鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3d打印制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，首先CT掃描人體損傷處的骨組織，缺失處骨組織可掃描對稱部位的組織結(jié)構(gòu)，獲取損傷骨圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件，建立人體指定部位的骨骼三維模型；通過3D打印系統(tǒng)控制軟件，生成運動軌跡代碼；利用3D打印系統(tǒng)進(jìn)行聚醚醚酮人工骨支架的打印，直至完成整個人工骨支架的制造過程，將干燥好的人工骨支架放入磁控濺射儀的濺射室腔體內(nèi)，用銀膠粘貼到載物臺上，采用磁控濺射技術(shù)在人工骨支架上鍍鉭涂層；鍍鉭涂層完畢，濺射室放氣，取出人工骨支架，將鉭涂層多級孔聚醚醚酮支架進(jìn)行消毒處理后完成全部步驟。本發(fā)明通過3D打印制作人工骨支架，使制作的支架對人體無害。
【專利說明】鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于3D打印【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，屬于生物制造領(lǐng)域，是機(jī)械工程，信息，組織工程，生命科學(xué)交叉的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]骨骼是人體的支架，擔(dān)負(fù)著支持、保護(hù)、承重、造血、貯鈣等功能，是人體重要的組織。臨床上常由創(chuàng)傷、感染、先天性缺陷等原因?qū)е鹿侨睋p，這些是骨科每天都面臨的治療問題。用人工材料制造人工骨，填補(bǔ)骨缺陷位置，是一種十分理想的修復(fù)方式。人工骨是用人工材料制造的人骨替代品。理想的人工骨要具有良好的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)及骨生成作用。隨著對人工骨研究的深入，人工骨的功能不僅僅停留在對骨缺損的替換，而更多的是仿制人體骨骼復(fù)雜的非均質(zhì)多孔結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增大人工骨的生物活性的表面積，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞的粘附作用，保證與人體骨骼的可靠長合。為提升人工骨與成骨細(xì)胞的接觸面積，現(xiàn)有的人工骨大多采用多孔的支架結(jié)構(gòu)。美國的Zimmer公司生產(chǎn)的小梁金屬就是這其中的代表。但是現(xiàn)有的人工骨的多孔支架結(jié)構(gòu)，其孔的結(jié)構(gòu)單一，孔徑固定不變，支架孔隙很難完全貫通，這就導(dǎo)致了制備的人工骨支架與人體骨骼差異大，且生物相容性較差，生物活性低，成骨細(xì)胞難以粘附。現(xiàn)有多種人工骨支架典型的制造方法:纖維粘接技術(shù)，微粒浙濾技術(shù)，氣體發(fā)泡技術(shù)，相分離技術(shù)。這些方法均存在著一定的缺陷:(I)在制造過程中都經(jīng)歷高溫、高壓過程或使用了有機(jī)溶劑，這對生物活性是非常有害的；(2)難以成形200μπι以上的可控孔隙結(jié)構(gòu)；(3)難以保證孔隙之間的完全貫通；(4)難以實現(xiàn)具有孔隙梯度的多級孔結(jié)構(gòu)和材料梯度結(jié)構(gòu)的成形；(5)難以實現(xiàn)個性化制造。
[0003]聚醚醚酮是由英國ICI公司于1977年率先開發(fā)出的一種新型工程塑料，其既具有熱固性塑料的耐高溫性能、優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度(高強(qiáng)度、高彈性模量、高斷裂韌性)、化學(xué)穩(wěn)定性、耐輻射性能，又具有熱塑 性材料的易加工性。聚醚醚酮材料和用于制造人工骨的金屬材料相比，其彈性模量和人骨彈性模量更接近，這就保證了用聚醚醚酮制備的人工骨和人體骨骼彈性模量相近，從而解決了金屬材料人工骨因與人體骨骼彈性模量差距過大而造成的應(yīng)力遮擋、骨吸收、骨發(fā)炎、二次手術(shù)等問題。聚醚醚酮材料其韌性和剛性兼?zhèn)?，特別是它對交變應(yīng)力的優(yōu)良耐疲勞特性，可以制成具有長疲勞壽命的人工骨支架。并且聚醚醚酮具有優(yōu)良生物相容性，無細(xì)胞毒性，是一種臨床可植入材料。
[0004]鉭金屬無細(xì)胞毒性，生物體內(nèi)呈惰性,具有良好生物相容性,生物活性高,其使用歷史可以追溯到20世紀(jì)中期，當(dāng)時有許多醫(yī)療器械就已經(jīng)采用這種材料進(jìn)行制作，例如顱骨成形術(shù)中使用的金屬板，目前鉭金屬植入物已經(jīng)在骨科、顱面部等方面廣泛使用。
[0005]現(xiàn)有人工骨支架孔結(jié)構(gòu)受到加工方式的限制，無法做出較深的、孔隙率可以漸變的多級孔結(jié)構(gòu)。采用3D打印技術(shù)，可以制造出符合人體骨骼微觀結(jié)構(gòu)的，極其復(fù)雜非均質(zhì)的多級孔結(jié)構(gòu)，保證孔隙的貫通和孔隙率的可調(diào)性。現(xiàn)有的人工骨支架制造過程中，均涉及高溫、高壓過程并使用了大量的有機(jī)溶劑，而采用3D打印技術(shù)打印聚醚醚酮所制造的支架，可避免這些缺點，保證人工骨支架植入人體內(nèi)的安全。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，解決了現(xiàn)有材料在人工骨支架制造過程中，大部分涉及高溫高壓過程并使用了大量的對人體有害的有機(jī)溶劑問題，實現(xiàn)了具有較高生物活性，與人體骨骼力學(xué)性能接近，滿足個體差異的人工骨的制備。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下步驟進(jìn)行:
[0008]步驟1、采用CT掃描人體損傷處的骨組織，缺失處骨組織可掃描對稱部位的組織結(jié)構(gòu)，獲取損傷骨組織圖像數(shù)據(jù)；
[0009]步驟2、將掃描獲取的損傷骨組織的圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件，建立人體指定部位的骨骼三維模型；
[0010]步驟3、將骨骼三維模型以STL格式輸入到3D打印系統(tǒng)；
[0011]步驟4、啟動聚醚醚酮3D打印系統(tǒng)，采用聚醚醚酮為原材料，通過溫控系統(tǒng)對3D打印系統(tǒng)噴頭、成形基板、打印室進(jìn)行預(yù)熱，送絲速度設(shè)定為15-25mm/min,層厚設(shè)定為
0.1-0.3mm ;
[0012]步驟5、利用3D打印系統(tǒng)進(jìn)行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一層的打印過程中，運動速度為送絲速度的60%，保證打印件和基板的有效粘接。完成第一層打印后，噴頭上升0.1-0.3mm，進(jìn)行第二層打印，打印過程中先走出一圈較密實的外輪廓，保證生成人工骨支架后有較好的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和外形精度，之后再打印內(nèi)部結(jié)構(gòu)。每完成一層后，噴頭上升
0.1-0.3mm,進(jìn)行下一層的打印,直至完成整個人工骨支架的制造過程。懸空部位的支架底層需采用水溶性支撐材料進(jìn)行打?。?br> [0013]步驟6、將打印室溫度冷卻到室溫，然后再從打印室中取出聚醚醚酮人工骨支架；
[0014]步驟7、將打印好的支架放入超聲波清洗機(jī)中用堿性溶液清洗，直至去除支撐材料，然后分別用丙酮，無水乙醇，去離子水超聲波清洗，高純N2吹干；
[0015]步驟8、將干燥好的人工骨支架放入磁控濺射儀的濺射室腔體內(nèi)，用銀膠粘貼到載物臺上，為采用磁控濺射技術(shù)在人工骨支架上鍍鉭涂層做準(zhǔn)備；
[0016]步驟9、接通電源和冷卻水,抽真空到5χ 10-5-1χKT4Pa ；
[0017]步驟10、打開進(jìn)氣閥，向派射室內(nèi)通入Ar氣。當(dāng)真空計示數(shù)達(dá)到0.3~0.8Pa時，打開各靶對應(yīng)的直流電源，使靶起輝，預(yù)濺射10-20分鐘，清除靶材表面雜質(zhì)及氧化層；
[0018]步驟11、調(diào)節(jié)功率(80-300W)進(jìn)行濺射，待輝光正常后，打開擋板，將樣品加熱，并旋轉(zhuǎn)臺旋轉(zhuǎn)，開始鍍鉭涂層；
[0019]步驟12、鍍鉭涂層時間30min~60min，鍍鉭涂層完畢后，濺射室放氣，關(guān)閉電源，取出人工骨支架，將鉭涂層多級孔聚醚醚酮支架進(jìn)行消毒處理后完成全部步驟。
[0020]進(jìn)一步，步驟I中CT掃描采用醫(yī)用的3D_MicroCT、MRI等其他醫(yī)學(xué)圖像采集設(shè)備。
[0021]進(jìn)一步，步驟4中所使用聚醚醚酮為絲狀聚醚醚酮或粒狀聚醚醚酮，所用的材料為碳纖維增強(qiáng)聚醚醚酮或玻璃纖維聚醚醚酮。
[0022]進(jìn)一步，步驟4中，打印系統(tǒng)噴頭預(yù)熱溫度340°C~365°C ;成形基板預(yù)熱到110°C~130°C ;打印室預(yù)熱到180°C~230°C。
[0023]進(jìn)一步，步驟6中將打印室溫度以5°C -1O0C /min的速度逐漸冷卻到室溫。[0024]進(jìn)一步，人工骨支架鉭金屬涂層的制備，所用的方法可以為化學(xué)氣相沉積法或熱噴涂等物理氣相沉積法。
[0025]本發(fā)明的有益效果是通過3D打印制作人工骨支架，使制作的支架對人體無害。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明Hoechst33342染色觀察細(xì)胞培養(yǎng)24h細(xì)胞核形態(tài)對比圖；
[0027]圖2是本發(fā)明Westernblot方法檢測檢測Bcl_2、Bax和β -actin蛋白表達(dá)圖；
[0028]圖3是本發(fā)明Westernblot方法檢測檢測Bcl_2、Bax蛋白表達(dá)分析圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0030]理想的人工骨支架要具有以下的特點:(I)生物理化性質(zhì)方面:①良好的生物相容性，無不可接受的細(xì)胞毒性、免疫排斥和炎癥反應(yīng)；②高的比表面積、合適的表面理化性質(zhì)，可以吸附并結(jié)合誘導(dǎo)劑、細(xì)胞因子和生長因子等，以利于細(xì)胞的粘附、增殖以及分化。
(2)結(jié)構(gòu)特點方面:①特定的結(jié)構(gòu)外形，以獲得所需組織或器官的形狀合適的孔徑尺寸、高的孔隙率和高度貫通的孔隙結(jié)構(gòu)，以利于氧分、營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的交換，為細(xì)胞的大量種植和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、以及血管和神經(jīng)的內(nèi)生長提供空間和環(huán)境。(3)力學(xué)性能方面:與植入部位組織相匹配的力學(xué)強(qiáng)度，能為細(xì)胞提供合適的微應(yīng)力環(huán)境，并在體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性。
[0031]本發(fā)明結(jié)合醫(yī)用MicroCT和采用3D打印技術(shù),可以實現(xiàn)個性化制造,滿足不同個體的需要。為增強(qiáng)聚醚醚酮人工骨支架植入人體后骨細(xì)胞生長、增殖和成骨分化的需要，采用物理氣相沉積(PVD)技術(shù)將鉭涂覆于聚醚醚酮3D打印人工骨支架表面，提高人工骨支架的生物相容性，增強(qiáng)骨支架與人體軟/硬組織的結(jié)合強(qiáng)度。
[0032]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0033]步驟1、采用醫(yī)用CT掃描人體損傷處的骨組織，缺失處骨組織可掃描對稱部位的組織結(jié)構(gòu)，獲取損傷骨組織圖像數(shù)據(jù)。所用的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)采集可以用3D-Micix)CT、MRI等其他醫(yī)學(xué)圖像采集設(shè)備。
[0034]步驟2、將掃描獲取的損傷骨圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件，Mimics軟件是醫(yī)學(xué)圖像(如CT、MRI圖像)和CAD設(shè)計之間的橋梁。通過軟件測量缺損骨骼的數(shù)據(jù)以確定人工骨支架的尺寸，根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果和測量結(jié)果，通過對比增強(qiáng)、平滑處理等創(chuàng)建缺損骨骼的三維模型，根據(jù)該三維模型制備聚醚醚酮多級孔人工骨支架。
[0035]步驟3、將骨骼三維模型以STL格式輸入到3D打印系統(tǒng)控制軟件中，軟件根據(jù)參數(shù)設(shè)置，將三維模型的數(shù)據(jù)進(jìn)行分層切片處理，并將每層的數(shù)據(jù)變換成運動軌跡代碼。
[0036]步驟4、啟動聚醚醚酮3D打印系統(tǒng)，采用聚醚醚酮為原材料，通過溫控系統(tǒng)將3D打印系統(tǒng)噴頭預(yù)熱到T1 (340°C~365°C )，成形基板預(yù)熱到T2 (110°C~130°C )，打印室預(yù)熱到T3(180°C~230°C )。 送絲速度設(shè)定為15-25mm/min，層厚設(shè)定為0.1-0.3mm。聚醚醚酮為絲狀聚醚醚酮原材料但不局限為絲狀，也可以是粒狀聚醚醚酮原材料或其他，所用的材料可以為碳纖維增強(qiáng)聚醚醚酮或玻璃纖維聚醚醚酮。
[0037]步驟5、采用3D打印機(jī)進(jìn)行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一層的打印過程中，運動速度為送絲速度的60%，保證打印件和成形基板的有效粘接。完成第一層打印后，噴頭上升0.1-0.3mm，進(jìn)行第二層打印，打印過程中先走出一圈較密實的外輪廓，保證生成人工骨支架后有較好的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和外形精度，之后再在內(nèi)圈打印出具有多級孔隙率的微結(jié)構(gòu)。每完成一層后，噴頭上升0.1-0.3mm，進(jìn)行下一層的打印，直至完成整個人工骨支架的制造過程。懸空部位的支架底層需采用水溶性支撐材料進(jìn)行打印，起到支撐的作用，以保證下一層支架的順利成形。
[0038]步驟6、將打印室溫度T3由180°C~230°C以5°C _10°C /min的速度逐漸冷卻到室溫，然后再從打印室中取出多級孔聚醚醚酮人工骨支架。
[0039]步驟7、取出打印完的支架，放入超聲波清洗機(jī)中用堿性溶液清洗，直至去除支撐材料。將去掉支撐的人工骨支架先后在丙酮和乙醇溶液中超聲清洗20min，再用去離子水超聲清洗20min，最后用高純N2吹干。
[0040]步驟8、用乙醇擦拭磁控濺射儀的濺射室，安裝鉭靶，將干燥好的人工骨支架放入磁控濺射儀的濺射室腔體內(nèi)，用銀膠粘貼到載物臺上，為采用磁控濺射技術(shù)在人工骨支架上鍍鉭涂層做準(zhǔn)備。
[0041]步驟9、分子泵、各磁控靶接通冷卻水，接通電源，壓縮空氣泵工作，啟動機(jī)械泵，預(yù)抽濺射室至4Pa，復(fù)合真空計示數(shù)到達(dá)4Pa時，啟動分子泵，抽至5xl0_5~1χ10_4 (大概半小時)，準(zhǔn)備鍍鉭涂層。
[0042]步驟10、打開氣瓶,打開進(jìn)氣閥，向派射室內(nèi)通入Ar氣，當(dāng)真空計示數(shù)達(dá)到0.3~
0.8Pa時，打開各靶對應(yīng)的直流電源，使靶起輝，預(yù)濺射10~20分鐘，清除靶材表面雜質(zhì)及
氧化層。
[0043]步驟11、調(diào)節(jié)不同功率(80~300W)進(jìn)行濺射，待輝光正常后，打開擋板，樣品加熱，旋轉(zhuǎn)臺旋轉(zhuǎn)，鍍鉭涂層開始，此后鍍膜時間、樣品換位均由計算機(jī)控制。鍍鉭涂層30min~60min,由涂層厚度確定。
[0044]步驟12、鍍鉭涂層完畢，濺射室放氣完畢，關(guān)閉電源，取出人工骨支架，將鉭涂層多級孔聚醚醚酮支架進(jìn)行消毒處理，完成全部步驟。
[0045]上述本發(fā)明的人工骨支架鉭金屬涂層的制備，所用的方法可以為化學(xué)氣相沉積法或熱噴涂等物理氣相沉積法。本發(fā)明制造的多級孔聚醚醚酮人工骨支架，通過改變孔隙率，調(diào)節(jié)人工骨支架彈性模量，使之與人體皮質(zhì)骨彈性模量更好的匹配。針對現(xiàn)有人工骨支架機(jī)械性能方面的缺陷，采用新型特種工程塑料聚醚醚酮作為本發(fā)明制備人工骨支架材料，解決金屬材料(如鈦合金)制備的人工骨支架彈性模量較人體骨骼有較大差異所導(dǎo)致的，植入人體后產(chǎn)生應(yīng)力遮擋、骨吸收、骨發(fā)炎等問題；解決現(xiàn)有材料制備的人工骨支架疲勞強(qiáng)度不足、易老化、易產(chǎn)生斷裂破壞等問題。本發(fā)明的人工骨支架可以通過改變孔隙率，調(diào)節(jié)人工骨支架彈性模量，使之與人體骨骼彈性模量更好的匹配，韌性和強(qiáng)度高。本發(fā)明采用磁控濺射技術(shù)，將鉭涂覆在人工骨支架的表面，提高了人工骨支架的生物相容性。本方法的模型更接近人體骨骼生理解剖結(jié)構(gòu)，本發(fā)明采用的聚醚醚酮人工骨支架的強(qiáng)度更高，且采用了生物相容性非常好的惰性材料鉭進(jìn)行表面涂覆，具有非常好的強(qiáng)度和生物相容性。
[0046]以下為具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明:
[0047]實例1:
[0048] 步驟1、采用醫(yī)用CT掃描人體損傷處的骨組織，缺失處骨組織可掃描對稱部位的組織結(jié)構(gòu)，獲取損傷骨組織圖像數(shù)據(jù)。所用的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)采集可以用3D-Micix)CT、MRI等其他醫(yī)學(xué)圖像采集設(shè)備。
[0049]步驟2、將掃描獲取的損傷骨外形的圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件，Mimics軟件是醫(yī)學(xué)圖像(如CT、MRI圖像)和CAD設(shè)計之間的橋梁。通過軟件測量缺損骨骼的數(shù)據(jù)以確定人工骨支架的尺寸，根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果和測量結(jié)果，通過對比增強(qiáng)、平滑處理創(chuàng)建缺損骨骼的三維模型，根據(jù)該三維模型制備聚醚醚酮多級孔人工骨支架。
[0050]步驟3、將骨骼三維模型以STL格式輸入到3D打印系統(tǒng)中，軟件根據(jù)參數(shù)設(shè)置，將三維模型的數(shù)據(jù)進(jìn)行分層切片處理，并將每層的數(shù)據(jù)，變換成運動軌跡代碼。
[0051]步驟4、啟動聚醚醚酮3D打印機(jī)，采用直徑為1.65mm絲狀聚醚醚酮為原材料，通過溫控系統(tǒng)將3D打印系統(tǒng)噴頭預(yù)熱到360°C，成形基板預(yù)熱到120°C，打印室預(yù)熱到200°C。送絲速度設(shè)定為25mm/min,層厚設(shè)定為0.3mm。
[0052]步驟5、利用3D打印機(jī)進(jìn)行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一層的打印過程中，運動速度為送絲速度的60%，保證打印件和成形基板的有效粘接。完成第一層打印后，噴頭上升0.3mm，進(jìn)行第二層打印，打印過程中先打印出一圈較密實的外輪廓，保證生成人工骨支架后有較好的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和外形精度。之后再在內(nèi)圈打印出具有多級孔隙率的微結(jié)構(gòu)。每完成一層后，噴頭上升0.3mm，進(jìn)行下一層的打印，直至完成整個人工骨支架的制造過程。懸空部位的支架底層需采用水溶性支撐材料進(jìn)行打印，起到支撐的作用，以保證下一層支架的順利成形。
[0053]步驟6、將打印室溫度T3由200°C以8°C /min的速度逐漸冷卻到室溫，然后再從打印室中取出多級孔 聚醚醚酮人工骨支架。
[0054]步驟7、取出打印完的支架，放入超聲波清洗機(jī)中用堿性溶液清洗，直至去除掉支撐材料。將去掉支撐的聚醚醚酮人工骨支架先后在丙酮和乙醇溶液中超聲清洗20min，再用去離子水超聲清洗20min，最后用高純N2吹干。
[0055]步驟8、用乙醇擦拭磁控濺射儀的濺射室，安裝鉭靶，將干燥好的人工骨支架放入磁控濺射儀的濺射室腔體內(nèi)，用銀膠粘貼到載物臺上，為采用磁控濺射技術(shù)在人工骨支架上鍍鉭涂層做準(zhǔn)備。
[0056]步驟9、分子泵、各磁控靶接通冷卻水，接通電源，壓縮空氣泵工作，啟動機(jī)械泵，預(yù)抽濺射室至4Pa，復(fù)合真空計示數(shù)到達(dá)4Pa時，啟動分子泵，抽至5xl0_5，準(zhǔn)備鍍鉭涂層。
[0057]步驟10、打開氣瓶,打開進(jìn)氣閥，向派射室內(nèi)通入Ar氣，當(dāng)真空計示數(shù)達(dá)到0.6Pa時，打開各靶對應(yīng)的直流電源，使靶起輝，預(yù)濺射10分鐘，清除靶材表面雜質(zhì)及氧化層。
[0058]步驟11、調(diào)節(jié)功率150W進(jìn)行濺射，待輝光正常后，打開擋板，樣品加熱，旋轉(zhuǎn)臺旋轉(zhuǎn)，鍍鉭涂層開始，此后鍍膜時間、樣品換位均由計算機(jī)控制，鍍鉭涂層45min。
[0059]步驟12、鍍鉭涂層完畢，濺射室放氣完畢，關(guān)閉電源，取出人工骨支架，將鉭涂層多級孔聚醚醚酮支架進(jìn)行消毒處理。
[0060]對本發(fā)明的3D打印人工骨支架進(jìn)行檢測實驗:
[0061]實驗1:聚醚醚酮3D打印支架對細(xì)胞形態(tài)的影響
[0062]HoeChst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。在細(xì)胞發(fā)生各種形式的死亡時，細(xì)胞都會出現(xiàn)細(xì)胞核形態(tài)的改變。Hoechst33342染色可以直觀的觀察到細(xì)胞中細(xì)胞核的形態(tài)。圖1中，對照組和打印支架組分別培養(yǎng)24h后進(jìn)行Hoechst33342染色，從圖上可以看出，與對照組相比，聚醚醚酮3D打印支架作用細(xì)胞24h，細(xì)胞核形態(tài)無明顯影響，也就是細(xì)胞生長狀態(tài)正常。
[0063]實驗方法:a、離心收集細(xì)胞樣品于1.5ml離心管內(nèi)，加入0.5ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定10分鐘(可4°C過夜)。b、離心去固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘。C、最后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。d、稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動。e、均勻滴上
0.5mlHoechst33342染色液，染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。f、用PBS或
0.9% NaCl洗兩遍，每次3分鐘。g、滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。h、熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。
[0064]實驗2 =Westernblot檢測聚醚醚酮3D打印支架對細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響,如圖2所示，Westernblot方法檢測Bcl_2、Bax蛋白表達(dá)圖，圖3為Westernblot方法檢測檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)分析圖。Bcl_2、Bax是細(xì)胞凋亡(細(xì)胞死亡的一種方式)的標(biāo)志性蛋白，如果發(fā)生凋亡，隨著時間的變化，應(yīng)該出現(xiàn)的是Bcl-2逐漸降低，Bax逐漸升高，本實驗在鉭涂層多孔聚醚醚酮人工骨支架作用的48h內(nèi)，未出現(xiàn)Bax/Bcl-2比值增高的現(xiàn)象，初步說明，聚醚醚酮對細(xì)胞沒有毒性。
[0065]實驗方法:1.收集蛋白樣品。在培養(yǎng)瓶中用加入3ml4°C預(yù)冷的PBS，搖動lmin，棄去洗液，重復(fù)三次。加入400 μ I含PMSF的裂解液，在冰上裂解30min。將裂解完成的細(xì)胞和裂解液離心5min，將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于零下20°C保存。
2.電泳。電泳時間一般4~5h，電壓為40V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。3.轉(zhuǎn)膜。4.一抗孵育。室溫下孵育I~2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次IOmin ;再用TBS洗一次，lOmin。5.二抗孵育。室溫下孵育I~2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次IOmin ;再用TBS洗一次，lOmin，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。6.化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。7.凝膠圖象分析。
[0066]實驗3 =SEM表征分析聚醚醚酮3D打印支架附著細(xì)胞形態(tài)。
[0067]實驗方法:a、用0.1mol/L的PBS緩沖溶液將培養(yǎng)細(xì)胞的材料沖洗三次，每次IOmin ;b、用2.5%的戊二醛固定2h ;c、固定后用PBS緩沖溶液沖洗三次，每次IOmin ;d、乙醇梯度脫水(10%，20%，40%，70%每次 5min，90% IOmin, 100% 15min) ;e、在干燥塔中自然干燥2h ;f、真空干燥2h ;g、離子濺射儀噴金后用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。
[0068] 由上述實驗看出，本發(fā)明采用3D打印技術(shù)制備的鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架具有優(yōu)良生物相容性，無毒無害。
【權(quán)利要求】
1.鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行: 步驟1、 CT掃描人體損傷處的骨組織，缺失處骨組織可掃描對稱部位的組織結(jié)構(gòu)，獲取損傷骨組織圖像數(shù)據(jù)； 步驟2、將掃描獲取的損傷骨的圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件，建立人體指定部位的骨骼二維模型； 步驟3、將骨骼三維模型以STL格式輸入到3D打印系統(tǒng)中，生成運動軌跡代碼； 步驟4、啟動聚醚醚酮3D打印系統(tǒng)，采用聚醚醚酮為原材料，通過溫控系統(tǒng)對3D打印系統(tǒng)噴頭、成形基板、打印室進(jìn)行預(yù)熱，送絲速度設(shè)定為15-25mm/min,層厚設(shè)定為0.1-0.3mm ； 步驟5、利用3D打印系統(tǒng)進(jìn)行聚醚醚酮人工骨支架的打印，在第一層的打印過程中，運動速度為送絲速度的60%，保證打印件和基板的有效粘接，完成第一層打印后，噴頭上升0.1-0.3mm,進(jìn)行第二層打印，打印過程中先走出一圈較密實的外輪廓，保證生成人工骨支架后有較好的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和外形精度，之后再打印內(nèi)部結(jié)構(gòu)；每完成一層后，噴頭上升0.1-ο.3mm,進(jìn)行下一層的打印,直至完成整個人工骨支架的制造過程；懸空部位的支架底層需采用水溶性支撐材料進(jìn)行打?。? 步驟6、將打印室溫度冷卻到室溫，然后再從打印室中取出聚醚醚酮人工骨支架； 步驟7、將打印好的支架放入超聲波清洗機(jī)中用堿性溶液清洗，直至去除支撐材料，然后分別用丙酮，無水乙醇，去離子水超聲波清洗，高純N2吹干； 步驟8、將干燥好的人工骨支架放入磁控濺射儀的濺射室腔體內(nèi)，用銀膠粘貼到載物臺上，為采用磁控濺射技術(shù)在人工骨支架上鍍鉭涂層做準(zhǔn)備； 步驟9、接通電源和冷卻水，抽真空到5xl0_5~lxlO_4Pa ； 步驟10、打開進(jìn)氣閥，向派射室內(nèi)通入Ar氣當(dāng)真空計示數(shù)達(dá)到0.3~0.8Pa,打開各革巴對應(yīng)的直流電源，使靶起輝，預(yù)濺射10-20分鐘，清除靶材表面雜質(zhì)及氧化層； 步驟11、調(diào)節(jié)功率(80-300W)進(jìn)行濺射，待輝光正常后，打開擋板，樣品加熱，旋轉(zhuǎn)臺旋轉(zhuǎn)，鍍鉭涂層開始； 步驟12、鍍鉭涂層時間30min~60min，鍍鉭涂層完畢，濺射室放氣，關(guān)閉電源，取出人工骨支架，將鉭涂層多級孔聚醚醚酮支架進(jìn)行消毒處理后完成全部步驟。
2.按照權(quán)利要求1所述鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于:所述步驟I中CT掃描采用醫(yī)用的3D-Micix)CT、MRI等其他醫(yī)學(xué)圖像采集設(shè)備。
3.按照權(quán)利要求1所述鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于:所述步驟4中所使用聚醚醚酮為絲狀聚醚醚酮或粒狀聚醚醚酮，所用的材料為碳纖維增強(qiáng)聚醚醚酮或玻璃纖維聚醚醚酮。
4.按照權(quán)利要求1所述鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于:所述步驟4中，打印系統(tǒng)噴頭預(yù)熱溫度340°C~365°C ;成形基板預(yù)熱到110°C~130。。;打印室預(yù)熱到180°C~ 2300C ο
5.按照權(quán)利要求1所述鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于:所述步驟6中將打印室溫度以5°C -1O0C /min的速度逐漸冷卻到室溫。
6.按照權(quán)利要求1所述鉭涂層多級孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，其特征在于:所述的人工骨支架鉭金屬涂層的制備，所用的方法可以為化學(xué)氣相沉積法或熱噴涂等物理氣相沉積法。
【文檔編號】A61L27/30GK103977451SQ201410209408
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】吳文征, 趙繼, 耿鵬, 孫慧超, 趙帝 申請人:吉林大學(xué)