048]層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作；
[0049]4)向帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體；
[0050]其中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含有血管內(nèi)皮細胞的動物血液；
[0051]靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ；
[0052] 動態(tài)培養(yǎng)是將常規(guī)的動態(tài)系統(tǒng)連接起來(包括注射泵、注射器、三通閥、培養(yǎng)液、注射泵控制面板等)，將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)(除注射泵控制面板外)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:選擇注射器為20ml，注射器運行分6個階段進行，每階段注射3ml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為20min ；
[0053]5)當(dāng)面向肌肉組織工程制備人工軟組織體時，為滿足光固化水凝膠軟組織支架內(nèi)細胞定向生長的要求，在體外培養(yǎng)過程中給予預(yù)定刺激(電刺激和力刺激)，促進細胞沿單軸方向定向生長。
[0054]實施例3
[0055]I)根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果，利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板；
[0056]其中設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m，考慮水凝膠的成型工藝，設(shè)計血管直徑為900 μ m ;模型分層厚度與水凝膠成型工藝有關(guān)和血管孔徑大小有關(guān)，設(shè)計軟組織支架模型的分層厚度為900 μ m ;
[0057]各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板；
[0058]2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液；
[0059]其中細胞為衛(wèi)星細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為I X 17個/ml，混合液中膠原的濃度為5mg/ml，混合液呈中性，其pH值為7.5 ;光固化水凝膠為聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-dma);光引發(fā)劑為2，2-二甲氧基-1，2-二苯基甲烷
1-1(1651)(購買自西格瑪奧德里奇公 司)；光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度為30%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為1% ；
[0060]3)采用打印技術(shù)用注射泵將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，注射的體積是根據(jù)設(shè)計的每層支架的體積決定，注射的體積由程序控制，注射后蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；
[0061]其中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為300mW，激光波長為355nm ；
[0062]層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作；
[0063]4)向帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體；
[0064]其中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含血管內(nèi)皮細胞的溶液，讓血管內(nèi)皮細胞貼附在血管結(jié)構(gòu)表面；
[0065]靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ；
[0066]動態(tài)培養(yǎng)是將常規(guī)的動態(tài)系統(tǒng)連接起來(包括注射泵、注射器、三通閥、培養(yǎng)液、注射泵控制面板等)，將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)(除注射泵控制面板外)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:選擇注射器為20ml，注射器運行分10個階段進行，每階段注射5ml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為60min ；
[0067]5)當(dāng)面向肌肉組織工程制備人工軟組織體時，為滿足光固化水凝膠軟組織支架內(nèi)細胞定向生長的要求，在體外培養(yǎng)過程中給予預(yù)定刺激(流體動力刺激)，促進細胞沿單軸方向定向生長。
[0068]實施例4
[0069]I)根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果，利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板；
[0070]其中設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m，考慮水凝膠的成型工藝，設(shè)計血管直徑為850 μ m ;模型分層厚度與水凝膠成型工藝有關(guān)和血管孔徑大小有關(guān)，設(shè)計軟組織支架模型的分層厚度為850 μ m ;
[0071]各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板；
[0072]2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液；
[0073]其中細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為I X 16個/ml，混合液中膠原的濃度為2mg/ml，混合液呈中性，其pH值為7.4 ;光固化水凝膠為聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA);光引發(fā)劑為2-羥基-4’ -(2-羥乙基)-2-對羥基苯甲酸甲酯(12959)(購買自西格瑪奧德里奇公司)；光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度為20%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為1% ；
[0074]3)采用打印技術(shù) 用注射泵將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，注射的體積是根據(jù)設(shè)計的每層支架的體積決定，注射的體積由程序控制，注射后蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架；
[0075]其中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為250mW，激光波長為355nm ；
[0076]層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作；
[0077]4)向帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體；
[0078]其中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含血管內(nèi)皮細胞的溶液，讓血管內(nèi)皮細胞貼附在血管結(jié)構(gòu)表面；
[0079]靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ；
[0080]動態(tài)培養(yǎng)是將常規(guī)的動態(tài)系統(tǒng)連接起來(包括注射泵、注射器、三通閥、培養(yǎng)液、注射泵控制面板等)，將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)(除注射泵控制面板外)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為--溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:選擇注射器為20ml，注射器運行分8個階段進行，每階段注射4ml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為40mino
[0081]實施例4制得的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的彈性模量約為0.92MPa，其強度與面向的軟組織強度有關(guān)。
[0082]本發(fā)明用包埋細胞的膠原小球與光固化水凝膠制造帶有血管網(wǎng)絡(luò)的大塊組織工程軟組織支架，膠原小球包埋細胞，是以膠原作為細胞的生長載體，為細胞提供粘附、爬行、生長的空間，同時為細胞的生存提供一定得營養(yǎng)和氧氣，盡可能實現(xiàn)支架的功能化。利用光固化水凝膠快速成型和光掩模技術(shù)制造附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體，血管網(wǎng)絡(luò)為內(nèi)部細胞提供充分的氧氣和營養(yǎng)，同時也是滿足軟組織自身的結(jié)構(gòu)，并在移植時與體內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)更好的接合。因此本發(fā)明能夠制造出活性及生物兼容性好的大塊人工軟組織體，解決現(xiàn)有的軟組織工程支架在制造水凝膠支架中存在修復(fù)體積小，及支架血管化、細胞生長氧氣和營養(yǎng)供給等方面不足的問題，并解決軟組織大塊缺損修復(fù)中大塊組織工程軟組織支架內(nèi)細胞的存活問題，以及軟組織支 架血管網(wǎng)絡(luò)制造和血管化的問題。
【權(quán)利要求】
1.一種附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)利用CAD軟件設(shè)計出帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，將設(shè)計出的軟組織支架模型逐一等距分層，分層后得到各層支架，然后分別制造出用于制造各層支架的各個光掩膜板； 2)將細胞與膠原溶液混合均勻，使細胞包埋在膠原小球中，得到混合液，然后向混合液中注入光固化水凝膠，再加入光引發(fā)劑，得到混合有細胞的光固化復(fù)合溶液； 3)將配制的光固化復(fù)合溶液注射到工作臺上的無菌操作區(qū)內(nèi)，蓋上光掩膜板，使用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液，然后層層固化累加，獲得帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架； 4)向帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的血管結(jié)構(gòu)中種植血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞附著在血管管道表面，在體外進行靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)，實現(xiàn)多細胞的共培養(yǎng)，得到附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟I)中根據(jù)生物體動脈血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其氧氣和營養(yǎng)的擴散效果來設(shè)計帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型，設(shè)計的帶血管結(jié)構(gòu)的軟組織支架模型中氧氣和營養(yǎng)的擴散距離為200 μ m,血管直徑為800 μ m~Imm ;軟組織支架模型的分層厚度為800 μ m~1mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟I)中各個光掩膜板分別根據(jù)各層支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計加工，具體制造方法是:首先保持硅片表面的清潔和干燥，然后在硅片上涂膠，前烘蒸發(fā)掉膠中的有機溶劑，放入曝光機中曝光，后烘去除駐波 效應(yīng)，最后顯影，把設(shè)計的掩膜圖形制作到硅片上，形成光掩膜板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟2)中的細胞為成肌細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或衛(wèi)星細胞，膠原溶液中的膠原為I型膠原，混合液中細胞的混合密度為I X 15~I X 17個/ml，混合液中膠原的濃度為Img/ml~5mg/ml,混合液的pH值為7.3~7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟2)中的光固化水凝膠為聚乙二醇丙烯酸酯或聚乙二醇甲基丙烯酸酯；光引發(fā)劑為2-羥基-4’ - (2-羥乙基)-2-對羥基苯甲酸甲酯、1-羥基苯基酮或2，2- 二甲氧基-1，2-二苯基甲烷1-1 ;光固化復(fù)合溶液中光固化水凝膠的質(zhì)量濃度為10%~30%，光引發(fā)劑的質(zhì)量濃度為I %。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟3)中采用面曝光技術(shù)固化光固化復(fù)合溶液時的激光功率為150mW~300mW，激光波長為355nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述的層層固化累加是指:按照軟組織支架模型中各層支架的順序從下向上依次制造各層支架，先用最底層支架對應(yīng)的光掩膜版固化制作最底層支架，然后在最底層支架上利用其上一層支架對應(yīng)的光掩膜版，在最底層支架上直接固化制作其上一層支架，依次類推，直至完成整個帶血管結(jié)構(gòu)的光固化水凝膠軟組織支架的制作。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟4)中種植血管內(nèi)皮細胞時直接向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含血管內(nèi)皮細胞的溶液，讓血管內(nèi)皮細胞貼附在血管結(jié)構(gòu)表面，或著向血管結(jié)構(gòu)內(nèi)注射含有血管內(nèi)皮細胞的動物血液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:所述步驟4)中靜態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架浸沒在培養(yǎng)液中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~3天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ； 動態(tài)培養(yǎng)是將種植血管內(nèi)皮細胞的光固化水凝膠軟組織支架放入帶有培養(yǎng)液的常規(guī)動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，將動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7天，細胞培養(yǎng)箱的參數(shù)為:溫度37°C、二氧化碳體積濃度5% ;動態(tài)培養(yǎng)注射設(shè)置為:注射器運行分4~10個階段進行，每階段注射I~5ml培養(yǎng)液，每階段的注射時間為5~60min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、6或8所述的附帶血管網(wǎng)流道的人工軟組織體的制造方法，其特征在于:當(dāng)面向肌肉組織工程制備人工軟組織體時，為滿足光固化水凝膠軟組織支架內(nèi)細胞定向生長的要求，在體外培養(yǎng)過程中給予預(yù)定刺激，促進細胞沿單軸方向定向生長，所述的預(yù)定刺激包括 電刺激、力刺激和或流體動力刺激。
【文檔編號】A61L27/44GK104027847SQ201410280450
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】連芩, 陳成, 李滌塵, 莊佩, 賀健康, 劉亞雄, 靳忠民 申請人:西安交通大學(xué)