microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用，涉及microRNA-219。microRNA-219可在制備抗癲癇藥物中應(yīng)用。所述抗癲癇藥物為預(yù)防或治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。所述藥物可按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑等。提供microRNA-219及其激動(dòng)劑在預(yù)防、治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途，用以治療和預(yù)防癲癇及以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。
【專(zhuān)利說(shuō)明】microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及microRNA-219,尤其是涉及microRNA_219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癲癇是一種以大腦神經(jīng)元異常同步化放電為特征的慢性反復(fù)性嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球約5千萬(wàn)患者深受其擾。抗癲癇藥物僅控制約三分之二患者的癲癇發(fā)作，且不能從根本上改善其病理生理狀態(tài)。癲癇的發(fā)生涉及到離子通道改變，突觸重塑，炎癥，神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)元死亡等。然而，迄今為止，針對(duì)這些過(guò)程的干預(yù)措施在臨床上很少表現(xiàn)出足夠的療效，我們對(duì)癲癇發(fā)生的細(xì)胞和分子機(jī)制仍缺乏完整了解。
[0003]microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為19~23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其被RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC,由Dicer, Argonaute及其他蛋白質(zhì)組成)載入后可以與祀mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)配對(duì)，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯效率，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)(Vasudevan S，Tong Y，Steitz J A.Switching from repression to activation:miRNAscan up-regulate translation.Science, 2007;(5858):1931-1934 ；Lewis B P，Burge CB，Bartel D P.Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates thatthousands of human genes are miRNA targets Cell2005 (I): 15-20)。miRNA 以復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的方式參與生物體生理過(guò)程，對(duì)在生理?xiàng)l件下神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA分布、表達(dá)和功能的研究表明，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，廣泛參與對(duì)神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞成熟與迀移、髓鞘形成、突觸發(fā)育成熟和可塑性、膠質(zhì)疤痕形成、神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)修復(fù)和再支配等多種生理病理過(guò)程，miRNA生成異?；蚱涔δ芡钒l(fā)生障礙在神經(jīng)退行性疾病、精神病和腦腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Hebert S S，De Strooper B.Alterations of the miRNAnetwork cause neurodegenerative disease.Trends Neurosci，2009; (4):199-206 ；Saugstad JA.MiRNAs as effec`tors of brain function with roles in ischemiaand injury,neuroprotection, and neurodegeneration.J Cereb Blood FlowMetab.2010;30 (9):1564-1576)。
[0004]MiRNA-219為人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦組織所特有的miRNA之一(DostieJ，Mourelatos Z,Yang M，Sharma A,Dreyfuss G.Numerous microRNPs in neuronalcell containing novel miRNAs.RNA.2003; 9 (2): 180-6)，與腦組織的發(fā)育和高級(jí)神經(jīng)功能密切相關(guān)(Okabe M, Imai T, Kurusu M, Hiromi Y，Okano H，Translationalrepression determines a neuronal potential in Drosophila asymmetric celldivison.Nature.2001;411 (6833):94-98 ；Miller S，Yasuda M，Coats JKj JonesY，Martone ME, Mayford M.Disruption of dendritic translation of CaMK II alphaimpairs stabilization of synaptic plasticity and memory consolidation.Neuron.2002; 36 (3): 507-19)。對(duì)其生理功能的深入研究逐步顯示出miRNA_219與癲癇發(fā)生的潛在相關(guān)性。如最近Jannet Kocerha等發(fā)現(xiàn)N-甲基-D-天冬氨酸受體功能減退與miRNA-219表達(dá)下調(diào)相關(guān)，miRNA-219通過(guò)調(diào)節(jié)NMDAR信號(hào)下游效應(yīng)蛋白CaMKII y 而參與 NMDAR 功能異常所致行為失常(Kocerha J, Faghihi MA, Lopez-ToledanoMA, Huang J, Ramsey AJ, Caron MG,Sales N, Willoughby D, Elmen J, Hansen HF, OrumH, Kauppinen S, Kenny PJ, Wahlestedt C.MiRNA-219modulates NMDA receptor-mediatedneurobehavioral dysfunction.Proc Natl Acad Sci USA.2009; 106 (9): 3507-12);此外，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-219在海馬神經(jīng)元的胞體、樹(shù)突區(qū)域高表達(dá)，在軸突區(qū)也有表達(dá)(OkadoH,Ohtaka-Maruyama C，Sugitani Y，F(xiàn)ukuda Y，Ishida R, Hirai S，Miwa A, TakahashiA,Aoki K, Mawano H，Kasai M.The transcriptional repressor RP58is crucial forcell-division patterning and neuronal survival in the developing cortex.Dev Biol.2009;331 (2):140-51),表明其在突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。以上研究提示，miRNA-219與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)，其可能參與調(diào)控癲癇的發(fā)病過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用。
[0006]microRNA-219可在制備抗癲癇藥物中應(yīng)用。
[0007]所述抗癲癇藥物為預(yù)防或治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。
[0008]所述藥物可按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑等。
[0009]本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明所述的microRNA-219的核苷酸序列進(jìn)行適當(dāng)修飾，所述的修飾包括任意核苷酸的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或任意核苷酸的增減、替換，只要修飾后的核苷酸序列仍具有與microRNA-219相同的活性就應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范·圍之內(nèi)。
[0010]本發(fā)明公開(kāi)了 micix)RNA-219及其激動(dòng)劑在預(yù)防、治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的用途。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在誘發(fā)癲癇發(fā)作的小鼠模型中，小鼠大腦海馬組織中microRNA-219水平顯著降低。給予小鼠側(cè)腦室注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir)能引起小鼠癲癇發(fā)作癥狀。而給予癲癇模型小鼠側(cè)腦室注射microRNA-219的激動(dòng)劑(agomir)則能顯著改善其癲癇發(fā)作癥狀，意味著microRNA-219在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用，其為拮抗癲癇及其相關(guān)疾病發(fā)病的重要保護(hù)性小分子核酸。本發(fā)明旨在公開(kāi)基于microRNA-219及其激動(dòng)劑/類(lèi)似物/修飾物的生物制劑的用途，用以治療和預(yù)防癲癇及以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為小鼠側(cè)腦室注射1.5ug KA后小鼠腦電圖波形。
[0012]圖2為KA誘導(dǎo)癲癇模型小鼠海馬內(nèi)microRNA-219表達(dá)變化情況。
[0013]圖3為癲癇患者腦脊液中miCix)RNA-219表達(dá)情況。
[0014]圖4為小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0015]圖5為小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol陰性對(duì)照劑antagomir-NC后小鼠腦電圖波形。
[0016]圖6為小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠海馬內(nèi)microRNA-219表達(dá)變化情況。
[0017]圖7為癲癇模型小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0018]圖8為癲癇模型小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol陰性對(duì)照劑agomir_NC后小鼠腦電圖波形。
[0019]圖9為小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0020]圖10為癲癇模型小鼠側(cè)腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠海馬內(nèi)microRNA-219表達(dá)變化情況。
[0021]圖11為癲癇細(xì)胞模型(原代培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元)中加入0.8nmol agomir-219(終濃度為400nM)后microRNA-219表達(dá)變化情況。
[0022]圖12為癲癇細(xì)胞模型(原代培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元)中加入0.8nmol antagomir-219(終濃度為400nM)后microRNA-219表達(dá)變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，所有實(shí)施例僅用于例證本發(fā)明，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024]用成年雄性ICR小鼠(30_35g)，側(cè)腦室注射經(jīng)典致癇劑海人酸(Kainic acid,KA)
1.5ug誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作，建立小鼠癲癇動(dòng)物模型。注射海人酸后小鼠表現(xiàn)出雙眼凝視、須動(dòng)增加、呼吸急促、反復(fù)洗臉動(dòng)作，伴有頭面部抽搐，逐漸發(fā)展為伴有站立并摔倒的全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作的癲癇癥狀，發(fā)作等級(jí)達(dá)到Racine分級(jí)IV~V級(jí)，小鼠腦電圖顯示為多量高幅棘波的癲癇發(fā)作波形，各導(dǎo)聯(lián)見(jiàn)`每s5~6次，30~80ii V的癇樣放電持續(xù)發(fā)放(參見(jiàn)圖1 )。24h后，斷頭取腦，取出雙側(cè)海馬，提取RNA，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，KA組小鼠較正常對(duì)照組小鼠，海馬內(nèi)microRNA-219水平顯著降低(降低70%)(參見(jiàn)圖2)。收集臨床癲癇患者的腦脊液標(biāo)本，檢測(cè)顯示癲癇患者腦脊液中microRNA-219水平較非癲癇患者顯著降低(參見(jiàn)圖3)。這意味著microRNA-219的表達(dá)變化與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
[0025]進(jìn)一步給予成年雄性I CR小鼠側(cè)腦室注射mi croRNA-219的特異性拮抗劑(antagomir-219),小鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作癥狀,發(fā)作等級(jí)達(dá)到Racine分級(jí)IV級(jí),腦電圖顯示為異常棘波波形，各導(dǎo)聯(lián)見(jiàn)每si次，10~60 ii V的癇樣放電持續(xù)發(fā)放(參見(jiàn)圖4)。癲癇靜止期，部分小鼠易激怒、暴躁，有攻擊行為。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，注射microRNA-219拮抗劑后，小鼠海馬內(nèi)microRNA-219水平顯著降低(參見(jiàn)圖6),意味著拮抗microRNA-219可誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作，microRNA-219在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。
[0026]同時(shí)，ICR小鼠KA誘發(fā)癲癇發(fā)作6h后，給予其側(cè)腦室注射microRNA-219的激動(dòng)劑 (agomir-219)，小鼠癲癇癥狀明顯好轉(zhuǎn)，發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，發(fā)作持續(xù)時(shí)間大大縮短，只出現(xiàn)凝視，頭面部抽搐，雙前肢抬起陣攣等輕度發(fā)作。而后未見(jiàn)小鼠多次發(fā)作。小鼠腦電圖顯示皮層癇樣放電明顯受到抑制，基本波動(dòng)為4~6HZ的0節(jié)律，間隔5~7s出現(xiàn)一次低幅癇樣放電(參見(jiàn)圖7)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠海馬內(nèi)microRNA-219水平恢復(fù)到正常水平，意味著microRNA-219為拮抗癲癇及其相關(guān)疾病發(fā)病的重要保護(hù)性小分子核酸(參見(jiàn)圖 10)。[0027]通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠癲癇模型大腦海馬組織中micix)RNA-219水平顯著降低。給予小鼠側(cè)腦室注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir)能誘發(fā)小鼠癇性發(fā)作。而給予癲癇模型小鼠側(cè)腦室注射microRNA-219的激動(dòng)劑(agomir)則能顯著改善其癲癇發(fā)作癥狀，提示microRNA-219在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用，其為拮抗癲癇及其相關(guān)疾病發(fā)病的重要保護(hù)性小分子核酸。這一結(jié)果在癲癇細(xì)胞模型中進(jìn)一步得到了證實(shí)(參加圖11和12)。同時(shí)，收集了臨床癲癇患者的腦脊液，檢測(cè)其中micix)RNA-219水平，證實(shí)其與癲癇發(fā)病具有相關(guān)性(參見(jiàn)圖3)。
[0028]本發(fā)明是在大量動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床癲癇患者的腦脊液檢查結(jié)果，旨在開(kāi)發(fā)基于micix)RNA-219的用以治療和預(yù)防癲癇及以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物制劑。具體如下:
[0029]microRNA219生物制劑:制備的藥物可以只含microRNA219的核苷酸序列或其類(lèi)似物/激動(dòng)劑/修飾物，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA219的核苷酸序列或其類(lèi)似物及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的載體可為納米顆粒，脂質(zhì)體，膽固醇，殼聚糖，病毒等。合成microRNA219的核苷酸序列或其類(lèi)似物/激動(dòng)劑，并與上述載體連接形成藥物，可制成注射制劑或口服制劑，通過(guò)靜脈或肌肉注射或口服的方式，用于治療癲癇或以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0030]實(shí)施例1.小鼠腦電圖記錄
[0031]采用Nicolet尼高力數(shù)字化腦電圖儀進(jìn)行描記，以頭皮電極描記小鼠腦電圖，采用4導(dǎo)聯(lián)，在小鼠左右額(F3、F4)，左右頂(P3、P4)相對(duì)的頭皮上各放置一根針電極，參考電極置左耳并接地。靈敏度:10yV/mm，紙速:30mm/sec,高頻濾波:70HZ,低頻濾波:1.6Hz。
[0032]實(shí)施例2.癲癇模型小鼠海馬中microRNA-219表達(dá)水平的檢測(cè)
[0033]1、本實(shí)驗(yàn)采用6~8周·齡雄性ICR小鼠，具體分為2組:癲癇模型小鼠組及對(duì)照組。癲癇模型小鼠組小鼠放置固定在小鼠腦立體定位儀上，給予側(cè)腦室微量注射海人酸(KA)1.5ug (lug/yL)，誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作，制造小鼠癲癇模型。對(duì)照組小鼠給予同側(cè)側(cè)腦室微量注射生理鹽水1.5iiL。
[0034]2、24h后，常規(guī)提取小鼠雙側(cè)海馬RNA:
[0035]每IOOmg組織中加入ImL TRIZOL試劑，電動(dòng)勻漿器勻漿。室溫下放置5min后，加A 0.2mL氯仿,混勻后室溫下放置5min,4°C 12, OOOr離心15min。將上層水相液轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入等體積(0.5mL)異丙醇，混勻后室溫下放置IOmin, 4。。12, OOOr離心IOmin0棄上清，加入lmL75%乙醇,混勻后4°C 9，OOOr離心5min。棄上清，空氣干燥沉淀IOmin,加A 20 u L DEPC處理水，于55~60°C水浴IOmin溶解RNA。獲得的RNA溶液保存于_80°C。
[0036]3、紫外吸收法測(cè)定RNA濃度及純度:
[0037]按照酶標(biāo)儀使用說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。根據(jù)260nm處讀值獲得RNA濃度，以A260/A280的比值判定RNA純度。
[0038]4、變性瓊脂糖凝膠電泳:
[0039]Ig瓊脂糖溶于72mL水中，冷卻至60°C，加入IOmL的10XMOPS電泳緩沖液和18mL的37%甲醛溶液。取3ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10ug/mL。加熱至70°C孵育5min使樣品變性。上樣于膠孔中，5~6V/cm電壓下電泳至溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)膠至少2~3cm，紫外透射光下觀察并拍照。[0040]5、采用 TaKaRa 公司 PrimeScript miRNA qPCR 檢測(cè)試劑盒對(duì) hasiiR-219 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè):[0041]miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄:
[0042]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 ii L):
[0043]
2 xmi RN A Reaction Buffer Mix(for Real Time)I OjaL
0.1%BSA2j.1L
MiRNA PrimcScript RT Enzyme Mix2[iL
Total RNA(10pg/j_iL~lug/‘uL)I(.1L
RNasc Free dH20Up 1 20j.1L
[0044]以上體系混勻后，瞬時(shí)離心，37°C孵育60min后，85°C孵育5sec (酶的失活反應(yīng))。停止后4°C備用，產(chǎn)物保存于-20°C。
[0045]MiRNAs real-time PCR: (PCR 試劑來(lái)源于 TaKaRa 公司，miR-219, U6 等引物由廣州銳博生物有限公司合成)
[0046]反應(yīng)體系(20iiL):
[0047]
SYBY Premix Ex Taq II (2 x)IOpL
PCR Forward Primcr(10|.1M)0.8|.1L
PCR Reverse Primer( IOjiM)0.8(.1L
ROX Rcfcrcncc Dyc II (50x)0.4(..1L
模板(cDAN溶液)2(_iL
dH206(.1L
[0048]反應(yīng)程序:
[0049]95°C 30sec— (95°C 3sec—65°C 30sec) X40cycles—Melting Curve
[0050]結(jié)果顯示:小鼠癲癇造模成功(圖1)。癲癇模型小鼠海馬中microRNA-219含量較對(duì)照正常組小鼠有明顯下降，說(shuō)明在癲癇小鼠海馬中，micix)RNA-219表達(dá)水平下降(圖2)。
[0051]實(shí)施例3.癲癇患者腦脊液microRNA-219的表達(dá)情況
[0052]1、收集5例癲癇患者及5例正常對(duì)照者腦脊液樣本(取自2013年廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者，每個(gè)病例均由兩個(gè)或以上臨床醫(yī)師確診分類(lèi))。按照實(shí)施例2所述方法提取RNA，并檢測(cè)microRNA-219的表達(dá)。
[0053]2、結(jié)果顯示:癲癇患者腦脊液中microRNA-219表達(dá)水平明顯降低(圖3)。提示microRNA-219的表達(dá)變化與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
[0054]實(shí)施例4.microRNA-219的特異性拮抗劑(antagomir-219)能誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作
[0055]1、本實(shí)驗(yàn)采用6~8周齡雄性ICR小鼠，具體分為2組:antagomir_219處理干預(yù)小鼠組及陰性對(duì)照組。antagomir-219處理干預(yù)組小鼠放置固定在小鼠腦立體定位儀上，給予側(cè)腦室微量注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir-219) 0.2nmol(0.2nmol/2.5 u L)。對(duì)照組小鼠給予同側(cè)側(cè)腦室微量注射antagomir-219的陰性對(duì)照劑antagomir-NC0.2nmol。
[0056]2、觀察小鼠的行為表現(xiàn):antagomir-219處理干預(yù)組小鼠表現(xiàn)為明顯的癲癇發(fā)作癥狀，Racine分級(jí)達(dá)到IV級(jí)。小鼠腦電圖顯示，干預(yù)組小鼠呈現(xiàn)出異常棘波波形，各導(dǎo)聯(lián)見(jiàn)每Si次，10~60 y V的癇樣放電持續(xù)發(fā)放(圖4)。對(duì)照組小鼠表現(xiàn)為正常行為，腦電圖亦無(wú)異常癇性波形(圖5)。
[0057]3、24h后，常規(guī)提取兩組小鼠海馬RNA，如實(shí)施例2的步驟分別檢測(cè)兩組小鼠海馬內(nèi)的microRNA-219表達(dá)水平。結(jié)果顯示antagomir-219處理干預(yù)組小鼠海馬內(nèi)microRNA-219表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(圖6)。
[0058]這些結(jié)果表明拮抗小鼠海馬內(nèi)的antagomir-219表達(dá)水平可誘發(fā)小鼠癲癇發(fā)作，說(shuō)明micix)RNA-219在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。
[0059]實(shí)施例5.microRNA-219及其激動(dòng)劑(agomir-219)在小鼠癲癇中的治療作用
[0060]1、本實(shí)驗(yàn)采用6-8周齡雄性ICR小鼠，具體分為4組:正常對(duì)照組(側(cè)腦室注射生理鹽水)，癲癇模型小鼠agomir-219處理干預(yù)組(KA誘發(fā)小鼠癲癇6h后側(cè)腦室注射agomir-2190.2nmol),癲癇模型小鼠agomir-219陰性對(duì)照劑(agomir-NC)處理干預(yù)組(KA誘發(fā)小鼠癲癇6h后側(cè)腦室注射agomir-NC0.2nmol) , agomir-219處理干預(yù)組(側(cè)腦室注射agomir-2190.2nmol)。
[0061]2、觀察小鼠的行為表現(xiàn):癲癇模型小鼠agomir-219處理干預(yù)組小鼠的癲癇癥狀有明顯改善，其后未見(jiàn)多次癇性發(fā)作。做小鼠腦電圖顯示，癲癇小鼠注射agomir-219后小鼠皮層癇樣放電明顯受到抑制，基本波動(dòng)為4~6HZ的0節(jié)律，間隔5~7s出現(xiàn)一次低幅癇樣放電(參見(jiàn)附圖7)。癲癇模型小鼠agomir-219陰性對(duì)照劑(agomir-NC)處理干預(yù)組小鼠癲癇癥狀無(wú)明顯改善，小鼠·Racine分級(jí)達(dá)到IV級(jí)，腦電圖顯示有異常棘波波形，各導(dǎo)聯(lián)可見(jiàn)每s3~4次，30-60 ii V棘波持續(xù)發(fā)放(圖8)。而agomir-219處理干預(yù)組小鼠表現(xiàn)正常，腦電圖亦無(wú)異常波。說(shuō)明agomir-219不影響小鼠的正常生理功能，對(duì)小鼠無(wú)損害(圖9)。
[0062]3、24h后，常規(guī)提取四組小鼠海馬RNA，如實(shí)施例2的步驟分別檢測(cè)各組小鼠海馬內(nèi)的microRNA-219表達(dá)水平。結(jié)果顯示癲癇模型小鼠agomir-219處理干預(yù)組小鼠海馬內(nèi)microRNA-219表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平(圖10)。
[0063]這些結(jié)果表明microRNA-219為拮抗癲癇及其相關(guān)疾病發(fā)病的重要保護(hù)性小分子核酸，可成為預(yù)防和治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。
[0064]實(shí)施例6.癲癇細(xì)胞模型中加入microRNA-219的激動(dòng)劑/拮抗劑后microRNA-219的表達(dá)變化情況
[0065]1、本實(shí)驗(yàn)采用懷孕18天小鼠的胚胎，取出其中海馬神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)7天后，分為如下組:正常對(duì)照組(加入生理鹽水)；癲癇細(xì)胞模型組(加入KA，終濃度為50iiM);癲癇細(xì)胞模型agomir-219處理干預(yù)組(加入KA6h候，加入agomir-2190.8nmol使終濃度為400nM);癲癇細(xì)胞模型agomir-219陰性對(duì)照劑(agomir-NC)處理干預(yù)組(處理方法同agomir-219處理組)；Agomir_219處理干預(yù)組(神經(jīng)元中加入0.8nmol agomir-219使終濃度為400nM);Antagomir-219處理干預(yù)組(神經(jīng)元中加入0.8nmol Antagomir-219使終濃度為400nM) ；Antagomir-NC處理干預(yù)組(處理方法同antagomir-219處理組)。[0066]2、24h候后，常規(guī)提取各組細(xì)胞的RNA，如實(shí)施例2的步驟分別檢測(cè)各組細(xì)胞的microRNA-219表達(dá)水平。結(jié)果如圖`11和12所示。
【權(quán)利要求】
1.microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述抗癲癇藥物為預(yù)防或治療癲癇和以癇性發(fā)作為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。
3.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述藥物按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/7088GK103656685SQ201410011211
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】鄭紅花, 鄭維紅, 唐榮, 計(jì)志林, 張?jiān)莆? 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)