抗人il-4受體的高親和性人抗體的制作方法
【專利摘要】一種分離的人抗體或其抗體片段，其以高親和性(KD)與人白細(xì)胞介素-4受體α(hIL-4Rα)結(jié)合，能夠阻斷hIL-4和hIL-13的活性。
【專利說明】抗人IL-4受體的高親和性人抗體
[0001]本申請為2009年10月27日提交的、發(fā)明名稱為“抗人IL_4受體的高親和性人抗體”的PCT申請PCT/US2009/062168的分案申請，所述PCT申請進(jìn)入中國國家階段的日期為2011 年 4 月 28 日，申請?zhí)枮?200980143007.6。
[0002]發(fā)明背景
[0003]白細(xì)胞介素-4(IL_4，又稱為B細(xì)胞刺激因子或BSF-1)起初是以其響應(yīng)低濃度抗表面免疫球蛋白抗體而刺激B細(xì)胞增殖的能力而得到表征。IL-4已被證明具有廣泛的生物活性，包括對T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞的生長刺激。IL-4誘導(dǎo)II類主要組織相容性復(fù)合物分子在靜息B細(xì)胞中的表達(dá)，并通過受激B細(xì)胞增強(qiáng)IgE和IgGl同種型的分泌。
[0004]IL-4的生物活性是由特定的細(xì)胞表面IL-4受體介導(dǎo)的。人IL_4受體a (hIL_4R)(SEQ ID NO:274)在例如美國專利 5，599，905,5, 767，065和 5，840，869 中均有描述。hIL_4R抗體在美國專利5，717，072和7，186，809中均有描述。
[0005]生產(chǎn)可作為人治療劑抗體的方法包括產(chǎn)生嵌合抗體和人源化抗體(參閱如美國專利6，949，245)。參閱，如W094/02602和美國專利6，596，541，其中描述了產(chǎn)生能生成人抗體的非人轉(zhuǎn)基因小鼠的一些方法。[0006]美國專利5，714，146,5, 985，280和6，716，587描述了使用hIL_4R抗體的一些方法。
[0007]發(fā)明概述
[0008]在第一個方面，本發(fā)明提供了與人白細(xì)胞介素-4受體(hIL_4R)特異性結(jié)合的人抗體，首選的是重組人抗體。這些人抗體的特征是以高親和性與hIL-4R結(jié)合，并能夠中和hIL-4的活性。在一些具體的實施方案中，這些人抗體能夠阻斷與hIL-4R結(jié)合的hIL_13/hIL-13Rl復(fù)合物，從而抑制hIL-13的信號發(fā)送。這些抗體可以是全長抗體(如IgGl或IgG4抗體)或者可能僅包含抗原結(jié)合部分(如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可被修飾而實現(xiàn)其功能，如消除殘余效應(yīng)子功能(Reddy等人(2000) J.1mmunol.164:1925-1933)。
[0009]在一個一般的實施方案中，本發(fā)明提供了一種與hIL_4R(SEQ ID NO:274)特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，經(jīng)單體和二聚體表面等離振子共振分析，Kd為約300pM或以下。在一個更具體的實施方案中，此抗體或其抗原結(jié)合部分顯示的Kd為約200pM或以下、約150pM或以下、約IOOpM或以下，或約50pM。在各種實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段阻斷了 hIL-4活性，經(jīng)螢光素酶生物分析測定，IC5tl為約IOOpM或以下。在一些更具體的實施方案中，經(jīng)STAT6螢光素酶生物分析測定，抗體或抗原結(jié)合片段顯示出IC5tl為約50pM或以下，約30pM或以下，或約25pM或以下。在各種實施方案中，此抗體或抗原結(jié)合片段阻斷了hIL-13活性，經(jīng)STAT6螢光素酶生物分析測定，IC50為約IOOpM或以下，約90pM或以下，約50pM或以下，或約20pM或以下。
[0010]在第二個方面，本發(fā)明的抗體包含選自以下一組序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)序列:SEQ ID NO:2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258 和 262，或與其基本上相似的序列。[0011]在第三個方面，本發(fā)明的抗體包含選自以下一組序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)序列:SEQ ID NO:10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260 和 264，或與其基本上相似的序列。
[0012]在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含選自以下一組序列的HCVR和LCVR 序列對(HCVR/LCVR):SEQ ID NO:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260 以及 262/264。在一個優(yōu)選的實施方案中，此抗體或抗體片段包含HCVR/LCVR序列對SEQ ID NO: 162/164、210/212或18/20。含有這些HCVR/LCVR序列對的代表性抗體包括被命名為H4H098P(SEQ ID NO: 162/164)、H4H083P (SEQID NO:210/212)以及 H4H095P (SEQ ID NO:18/20)的抗體。
[0013]在第四個方面，本發(fā)明提供了編碼HCVR的核酸分子，其中該核酸分子是一個選自以下序列的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257 和 261，或
其至少具有95 %同源性的基本上相同的序列。
[0014]在第五個方面，本發(fā)明提供了編碼LCVR的核酸分子，其中該核酸分子是選自以下序列的序列:SEQ ID NO:9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259 和 263，或其至少具
有95%同源性的基本上相同的序列。
[0015]在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含由選自以下序列的核苷酸序列對所編碼的 HCVR和 LCVR:SEQ ID NO:1/9、17/19、21/22、25/33、41/43、45/47、49/57、65/67、69/71、73/81、89/91、93/95、97/105、113/115、117/119、121/129、137/139、141/143、145/153、161/163、165/167、169/177、185/187、189/191、193/201、209/211、213/215、217/225、233/235、237/239、241/249、257/259和261/263。在一個優(yōu)選的實施方案中，此抗體或抗體片段包含由選自以下序列的核酸序列編碼的HCVR/LCVR序列:SEQ ID NO:161/163,209/211和17/19。在一個更優(yōu)選的實施方案中，此抗體或抗體片段包含由核酸序列SEQ IDNO:161/163 編碼的 HCVR/LCVR。
[0016]在第六個方面，本發(fā)明提供了一種包含HCDR3和IXDR3的抗體或抗原結(jié)合片段，其中 HCDR3 結(jié)構(gòu)域選自以下一組序列:SEQ ID NO:8、32、56、80、104、128、152、176、200、224和 248 ;LCDR3 結(jié)構(gòu)域選自以下一組序列:SEQ ID NO:16、40、64、88、112、136、160、184、208、232和256。在一個優(yōu)選的實施方案中，HCDR3/LCDR3序列為SEQ ID NO: 152/160、8/16或200/208。在一個更優(yōu)選的實施方案中，HCDR3和LCDR3序列為SEQ ID NO:152和160。
[0017]在另一個實施方案中，此抗體或抗體片段進(jìn)一步包含選自以下一組序列的HCDRl序列:SEQ ID NO:4、28、52、76、100、124、148、172、196、220 和 244，或與其基本上相似的序列；選自以下一組序列的 HCDR2 序列:SEQ ID NO:6、30、54、78、102、126、150、174、198、222和246，或與其基本上相似的序列；選自以下一組序列的HCDR3序列:SEQ ID NO:8、32、56、80、104、128、152、176、200、224和248，或與其基本上相似的序列；選自以下一組序列的LCDRl 序列:SEQ ID NO: 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228 和 252，或與其基本上相似的序列；選自以下一組序列的 LCDR2 序列:SEQ ID NO:14、38、62、86、110、134、158、182、206,230和252，或與其基本上相似的序列，以及選自以下一組序列的IXDR3序列:SEQ IDNO:16、40、64、88、112、136、160、184、208、232和256，或與其基本上相似的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，此抗體或抗原結(jié)合片段包含HCDR序列SEQ ID NO: 148、150和152以及LCDR 序歹Ij SEQ ID NO: 156、158 和 160 ；HCDR 序列 SEQ ID NO:4、6 和 8 和 LCDR 序列 SEQ IDNO: 12、14 和 16 ;以及 HCDR 序列 SEQ ID NO: 196、198 和 200 和 LCDR 序列 SEQ ID NO:204、206 和 208。
[0018]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了抗hIL_4R抗體或其抗原結(jié)合片段，它們含有選自以下一組序列的 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列:SEQ ID NO:148/150/152/156/158/160 ；4/6/8/12/14/16 ;以及 196/198/200/204/206/208。含有這些HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列的代表性抗體包括被命名為 H4H098P (SEQ IDNO:148/150/152/156/158/160)、H4H083P (SEQ ID NO: 196/198/200/204/206/208)，以及H4H095P(SEQ ID NO:4/6/8/12/14/16)的抗體。
[0019]在第七個方面，本發(fā)明的特點是包含HCDR3和IXDR3的人抗體或抗體片段，其中HCDR3由選自以下一組序列的核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:7、31、55、79、103、127、151、175、199、223和247，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；且^:01?3由選自以下一組序列的核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:15、39、63、87、111、135、159、183、207、231 和 255，或其至少具有95 %同源性的基本上相同的序列。
[0020]在另一個實施方案中，本發(fā)明的特點是人抗體或抗體片段，其包含由選自以下序列的核苷酸序列編碼的 HCDRl 結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:3、27、51、75、99、123、147、171、195、219和243，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由選自以下序列的核苷酸序列編碼的HCDR2 結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:5、29、53、77、101、125、149、173、197、221 和 245，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由選自以下序列的核苷酸序列編碼的HCDR3結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:7、31、55、79、103、127、151、175、199、223 和 247，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由選自以下序列的核苷酸序列編碼的IXDRl結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:11、35、59、83、107、131、155、179、203、227和251，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由選自以下序列的核苷酸序列編碼的LCDR2結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:13、37、61、85、109、133、157、181、205、229和253，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；以及由選自以下序列的核苷酸序列編碼的 LCDR3 結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:15、39、63、87、111、135、159、183、207、231和255，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含由核苷酸序列SEQ ID NO:147、149、151、155、157和159;195、197、199,203,205 和 207 ;以及 3、5、7、11、13 和 15 編碼的 HCDR 和 LCDR 序列。
[0021]在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗hIL_4R抗體或抗原結(jié)合片段包含含有SEQID NO:162所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO:164所示氨基酸序列的LCVR，且其特征為:在25°C和37°C時，Kd值分別為約IOOpM或以下(單體底物)或70pM或以下(二聚體底物)；KD值分別為約160pM或以下(單體底物)或40pM或以下(二聚體底物)；以及IC50值為約1OpM或以下(25pM 二聚體底物)或約IOOpM或以下(200pM單體底物)，它既能阻斷hIL-4也能阻斷hIL-13的活性，其I0為約30pM或以下(由生物分析法獲得)并可與猴IL-4R交叉反應(yīng)。[0022]在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗hIL_4R抗體或抗原結(jié)合片段包含含有SEQID NO: 18所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO: 20所示氨基酸序列的LCVR，其特征為=Kd值為約450pM或以下(單體或二聚體底物)，IC5tl為約或40pM或以下(25pM 二聚體底物)或約IOOpM或以下(200pM單體底物)，它既能阻斷hIL-4也能阻斷hIL_13的活性，其IC5tl為約IOOpM或以下(由生物分析法獲得)。
[0023]在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗hIL_4R抗體或抗原結(jié)合片段包含含有SEQID NO:210所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO:212所示氨基酸序列的LCVR，其特征為:分別在25°C和37°C時，Kd值為約50pM或以下(單體底物)或30pM或以下(二聚體底物)；KD值為約200pM或以下(單體底物)或40pM或以下(二聚體底物)；以及IC5tl值為約IOpM或以下(25pM 二聚體底物)或約90pM或以下(200pM單體底物)，它既能阻斷hIL_4也能阻斷hIL-13的活性，其IC5tl為約25pM或以下(由生物分析法獲得)且不與猴IL-4R交叉反應(yīng)。
[0024]在第八個方面，本發(fā)明的特點是與hIL_4R特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，該抗體或抗原結(jié)合片段包含三個重鏈和三個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2、LCDR3)，其中 HCDRl 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或Ser ；X7 = Tyr ;且 X8 = Ala 或 Gly ;HCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO:266)的氨基酸序列，其中 X1 = IIe 或 Leu, X2 = Ser, X3 = Gly, Tyr 或 Arg, X4 = Ser> Asp或 Thr, X5 = Gly 或 Ser, X6 = Gly、Ser 或 Val, X7 = Ser 或 Asn,且 X8 = Thr> Lys 或 Ile ;HCDR3 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xic1-Xi1-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ IDNO:267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = L`ys, X3 = Asp、Glu 或 Trp, X4 = Gly 或 Arg,X5 = Leu> Thr 或 Arg, X6 = Gly、Arg 或 Ser, X7 = Ile 或 Gly, X8 = Thr> Phe 或 Tyr, X9 =He, Asp 或 Phe, X10 = Arg、Tyr 或 Asp, X11 = Pro> Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 =Val 或缺失；LCDRl 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xic1-X11 (SEQ ID NO:268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp, Ser 或 Val, X3 = Ile 或 Leu, X4 = Ser> Leu 或 Asn, X5=AsruTyr 或 lie,X6 = Trp>Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3 (SEQ ID NO:269)的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或Val，X2 =Ala或Gly，且X3 = Ser jLCDR3包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 =Gin, X3 = Ala 或 Tyr, X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr> Phe 或 His, X7 = Pro, X8=Tyr, Ile 或 Trp,且 X9 = Thr0
[0025]在一個更具體的實施方案中，HCDRl包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDNO:265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Arg ；X6 = Asp或 Ser ；X7 = Tyr ;且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDNO:266)的氨基酸序列，其中 X1 = He, X2 = Ser, X3 = Gly 或 Tyr, X4 = Ser 或 Thr, X5 =Gly, X6 = Gly 或 Ser，X7 = Asn,且 X8 = Thr 或 Lys ；HCDR3 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xi1-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO:267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala，X2 = Lys, X3 = Asp 或 Glu, X4 = Gly 或 Arg, X5 = Leu 或 Arg, X6 = Gly 或 Ser, X7 = Ile 或Gly, X8 = Thr 或 Phe, X9 = Ile 或 Asp, X10 = Arg 或 Tyr, X11 = Pro 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且 X18 = Val 或缺失；LCDR1 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xic1-X11 (SEQID NO:268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Ser 或 Val, X3 = Ile 或 Leu, X4 = Leu 或Asn, X5 = Asn 或 Tyr, X6 = Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3 (SEQ ID NO:269)的氨基酸序列，其中X1 = Leu或Ala，X2 = Ala或Gly和X3 = Ser ;且LCDR3包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 = Gln,X3 = Ala 或 Tyr, X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr 或Trp,且 X9 = Thr。[0026]在另一個更具體的實施方案中，HCDRl包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQID NO:265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp ；X7 = Tyr ;且 X8 = Ala ；HCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO:266)的氨基酸序列，其中 X1 = He 或 Leu, X2 = Ser, X3 = Gly 或 Arg, X4 = Ser 或 Thr, X5=Gly 或 Ser,X6 = Gly 或 Val,X7 = Ser 或 Asn,且 X8 = Thr 或 lie ；HCDR3 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xi1-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO:267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Asp 或 Trp, X4 = Gly 或 Arg, X5 = Leu 或 Thr, X6 = Arg 或Ser,X7 = Ile 或 Gly,X8 = Thr 或 Tyr,X9 = Ile 或 Phe,X1。= Arg 或 Asp,X11 = Pro>Tyr 或缺失，X12 = Arg或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 = Val或缺失；LCDR1包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO:268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp 或 Ser，X3 = Ile 或Leu,X4 = Ser 或 Leu,X5 = Tyr 或 lie,X6 = Trp 或 Ser ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr或缺失；X1Q = Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失；LCDR2包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3GEQID NO:269)的氨基酸序列，其中 X1 = Leu 或 Val，X2 = Ala 或 Gly，且 X3 = Ser ;且 LCDR3包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met, X2 = Gin, X3 = Ala, X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr 或 Phe, X7 = Pro, X8=Tyr 或 lie,且 X9 = Thr。
[0027]在第九個方面，本發(fā)明提供了含有得自HCVR和LCVR對的HCDR1/HCDR2/HCDR3/IXDR1/IXDR2/IXDR3序列的抗體或抗原結(jié)合片段，其中HCVR/LCVR序列選自以下一組序列:SEQ ID NO:162/164、210/212和18/20。在一個更具體的實施方案中，重鏈和輕鏈CDR序列為包含在HCVR SEQ ID NO:162和LCVR SEQ ID NO:164中的序列。在另一個更具體的實施方案中，重鏈和輕鏈⑶R序列為包含在HCVR SEQ ID NO: 18和LCVR SEQ ID N0:20中的序列。在另一個具體的實施方案中，重鏈和輕鏈⑶R序列為包含在HCVR SEQ ID NO:210和LCVR SEQ ID NO:212 中的序列。
[0028]本發(fā)明涵蓋了具有經(jīng)修飾的糖基化模式的抗hIL_4R抗體。在某些應(yīng)用中，進(jìn)行修飾以除去不需要的糖基化位點可能是很有用的，例如在寡糖鏈上缺少巖藻糖基元的抗體，可以增加抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)功能(參閱Shield等人(2002)JBC277:26733)。在其它一些應(yīng)用中，可進(jìn)行半乳糖基化修飾以改變補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
[0029]在第十個方面，本發(fā)明提供了帶有本發(fā)明核酸分子的重組表達(dá)載體以及包含這些載體的宿主細(xì)胞，以及通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞而制備本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的方法。此宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞。
[0030]在第^^一個方面，本發(fā)明的特點是組合物，其包含與hIL_4R特異性結(jié)合的重組人抗體和可接受的載體。
[0031]在第十二個方面，本發(fā)明的特點是利用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分抑制hIL-4活性的方法。在一些具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體還能阻斷與hIL-4R結(jié)合的hIL-13/hIL-13Rl復(fù)合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括使本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與hIL-4R接觸，從而抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13的活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括給患有可通過抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善的疾病的人類受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。所治療的疾病是可通過消除、抑制或降低hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善、好轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防的任何疾病或病癥。
[0032]用本發(fā)明的抗體或抗體片段治療的IL-4相關(guān)疾病包括例如關(guān)節(jié)炎(包括膿毒性關(guān)節(jié)炎)、皰疹(herpetiformis)、慢性原發(fā)性蕁麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病(Whipple/ s Disease)、良性前列腺增生、肺病，如輕度、中度和重度哮喘、炎癥性疾病，如炎癥性腸病、變應(yīng)性反應(yīng)、川崎病、鐮狀細(xì)胞病、Churg-Strauss綜合征、格雷夫斯氏病、先兆子癇、舍格倫綜合征、自體免疫淋巴組織增生綜合征、自體免疫溶血性貧血、巴雷特食管、自體免疫葡萄膜炎、結(jié)核(病)和腎病。
[0033]在閱讀下面的詳細(xì)說明后，本發(fā)明的其它目標(biāo)和優(yōu)勢將變得明顯。
[0034]詳細(xì)說明
[0035]在描述本發(fā)明的方法之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于所描述的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件是可以改變的。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語只是出于描述具體實施方案的目的，并非意在加以限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
[0036]除非另有定義，本文所用的一切技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通專業(yè)人員通常理解的同樣的含義。盡管任何與本文所述的方法和材料類似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧暇刹捎?，但下面描述的是?yōu)選的方法和材料。
[0037]定義
[0038]本文所用的術(shù)語“人IL4R” (hIL-4R)意指與白細(xì)胞介素-4(IL_4)、IL_4Ra (SEQID NO:274)特異性結(jié)合的人細(xì)胞因子受體。術(shù)語“人白細(xì)胞介素-13”(hIL-13)意指與IL-13受體特異性結(jié)合的細(xì)胞因子，“hlL-13/hIL-13Rl復(fù)合物”意指由hIL_13與hIL_13Rl復(fù)合物結(jié)合而形成的復(fù)合物，該復(fù)合物與hIL-4受體結(jié)合以啟動生物活性。
[0039]本文所用的術(shù)語“抗體”指由四條多肽鏈即由二硫鍵互聯(lián)的兩條重鏈⑶和兩條輕鏈(L)組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含CH1、CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域(CLl)。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步分成被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其中散布著較保守的被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，從氨基酸末端到羧基末端按下列次序排列:FRUDRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。
[0040]本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗體部分”或“抗體片段”)指抗體中保留了與抗原(如hIL-4R)特異性結(jié)合能力的一個或多個片段。業(yè)已證明，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的某些片段來實現(xiàn)。抗體的“抗原結(jié)合部分”這一術(shù)語所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL1和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，即由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個F(ab)’片段組成的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人(1989) Nature241:544-546);以及(vi)CDR。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由不同的基因編碼的，但它們可通過重組方法，由一種合成的接頭連接在一起而成為單獨的相連的鏈，其中VL和VH區(qū)配對而形成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv);參閱例如 Bird 等人(1988) Science242:423-426 ;以及 Huston 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 =5879-5883)。這樣的單鏈抗體也涵蓋在抗體的“抗原結(jié)合部分”的術(shù)語范圍內(nèi)。其它形式的單鏈抗體，如雙特異抗體也涵蓋在內(nèi)(參閱如Holliger等人(1993)Pr。。.Natl.Acad Sc1.USA90:6444-6448)。
[0041]本文所用的“中和”或“阻斷”抗體意指其與hIL_4R的結(jié)合造成對hIL-4和/或hIL-13生物活性抑制的抗體。這種hIL-4和/或IL-13生物活性的抑制可通過測量本領(lǐng)域眾所周知的一個或多個hIL-4/或hIL-13生物活性指標(biāo)，如hlL-4/或hIL_13誘導(dǎo)的細(xì)胞活化和hIL-4與hIL-4R的結(jié)合等指標(biāo)來評估(參閱下面的實施例)。
[0042]“CDR”或互補(bǔ)決定區(qū)是散布在較保守的被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域內(nèi)的超變區(qū)。在本發(fā)明的抗hIL- 4R抗體或片段的不同實施方案中，F(xiàn)R可能與人種系序列相同，或者可能經(jīng)過天然或人工修飾。
[0043]本文所用的術(shù)語“表面等離振子共振”指的是一種光學(xué)現(xiàn)象，它使得可通過檢測一種生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的改變來進(jìn)行實時互動分析，例如使用BIAC0RE?系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB)進(jìn)行分析。
[0044]術(shù)語“表位”是與抗體分子中稱為互補(bǔ)位的可變區(qū)之特定抗原結(jié)合位點相互作用的抗原決定簇。單個抗原可能有一個以上表位。表位可為構(gòu)象的，也可為線性的。構(gòu)象表位是由線性多肽鏈不同片段上空間并列排布的氨基酸產(chǎn)生的。線性的表位是由多肽鏈上相鄰的氨基酸殘基形成的。在某些情況下，表位可包括抗原上的糖類、磷?；?，或磺?；糠?。
[0045]術(shù)語“基本同一性”或“基本上相同”當(dāng)其指核酸或其片段時，表示當(dāng)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除與另一個核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最佳比對時，用下述任何著名的序列同一性計算程序如FASTA、BLAST或Gap計算，在至少約95%，更優(yōu)選在至少約96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中具有核苷酸序列同一'丨生。
[0046]當(dāng)應(yīng)用于多肽時，術(shù)語“基本相似性”或“基本上相似”意為當(dāng)以GAP或BESTFIT等程序用默認(rèn)空位權(quán)重進(jìn)行最佳比對時，兩個肽序列至少具有95%的序列同一性，更優(yōu)選的是至少具有98%或99%的序列同一性。更優(yōu)選的是，不相同的殘基位置的區(qū)別在于保守的氨基酸取代?！氨Ｊ氐陌被崛〈笔侵高@樣的取代，其中氨基酸殘基被另一個含有具有類似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團(tuán))的氨基酸殘基所取代。一般來說，保守的氨基酸取代不會從實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或兩個以上氨基酸序列由于保守的取代而彼此不同的情況下，可向上調(diào)節(jié)序列同一性百分?jǐn)?shù)或類似程度，以修正取代的保守性。進(jìn)行這種調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知。參閱如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。含有具有類似化學(xué)性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸群的實例包括(I)脂族側(cè)鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)脂族-羥基側(cè)鏈:絲氨酸和蘇氨酸；(3)含酰胺側(cè)鏈:天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族側(cè)鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)堿性側(cè)鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫側(cè)鏈:半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守的氨基酸取代群為:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘撸Ｊ氐娜〈梢允窃贕onnet等人(1992) Science256:1443-1445所披露的PAM250對數(shù)-似然矩陣中具有正值的任何變化?！爸卸缺Ｊ氐摹比〈荘AM250對數(shù)-似然矩陣中具有非負(fù)值的任何變化。
[0047]多肽的序列相似性也稱為序列同一性，通常是由序列分析軟件測量的。蛋白質(zhì)分析軟件利用各種取代、刪除和其它修飾，包括保守的氨基酸取代的相似性測量值來對相似的序列進(jìn)行匹配。例如，GCG軟件包含諸如Gap和Bestfit等程序，可用默認(rèn)參數(shù)來確定密切相關(guān)的多肽例如來自不同生物種的同源多肽的序列同源性或序列同一性，或確定野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白質(zhì)之間的序列同源性或序列同一性，參閱如GCG6.1版。還可以用GCG6.1版中的FASTA程序，用默認(rèn)或建議的參數(shù)來比較多肽序列。FASTA(如FASTA2和FASTA3)提供了查詢的和搜索到的序列之間最佳迭合區(qū)域的比對和序列同一性百分?jǐn)?shù)(Pearson (2000)，如上)。當(dāng)對本發(fā)明的序列和包含大量源自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較時，另一種優(yōu)選的計算程序是計算機(jī)程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，在比較時采用默認(rèn)參數(shù)。參閱如 Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389_402。
[0048]人抗體的制備
[0049]產(chǎn)生人抗體的方法包括美國專利6，596, 541、Green等人(1994) NatureGenetics7:13-21)，以及美國專利5，545，807和6，787，637中描述的方法。
[0050]可采用本領(lǐng)域已知的任何方法對嚙齒類動物進(jìn)行免疫(參閱如Harlow andLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual1988Cold Spring Harbor Laboratory ；Malik and Lillehoj (1994)Ant``ibo`dy Techniques,Academic Press, CA)。本發(fā)明抗體的優(yōu)選制備方法是采用VEL0CIMMUNETM技術(shù)(美國專利6，596，541)。利用所研究抗原激發(fā)其中內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)被對應(yīng)的人可變區(qū)取代的轉(zhuǎn)基因小鼠，并從表達(dá)抗體的小鼠收獲淋巴細(xì)胞(如B-細(xì)胞)。淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞系融合來制備永生雜交瘤細(xì)胞系，然后對這種雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選，以識別能產(chǎn)生對所研究抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？蓪⒕幋a重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA分離出來并與所需的重鏈和輕鏈同種型恒定區(qū)連接。這樣的抗體蛋白質(zhì)可在細(xì)胞，如CHO細(xì)胞中形成?；蛘撸幋a抗原特異的嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA可直接從抗原特異的淋巴細(xì)胞中分離出來。
[0051]編碼抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA可被分離出來并有效連接到編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA上。然后在能夠表達(dá)完全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)該DNA。在一個具體的實施方案中，該細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
[0052]抗體可能具有治療作用，這種作用是通過阻斷配體-受體相互作用或抑制受體組成部分的相互作用來實現(xiàn)的，而不是通過補(bǔ)體固定(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)(CDC)和參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)而殺死細(xì)胞來實現(xiàn)的?？贵w的恒定區(qū)對抗體固定補(bǔ)體和介導(dǎo)細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性的能力是很重要的。因此，可根據(jù)是否需要抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒性來選擇抗體的同種型。
[0053]人免疫球蛋白可以兩種與鉸鏈異質(zhì)性相關(guān)的形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含約為150-160kDa的穩(wěn)定四鏈結(jié)構(gòu)，其中二聚體通過鏈間重鏈二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，二聚體不是通過鏈間二硫鍵連接的，而是形成了由共價連接的輕鏈和重鏈組成的約為75-80kDa的分子(半抗體)。這些形式極難分離，甚至在親和提純后也是如此。第二種形式在各種完整的IgG同種型中出現(xiàn)的頻度是由于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差別。事實上，人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)的單個氨基酸取代可將第二種形式(Angal等人(1993)Molecular Immunology30:105)的出現(xiàn)頻度顯著地降低到利用人IgGl鉸鏈通常所觀察到的水平。本發(fā)明涵蓋在鉸鏈、CH2或CH3區(qū)中具有一個或多個突變的抗體。這類抗體可能是可取的，例如，可在生產(chǎn)中提高所需抗體形式的產(chǎn)率。
[0054]優(yōu)先，分離出具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的高親和嵌合抗體。如下所述，鑒定抗體的特征并選擇所需的特征，包括與hIL-4R結(jié)合親和性、阻斷hIL-4與hIL_4R結(jié)合的能力，和/或?qū)θ说鞍踪|(zhì)的選擇性。用所需的人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)以產(chǎn)生本發(fā)明的完全人抗體，如野生型或經(jīng)修飾的IgG4或IgGl (如SEQ ID NO:271、272、273)。盡管所選擇的恒定區(qū)可依具體用途而改變，但高親和性抗原結(jié)合和靶標(biāo)特異性特征則在于可變區(qū)。
[0055]表位作圖和相關(guān)技術(shù)
[0056]為了篩選與某特定表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行常規(guī)交叉阻斷分析，例如如上Harlow和Lane所述的。其它方法包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡(Reineke (2004)Methods MolBiol248:443-63)或肽裂解分析。此外，還可采用諸如表位切除、表位提取和抗原的化學(xué)修飾等方法(Tomer (2000) Protein Science:9:487-496)。
[0057]修飾協(xié)助分類法(MAP)，又稱為基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體分類法(ASAP)是一種將大量針對相同的抗原的單克隆抗體(mAb)按照每種抗體對化學(xué)或酶學(xué)修飾的抗原表面的結(jié)合特性的相似性進(jìn)行分類的方法(美國專利申請公開書2004/0101920)。每一類別可能反映了獨特的表位，它可能與另一類別所代表的表位顯著不同或與之部分重迭。這一技術(shù)使得能快速過濾遺傳上相同的抗體，從而使對特征的鑒定著重于遺傳上顯著不同的抗體。當(dāng)應(yīng)用于雜交瘤篩選時，MAP可促進(jìn)帶有所需特征的稀少雜交瘤克隆的識別。MAP可用來將本發(fā)明的hIL-4R抗體分成可與不同表位結(jié)合的抗體組。
[0058]對改變固定化抗原的結(jié)構(gòu)有用的試劑有酶如蛋白水解酶和化學(xué)試劑?？乖鞍卓晒潭ㄔ谏飩鞲衅餍酒砻婊蚓郾揭蚁┲樯?。后者可用例如分析法來處理，如多重LUMINEX?檢測分析(Luminex Corp., TX)。由于LUMINEX?有能力處理多達(dá)100種不同聚苯乙烯珠的多重分析，該方法提供了幾乎無限的具有各種修飾的抗原表面，結(jié)果在抗體表位特性分析方面比生物傳感器分析有更高的分辨率。
[0059]雙特異性
[0060]本發(fā)明的抗體可以是單特異、雙特異或多特異抗體。多特異抗體可對靶標(biāo)肽的不同表位顯示特異性，或也可包含對一個以上靶標(biāo)肽顯示特異性的抗原結(jié)合域。參閱如Tutt等人(1991) J.1mm unol.147:60_69。人抗IL-4R抗體可被連接到另一個功能分子如另一個肽或蛋白質(zhì)上，或與之共表達(dá)。例如，抗體或其片段可功能性地(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合或其它方式)與一個或多個其它分子如另一個抗體或抗體片段連接，以產(chǎn)生帶有第二結(jié)合特異性的雙特異或多特異抗體。[0061]治療給藥方式和配方
[0062]本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗IL-4R抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。本發(fā)明的治療組合物將與適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑以及其它制劑一起施用。這些制劑納入配方是為了改善傳送、遞送和耐受性等。在所有藥劑化學(xué)家熟知的藥典:雷氏藥學(xué)大全(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA)中可找到大量適當(dāng)?shù)呐浞?。這些配方包括，如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類、含有月旨(陽離子或陰離子)的液囊(如LIPOFECTINTM)、DNA偶聯(lián)物、無水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體狀凝膠以及含有碳蠟的半固體狀混合物。另請參閱 Powell 等人“Compendium of excipients for parenteralformulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238_311。
[0063]劑量隨受藥的受試者年齡和體型大小、目標(biāo)疾病、癥狀、施用途徑等不同而可以改變。當(dāng)本發(fā)明的抗體用來治療成人的各種與IL-4R相關(guān)的病癥和疾病時，有利的是采用靜脈給藥本發(fā)明抗體，通常單劑按每公斤體重計約0.01至約20mg/kg給藥，更優(yōu)選的是約
0.02至約7、約0.03至約5，或約0.05至約3mg/kg體重。根據(jù)病癥的嚴(yán)重性，可對治療的頻度和持續(xù)時間進(jìn)行調(diào)整。
[0064]已知有各種藥物遞送系統(tǒng)可用來施用本發(fā)明的藥物組合物，例如包在脂質(zhì)體、微顆粒、微膠囊中的膠囊化，能夠表達(dá)變異病毒的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的胞吞作用(參閱如Wu等人(1987), J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入藥物的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜，和口腔等途徑。該藥物組合物可采用任何方便的途徑施用，如通過灌注或靜脈團(tuán)注、上皮和粘膜層(如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜)吸收，并可與其它生物活性藥劑一起施用。施用方式可為全身性或局部性施用。
[0065]該藥物組合物也可通過液囊遞送，尤其是通過脂質(zhì)體液囊遞送(參閱Langer (1990) Science249:1527-1533 ;Treat 等人(1989) in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (編著)，Liss, NewYork,第 353-365 頁；Lopez-Berestein,同上，第 317-327 頁；一般參閱如上。
[0066]在某些情況下，該藥物組合物可以受控釋放系統(tǒng)遞送。在一個實施方案中，可使用泵(參閱 Langer,如上；Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一個實施方案中，可米用聚合物材料(參閱Medical Applications of Controlled Release,Langerand Wise(編著)，CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974)。在又一個實施方案中，可在該藥物組合物的目標(biāo)附近放置受控釋放系統(tǒng)，因此僅需要使用全身劑量的一部分(參閱如Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,同上,第 2卷,第 115-138頁，1984)。關(guān)于其它受控釋放系統(tǒng)的討論見Langer (1990) Science249:1527_1533。
[0067]注射制劑可包括用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射、滴注等的劑型。這些注射制劑可用已公開的方法制備。 例如，注射制劑可通過將抗體或其鹽溶于、懸浮于或乳化于慣常用于注射的無菌水介質(zhì)或油介質(zhì)的方式來制備。用于注射的水性介質(zhì)有，例如生理鹽水、含有葡萄糖和其它輔助劑的等滲溶液等。它們可與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┤绱?如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑[如聚山梨醇酯80、HC0-50 (氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩爾)加成物)等結(jié)合使用。所用的油介質(zhì)有，如芝麻油、大豆油等。它們可與增溶劑如苯甲酸芐酯、苯甲醇等結(jié)合使用。這樣制備的注射劑最好封裝在適當(dāng)?shù)陌碴称恐?。[0068]有利的是，上述用于口服或非經(jīng)腸施用的藥物組合物可制備成能容納活性成分劑量的單位劑量形式。這樣的單位劑量形式包括，如片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。每個單位劑量所包含的上述抗體的量一般為約5到500毫克，尤其是在注射劑中，所包含的上述抗體的量最好為約5到100毫克；對于其它劑量形式，最好為約10到250毫克。
[0069]單一治療和聯(lián)合治療本發(fā)明的抗體和抗體片段對于治療可通過降低IL-4活性而得到改善、抑制或者好轉(zhuǎn)的疾病和紊亂很有用。這些疾病包括那些以IL-4異常表達(dá)或過度表達(dá)或宿主對IL-4生成的異常反應(yīng)為特征的疾病。用本發(fā)明的抗體或抗體片段治療的與IL-4相關(guān)的疾病包括例如關(guān)節(jié)炎(包括膿毒性關(guān)節(jié)炎)、皰疹、慢性原發(fā)性蕁麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病、良性前列腺增生、肺病，如哮喘(輕度、中度和重度)、炎癥性疾病，如炎癥性腸病、變應(yīng)性反應(yīng)、川崎病、鐮狀細(xì)胞病、Churg-Strauss綜合癥、格雷夫斯氏病、先兆子癇、舍格倫綜合征、自體免疫淋巴組織增生綜合征、自體免疫溶血性貧血、巴雷特食管、自體免疫葡萄膜炎、結(jié)核(病)、遺傳過敏性皮炎、潰瘍性結(jié)腸炎、纖維癥和腎病(參閱美國專利 7，186，809)。[0070]本發(fā)明涵蓋聯(lián)合治療，其中抗IL-4R抗體或抗體片段與第二種治療藥劑聯(lián)合施用。共同給藥和聯(lián)合治療并不限于同時給藥，而是還包括在涉及給予患者至少一種其它治療藥劑的療程中至少給予一次抗IL-4R抗體或抗體片段的治療方案。第二種治療藥劑可能為另一種IL-4拮抗劑，如另一種抗體/抗體片段，或可溶的細(xì)胞因子受體、IgE拮抗劑、可通過吸入或其它適當(dāng)方式給藥的抗哮喘藥物(皮質(zhì)類固醇、非類固醇藥劑、β激動劑、白三烯、拮抗劑、黃嘌呤類、氟替卡松、沙美特羅、舒喘寧)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗IL-4R抗體或抗體片段可與IL-1拮抗劑,如利納西普(rilonacept)或IL-13拮抗劑一起施用。第二種藥劑可能包括一種或多種白三烯受體拮抗劑，以治療諸如變應(yīng)性發(fā)炎疾病，如哮喘和過敏癥。白三烯受體拮抗劑的實例包括但不限于孟魯司特、普侖司特和扎魯司特。第二種藥劑可包括細(xì)胞因子抑制劑，如一種或多種TNF (依那西普，ENBREL?)、IL-9、IL-5或IL-17拮抗劑。
[0071]本發(fā)明還包括本文所述的任何抗IL-4R抗體或抗原結(jié)合片段在制備治療疾病或癥狀的藥物中的應(yīng)用，其中的疾病或癥狀是通過消除、抑制或降低人白細(xì)胞介素-4(hIL-4)活性而得到改善、好轉(zhuǎn)或抑制的。這類疾病或癥狀的實例包括，例如，關(guān)節(jié)炎、皰疹、慢性原發(fā)性蕁麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎癥性疾病、變應(yīng)性反應(yīng)、川崎病、鐮狀細(xì)胞病、Churg-Strauss綜合征、格雷夫斯氏病、先兆子癇、舍格倫綜合征、自體免疫淋巴組織增生性綜合征、自體免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自體免疫葡萄膜炎、結(jié)核(病)、腎病、遺傳過敏性皮炎以及哮喘。
實施例
[0072]我們提供以下實施例以便向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就如何制備本發(fā)明的組合物和如何使用本發(fā)明的方法提供完整的披露和說明，它們并非意在限制本發(fā)明之發(fā)明人所認(rèn)為的發(fā)明的范圍。已經(jīng)作出努力以保證所用數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是，也應(yīng)考慮到會有一些實驗誤差和偏差。除非另外注明，份數(shù)為重量份數(shù)，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
[0073]實施例1.人IL-4受體人抗體的生成[0074]將VEL0CMMUNE? 小鼠(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.；US 6，596，541)用人 IL-4R(hIL-4R, SEQ ID NO:274)或 hIL_4R 和食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-4R(mfIL-4R,SEQ ID NO:275)蛋白質(zhì)或DNA的組合進(jìn)行免疫。為了獲得最佳免疫反應(yīng)，隨后每3-4周對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫并在每次加強(qiáng)免疫后10天獲得血樣以評估抗抗原反應(yīng)的進(jìn)展。
[0075]當(dāng)小鼠達(dá)到最大免疫反應(yīng)時，收獲表達(dá)抗體的B細(xì)胞并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤?；蛘?，不與骨髓瘤細(xì)胞融合而直接從B細(xì)胞分離抗原特異的抗體，如美國專利公開書2007/0280945A1所述，該公開書特別通過引用而以其整體納入本文。從分離的適當(dāng)重組細(xì)胞建立了穩(wěn)定的表達(dá)抗體的重組CHO細(xì)胞系。通過篩查雜交瘤或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的特異性、抗原結(jié)合親和性以及阻斷hIL-4與hIL-4R結(jié)合的效能(如下所述)，選擇了具有所需功能的單克隆抗體。
[0076]通過前述方法獲得了幾種抗hIL-4R抗體，包括被命名為H4H083P、H4H094P和H4H095P、H4H098P和H4H099P的代表性抗體。這些代表性抗hIL_4R抗體以及它們的生物特性將在以下 實施例中更為詳細(xì)地敘述。
[0077]實施例2.抗原結(jié)合親和性測定
[0078]利用實時生物傳感器表面等離振子共振分析(BIAC0RE?2000)，于25°C或37°C測定了所選擇抗體相對于hIL-4R的結(jié)合親和性(Kd)。簡言之，將抗體捕獲到通過與BIAC0RE?芯片直接偶聯(lián)而產(chǎn)生的山羊抗hFc多克隆抗體的表面上，以形成抗體得到捕獲的表面。在25。?；?7。，將各種不同濃度(范圍從50nM到12.5nM)的單體hIL_4R(R&D Systems)或二聚體hIL-4R-mFc注射到抗體得到捕獲的表面，注射速率為10 μ 1/min，注射時間為2.5分鐘。對抗原與抗體的結(jié)合以及所結(jié)合復(fù)合物的離解進(jìn)行實時監(jiān)控。利用BIA評估軟件進(jìn)行動力學(xué)分析確定了平衡解離常數(shù)(Kd)和解離速率常數(shù)。還利用BIA評估軟件計算了抗原/抗體復(fù)合物解離的半衰期(Tla)。其結(jié)果如表1所示。NB:在實驗條件下未觀察到抗體-抗原結(jié)合。對照:完整的人抗IL-4R抗體(美國專利7，186，809 ；SEQ ID NO:10和12)。
[0079]表1
[0080]
【權(quán)利要求】
1.與人IL-4R特異性結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，其包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)10?1?1)、重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 0?1?2)、重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 0?1?3)以及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)I (IXDRl)、輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 0XDR2)、輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 (IXDR3)，其中: HCDRl 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:265)的氨基酸序列，其中 X1=Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或 Ser ；X7 = Tyr ;且 X8 =Ala 或 Gly ； HCDR2 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列，其中 X1=Ile 或 Leu, X2 = Ser, X3 = Gly, Tyr 或 Arg，X4 = Ser、Asp 或 Thr，X5 = Gly 或 Ser，X6 =Gly、Ser 或 Val, X7 = Ser 或 Asn,且 X8 = Thr> Lys 或 lie ;
HCDR3 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xic1-Xi1-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO:267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Asp、Glu 或 Trp, X4 = Gly 或Arg, X5 = Leu> Thr 或 Arg, X6 = Gly、Arg 或 Ser, X7 = Ile 或 Gly, X8 = Thr> Phe 或 Tyr, X9=lie、Asp 或 Phe, X10 = Arg、Tyr 或 Asp, X11 = Pro> Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 =Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18=Val或缺失；
LCDRl 包含結(jié)構(gòu)式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xic1-X11 (SEQ ID NO:268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp、Ser 或 Val, X3 = Ile 或 Leu, X4 = Ser> Leu 或 Asn, X5 = Asn、Tyr 或 He, X6 = Trp> Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10=Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失； LCDR2包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3(SEQ ID NO:269)的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或Val, X2 = Ala 或 Gly,且 X3 = Ser ;且 LCDR3 包含結(jié)構(gòu) 式為 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:270)的氨基酸序列，其中X1 = Gln 或 Met, X2 = Gin, X3 = Ala 或 Tyr，X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr>Phe 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr> Ile 或 Trp,且 X9 = Thr。
2.如權(quán)利要求1所述之抗體或抗原結(jié)合片段，其中重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2、LCDR3)分別具有 SEQ ID NO: 148、150、152、156、158、和160的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述之抗體或抗原結(jié)合片段，其中重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2、LCDR3)分別由 SEQ ID NO:147、149、151、155、157、和159的核苷酸序列編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的抗體或抗原結(jié)合片段，其中抗體或抗原結(jié)合片段包含具有SEQID NO:162的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)和具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于針對hIL-4R的親和力(Kd) ( 300pM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于針對hIL-4R的親和力(Kd) ( IOOpM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于針對hIL-4R的親和力(Kd) ( 50pM。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其中抗體或其片段與猴IL-4R交叉反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其用于治療哮喘或遺傳過敏性皮炎。
10.核酸序列，其編碼權(quán)利要求1-9中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段。
11.含有如權(quán)利要求10所述之核酸序列的載體。
12.分離的宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求11的載體。
13.生產(chǎn)與人白細(xì)胞介素-4受體a(hIL-4R)特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，該方法包括在表達(dá)抗體或片段的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求12所述之宿主細(xì)胞，并收獲由此表達(dá)的抗體或抗原結(jié)合片段。
14.如權(quán)利要求13所述之方法，其中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13或14所述之方法，其中宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段在制備用于治療哮喘的藥物中的用途，其中哮喘通過消除、抑制或降低人白細(xì)胞介素-4(hIL-4)活性而得到改善、好轉(zhuǎn)或抑制。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段在制備用于治療遺傳過敏性皮炎的藥物中的用途，其中遺傳過敏性皮炎通過消除、抑制或降低人白細(xì)胞介素-4(hIL-4)活性而得到改善、好轉(zhuǎn)或抑制。
18.治療組合物，其包含根據(jù)權(quán)`利要求1-9的任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，以及可接受的載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的治療組合物，其還包含選自孟魯司特、普侖司特、扎魯司特和利納西普的第二治療劑。
【文檔編號】A61K39/395GK103739711SQ201410018529
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月29日
【發(fā)明者】J·H·馬丁, T·T·黃, J·L·費爾赫斯特, N·J·帕帕多普洛斯 申請人:瑞澤恩制藥公司