組織修復(fù)材料的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：(a)使用含有溶解于水性介質(zhì)的明膠的明膠溶液來獲得含有該明膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間體，(b)進行所述含明膠中間體的干燥，(c)在所述含明膠中間體的干燥之前或之后進行所述明膠的交聯(lián)。
【專利說明】組織修復(fù)材料的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織修復(fù)材料的制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，試圖進行陷于功能障礙或功能衰竭的生物體組織/臟器的再生的再生醫(yī)療 的實用化有所發(fā)展。再生醫(yī)療是對僅靠生物體所具有的自然治愈能力無法恢復(fù)的生物體組 織使用細胞、支架及生長因子這三種因子而再次制造出與原來的組織具有相同形態(tài)或功能 的新型醫(yī)療技術(shù)。
[0003] 在再生醫(yī)療領(lǐng)域中，為了補充利用細胞進行的組織修復(fù)或者再生等，有利用生物 體親和性高的膠原或明膠的情況。特別是，有將骨或皮膚等三維結(jié)構(gòu)用于組織再生的情況， 以良好的組織再生為目的，進行了各種改良。
[0004] 例如，在國際公開第2011/027850號小冊子中公開了含有重組明膠且利用補填材 料載體本身可促進骨再生的骨再生劑及骨補填制劑。
[0005] 另外，日本特開平8-196618號公報中公開了由存在多個空孔的海綿狀膠原基質(zhì) 構(gòu)成的細胞介入性膠原制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明欲解決的技術(shù)問題
[0007] 但是，上述技術(shù)從獲得促進骨再生的組織修復(fù)材料的觀點出發(fā)，均有改善的余地。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供可獲得具有良好的組織再生能力的組織修復(fù)材料的組織 修復(fù)材料的制造方法。
[0009] 用于解決技術(shù)問題的手段
[0010] 本發(fā)明如下所述。
[0011] [1] 一種組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述工序（a)?（C):
[0012] (a)使用含有溶解于水性介質(zhì)的明膠的明膠溶液來獲得含有該明膠且具有網(wǎng)眼結(jié) 構(gòu)的含明膠中間體，（b)進行所述含明膠中間體的干燥，（c)在所述含明膠中間體的干燥之 前或之后進行所述明膠的交聯(lián)。
[0013] [2]上述[1]所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述干燥為冷凍干燥。
[0014] [3]上述[1]或[2]所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠為重組明膠。
[0015] [4]上述[1]?[3]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述含明膠 中間體的網(wǎng)眼的孔徑至少為IOum以上。
[0016] [5]上述[1]?[4]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述工序： 對所述明膠溶液進行攪拌，使所述明膠溶液中產(chǎn)生氣泡,之后對該明膠溶液進行凝膠化，從 而獲得所述含明膠中間體。
[0017] [6]上述[1]?[4]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述工序： 通過在一l〇〇°C?一 10°C的溫度下對所述明膠溶液進行冷凍，從而獲得所述含明膠中間 體。
[0018] [7]上述[1]?[6]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的 交聯(lián)為使用交聯(lián)劑、在所述干燥之前進行。
[0019] [8]上述[1]?[6]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的 交聯(lián)通過HKTC?20(TC條件下的加熱、在所述干燥之后進行。
[0020] [9]上述[1]?[8]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的 交聯(lián)通過加熱進行，并且所述明膠的交聯(lián)按照在所制造的組織修復(fù)材料5tng中添加Iml的 1摩爾/L的鹽酸并在37°C下處理5小時時的酸分解率達到20%以上的方式進行。
[0021] [10]上述[3]?[9]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明 膠具有Gly-X-Y(X及Y表示任意的氨基酸殘基）所示的序列的重復(fù)單元和細胞粘附信號。 [0022] [11]上述[10]所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明膠具有 A-[ (Gly-X-Y)n]m_B (X及Y表示任意的氨基酸殘基、m表示2?10的整數(shù)、n表示3?10的 整數(shù)、A及B各自獨立地表示任意的氨基酸殘基或氨基酸序列）所示的序列和細胞粘附信 號。
[0023] [12]上述[11]或[12]所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明膠具有 Gly-Ala-Pro-[ (Gly-X-Y) 63] 3-Gly (式中，63個X各自獨立地表示任意的氨基酸殘基、63個 Y各自獨立地表示任意的氨基酸殘基。其中，3個（Gly-X-Y)63可分別相同也可不同）所示 的序列和細胞粘附信號。
[0024] [13]上述[3]?[12]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組 明膠為以下（A)?（C)中的任一者：
[0025] (A)序列號1所示的多肽，
[0026] (B)具有與由所述（A)的氨基酸序列中的第4個?第192個氨基酸殘基構(gòu)成的部 分氨基酸序列具有80%以上序列同源性的部分序列、并且具有組織修復(fù)能力的多肽，
[0027] (C)由相對于所述（A)的氨基酸序列缺失、替換或添加有1個或多個氨基酸的氨基 酸序列構(gòu)成且具有組織修復(fù)能力的多肽。
[0028] [14]上述[1]?[13]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述組織 為骨。
[0029] [15]通過上述[1]?[14]中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法獲得的組織 修復(fù)材料，其為含有經(jīng)交聯(lián)的所述明膠且吸水率以質(zhì)量基準計為100%以上的多孔質(zhì)。
[0030] 發(fā)明效果
[0031] 通過本發(fā)明，可以提供能夠獲得具有良好的組織再生能力的組織修復(fù)材料的組織 修復(fù)材料制造方法

【具體實施方式】
[0032] [組織修復(fù)材料的制造方法]
[0033] 本發(fā)明中，"組織修復(fù)材料"是指通過植入到生物體內(nèi)而有助于該部位的組織形成 的材料，可以含有細胞也可不含細胞。另外，可以含有也可不含生長因子或藥劑等促進生物 體的反應(yīng)的成分。此外，還可以與羥磷灰石等無機材料混合或者制成復(fù)合物后應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明的"組織修復(fù)材料"不僅包含有助于植入部位中通常存在的正常組織的形 成的材料，還包含促進包括瘢痕組織等在內(nèi)的非正常組織的形成的材料。
[0035]本發(fā)明的組織修復(fù)材料的制造方法包含下述（a)?（C)的工序：(a)使用含有溶 解于水性介質(zhì)的明膠的明膠溶液來獲得含有該明膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間體（以 下稱作中間體制造工序），（b)進行所述含明膠中間體的干燥（以下稱作千燥工序），（c)在 所述含明膠中間體的干燥之前或之后進行所述明膠的交聯(lián)（以下稱作交聯(lián)工序）。
[0036]通過本制造方法，由于在獲得含有明膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間體之后對其 進行干燥，從而獲得組織修復(fù)材料，因此可獲得保持了組織修復(fù)的良好形狀的組織修復(fù)材 料。
[0037] 本說明書中"工序"的用語不僅包含獨立的工序，在與其他工序無法明確地區(qū)別時 只要能夠達成本工序所期待的作用，則也包含在本用語中。
[0038]另外，本說明書中使用"?"表示的數(shù)值范圍表示將"?"前后所記載的數(shù)值分別 作為下限值及上限值并包含在內(nèi)的范圍。
[0039] 另外，本發(fā)明中，關(guān)于組合物中的各成分的量，當(dāng)在組合物中存在多個相當(dāng)于各成 分的物質(zhì)時，只要沒有特別說明，則是指組合物中存在的該多個物質(zhì)的總量。
[0040] 本發(fā)明中，有時使用本領(lǐng)域公知的單字母表述（例如甘氨酸殘基時為"G"）或三字 母表述（例如甘氨酸殘基時為"Gly"）來表述構(gòu)成多肽的氨基酸序列。
[0041] 另外，本發(fā)明中的組織修復(fù)材料是指經(jīng)過了干燥工序及交聯(lián)工序的材料，含明膠 中間體是指未經(jīng)過干燥工序及交聯(lián)工序中的至少一者的材料。
[0042] 以下對本發(fā)明進行說明。
[0043] (a)中間體制造工序
[0044] 中間體制造工序中，使用含有溶解于水性介質(zhì)的明膠的明膠溶液來獲得含有該明 膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間體。
[0045] 所述明膠是指連續(xù)含有6個以上Gly-X-Y所示的序列的多肽，多肽中除了 Gly-X-Y 所示的序列以外，還可以具有1個以上其他氨基酸殘基。Gly-X-Y所示的序列是相當(dāng)于膠原 的部分氨基酸序列來源的氨基酸序列的序列，該序列的重復(fù)意味著膠原的特征性序列。
[0046] 多個Gly-X-Y可分別相同也可不同。另外，Gly_X-Y序列中X和Y在各個重復(fù)單元 中是獨立的，可以相同也可不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸殘基、X及Y表示除甘氨酸殘 基以外的任意的氨基酸殘基。作為X及Y，優(yōu)選大量含有亞氨基酸殘基，即脯氨酸殘基或羥 基脯氨酸殘基。這種亞氨基酸殘基的含有率優(yōu)選占所述明膠整體的 10%?45%。作為所 述明膠中的Gly-X-Y的含有率，優(yōu)選為整體的S0%以上、更優(yōu)選為95%以上、最優(yōu)選為的％ 以上。
[0047] 作為所述明膠，可以是天然型的，天然型可以是至少1個氨基酸殘基不同的突變 型。另外，作為所述明膠，優(yōu)選是通過常規(guī)方法將堿基序列或氨基酸序列導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗?中并使其表達所獲得的重組明膠，所述堿基序列或氨基酸序列相對于編碼連續(xù)具有 6個以 上所述Gly-X-Y所示的序列的所述膠原的基因的堿基序列或氨基酸序列施有1個以上堿基 或氨基酸殘基的變更。通過使用這種重組明膠，在提高組織修復(fù)能力的同時，與使用天然明 膠的情況相比，可以表現(xiàn)出各種特性，例如具有可以避免生物體的排斥反應(yīng)等不良影響等 的優(yōu)點。
[0048] 作為所述重組明膠，例如可特別優(yōu)選地使用EP1014176A2、USe9 92l72、 W〇2〇04/85473、W02008/103041、日本特表 2〇10_519293、日本特表 2010_519252、日本特表 2010-518833、日本特表 2010-519251、W02010/128672 及 W02010/147109 等所公開的重組明 膠。
[0049] 另外，所述重組明膠的分子量優(yōu)選為2kDa以上且IOOkDa以下、更優(yōu)選為5kDa以 上且90kDa以下、進一步優(yōu)選為IOkDa以上且90kDa以下。
[0050] 所述重組明膠從生物體親和性的角度出發(fā)，優(yōu)選進一步含有細胞粘附信號，更優(yōu) 選在一個分子中具有2個以上存在于所述重組明膠的細胞粘附信號。作為這種細胞粘附信 號，可以舉出RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG 序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的各序列，優(yōu)選地可以 舉出RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，特別優(yōu)選RGD 序列。RGD序列中，進一步優(yōu)選為ERGD序列。
[0051] 作為所述重組明膠中的RGD序列的配置，優(yōu)選RGD之間的氨基酸殘基數(shù)為0?100 個、更優(yōu)選為25?60個。另外，RGD序列優(yōu)選在這種氨基酸殘基數(shù)的范圍內(nèi)不均勻地配置。
[0052] 另外，RGD序列相對于所述重組明膠中的氨基酸殘基總數(shù)的比例優(yōu)選至少為 0. 4%，當(dāng)重組明膠含有350個以上的氨基酸殘基時，優(yōu)選350個氨基酸殘基的各延伸段含 有至少1個RGD序列。
[0053] 所述重組明膠優(yōu)選每250個氨基酸殘基含有至少2個RGD序列、更優(yōu)選含有至少3 個RGD序列、進一步優(yōu)選含有至少4個RGD序列。但是，所述重組明膠的序列優(yōu)選為以下方 式：（1)不含絲氨酸殘基及蘇氨酸殘基、（2)不含絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、天冬酰胺殘基、 釀氨酸殘基及半胱氨酸殘基，（3)不含Asp-Arg-Gly-Asp所示的氨基酸序列。所述重組明 膠可單獨具備該優(yōu)選序列的方式（1)?（3)，也可組合具備2個以上的方式。
[0054] 另外，所述重組明膠還可被部分地水解。
[0055] 所述重組明股優(yōu)選具有A-[ (Gly-X_Y)n]m-B的重復(fù)結(jié)構(gòu)。m表示2?10、優(yōu)選表不 3?5。A及B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。n表示3?100、優(yōu)選表示15?70、更優(yōu) 選表示50?60。
[0056] 優(yōu)選重組明膠用式：Gly-Ala-Pr〇-[(Gly_X-Y)63] 3-Gly(式中、63個X各自獨立地 表示氨基酸殘基中的任一種，63個Y各自獨立地表示氨基酸殘基中的任一種。其中，3個 (Gly-X-丫) 63可分別相同也可不同。）表示。
[0057] 所述重組明膠的重復(fù)單元中優(yōu)選結(jié)合有多個天然存在的膠原的序列單元。作為這 里所說的天然存在的膠原，優(yōu)選地可以舉出I型、II型、III型、IV型及V型。更優(yōu)選地可 以舉出I型、II型或III型。作為膠原的來源,優(yōu)選地可以舉出人、馬、豬、小鼠、大鼠，更優(yōu) 選為人。
[0058] 所述重組明膠的等電點優(yōu)選為5?10、更優(yōu)選為6?10、進一步優(yōu)選為7?9. 5。
[0059] 作為所述重組明膠的優(yōu)選方式，可以舉出以下方式：（1)未經(jīng)脫胺化、（2)沒有前 膠原、（3)沒有端肽、（4)利用編碼天然膠原的核酸制備的實質(zhì)上純粹的膠原用材料。所述 重組明膠可以單獨具有該優(yōu)選的方式（1)?（4)、也可組合具備2個以上的方式。
[0060] 所述重組明膠從組織修復(fù)能力高低的角度出發(fā)，優(yōu)選可以為以下（A)?（C)中的 任一者。
[0061] (A)下述序列號1所示的多肽、
[0062] GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADG APGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKG ERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLA GPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPP GPAG APGAPGLQGMPGERGMGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGV RGLAGPP)3G(序列號 I)
[0063] (B)具有與由所述（A)的氨基酸序列中的第4個?第192個氨基酸殘基構(gòu)成的部 分氨基酸序列具有80 %以上序列同源性的部分序列，并且具有組織修復(fù)能力的多肽、
[0064] (C)由相對于所述（A)氨基酸序列缺失、替換或者添加有1個或多個氨基酸殘基的 氨基酸序列構(gòu)成且具有組織修復(fù)能力的多肽。
[0065] 作為所述⑶中的序列同源性，從重組明膠的組織修復(fù)能力的觀點出發(fā)，更優(yōu)選 可以為90%以上、進一步優(yōu)選可以為95%以上。
[0066] 其中，本發(fā)明中的"序列同源性"是指用下式計算的值。
[0067] %序列同源性=[(相同殘基數(shù)V(排列長度）]X 100
[0068] 所述⑶序列中的所述部分氨基酸序列是相當(dāng)于序列號1所示的序列的重復(fù)單元 的部分氨基酸序列。所述（B)的多肽中存在多個相當(dāng)于所述重復(fù)單元的部分氨基酸序列 時，可以是含有1個以上、優(yōu)選含有 2個以上的序列同源性達到80%以上的重復(fù)單元的多 肽。
[0069] 另外，所述（B)中規(guī)定的多肽以總的氨基酸殘基數(shù)計優(yōu)選含有總氨基酸殘基數(shù)的 80%以上的、與相當(dāng)于所述重復(fù)單元的部分氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的部分 序列。
[0070] 作為所述⑶中規(guī)定的多肽的長度，可以為151個?2260個的氨基酸殘基數(shù)，從 交聯(lián)后的分解性的觀點出發(fā)，優(yōu)選為193個以上的氨基酸殘基數(shù)，從穩(wěn)定性的觀點出發(fā)，優(yōu) 選為944個以下的氨基酸殘基數(shù)，更優(yōu)選為380個?756個的氨基酸殘基數(shù)。
[0071] 另外，所述（C)中規(guī)定的多肽也可以是由相對于所述（A)的氨基酸序列缺失、替換 或添加有1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成且具有組織修復(fù)能力的多肽。
[0072] 作為所述（C)規(guī)定的多肽中缺失、替換或添加的氨基酸殘基數(shù)，可以為1個或數(shù) 個，雖然根據(jù)重組明膠的總氨基酸殘基數(shù)的不同而不同，但例如可以為2個?15個、優(yōu)選為 2個?5個。
[0073] 所述重組明膠可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因重組技術(shù)來制造，例如可根據(jù) EP1014176A2、US6992172、W02004/85473、W02008/103041 等記載的方法來制造。具體而言， 獲得編碼規(guī)定重組明膠的氨基酸序列的基因，將其組裝到表達載體中，制作重組表達載體， 將其導(dǎo)入至適當(dāng)?shù)乃拗髦?，制作轉(zhuǎn)化體。通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體，由此生產(chǎn)重組 明膠，因此通過將自培養(yǎng)物生產(chǎn)的重組明膠回收，可以制備本發(fā)明中使用的重組明膠。
[0074] 這里，組織修復(fù)能力的評價可以使用利用所述重組明膠獲得的組織修復(fù)材料來進 行。評價方法根據(jù)目標組織的不同而不同。
[0075] 例如，為骨組織時，可以通過骨再生能力進行評價。骨再生能力可如下評價：在大 鼠的頭蓋骨上制作規(guī)定大小的骨缺損部，將規(guī)定量的組織修復(fù)材料填充到骨缺損部中后， 將皮膚縫合，在手術(shù)后的第4周使用微型CT測量骨量，用再生的骨體積與骨缺損部的體積 的比例進行評價。
[0076] 另外，還可利用骨粘接來進行評價。骨粘接能力與骨再生能力評價同樣，可如下評 價：在骨缺損部中填充組織修復(fù)材料之后，將皮膚縫合，在手術(shù)后的第4周將所摘取的頭部 進行HE染色，用所填充的組織修復(fù)材料與新生骨不介由纖維性組織而接觸的區(qū)域的大小 進行評價。
[0077] 當(dāng)通過任一種評價確認到骨修復(fù)能力時，可以將所述重組明膠評價為具有組織修 復(fù)能力。
[0078] 作為所述水性介質(zhì)，只要可將明膠溶解并可用于生物體組織，則無特別限定，例如 可以舉出水、生理鹽水、磷酸緩沖液等在本領(lǐng)域中通常使用的物質(zhì)。
[0079] 對于明膠溶液中的所述明膠的含有率，只要是明膠能夠溶解的含有率則無特別限 定。例如，明膠溶液中的所述明膠的含有率例如優(yōu)選為〇. 5質(zhì)量％?20質(zhì)量％、更優(yōu)選為2 質(zhì)量16質(zhì)量％、進一步優(yōu)選為4質(zhì)量％?12質(zhì)量％。通過為所述0.5質(zhì)量％以上，有 強度進一步增高的傾向，通過為20質(zhì)量％以下，有更易形成均勻性高的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的傾向。
[0080] 其中，中間體制造工序中的明膠溶液可以準備已制備品來使用，也可在獲得含明 膠中間體之前，另外設(shè)置制備明膠溶液的工序。
[0081] 在制備明膠溶液的工序中，通過準備作為材料的所述明膠并使其溶解在所述水性 介質(zhì)中來制備。作為材料的所述明膠可以是粉末狀的，也可以是固體狀的。
[0082] 對于制備所述明膠溶液時的溫度而言，并無特別限定，可以是通常使用的溫度、例 如(TC?60°C，優(yōu)選為3°C?30°C左右。
[0083] 另外，明膠溶液中還可根據(jù)需要含有后述各工序所需的成分，例如交聯(lián)劑、對于用 于對所述組織修復(fù)材料賦予所需特性而言有用的成分等。
[0084] 作為獲得所述含明膠中間體的方法，只要是能夠形成后述的規(guī)定空隙，則可以是 任何一種方法。
[0085] 具體而言，所述含明膠中間體優(yōu)選通過包含以下工序的方法獲得：對所述明膠溶 液進行攪拌，使所述明膠溶液中產(chǎn)生氣泡（以下稱作氣泡產(chǎn)生工序），之后將該明膠溶液凝 膠化（以下稱作凝膠化工序）；或者通過包含將所述重組明膠溶液冷卻至冰晶形成溫度以 下（以下為冰晶形成工序）的方法獲得。
[0086] 使用包含氣泡產(chǎn)生工序及凝膠化工序的方法來形成所述含明膠中間體時，所述含 明膠中間體的空隙的形狀有變?yōu)榍驙畹膬A向，而使用包含所述冰晶形成工序的方法來形成 所述含明膠中間體時，所述含明膠中間體的空隙的形狀有變?yōu)橹鶢畹膬A向。
[0087] 作為適用于所述氣泡產(chǎn)生工序的所述明膠溶液的攪拌條件，只要是能夠產(chǎn)生氣泡 的能夠攪拌的條件即可。本發(fā)明中能夠產(chǎn)生氣泡的攪拌條件定義為用下式（1)表示的攪拌 弗勞德數(shù)Fr為2. 0以上及用下述式（2)表示的攪拌雷諾數(shù)Re為6000以下。
[0088] Fr = n2d/g (1)
[0089] Re = P nd2/ y (2)
[0090]兩式中，n表示攪拌數(shù)（/秒）、d表示攪拌翼的直徑（m)。式（1)中，g表示重力加 速度（m/s2);式（2)中，P表示溶液密度（kg/m3)、P表示溶液粘度（Pa ? s)。
[0091] 只要能夠進行攪拌弗勞德數(shù)Fr為2. 0以上及攪拌雷諾數(shù)Re為6000以下的攪拌， 則對攪拌所用的裝置并無特別限定，可以舉出勻漿機、溶解器、高速攪拌機等。
[0092] 關(guān)于上述攪拌條件，例如可以舉出使用T. K_ Homodisper 2. 5型（PRIMIX制）且攪 拌轉(zhuǎn)速為1400rpm條件下的攪拌。
[0093] 攪拌時的溫度從流動性和保持氣泡的角度出發(fā)優(yōu)選為2°C?50°C、更優(yōu)選為 5。。?30。。。
[0094]在凝膠化工序中，以維持產(chǎn)生了氣泡的所述明膠溶液中的氣泡的狀態(tài)進行凝膠 化。作為凝膠化的條件，例如可以在進行rc?2〇°c溫度下的冷卻之后實施固化來進行。 [0095]在包含所述冰晶形成工序的方法中，將所述明膠溶液冷卻至冰晶形成溫度以下。 由此，可獲得內(nèi)部具有適當(dāng)大小的冰晶的所述含明膠中間體。由于所形成的冰晶，所述重組 明膠的肽鏈的密度變得不規(guī)則，所述含明膠中間體發(fā)生固體化，因此在冰晶消失之后，形成 所述含明膠中間體的網(wǎng)眼的空隙。冰晶的消失可以通過后段的干燥工序來容易地進行。所 述含明膠中間體的網(wǎng)眼的孔徑可以通過冰晶溫度、冷卻時間或它們的組合來進行調(diào)整。
[0096] 冰晶形成溫度是指所述明膠溶液的至少一部分冷凍的溫度。冰晶形成溫度根據(jù) 所述明膠溶液中含有所述重組明膠的固體成分濃度的不同而不同，但一般可以為一 10°c以 下。
[0097] 優(yōu)選可以將所述明膠溶液冷卻至一 100°C?一 10°C、更優(yōu)選冷卻至_ 80°C?一 20°C。當(dāng)冷卻至一100°C以上時，有網(wǎng)眼尺寸變得足夠大的傾向，當(dāng)冷卻至一KTC以下時， 有所述含明膠中間體的網(wǎng)眼孔徑的均勻性高、可發(fā)揮良好的組織修復(fù)能力的傾向。
[0098] 作為維持于冰晶形成溫度以下的時間，從均勻性的觀點出發(fā)，優(yōu)選為1?8小時、 更優(yōu)選為1?6小時。
[0099] 在所述冰晶形成工序之前，還可設(shè)置所述的氣泡產(chǎn)生工序。由此，由于在產(chǎn)生氣泡 之后進行冰晶的形成，因此可以生成更為良好的形狀的含明膠中間體，進而有可以獲得具 有良好組織修復(fù)能力的組織修復(fù)材料的傾向。作為在所述冰晶形成工序之前實施的氣泡產(chǎn) 生工序，可以直接適用前述條件。
[0100] 通過上述中間體制造工序，可獲得含有所述明膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間 體。
[0101] 本說明書中"網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)"的用語是指內(nèi)部含有大量空隙的結(jié)構(gòu)，并不限定于平面結(jié) 構(gòu)。另外，結(jié)構(gòu)部不僅包括纖維狀的結(jié)構(gòu)，還包括壁狀的結(jié)構(gòu)。此外,是指利用含有明膠的 材料構(gòu)成的結(jié)構(gòu)物的結(jié)構(gòu)，不包括膠原纖維等分子水平的結(jié)構(gòu)。
[0102] "具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)"是指通過含有構(gòu)成所述含明膠中間體的所述重組明膠而構(gòu)成的 壁狀結(jié)構(gòu)而形成微米級以上的空隙，即具有1 ^ m以上的孔徑。
[0103] 對于所述含明膠中間體的網(wǎng)眼的形狀并無特別限定，可以是蜂窩等二維的結(jié)構(gòu)、 也可以是松質(zhì)骨等三維的結(jié)構(gòu)。另外，網(wǎng)眼的截面形狀可以是多邊形、也可以是圓或橢圓 等。另外，所述含明膠中間體中的網(wǎng)眼的三維形狀可以是柱狀、也可以是球狀。
[0104] 另外，所述含明膠中間體中還可存在連續(xù)形成有空隙的連通孔。通過存在連通孔， 空隙從所述含明膠中間體的外部連續(xù)至深部。這種空隙的連接在細胞與由所述含明膠中間 體獲得的組織修復(fù)材料的外部接觸時，能夠分散/擴散到多孔質(zhì)體的內(nèi)部。另外，連通孔由 于發(fā)揮這種功能，因此優(yōu)選為 1011 m以上。
[0105] 所述含明膠中間體的網(wǎng)眼的孔徑用長軸方向的直徑（長徑）的平均值來進行評 價。長邊的平均值如下評價。
[0106]首先，將所述含明膠中間體干燥后獲得的千燥中間體沿水平和垂直方向截斷。接 著，使各截面密合在印臺（ink pad)上進行染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察2.0mmX2.0mm的區(qū) 域。從觀察區(qū)域內(nèi)的與被染色的材料包圍的區(qū)域外接的長方形中，選擇長方形相對兩邊的 距離達到最大的外接長方形。在水平方向的各截面及垂直方向的各截面的觀察區(qū)域內(nèi)，分 別測量50個該相對兩邊的距離達到最大的外接長方形的長邊長度，將其平均值作為該含 明膠中間體的網(wǎng)眼的長徑的平均值。
[0107] 另外，對于各個網(wǎng)眼，將與上文同樣地求得的水平方向的截面的長徑平均值和垂 直方向的截面的長徑平均值中的較小者記為dl、將另一者記為d2,將該比率d2/dl作為網(wǎng) 眼長寬比。將該網(wǎng)眼長寬比為1?3的情況記為"球狀"、該范圍外的情況記為"柱狀"。
[0108] 其中，網(wǎng)眼的形狀為柱狀時（網(wǎng)眼長寬比在1?3的范圍外），網(wǎng)眼長寬比從骨粘 接的觀點出發(fā)優(yōu)選為4或5。為5以下時，有骨粘接增加的傾向。
[0109] 作為所述網(wǎng)眼的形狀，從組織修復(fù)能力的觀點出發(fā)，優(yōu)選為球狀（網(wǎng)眼長寬比為 1 ?3)。
[0110] 所述含明膠中間體的網(wǎng)眼的孔徑在網(wǎng)眼的形狀為柱狀時，從骨粘接的觀點出發(fā)， 優(yōu)選為IOym以上、更優(yōu)選為50 um以上、進一步優(yōu)選為IOOum以上。對含明膠中間體的 網(wǎng)眼的孔徑上限并無特別限定，從物質(zhì)強度穩(wěn)定的角度出發(fā)，優(yōu)選為2500um以下、更優(yōu)選 為IOOOum以下。
[0111] 所述長軸方向的直徑為20um以上時，有細胞易于侵入網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部的傾向， 為2500 um以下時，有提高與生物體的親和性的傾向。
[0112] 所述含明膠中間體的網(wǎng)眼的孔徑在網(wǎng)眼的形狀為球狀時，從骨粘接的觀點出發(fā)， 優(yōu)選為10 y m以上、更優(yōu)選為50 y m以上、進一步優(yōu)選為100 ii m以上。對含明膠中間體的網(wǎng) 眼的孔徑上限并無特別限定，通常為25OOum以下，從骨粘接的角度出發(fā)，優(yōu)選為 10〇〇ym 以下。網(wǎng)眼的形狀為球狀時，所述網(wǎng)眼的孔徑（長寬比超過1時為長軸方向的直徑）為 IOym以上時，有細胞易于侵入網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部的傾向，為2500um以下時，有提高與生物 體的親和性的傾向。
[0113] 所述含明膠中間體的空隙率優(yōu)選為80%以上且99. 99%以下、更優(yōu)選為95. 01% 以上且99.9%以下。其中，空隙率利用體積密度（p)和真密度（pc)用空隙率（P= (1 _ p/pc) X100(% ))求得。體積密度（p)由干燥質(zhì)量和體積算出，真密度（pc)可利用 Gay-Lussac型比重瓶法求得。
[0114] (b)干燥工序
[0115] 千燥工序中，進行所述含明膠中間體的干燥。
[0116]作為干燥方法，有流化床干燥法、薄膜干燥法、噴霧千燥法、冷凍干燥法等，優(yōu)選使 用冷凍干燥法。
[0117]作為冷凍條件，可以直接采用蛋白質(zhì)的冷凍干燥中通常使用的條件。作為冷凍干 燥的期間，例如可以為〇?5小時?3〇〇小時。對于能夠使用的冷凍干燥器也無特別限定。 [0118] (C)交聯(lián)工序
[0119]在所述千燥工序之前或之后進行的交聯(lián)工序中，進行所述重組明膠的交聯(lián)。
[0120]作為交聯(lián)的方法，可以使用熱交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)、利用醛類（例如甲醛、戊二醛等）的 交聯(lián)、利用縮合劑（碳化二亞胺、氨腈等）的交聯(lián)、酶交聯(lián)、光交聯(lián)、UV交聯(lián)、疏水性相互作 用、氫鍵、離子性相互作用等公知的方法。
[0121]作為光交聯(lián)，可以舉出利用對導(dǎo)入有光反應(yīng)性基團的高分子進行光照射或者在光 敏劑的存在下進行光照射的方法。作為光反應(yīng)性基團，例如可以舉出肉桂基、香豆素基、二 硫代氨基甲?；?、咕噸染料、樟腦醌。
[0122] 進行利用酶的交聯(lián)時，作為酶，只要是具有生物降解性材料間的交聯(lián)作用則無特 別限定，優(yōu)選可以使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和漆酶進行交聯(lián)，最優(yōu)選使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)。
[0123] 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以是哺乳類來源，也可以是微生物來源，具體而言可以舉出味之 素株式會社制ACTIVA系列，作為試劑出售的哺乳類來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、例如Oriental酵 母工業(yè)株式會社制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等的藤鼠肝臟來源 的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、山羊來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、兔來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等、人類來源的血液凝 固因子（Factor Xllla、Haematologic Technologies，Inc.公司）等。
[0124] 本發(fā)明中，利用醛類或縮合劑等交聯(lián)劑進行處理時的與所述明膠的混合溫度只要 是能夠均勻地攪拌溶液，則無特別限定，優(yōu)選為(TC?40°C、更優(yōu)選為(TC?30°C、更優(yōu)選為 3°C?25°C、更優(yōu)選為3°C?15°C、進一步優(yōu)選為3°C?10°C、特別優(yōu)選為3°C?7°C。
[0125] 混合攪拌交聯(lián)劑之后，可以提高溫度。作為反應(yīng)溫度，只要交聯(lián)進行，則無特別限 定，考慮到所述明膠的變性或分解時，實質(zhì)上為〇°C?60°C、更優(yōu)選為0°C?40°C、更優(yōu)選為 3°C?25°C、更優(yōu)選為3°C?15°C、進一步優(yōu)選為3°C?10°C、特別優(yōu)選為3°C?7°C。
[0126] 作為交聯(lián)的方法，優(yōu)選為使用化學(xué)交聯(lián)劑的交聯(lián)法或熱交聯(lián)法。使用了化學(xué)交聯(lián) 劑的交聯(lián)法的情況下，更優(yōu)選使用了戊二醛作為化學(xué)交聯(lián)劑的交聯(lián)。
[0127] 采用使用了化學(xué)交聯(lián)劑的交聯(lián)法時，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)劑添加在所述明膠溶液中并在 所述干燥工序之前進行交聯(lián)。
[0128] 熱交聯(lián)法中所適用的交聯(lián)溫度優(yōu)選為KKTC?20(TC、更優(yōu)選為IKTC?180°C、進 一步優(yōu)選為120°C?160°C。通過采用熱交聯(lián)法，可以避免使用交聯(lián)劑。當(dāng)使交聯(lián)溫度為 KKTC以上時，可以使交聯(lián)充分地進行。而使交聯(lián)溫度為200°C以下時，由于不發(fā)生除交聯(lián)以 外的副反應(yīng),因此優(yōu)選。
[0129] 進行上述熱交聯(lián)處理的環(huán)境氣體只要氧和氫氣的濃度保持為足夠低，則無特別限 定，優(yōu)選在不活潑性氣體或5kPa以下的真空中進行。對不活潑性氣體的壓力并無特別限 定，優(yōu)選在0. 15MPa以下的壓力下進行。另外，對不活潑性氣體的種類也無限定，優(yōu)選使用 氮氣。
[0130] 關(guān)于交聯(lián)時間，以下述酸分解性為指標，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)供于交聯(lián)的明膠 的性狀以及成為對象的組織來適當(dāng)?shù)剡x擇。通過延長交聯(lián)時間和/或降低交聯(lián)溫度，酸分 解性降低。
[0131] 酸分解性例如在為以骨組織為對象的修復(fù)材料時，優(yōu)選顯示通過使用了 1摩爾/ L (升）鹽酸的5小時分解處理獲得的以質(zhì)量基準計為80%以下的殘留率，進一步優(yōu)選3小 時處理時的殘留率為10%?70%。使用上述序列號1所示的多肽作為供于交聯(lián)的明膠時， 所述殘留率可通過在真空（包括OMPa)?0. 15MPa的不活潑性氣體中、在120?150°C下進 行4?20小時的處理來實現(xiàn)。
[0132] 另外，采用熱交聯(lián)法時，從所得組織修復(fù)材料的形狀及組織修復(fù)能力的觀點出發(fā)， 優(yōu)選在所述干燥工序之后進行。
[0133] [酸分解性]
[0134] 本發(fā)明的組織修復(fù)材料的酸分解性如下測定。酸分解性可用酸分解率表示。
[0135] 對測定用的微型管（以下稱為管）的質(zhì)量進行測定（A)。稱量組織修復(fù)材料 5.0(±0_2)mg(B)，填充到測定用管中。在裝有組織修復(fù)材料的管中添加L〇ml的1摩爾 /L的HC1，利用設(shè)定為37°C的振蕩恒溫器（HB-80(Taitec)、1分鐘的振蕩次數(shù)：60次）振 蕩規(guī)定的時間。規(guī)定時間后，將管立在冰上，停止反應(yīng)，利用預(yù)先設(shè)定為4。(：的離心器離心 IOOOOX gU分鐘。確認組織修復(fù)材料沉淀后，吸取上清,添加預(yù)先在冰上冷卻了的超純水 lml，在與上述相同的條件下再次離心。吸取上清，再次添加超純水，在與上述相同的條件下 再次進行離心。吸取上清之后，進行冷凍干燥。干燥結(jié)束后，從冷凍干燥機中取出，為了防 止組織修復(fù)材料吸取空氣中的水分，迅速地將管的蓋子蓋上。測定各個管子的質(zhì)量（C)、使 用下述計算式（ 3)計算殘留率。酸分解性使用下述計算式（4)算出。
[0136] 殘留率=(C _ A)/BX100(% ) (3)
[0137] 酸分解率=100 _殘留率（％ ) (4)
[0138]本發(fā)明的組織修復(fù)材料中，優(yōu)選5小時的分解處理下上述殘留率為80%以下。當(dāng) 5小時下的殘留率超過80 %時，有組織再生速度降低的傾向。本發(fā)明的組織修復(fù)材料中，從 缺損部位的空間維持、與再生骨的替換的觀點出發(fā)，殘留率更優(yōu)選在 3小時處理下為70質(zhì) 量％以下、進一步優(yōu)選為60質(zhì)量％以下。另外，在本發(fā)明的組織修復(fù)材料中，從植入部位的 空間維持的觀點出發(fā)，殘留率的下限值優(yōu)選在3小時處理下為1〇質(zhì)量％以上、進一步優(yōu)選 為30質(zhì)量％以上。
[0139][組織修復(fù)材料]
[0140]通過本發(fā)明的制造方法獲得的組織修復(fù)材料是含有經(jīng)交聯(lián)的所述重組明膠、吸水 率以質(zhì)量基準計為100%以上的多孔質(zhì)的組織修復(fù)材料。通過制成這種組織修復(fù)材料，可以 發(fā)揮良好的組織修復(fù)能力。
[0141] 所述組織修復(fù)材料的吸水率是指在25°C下將約15mg的組織修復(fù)材料填充在 3cmX 3cm的尼龍網(wǎng)制的袋中，利用離子交換水使其膨潤2小時后,風(fēng)干10分鐘時利用下述 式（5)計算的比。
[0142] 吸水率=(w2 -wl -w0) /wO (5)
[0143] 式中，wO表示吸水前的材料的質(zhì)量、wl表示吸水后的空袋的質(zhì)量、w2表示包括吸 水后的材料在內(nèi)的袋整體的質(zhì)量。
[0144] 所述吸水率從組織的修復(fù)能力的觀點出發(fā)，優(yōu)選為100%以上、更優(yōu)選為200%以 上、進一步優(yōu)選為400%以上。對所述吸水率的上限并無特別限定，通常為9900%以下、優(yōu) 選為5000%以下。吸水率為1〇〇%以上時，例如有骨再生率變得良好的傾向。
[0145] 所述組織修復(fù)材料是具備所述含明膠中間體的規(guī)定的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)來源的空隙的多 孔質(zhì)體。
[0146] 本說明書中"多孔質(zhì)"是指在主體內(nèi)部具有多個空孔的材料或?qū)@種材料進行粉 碎所獲得的材料。在這些材料中，所述內(nèi)部的空孔可以相互連通、也可以部分或全部空孔開 口至材料表面上。
[0147] 所述含明膠中間體的規(guī)定的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)即便是在所述干燥工序之后（根據(jù)不同情 況為交聯(lián)工序之后）也能夠良好地維持，因此所述組織修復(fù)材料在結(jié)構(gòu)上的特性與所述含 明膠中間體的特性基本相同。
[0148] 所述組織修復(fù)材料的空隙率與所述含明膠中間體同樣地優(yōu)選為80%以上且 99. 99 %以下、進一步優(yōu)選為95. 01 %以上且99_ 9%以下。其中，空隙率為利用體積密度 (P)和真密度（PC)用空隙率（P= (I - P/pc) x 100(%))求得的值。體積密度（P) 由干燥重量和體積算出，真密度（Pc)可利用Hubbard型比重瓶法求得。
[0149]另外，所述組織修復(fù)材料中與所述含明膠中間體同樣地也可存在連通孔。通過存 在連通孔，空隙從所述組織修復(fù)材料的外部連續(xù)至深部，由此與組織修復(fù)材料的外部接觸 的細胞能夠分散/擴散至多孔質(zhì)體的內(nèi)部。另外，連通孔的孔徑為了發(fā)揮上述功能，優(yōu)選為 10 U m以上。
[0150]所得的組織修復(fù)材料還可在之后進一步進行粉碎、粉末化。由此，可以獲得便利性 優(yōu)異的粉末形態(tài)的組織修復(fù)材料。作為適于粉碎的粉碎方法，并無特別限定，可以直接適用 為了將冷凍千燥物粉末化而通常使用的方法。
[0151]本發(fā)明的組織修復(fù)材料例如可利用上述的骨再生率、骨粘接或它們的組合進行特 別規(guī)定。
[0152] 作為骨再生率，可以直接適用前述的骨再生率。骨再生率只要為22%以上，則作為 組織的修復(fù)充分，優(yōu)選為25%以上。
[0153] 另外，作為骨粘接，只要為20%以上，則作為組織的修復(fù)充分，優(yōu)選為25%以上。 [0154]作為能夠利用本發(fā)明的組織修復(fù)材料進行修復(fù)的組織，優(yōu)選為牙齒、骨等硬組織。 所述組織修復(fù)材料特別是可作為骨再生用、組織的修復(fù)材料或治療劑等使用。本發(fā)明的組 織修復(fù)材料可單獨作為骨再生治療劑使用。只要是骨再生、骨新生所需要的治療，則對疾病 并無限定。此外，本發(fā)明的組織修復(fù)材料通過與移植細胞、骨誘導(dǎo)藥劑并用，也可作為骨再 生治療劑使用。作為骨誘導(dǎo)藥劑，例如可以舉出BMP(骨形成因子）或bFGF(堿性成纖維細 胞生長因子），并無特別限定。
[0155] 另外，本發(fā)明由于能夠提供上述組織修復(fù)能力良好的組織修復(fù)材料，因此組織的 修復(fù)方法、伴隨有組織損傷的疾病等的治療方法也包含在本申請發(fā)明內(nèi)。
[0156] 具體而言，本發(fā)明的組織的修復(fù)方法包含對對象組織發(fā)生缺損或損傷的部位應(yīng)用 所述組織修復(fù)材料，并包含根據(jù)需要的其他工序。
[0157]另外，本發(fā)明的損傷組織的治療方法包括對對象組織發(fā)生缺損或損傷的部位應(yīng)用 所述組織修復(fù)材料或在對象組織為骨時應(yīng)用所述骨再生治療劑的工序，并包含根據(jù)需要的 其他工序。作為其他工序，例如可以舉出在將移植細胞和/或所述骨誘導(dǎo)劑應(yīng)用于組織修 復(fù)材料的前后或者同時，將組織修復(fù)材料應(yīng)用于所要應(yīng)用的部位。
[0158] 所述治療方法或修復(fù)方法可優(yōu)選用于頌面部區(qū)域的牙周組織缺損（periodontal defect)、植入物缺損（implant defect)等；作為植入物埋入時的預(yù)備處置的GBR法、牙 槽嵴增高術(shù)（Ridge Augmentation)、竇底提升術(shù)（sinus lift method)或牙槽骨保留術(shù) (socket reservation method)等。
[0159] 實施例
[0160] 以下使用實施例對本發(fā)明進行更詳細地說明。但是，本發(fā)明并不受這些實施例的 任何限定。其中，只要無特別說明，則" ％ "為質(zhì)量基準。
[0161] [實施例1]
[0162] 使用重組多肽CBE3作為重組明膠來制造實施例1中的組織修復(fù)材料。
[0163] 作為CBE3,使用以下記載的物質(zhì)（記載于W02008-103041中）。
[0164] CBE3
[0165] 分子量：51. 6kD
[0166] 結(jié)構(gòu)：GAP [(GXY)6J3G
[0167] 氨基酸數(shù)：571個
[0168] RGD 序列：12 個
[0169] 亞氨基酸含量：33%
[0170] 幾乎100 %的氨基酸為GXY的重復(fù)結(jié)構(gòu)。
[0171] CBE3的氨基酸序列不含絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、天冬酰胺殘基、酪氨酸殘基及半 胱氨酸殘基。
[0172] CBE3 具有 ERGD 序列。
[0173] 等電點：9.34
[0174] 氨基酸序列（序列號1)
[0175] GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADG APGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKG ERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLA GPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPP GPAG APGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGV RGLAGPP) 3G
[0176] 使含有I2質(zhì)量％的所述重組明膠的明膠水溶液流入鋁制盤中后，在一201；冰箱 內(nèi)靜置過夜，從而獲得冷凍的明膠塊。對該明膠塊進行冷凍干燥，獲得千燥中間體1。利用 粉碎機粉碎該干燥中間體1，回收通過篩孔為710 u m的篩子且不通過篩孔為500 y m的篩子 的級分，然后在減壓下、160°C下處理15小時，作為試樣1。
[0177] 分別如下評價干燥中間體1的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑（長徑）的 平均值、試樣1的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0178] (1)干燥中間體1的網(wǎng)眼的形狀、長徑的平均值
[0179] 將干燥中間體1沿水平和垂直方向截斷。接著，使各截面密合在印臺上進行染色， 利用光學(xué)顯微鏡觀察2. OmmX2. Omm的區(qū)域。從觀察區(qū)域內(nèi)的與被染色的材料包圍的區(qū)域 外接的長方形中，選擇長方形相對兩邊的距離達到最大的外接長方形。在水平方向的各截 面及垂直方向的各截面的觀察區(qū)域內(nèi)，分別測量50個該相對兩邊的距離達到最大的外接 長方形的長邊長度，將其平均值作為該干燥中間體1的網(wǎng)眼的長徑的平均值。
[0180]另外，對于此時的各個網(wǎng)眼，將水平方向的截面的長徑（平均值）和垂直方向的截 面的長徑（平均值）中的較小者記為dl、另一者記為d2,求出所得的比率d2/dl (網(wǎng)眼長寬 比），將該網(wǎng)眼長寬比為1?3的情況記為"球狀"、該范圍外的情況記為"柱狀"，評價剛艮 的形狀。將結(jié)果示于表1。
[0181] (2)吸水率
[0182] 在25°C下將約15mg的試樣1填充到3cmX3Cm的尼龍網(wǎng)制的袋中，利用離子交換 水使其膨潤 2小時，然后風(fēng)干10分鐘。在各個階段測定質(zhì)量，根據(jù)式（5)求出吸水率。將 結(jié)果示于表1。
[0183] 吸水率=(w2 -wl 一 w0) /wO (5)
[0184] 式中，wO表示吸水前的材料的質(zhì)量、wl表示吸水后的空袋的質(zhì)量、W2表示包括吸 水后的材料在內(nèi)的袋整體的質(zhì)量。
[0185] (3)骨再生評價
[0186] 在SD大鼠（雄性、1〇?12周齡、〇. 3kg?0. 5kg)的頭蓋骨上制作直徑為5mm的 圓形的骨缺損部，將約3. 6mg的試樣1填充到所制作的骨缺損部中，然后將皮膚縫合。在手 術(shù)后的第4周，使用微型CT測量大鼠的頭蓋骨的骨量，將相對于缺損部體積的缺損部內(nèi)部 的骨體積作為骨再生率（％)。將結(jié)果示于表1。
[0187] (4)骨粘接評價
[0188] 在SD大鼠（雄性、10?12周齡、0. 3kg?0. 5kg)的頭蓋骨上制作直徑為5mm的 圓形的骨缺損部，將約3. 6mg的試樣1填充到所制作的骨缺損部中，然后將皮膚縫合。在手 術(shù)后的第4周，在戊巴比妥麻醉下將其放血致死，摘出頭部。對包括埋入部在內(nèi)的頭蓋骨進 行HE染色，進行組織學(xué)觀察。計數(shù)所埋設(shè)的試樣1與新生骨不介由纖維性組織而接觸的部 位，根據(jù)所埋設(shè)的試樣1的平均1處的接觸位置數(shù)（骨粘接率），如下進行評價。將結(jié)果示 于表1。
[0189] 骨粘接率為30%以上時：良（A)
[0190] 骨粘接率為20%以上且小于30%時：尚可⑶
[0191] 骨粘接率小于20%時：不良（C)
[0192] [實施例2]
[0193]使含有12質(zhì)量％的實施例1中所用CBE3的明膠水溶液流入不銹鋼制盤中后， 在一 50°C冰箱內(nèi)靜置8小時，從而獲得冷凍的明膠塊。對該明膠塊進行冷凍干燥，獲得千燥 中間體2。利用粉碎機粉碎該干燥中間體2,回收通過篩孔為710 Um的篩子且不通過篩孔 為500 Iim的篩子的級分，然后在減壓下、16(TC下處理19小時，獲得試樣2。
[0194]與實施例1同樣地評價干燥中間體2的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑 (長徑）的平均值、試樣2的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0195][實施例3]
[0196]在于9 C下冷卻了的壺內(nèi)、使用T. K. Homodisper 2. 5型、以1400rpm對含有12質(zhì) 量％的實施例1中所用CBE3的明膠水溶液進行攪拌，然后在一 5〇。〇冰箱內(nèi)靜置8小時，從 而獲得冷凍的明膠塊。其中，本條件下的攪拌相當(dāng)于攪拌弗勞德數(shù)Fr為2. 22及攪拌雷諾 數(shù)為37〇0的攪拌條件。對該明膠塊進行冷凍干燥，獲得干燥中間體3。利用粉碎機粉碎該 千燥中間體 3,回收通過篩孔為710 Um的篩子且不通過篩孔為500 iim的篩子的級分，然后 在減壓下、160°C下處理19小時，獲得試樣3。 ''
[0197] 與實施例1同樣地評價干燥中間體3的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑 (長徑）的平均值、試樣2的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0198] [實施例4] _9]使實施例1中所用CBE3的最終濃度為L 5質(zhì)量％，制備明膠水溶液，使該明膠水 溶液流入不銹鋼制盤中后，在一 SCTC冰箱內(nèi)靜置8小時，從而獲得冷凍的明膠塊。對該明 膠塊進行冷凍干燥，獲得干燥中間體4。利用粉碎機粉碎該干燥中間體4,回收通過篩孔 710 y m的篩子且不通過篩孔為500 u m的篩子的級分，然后在減壓下、16(rC下處理19小時， 獲得試樣4。
[0200]與實施例1同樣地評價干燥中間體4的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑 (長徑）的平均值、試樣4的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0201][實施例5]
[0202]使實施例1中所用CBE3的最終濃度為7_ 5質(zhì)量％，制備明膠水溶液，使該明膠 水溶液流入培制容器中后，在一 40 C冰箱內(nèi)介由隔熱材料設(shè)置在經(jīng)過預(yù)冷的硬錯合金 (duralumin)塊上，靜置1小時，從而獲得冷凍的明膠塊。對該明膠塊進行冷凍干燥，獲得干 燥中間體5。利用粉碎機粉碎該千燥中間體5,回收通過篩孔為710 u m的篩子且不通過篩 孔為500 u m的篩子的級分，然后在0? 08MPa氮氣氣氛下、137。(：下處理7小時，獲得試樣5。 [0203]與實施例1同樣地評價干燥中間體5的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑 (長徑）的平均值、試樣5的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0204][比較例1]
[0205] 使含有12質(zhì)量％的實施例1中所用CBE3的明膠水溶液流入聚丙烯制盤中后，在 冰箱（4°C)內(nèi)靜置1周，從而獲得干燥的明膠塊。對該明膠塊進行冷凍干燥，獲得干燥中 間體6。利用粉碎機粉碎該干燥中間體 6,回收通過篩孔為710 u m的篩子且不通過篩孔為 500 um的篩子的級分，然后在減壓下、160°C下處理19小時，獲得試樣6。
[0206]與實施例1同樣地評價干燥中間體6的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的形狀觀察及長軸方向的直徑 (長徑）的平均值、試樣6的吸水率、骨再生及骨粘接。
[0207]表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述（a)?（c)的工序：(a)使用含有溶解于 水性介質(zhì)的明膠的明膠溶液來獲得含有該明膠且具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的含明膠中間體，（b)進行 所述含明膠中間體的干燥，（c)在所述含明膠中間體的干燥之前或之后進行所述明膠的交 聯(lián)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述干燥為冷凍干燥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠為重組明膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述含明膠中 間體的網(wǎng)眼的孔徑至少為10 μ m以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述工序： 對所述明膠溶液進行攪拌，使所述明膠溶液中產(chǎn)生氣泡，之后對該明膠溶液進行凝膠化，從 而獲得所述含明膠中間體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其包含下述工序： 通過在一 KKTC?一 10°C的溫度下對所述明膠溶液進行冷凍，從而獲得所述含明膠中間 體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的交 聯(lián)使用交聯(lián)劑、在所述干燥之前進行。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的交 聯(lián)通過10(TC?20(TC條件下的加熱、在所述干燥之后進行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述明膠的 交聯(lián)通過加熱進行，并且所述明膠的交聯(lián)按照在所制造的組織修復(fù)材料5mg中添加 lml的 1摩爾/L的鹽酸并在37°C下處理5小時時的酸分解率達到20%以上的方式進行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3?9中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明 膠具有Gly-X-Y所示的序列的重復(fù)單元和細胞粘附信號；其中，X及Y表示任意的氨基酸殘 基。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明膠具有 A-[ (Gly-X_Y)n]m-B所不的序列和細胞粘附彳目號；其中，X及Y表不任意的氨基酸殘基、m表 示2?10的整數(shù)、η表示3?10的整數(shù)、A及B各自獨立地表示任意的氨基酸殘基或氨基 酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明膠具有 Gly-Ala-Pro- [ (Gly-X-Y) 63] 3-Gly所示的序列和細胞粘附信號；式中，63個X各自獨立地表 示任意的氨基酸殘基、63個Y各自獨立地表示任意的氨基酸殘基，其中，3個（Gly-X-Y) 63可 分別相同也可不同。
13. 根據(jù)權(quán)利要求3?12中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述重組明 膠為以下㈧?（C)中的任一者： ㈧序列號1所示的多肽， (B) 具有與由所述（A)的氨基酸序列中的第4個?第192個氨基酸殘基構(gòu)成的部分氨 基酸序列具有80 %以上序列同源性的部分序列、并且具有組織修復(fù)能力的多肽， (C) 由相對于所述（A)的氨基酸序列缺失、替換或添加有1個或多個氨基酸的氨基酸序 列構(gòu)成且具有組織修復(fù)能力的多肽。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1?13中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法，其中，所述組織為 骨。
15. 通過權(quán)利要求1?14中任一項所述的組織修復(fù)材料的制造方法獲得的組織修復(fù)材 料，其為含有經(jīng)交聯(lián)的所述明膠且吸水率以質(zhì)量基準計為100%以上的多孔質(zhì)。
【文檔編號】A61L27/00GK104244999SQ201380013634
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月12日
【發(fā)明者】大屋章二, 酒井秀一, 川上愛, 平塚崇浩, 伏見英生, 山口雄大, 西村一郎, 大野由尊, 小椋泉 申請人:富士膠片株式會社