專利名稱：人il-6受體的高親和力抗體的制作方法
人IL-6受體的高親和カ抗體本申請為2007年6月I日提交的，發(fā)明名稱為“人IL-6受體的高親和カ抗體”的 PCT申請PCT/US2007/013062的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2008 年11月27日，申請?zhí)枮?00780019546. X。相關(guān)領(lǐng)域的說明白細(xì)胞介素-6(IL_6)是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多向性細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)、急性期反應(yīng)和造血作用的調(diào)控中起至關(guān)重要的作用。其與可溶的和細(xì)胞膜結(jié)合的 IL-6R(a鏈)相結(jié)合，形成ニ元復(fù)合物，此復(fù)合物能夠與細(xì)胞膜結(jié)合的gpl30( 3鏈)相互作用，誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)復(fù)合物的形成，其包含IL-6、IL-6R和gpl30各兩個。US 5，670，373、5，795，965、5，817，790、6，410，691 和 EP 409607B1 中描述了 hIL-6R的抗體。US 5，888，510和6，723，319中描述了治療方法。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了與人白細(xì)胞介素-6受體(hIL_6R)特異性結(jié)合的人抗體， 優(yōu)選重組人抗體。這些抗體的特征在干，與hIL-6R以高親和力和低解離動力學(xué)結(jié)合，且能夠中和IL-6的活性。抗體可為全長(例如，IgGl或IgG4抗體)，或可能僅包含抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2或scFv片斷)，可能被修飾以影響功能性,例如，消除殘留的效應(yīng)功能(Reddy等人，(2000) J. Immunol. 164 :1925-1933)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結(jié)合片斷，與人IL-6受體(SEQ ID NO: I)結(jié)合的Kd為約500pM或更小，Kd用表面等離子體共振測量。在更具體的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片斷的Kd小于300pM，或小于200pM，或甚至小于100pM。在多種實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片斷封閉hIL-6活性的IC5tl為250pM或更小，IC5tl用熒光素酶生物測定法測量。在更具體的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片斷顯示IC5tl為150pM或更小。在相關(guān)方面，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片斷與hIL_6R結(jié)合，比其與猴IL-6R結(jié)合的親和カ高至少兩倍。在更優(yōu)選的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片斷與hIL-6R蛋白(SEQ ID NO 1)結(jié)合，比其與猴 IL-6R(食蟹猴(Macacafascicularis)胞外域，如 SEQ ID NO :251 所示)結(jié)合的親和カ高約達(dá)三倍。在一個實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體的抗原結(jié)合部分包含重鏈可變區(qū)(HCVR)， 選自 SEQ ID NO:3、227、19、231、35、51、67、83、99、115、131、147、239、241、163、179、235、 195和211，或與這些基本上相似的序列。在更具體的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片斷還包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)，選自 SEQ ID NO :11、229、27、233、43、59、75、91、107、123、139、 155、171、187、237、203和219，或與這些基本上相似的序列。在具體實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片斷包含 HCVR/LCVR 對，選自 SEQ ID NO :3/11 ；227/229 ； 19/27 ；231/233 ；35/43 ； 51/59 ；67/75 ；83/91 ；99/107 ；115/123 ；131/139 ；147/155 ；239/155 ；241/155 ；163/171 ； 179/187 ；235/237 ； 195/203 ;和211/219，或與這些基本上相似的序列。第二方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的抗體或抗體的抗原結(jié)合片斷。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼包含上述HCVR的抗體或其片段。在具體實施方案中，編碼 HCVR 的核酸分子選自 SEQ ID NO :2、226、18、230、34、50、66、82、98、114、130、146、238、240、162、178、234、194和210，或與這些基本上相同的序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼上述的LCVR。在具體實施方案中，編碼LCVR的核酸分子為這樣的核苷酸序列，其選自 SEQ ID NO :10、228、26、232、42、58、74、90、106、122、138、154、 170、186、236、202和218，或與這些基本上相同的序列。第三方面，本發(fā)明提供這樣的抗體或抗原結(jié)合片斷，其包含重鏈互補決定區(qū) 3 (CDR3)結(jié)構(gòu)域和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其中重鏈CDR3 結(jié)構(gòu)域包含下式的氨基酸序列 A1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11-X12-Xi3-X14-X15-X16-X17-X18-X19 (SEQ ID NO :247)，其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, X6 = Ser 或 Ala, X7 = Phe, X8 = Asp ；X9 = He, X10 = Pro 或缺失，X11 = Phe 或缺失，X12 = Val或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Tyr或缺失，X16 = Gly 或缺失，X17 = Met或缺失，X18 = Asp或缺失，X19 = Val或缺失；和輕鏈CDR3 結(jié)構(gòu)域包含下式的氨基酸序列=X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO 250)，其中 X1 = Gin, X2 = Gln 或 His, X3 = Ala,X4 = Asn 或 Tyr, X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro, X9 = Thr。 在更具體的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片斷還包含 重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列W-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQID NO245)，其中 X1 = Gly 或 Arg, X2 = Phe, X3 = Thr, X4 =:Phe，X5=Asp, Xe1 = Asp, X7=Tyr,X8 = Ala ；
重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列=X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQID NO246)，其中 X1 = Ile 或 Val，X2 = Ser, X3 = Trp, X4 ==Asn, Xs=Ser, Xe=Gly, X7=Ser,X8 = Ile ；
輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列=X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQID NO 248)，其中 X1 = Gin, X2 = Gly, X3 = He, X4 = Ser, X5 = Ser,X6 = Trp ;和
輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列A1-X2-X3(SEQ ID NO :249)，其中 X1 =
Gly 或 Ala, X2 = Ala, X3 = Ser。第四方面，本發(fā)明提供抗體或抗原結(jié)合片斷，其包含重鏈CDR3 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :25、153、9、185、41、57、73、89、105、121、137、 169,201 和 217;和輕鏈CDR3 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :33、161、17、193、49、65、81、97、113、129、145、 177,209 和 225。在更具體的實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片斷還包含重鏈CDRl 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :21、149、5、181、37、53、69、85、101、117、133、 165,197 和 213 ；重鏈CDR2 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :23、151、7、183、39、55、71、87、103、119、135、 167,199 和 215 ；輕鏈CDRl 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :29、157、13、189、45、61、77、93、109、125、141、 173,205 和 221 ;和輕鏈CDR2 結(jié)構(gòu)域，選自 SEQ ID NO :31、159、15、191、47、63、79、95、111、127、143、 175,207 和 223。
在具體實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片斷包含重鏈⑶R序列SEQ ID NO :21、23、25 和輕鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :29、31、33 ;重鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :149、151、153 和輕鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :157,159,161 ;重鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :5、7、9 和輕鏈 SEQ ID N0:13、15、 17 ;重鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :181、183、185 和輕鏈 CDR 序列 SEQ ID NO :189、191、193。第五方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片斷，其中抗體或其片斷包含重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其編碼核苷酸序列選自SEQ ID NO :24、152、8、184、40、56、72、 88、104、120、136、168、200 和 216 ;和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其編碼核苷酸序列選自SEQ ID NO :32、160、16、192、48、64、80、 96、112、128、144、176,208和224 ；以及與這些基本相同的核酸序列。在更具體的實施方案中，提供分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片斷，其中抗體或其片斷包含重鏈CDRl，其編碼核苷酸序列選自 SEQ ID NO :20、148、4、180、36、52、68、84、100、 116、132、164、196 和 212 ；重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，其編碼核苷酸序列選自SEQ ID NO :22、150、6、182、38、54、70、 86、102、118、134、166、198 和 214 ；輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，其編碼核苷酸序列選自SEQ ID NO :28、156、12、188、44、60、76、 92、108、124、140、172、204 和 220 ;和輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，其編碼核苷酸序列選自SEQ ID NO :30、158、14、190、30、46、62、 78、94、110、126、142、174、206和222 ；以及與這些基本上相同的核酸序列。本發(fā)明包含具有修飾的糖基化模式的抗hIL_6R抗體或其抗原結(jié)合片斷。在一些應(yīng)用中，除去不期望的糖基化位點的修飾或在寡糖鏈上缺乏巖藻糖部分的抗體可用干， 例如，增加抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)(見Shield等人，(2002) JBC 277 26733)。在其它應(yīng)用中，可進行半乳糖基化修飾以改變補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)(CDC)。在其它方面，本發(fā)明提供載有本發(fā)明核酸分子的重組表達(dá)載體、引入該載體的宿主細(xì)胞、以及通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片斷的方法。宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，優(yōu)選宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞,如 CHO細(xì)胞。在其它方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含與hIL_6R特異性結(jié)合的人抗體或抗體的抗原結(jié)合片斷和可藥用的載體。在其它方面，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分抑制人IL-6活性的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明包含這樣的治療方法，包括對患病的人類受試者給藥本發(fā)明的抗體或其片段，其病癥通過抑制IL-6活性得到治療或改善。病癥可為例如關(guān)節(jié)炎， 包括慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸病，包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡和炎性疾病。在其它方面，本發(fā)明提供如上定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片斷在制備藥物中的用途，用于減輕或抑制IL-6介導(dǎo)的人類疾病或病癥。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供如上定義的抗體或抗體的抗原結(jié)合片斷，用于減輕或抑制IL-6介導(dǎo)的人類疾病或病癥。通過以下詳細(xì)說明，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將顯而易見。
發(fā)明詳述說明本發(fā)明方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于所描述的特定方法和實驗條件， 因為這樣的方法和條件可以變動。還應(yīng)理解此處使用的術(shù)語僅用于說明具體實施方案的目的，而非限制性的，因為本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求書限定。除非另有定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，其含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。盡管在實施或檢驗本發(fā)明時，可使用與在此說明的相似或等同的任何方法和材料，現(xiàn)對優(yōu)選的方法和材料予以說明。此處使用的術(shù)語“人IL6R”(hIL_6R)，意指與白細(xì)胞介素-6(IL_6)特異性結(jié)合的人細(xì)胞因子受體。hIL-6R的胞外域以SEQ ID NO 1表示。此處使用的術(shù)語“抗體”，意指免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，由ニ硫鍵互相連接。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(此處縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(此處縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域(CLl)。VH和VL區(qū)可進ー 步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，其間散布著更為保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。 各VH和VL包含三個⑶R和四個FR，從氨基末端到羧基末端以如下順序排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。此處使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或只是“抗體部分”或“抗體片斷”)，指抗體的ー個或多個片段，其保留了與抗原(例如，hIL_6R)特異性結(jié)合的能力。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段實現(xiàn)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片斷，包含VL、VH、CU和CHl結(jié)構(gòu)域的單價片段；(ii)F(ab’)2片斷， ニ價片斷，包含兩個Fab片斷，由鉸鏈區(qū)的ニ硫鍵連接；(iii)Fd片斷，包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域；(iv) Fv片斷,包含抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域,(v)dAb片斷(Ward等人，(1989) Nature 241 :544-546),包含VH結(jié)構(gòu)域；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片斷的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由獨立的基因編碼，但可用重組方法連接起來，通過合成接頭使它們制備為單個連續(xù)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);見例如，Bird等人，(1988) Science 242 :423-426 ;和 Huston 等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”也g在涵蓋這樣的單鏈抗體。還涵蓋其它形式的單鏈抗體，如雙體抗體(見例如，Holliger等人,(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。此處使用的“中和”或“封閉”抗體，意指與hIL_6R結(jié)合、導(dǎo)致抑制hIL-6的生物活性的抗體。通過測量ー個或多個本領(lǐng)域已知的hIL-6生物活性的指標(biāo)，如hIL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞激活和hIL-6與hIL-6R的結(jié)合(見下文實施例)，可評估對hIL-6生物活性的抑制。“CDR”或互補決定區(qū)為高變區(qū)，其間散布著更為保守的區(qū)域，稱為“框架區(qū)”(FR)。 在本發(fā)明的抗hIL-6R抗體或片斷的不同實施方案中，F(xiàn)R可以與人生殖系序列相同，或可以經(jīng)天然或人工修飾。ー組CDR可被定義為氨基酸共有序列；例如，在一個實施方案中， 本發(fā)明的抗hIL-6R抗體或抗原結(jié)合片斷可描述為包含這樣的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列 ^i-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-Xi3-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID NO 247)，其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, X6 = Ser 或 Ala, X7 =Phe, X8 = Asp ；X9 = He, X10 = Pro 或缺失，X11 = Phe 或缺失，X12 = Val 或缺失，X13 =Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Tyr或缺失，X16 = Gly或缺失，X17 = Met或缺失，X18 =Asp或缺失，X19 = Val或缺失；和這樣的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包含下式的氨基酸序列 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :250)，其中 X1 = Gin, X2 = Gln 或 His，X3 = Ala, X4 =Asn 或 Tyr，X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro, X9 = Thr。此處使用的術(shù)語“表面等離子體共振”指ー種光學(xué)現(xiàn)象，例如通過使用BIAcore 系統(tǒng)(Pharmacia BiosensorAB,法瑪西亞生物傳感器公司)，檢測生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，可以實時分析蛋白質(zhì)相互作用。術(shù)語“表位”為抗原決定簇，其與抗體分子可變區(qū)中稱為對位的特異性抗原結(jié)合位點相互作用。單個抗原可有不止ー個表位。表位可為構(gòu)象表位或線性表位。構(gòu)象表位由來自線性多肽鏈中不同部分的氨基酸在空間上并列產(chǎn)生。線性表位由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產(chǎn)生。在某些情況下，表位可包括抗原上的糖類、磷酰基或磺?；糠?。術(shù)語“基本同一性”或“基本上相同”，當(dāng)指核酸或其片斷時指的是，當(dāng)其以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔c另ー核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，核苷酸堿基中的核苷酸序列同一性至少約95 %，更優(yōu)選至少約96 %、97 %、98 %或99 %，使用任何眾所周知的序列同一性算法測定，例如以下討論的FASTA、BLAST或Gap。當(dāng)用于多肽吋，術(shù)語“基本相似性”或“基本上相似”指當(dāng)兩個肽序列最佳比對時， 例如用GAP或BESTFIT程序，使用缺省空位權(quán)重，享有至少95%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少98%或99%的序列同一性。優(yōu)選不相同的殘基位置的差別是保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔前被釟埢粋?cè)鏈(R基團)化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)相似的另ー氨基酸殘基所取代。通常，保守氨基酸取代不會實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或多個氨基酸序列彼此的區(qū)別為保守取代的情況下，序列同一性百分比或相似性程度可由于取代的保守性而予以上調(diào)。做此調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見,例如,Pearson (1994) Methods Mol.Biol.24 :307-331。側(cè)鏈具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸組的例子包括I)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺的側(cè)鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸，和7)含硫側(cè)鏈， 為半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。 可選地，保守性替換為在Gonnet等人，(1992) Science 256 :144345中公開的PAM250對數(shù)似然矩陣中，具有正值的任何改變?！斑m度保守性”替換為在PAM250對數(shù)似然矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。多肽的序列相似性，也稱為序列同一性，通常用序列分析軟件測定。蛋白質(zhì)分析軟件使用對多種取代、缺失和其它修飾包括保守氨基酸取代賦值的相似性測量方法來匹配相似序列。例如，GCG軟件包含程序如Gap和Bestfit，可用于以缺省參數(shù)測定密切相關(guān)的多肽之間的序列同源性或序列同一性，如來自不同物種生物的同源多肽，或野生型蛋白和其突變蛋白。見，例如，GCG版本6. I。還可用FASTA以缺省或推薦的參數(shù)比較多肽序列，GCG 版本6. I. FASTA中的程序(例如，F(xiàn)ASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同前)。當(dāng)用本發(fā)明的序列與包含大量來自不同生物序列的數(shù)據(jù)庫相比較時，另ー優(yōu)選算法是計算機程序BLAST，特別是blastp或 tblastn，使用缺省參數(shù)。見，例如，Altschul 等人，(1990) J. Mol. Biol. 215 :403410 和 Altschul 等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389402。人抗體的制備產(chǎn)生人抗體的方法包括例如Veloclmmune (雷杰納榮制藥Regeneron Pharmaceuticals) > XenoMouse 技術(shù)(Green 等人，(1994)Nature Genetics 7 :13-21 ； Abgenix公司)、“微小基因座(minilocus) ”方法和噬菌體展示(見，例如，US 5，545，807， US 6，787，637)。VeloclmmuneTM技術(shù)(US 6，596，541)包含針對選定抗原產(chǎn)生高特異性全人抗體的方法。此技術(shù)包括建立轉(zhuǎn)基因小鼠，其基因組包含人輕鏈和輕鏈可變區(qū)，與小鼠內(nèi)源性恒定區(qū)基因座有效地相連，從而小鼠響應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。分離抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼DNA，與人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼DNA有效地相連。而后DNA在能夠表達(dá)全人抗體的細(xì)胞中表達(dá)。在具體實施方案中，細(xì)胞為CHO細(xì)胞?？贵w可在治療上用于封閉配體-受體相互作用或抑制受體組分相互作用，而不是通過補體結(jié)合(補體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng))(CDC)和參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)殺死細(xì)胞?？贵w的恒定區(qū)對抗體結(jié)合補體和介導(dǎo)細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒作用的能力十分重要。因此，可依據(jù)是否期望抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用而選擇抗體的同種型。人免疫球蛋白可以以與鉸鏈區(qū)異質(zhì)性相關(guān)的兩種形式存在。在ー種形式中，免疫球蛋白分子包含穩(wěn)定的四條鏈結(jié)構(gòu)，約150-160kDa，其中二聚體通過鏈間的重鏈ニ硫鍵結(jié)合。在第二種形式中，ニ聚體不通過鏈間的ニ硫鍵連接，形成約75-80kDa的分子，其包含共價偶聯(lián)的輕鏈和重鏈(半抗體)。即使在親和純化之后，也極其難以分離這些形式。第二種形式在多種完整IgG同種型中出現(xiàn)的頻率是由于但不限干與抗體的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。事實上，人IgG4鉸鏈區(qū)的單個氨基酸取代可顯著減少第二種形式的出現(xiàn)(Angal 等人，(1993)Molecular Immunology 30 :105),減少至使用人IgGl鉸鏈時通常觀察到的水平。本發(fā)明包含在鉸鏈、CH2或CH3區(qū)具有一個或多個突變的抗體，其在例如制備中可期望提高期望抗體形式的產(chǎn)量。本發(fā)明的抗體優(yōu)選用VeloclmmuneTM技術(shù)制備。轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)被替換為相應(yīng)的人可變區(qū)，用目的抗原攻擊這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠，從表達(dá)抗體的小鼠中回收淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)。淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞系融合以制備永生的雜交瘤細(xì)胞系，篩選和選擇這樣的雜交瘤細(xì)胞系，以鑒定生產(chǎn)特異于目的抗原的抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？煞蛛x重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼DNA，與期望的同種型重鏈和輕鏈恒定區(qū)相連。 可在細(xì)胞中，如CHO中制備這樣的抗體蛋白?？蛇x地，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA可直接從抗原特異性淋巴細(xì)胞中分離。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含多達(dá)18種有功能的人可變重鏈基因和12種有功能的人可變K輕鏈基因。在另ー實施方案中,轉(zhuǎn)基因小鼠包含多達(dá)39種人可變重鏈基因和30種人可變K輕鏈基因。在又一實施方案中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含多達(dá)80種人可變重鏈基因和40種人可變K輕鏈基因。一般而言，本發(fā)明的抗體具有非常高的親和力，通過與固定在固相或處在液相中的抗原的結(jié)合測定，通常具有Kd約10_9到約10_12M。首先，分離具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的高親和カ嵌合抗體。如下文所述，表征并選擇具期望特征的抗體，特征包括對hIL-6R的結(jié)合親和力、封閉hIL-6的能力、和/或?qū)θ祟惖鞍踪|(zhì)的選擇性。用期望的人恒定區(qū)替換小鼠恒定區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明的全人抗體，例如野生型或修飾的IgG4或IgGl (例如，SEQ ID NO :242、243、244)。盡管選擇的恒定區(qū)可根據(jù)具體用途有所不同，但高親和力的抗原結(jié)合和靶特異性特征位于可變區(qū)中。表位作圖和相關(guān)技術(shù)為篩選與特定表位結(jié)合的抗體，可使用常規(guī)交叉封閉測定法(cross-blocking assay)，如在 Antibodies :A Laboratory Manual 1988Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow和Lane編中描述的方法。其它方法包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248 :443-63)、或在下文實施例中描述的肽切割分析。此外，可使用諸如表位切除、表位提取和抗原化學(xué)修飾(Tomer (2000)Protein Science :9 :487-496)等方法。修飾輔助分型(Modification-Assisted Profiling) (MAP),也稱為基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體分型(Antigen Structure-based antibody Profiling) (ASAP),是根據(jù)各抗體與經(jīng)化學(xué)或酶促修飾的抗原表面(美國專利申請公開號2004/0101920)結(jié)合特點的相似性，將大量針對相同抗原的單克隆抗體(mAb)加以分類的方法。各種類可能反映獨特的表位，與另ー種類表示的表位明顯不同或部分重疊。此技術(shù)能夠快速過濾遺傳上相同的抗體，從而可以集中表征遺傳上不同的抗體。當(dāng)用于雜交瘤篩選吋，MAP可幫助鑒定具有期望特征的稀有雜交瘤克隆?？墒褂肕AP將本發(fā)明的hIL-6R抗體分類為結(jié)合不同表位的抗體組?？捎糜诟淖児潭乖慕Y(jié)構(gòu)的物質(zhì)有酶如蛋白水解酶和化學(xué)試劑。抗原蛋白可固定于生物傳感器芯片表面或聚苯こ烯珠上。后者可用例如Luminex 多重檢測法 (multiplex Luminex detection assay)(盧明內(nèi)斯公司(Luminex Corp.),美國德州)測定。由于具有可處理多達(dá)100種不同類型小珠的多重分析容量，Luminex 提供了幾乎無限的具有多種修飾的抗原表面，使得抗體表位分型的分辨率高于生物傳感器測定法。治療性給藥和劑型根據(jù)本發(fā)明的治療實體與摻入制劑中以提供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等性質(zhì)的適合載體、賦形劑和其它試劑一同給藥。許多適合的劑型可在所有藥劑師均知的處方集中找到《雷氏藥學(xué)大全》(Remington，s Pharmaceutical Sciences)(第15版，麥克出版公司 (Mack Publishing Company)，伊斯頓，美國賓州，1975)，特別是其中由Blaug, Seymour撰寫的第87章。這些劑型包括，例如，粉劑、糊劑、膏劑、膠凍劑、臘類、油類、脂類、含脂(陽離子或陰離子)的囊泡(如Lipofectin )、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油乳劑和油包水乳劑、碳蠟(多種分子量的聚こニ醇)乳化剤、半固體凝膠劑、和含碳蠟的半固體混合物。只要制劑中的活性成份不由于配制失活，且制劑對于給藥路徑是生理相容和耐受的，任何上述混合物均可適合根據(jù)本發(fā)明的治療和療法。關(guān)于藥劑師所熟知的賦形劑和載體的額外信息，也見 Powell 等人，PDA(1998) J Pharm Sci Technol. 52 :238-311 和其中引述的文獻。
實施例下列實施例，意在為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物的完整公開和說明，而不是限制發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍。就使用的數(shù)字(例如， 用量、溫度等)而言，已盡力確保精確，但應(yīng)說明有一定實驗誤差和偏差。除非另有說明，份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓カ等于或接近大氣壓。實施例I.產(chǎn)生人IL-6受體的人抗體
可用本領(lǐng)域已知的任何方法免疫嚙齒動物(見，例如，Harlow和Lane (1988)，同前；Malik 和 Lillehoj, Antibody techniques Academic Press, 1994,美國加州)。在優(yōu)選實施方案中，對包含編碼人Ig重鏈可變區(qū)和K輕鏈可變區(qū)的DNA基因座的小鼠，直接給藥 hIL_6R 抗原和佐劑(Veloclmmune ,雷杰納榮制藥公司(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) ；US 6，596，541)，以刺激免疫反應(yīng)。這樣的佐劑包括完全和不完全弗氏佐劑，MPL+TDM 佐劑系統(tǒng)(西格瑪公司(Sigma)),或RIBI (胞壁酰ニ肽)(見0’Hagan, Vaccine adjuvant, by Human Press, 2000,美國新澤西州)。這樣的佐劑通過將抗原_離在局部藥庫可防止多肽的快速擴散，且可包含能刺激宿主免疫反應(yīng)的因子。在一個實施方案中，用DNA質(zhì)粒間接給藥hIL-6R，DNA質(zhì)粒包含hIL-6R基因，用宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)機器表達(dá)hIL_6R，在體內(nèi)產(chǎn)生抗原多肽。兩種方法中，免疫接種程序表都需要間隔數(shù)周數(shù)次給藥。用標(biāo)準(zhǔn)的抗原特異性免疫測定監(jiān)測抗體免疫反應(yīng)。當(dāng)動物的免疫反應(yīng)達(dá)到最大時，收獲表達(dá)抗體的B細(xì)胞, 與小鼠骨髄瘤細(xì)胞融合以維持其存活力，形成雜交瘤細(xì)胞。為選擇具期望功能的單克隆抗體，基于特異性、抗原結(jié)合親和力和封閉hIL-6與hIL-6R結(jié)合的能力，來篩選雜交瘤細(xì)胞或被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(在下文中說明)。實施例2.通過直接分離脾細(xì)胞產(chǎn)生抗_hIL6R抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域的編碼DNA可直接從單個抗原陽性的B細(xì)胞中分離。簡短地說， 處死hIL_6Ra免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠并收獲脾細(xì)胞。通過裂解而后沉淀收獲的脾細(xì)胞除去紅血細(xì)胞。重懸的脾細(xì)胞首先與人IgG、FITC-抗-mFc和生物素_IL6Ra的混合物孵育I小吋。染色的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，而后用人和大鼠IgG、APC-抗-mlgM和SA-PE的混合物染色I小吋。染色的細(xì)胞用PBS洗滌一次，使用MoFlo (Cytomation公司)用流式細(xì)胞儀分祈。分選各IgG陽性、IgM陰性和抗原陽性B細(xì)胞，置入96孔板的不同孔中。根據(jù)Wang等人(2000) (J Immunol Methods 244:217-225)描述的方法，對來自這些B細(xì)胞的抗體基因進行RT-PCR。簡短地說，通過RT-PCR合成各單個B細(xì)胞的cDNA。而后將得到的各RT產(chǎn)物一分為ニ，移入兩個96孔板上兩個相應(yīng)的孔中。使用特異于人IgG重鏈可變區(qū)前導(dǎo)序列的 5’簡并引物，和特異于小鼠重鏈恒定區(qū)的3’引物，先通過PCR擴增ー組得到的RT產(chǎn)物，形成擴增子。然后使用特異于人IgG重鏈可變區(qū)序列框架I的5’簡并引物集合和特異于小鼠重鏈恒定區(qū)的3’巢式引物，再次通過PCR擴增該擴增子。使用特異于人K輕鏈可變區(qū)前導(dǎo)序列的5’簡并引物和特異于小鼠K輕鏈恒定區(qū)的3’引物，先通過PCR擴增ー組得到的RT產(chǎn)物，形成擴增子。然后使用特異于人K輕鏈可變區(qū)序列框架I的5’簡并引物集合和特異于小鼠K輕鏈恒定區(qū)的3’巢式引物，再次通過PCR擴增該擴增子。將重鏈和輕鏈 PCR產(chǎn)物克隆進分別包含IgGl重鏈恒定區(qū)和K輕鏈恒定區(qū)的Sap I線性化抗體載體中。 重鏈質(zhì)粒在重鏈表達(dá)盒兩側(cè)具有l(wèi)ox2272位點和lox511位點。此外，在重鏈質(zhì)粒中緊接著 lox2272的下游，有缺乏啟動子和起始ATG的潮霉素抗性基因。潮霉素抗性基因還通過IRES 序列與下游eGFP在轉(zhuǎn)錄上相連。輕鏈質(zhì)粒在輕鏈表達(dá)盒兩側(cè)具有IoxP位點和lox2272位點。此外，輕鏈質(zhì)粒具有SV40啟動子，在位于lOX2272位點的ATG之前緊接著出現(xiàn)，從而使得整合進入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞時，輕鏈質(zhì)粒中鄰近loX2272的SV40啟動子和起始ATG以正確的讀碼框與重鏈質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因相鄰，使得潮霉素抗性和eGFP基因能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯。而后將具有重鏈可變區(qū)序列的純化的重組質(zhì)粒與具有來自相同B細(xì)胞的輕鏈可變區(qū)序列的質(zhì)?；旌希B同表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到改良的CHO宿主細(xì)胞系中。所述改良的CHO宿主細(xì)胞系從5’到3’包含IoxP位點、eCFP、lox2272位點、DsRed和位于轉(zhuǎn)錄活性座位上的lox511位點。因此，所述宿主CHO細(xì)胞可通過流式細(xì)胞儀分離為藍(lán)色陽性、 紅色陽性、和綠色陰性細(xì)胞。當(dāng)表達(dá)重鏈和輕鏈基因的重組質(zhì)粒與表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染時，由Cre重組酶介導(dǎo)的位點特異性重組導(dǎo)致抗體質(zhì)粒整合在包含Iox位點的染色體座位上，導(dǎo)致eCFP和DsRed基因的替換。重組體而后可通過流式細(xì)胞儀分離為藍(lán)色陰性、紅色陰性、綠色陽性細(xì)胞。從而，用具有重鏈可變區(qū)序列的重組質(zhì)粒和具有來自相同B 細(xì)胞的輕鏈可變區(qū)序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選，分離顯示藍(lán)色陰性、 紅色陰性和綠色陽性表型的正確重組體，由分離的克隆建立了表達(dá)抗體的穩(wěn)定重組CHO細(xì)胞系。實施例3.測定抗原結(jié)合親和力抗原與上述選定抗體結(jié)合的Kd通過用實時生物傳感器表面等離子體共振測定法 (BiAcore )測量其表面動力學(xué)而測定。更具體地，用BIAcore 2000或BIAcore 3000 測量抗體對人IL-6R的親和力?？贵w被捕獲在抗小鼠IgG表面上，與多種濃度的單體或ニ 聚體形式的重組hIL_6R蛋白相接觸。用BIAevaluation 軟件進行動力學(xué)分析，得到結(jié)合和解離速率常數(shù)。也以雜交瘤條件培養(yǎng)基或純化的蛋白形式，通過基于平板的競爭免疫測定法測定抗體對hIL_6R的結(jié)合親和力。從已除去牛IgG的雜交瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(英駿公司 Invitrogen)中用G蛋白親和層析純化抗體蛋白。對于競爭ELISA,簡短地說,將不同水平的定量抗體，與抗原蛋白hIL-6R-hFc范圍為0到10 ii g/ml的系列稀釋液預(yù)混合，室溫孵育兩小吋，以達(dá)到抗體和抗原之間的偽結(jié)合平衡狀態(tài)。然后將這些溶液移入96孔hIL-6R-hFc 預(yù)包被板，使得混合物中的游離抗體與板上包被的hIL-6R-hFc結(jié)合。通常用I到2 ii g/ml hIL-6R-hFc蛋白的PBS溶液包被板，在4°C過夜，隨后進行BSA非特異性封閉。洗去溶液中的過量抗體之后，用HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG或IgA多克隆抗體試劑檢測與板結(jié)合的抗體，用比色底物或化學(xué)發(fā)光底物進行顯影。用Prism 軟件(Graph Pad公司)通過4參數(shù)擬合分析(4-parameter fit analysis)來分析信號對溶液中抗原濃度的相關(guān)性,報告為 IC50O 用穩(wěn)態(tài)溶液相(steady state solution phase) Kinexa 儀器(Sapidyne 公司)進行競爭免疫測定。結(jié)果顯示在表I中(對照人IL-6R的人源化單克隆抗體(美國專利號 5，817，790，SEQ ID NO 69 和 71)。抗體(HCVR 和 LCVR 氨基酸序列)VQ8A9_6(3，
11)；VQ8F11-21(19,27) ;VV7G4-1 (35，43) ；VV7G4-10 (51,59)VV6C10-1 (67,75)； VV6C10-3(83,91) ；VV6C10-4(99,107) ；VV6F12-1I(I15,123) ；VV9A6-1I(131,139)； VV6A9-5(147,155), VV3D8-4(163,171) ；VVlG4-7 (179,187) ;248982-13-l_E5 (195，203)； 248982-13-2-A9(211，219)。單體和ニ聚體的 Kd 由 BiAcore 測定;溶液 Kd 由 Kinexa 測定；IC50由ELISA測定(n. d.=未測得)。表I.抗原結(jié)合親和力
權(quán)利要求
1.抗體或其抗原結(jié)合片段，其與人白細(xì)胞介素-6受體特異性結(jié)合，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID NO :149所示的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO :151所示的重鏈 CDR2結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO :153所示的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO :157所示的輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO :159所示的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO :161所示的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含具有SEQID NO :147的重鏈可變區(qū)。
3.權(quán)利要求I的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含具有SEQID NO :155的輕鏈可變區(qū)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段，包含具有SEQID NO :147的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO :155的輕鏈可變區(qū)。
5.前述權(quán)利要求任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab、 F (ab，) 2、FcU scFv 和 dAb。
6.分離的核酸分子，其編碼前述權(quán)利要求任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
7.包含權(quán)利要求6的核酸分子的表達(dá)載體。
8.分離的宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求7的表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
10.制備抗白細(xì)胞介素-6受體抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求8或 9所述的宿主細(xì)胞，并回收所產(chǎn)生的抗體或抗體片段。
11.權(quán)利要求I至5任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于減輕或抑制IL-6 介導(dǎo)的人類疾病或病癥的藥物中的用途。
12.權(quán)利要求11所述的用途，其中IL-6介導(dǎo)的疾病或病癥選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝巳丝贵w或抗原結(jié)合片斷，其與人IL-6受體(hIL-6R)結(jié)合的KD為約500pM或更小，封閉IL-6活性的IC50為200pM或更小。所述抗體或抗體片斷與hIL-6R結(jié)合的親和力比與猴IL-6R的結(jié)合高至少兩倍。
文檔編號A61K39/395GK102585002SQ20121005963
公開日2012年7月18日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日
發(fā)明者A·拉菲克, E·史密斯, G·陳, J·H·馬丁, J·L·費爾赫斯特, J·P·凡德爾, K·J·波博斯基, M·卡羅, N·J·帕帕佐普洛斯, S·史蒂文斯, T·T·黃 申請人:瑞澤恩制藥公司