專利名稱：一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種脂肪酶，尤其涉及一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶；另外，本發(fā)明還涉及該疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法和應用。
背景技術：
脂肪酶廣泛地存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻子、油菜子，當油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內，各類脂肪酶控制著消化、吸收、 脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富。由于微生物種類多、繁殖快，具有比動植物更廣的作用PH值、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，在脂質代謝中發(fā)揮著重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。也可以催化其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶反應條件溫和，具有優(yōu)良的立體選擇性，并且不會造成環(huán)境污染，因此，在食品、皮革、醫(yī)藥、飼料、洗滌劑和造紙等許多工業(yè)領域中均有廣泛的應用。一、脂肪酶在食品工業(yè)中的應用I.脂肪酶在面類食品加工中的應用面類制品的口感主要與小麥粉中的蛋白質、淀粉、脂肪等有關，特別是通過蛋白質的定向和形成網眼結構產生彈性，增加面的黏彈性。在面類食品加工中，以手工方式沿著壓延方向進行多方面揉壓，或是以機械方式沿著單一方向進行長時間的壓延，都會增加面的彈性、提高面類食品的質量，但采用上述兩種方法比較耗時。在面類食品生產時，可以將溶解有脂肪酶的水直接加入面粉中，然后在常溫下放置一段時間進行壓延處理，添加脂肪酶后產品品質會得到大幅度提高。脂肪酶能催化面粉中甘油三酯水解生成甘油二酯，甘油一酯或甘油。它對面團有強筋作用，能夠提高面包的入爐急脹，增大面包體積，且對面包芯有二次增白作用。2.脂肪酶在食用油脂工業(yè)上的應用2. I酶促油脂水解將油脂與水一起在催化劑作用下生成脂肪酸和甘油的反應叫油脂水解反應，它在脂肪酸與肥皂工業(yè)上被廣泛應用。傳統(tǒng)的油脂水解反應使用無機酸、堿及金屬氧化物等化學物質作為催化劑，需要高溫、中高壓、長時間及設備耐腐蝕的條件，其成本高、能耗大、操作安全性差，而且產物脂肪酸顏色深或生熱聚合，不適用于熱敏性油脂，如含共軛酸的油脂、易發(fā)生共軛化的油脂、易發(fā)生脫水的含油脂魚油等。脂肪酶水解法可以克服以上缺點， 防止常規(guī)法中極易出現的副反應，可為食品工業(yè)提供優(yōu)質的原料。2. 2酶促酯交換將一種酯與另一種脂肪酸或醇或酯混合并伴隨酰基交換生成新酯的反應叫酯交換反應。這是油脂工業(yè)常用來進行油脂改性的一種重要手段。傳統(tǒng)的酯交換工藝采用的是化學方法，但會產生許多副產品。如果用非特異性脂肪酶來催化甘三酯的酯交換，也會得到與化學法酯交換類似的結果?？梢愿纳剖秤糜偷馁|量，開發(fā)新食用油的品種，提高食用油的
營養(yǎng)價值。3.脂肪酶在乳品工業(yè)中的應用脂肪酶應用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉風味的增強、奶酪的熟化、代用奶制品的生產、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并產生脂肪酸，能賦予奶制品獨特的風味。脂肪酶釋放的短碳鏈脂肪酸(C4-C6)使產品具有一種獨特強烈的奶風味，而釋放的中碳脂肪酸(C10-C14)使產品具有皂似的風味。同時，由于脂肪酸參與到類似微生物反應的過程中，增加了一些新風味物質，如甲基酮類、風味酯類和乳酯類等。4.脂類的合成脂肪酶還可以催化甘油脂的合成，合成食用香料脂。在有機溶劑中催化合成低分子量羧酸酯系列香精酯、萜烯醇酯、中長鏈脂肪酸短鏈醇酯及長鏈脂肪酸長鏈脂肪醇酯等系列產品為食品工業(yè)提供新型的天然食品添加劑。多聚甘油和碳水化合物脂肪酸酯可以作為工廠的洗滌劑和各種食品配方(低脂肪的醬料、沙司、冰激凌和蛋黃醬等)的乳化劑而被廣泛使用，用脂肪酶在適當的條件下可以合成功能相似的表面活性劑單酯和二酯。二、脂肪酶在皮革工業(yè)中的應用在皮革上主要是用于豬，牛和羊皮的脫脂，動物皮中的脂肪含量較高，如不進行完全脫脂處理，得不到優(yōu)質的產品。用脂肪酶脫脂比堿法脫脂效果好，不傷害膠原纖維，皮革柔軟、易于染色。也可以配合蛋白酶一起脫毛，比單獨使用蛋白酶的效果要好。在鞣制軟化的工序中，同蛋白酶、胰酶一起使用，能夠縮短媒染的時間，而且皮革柔軟性、透氣性、絲光感均比較好，皮品無油膩感、豐滿、彈性好，使用中無副作用。三、脂肪酶在紡織工業(yè)上的應用生絲中除了含有絲膠外，還含有油脂和蠟質等雜質，在織造的過程中，也會沾染上油脂，影響了絲纖維的光澤、手感以及染色等方面的性能。常用的方法有皂堿法和腐化法。 前一種方法效果不理想且會污染環(huán)境，后一種方法勞動強度大且周期長。用脂肪酶和蛋白酶同時除蠟和脫膠處理后，絲纖維的失重率、潤濕性、染料上染率、顯微結構、手感和光澤等性能均得到改善，絲纖維其縱向表面更加干凈，吸水性更好。在羊毛纖維表面上有一層鱗片層，是導致氈縮、染色和手感不好的一個關鍵因素，傳統(tǒng)的方法是用有機氯法去除，但對環(huán)境帶來很大的危害。用脂肪酶來去除這些脂類物質，羊毛的氈縮性可以得到改善。在棉纖維上用脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶一起精練，纖維的白度增加，染色上染率提高，染色瑕疵減少， 變得更加柔軟。四、脂肪酶在飼料工業(yè)中的應用脂肪在畜禽體內的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2. 25倍，可滿足動物體對較高能量濃度的要求；脂肪是脂溶性維生素和某些激素的溶劑，促進對這些物質的吸收和利用，同時為畜禽提供必需的不飽和脂肪酸，保證畜禽的健康生長；添加脂肪還可減少飼料加工過程中的粉塵，改善飼料外觀，在高溫條件下，還有利于提高能量攝入量，降低畜禽的體熱增耗，減緩熱應激。此外，添加脂肪可有效地提高飼料的適口性。因此， 在豬、雞和奶牛飼養(yǎng)中，在飼料中添加脂肪是比較普遍的。脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，若缺乏將會危及機體健康。單胃動物自身能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等內源性消化酶。但幼禽幼畜消化機能尚未發(fā)育健全，內源性消化酶分泌量不足。在現代養(yǎng)豬生產中，為了縮短母豬繁殖周期和使仔豬盡早適應植物蛋白日糧，早期斷奶甚至超早期斷奶在養(yǎng)豬生產中普遍實施，但早期斷奶產生明顯應激，對消化系統(tǒng)發(fā)育和消化酶分泌產生不良影響，消化酶分泌急劇減少，斷奶2周后才又逐漸恢復與上升。斷奶后兩周內消化酶分泌不足是斷奶仔豬生長阻滯的主要因素之一；雛雞大多數消化酶在2周齡左右才發(fā)育到高峰，個別的(如脂肪酶)還要到21日齡左右。因此，消化酶分泌不足是雛雞對飼料利用的主要限制因素之一。在幼禽幼畜日糧中添加外源性脂肪酶、 淀粉酶、蛋白酶等，能補充體內內源酶的不足，并能減輕斷奶仔豬的斷奶應激，提高動物的生產性能。五、脂肪酶在造紙行業(yè)中的應用造紙木材除纖維素、木質素和半纖維素這三種主要成分外，在某些原料中還含有少量的樹脂。樹脂包括樹脂酸、脂肪酸及其酯，還含有非皂化物如萜烯、高碳醇等。在洗選漂工段，樹脂沉積在篩漿機篩板等，這些沉積物可能脫落并堵塞篩板和錐形除碴器，從而大大降低篩選、凈化效率和影響漿的質量。在抄造工段，樹脂沉積在毛毯，吸水箱，漿池、篩板、 流漿箱、造紙網、伏輥、壓榨輥、烘缸，壓光輥上等。降低脫水效率及紙頁的勻度和強度，或形成樹脂斑點和孔洞，甚至還引起的斷頭，降低紙質量。同時增加設備的清洗和維修時間，導致產量下降。而且制漿造紙廢水中的樹脂是非漂白廢水毒性的主要來源。傳統(tǒng)的樹脂控制主要應用化學反應方法進行控制，使樹脂附著在纖維表面或穩(wěn)定地分散在紙漿系統(tǒng)中，從而避免樹脂在制漿造紙設備上的沉積。但對樹脂的消除效率相對較低，用量大，容易造成設備磨損等不利影響。用脂肪酶去除紙漿中的樹脂，包括三酸甘油酯及蠟，避免造紙過程中樹脂沉積在設備上，影響設備的運轉，防止紙品斷頭、嚴重破裂的情形。疏棉狀嗜熱絲孢菌是一種分布廣泛、生長上限溫度較高的真菌，它能夠產生熱穩(wěn)定的具有重要工業(yè)價值的脂肪酶，即疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶，但是野生菌產酶存在培養(yǎng)溫度高等較多不利因素，因而近年來主要研究方向集中于采用基因工程方法構建重組菌， 進而表達獲得脂肪酶。目前尚未有采用里氏木霉來表達疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供采用上述方法制得的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供該疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案
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在本發(fā)明的一方面，提供一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，該方法包括如下步驟I)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建；3)里氏木霉的轉化與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶高產菌株的篩選；4)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的分離與提純。步驟I)中，合成的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的序列如SEQ ID NO. I所示，合成的基因編碼更加符合里氏木霉高效表達的基因編碼。步驟2)具體為將步驟I)所得的產物由SpeI和XhoI限制性內切酶降解后，用瓊脂糖凝膠分離，純化回收連接，然后通過T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5ci通透細胞，通過分析篩選提取質粒，完成疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建。步驟3)具體為首先，用EcoRI降解步驟2)構建的質粒形成質粒片段，采用化學轉化方法將該質粒片段轉入里氏木霉RUT C-30宿主細胞；然后在含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將生長旺盛的菌落接種置PDA培養(yǎng)基上，通過生長和發(fā)芽，將孢子再轉移到新鮮PDA培養(yǎng)基上，以分離純化轉代穩(wěn)定的轉化子，將這些轉化子的孢子接種在木霉纖維素酶誘導培養(yǎng)液(所述木霉纖維素酶誘導培養(yǎng)液的PH值為4. 8，用乳糖作為誘導物)，培養(yǎng)后，采樣離心，取上清液進行SDS-PAGE電泳分析。步驟4)完成后，得到的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2或 SEQ ID NO. 3 所示。在本發(fā)明的另一方面，提供采用上述制備方法制得的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在制備面制食品中的應用。例如，所述面制食品為慢頭。本發(fā)明采用化學方法人工合成疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因，然后進行疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建，再進行里氏木霉的轉化與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶高產菌株的篩選(本發(fā)明是首次采用里氏木霉來表達疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶)，由此得到的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶經實驗驗證在制備饅頭中對饅頭白度改進效果明顯。


圖I是本發(fā)明實施例I中用于疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在里氏木霉表達質粒 pTrTLL的示意圖。圖2是本發(fā)明實施例I中SDS-PAGE分析里氏木霉表達疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶 TLL的示意圖,其中，1-12表示轉化子的編號，M表示標準蛋白。圖3是本發(fā)明實施例I中異源表達疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TLL的純化結果示意圖，其中，M道表示標準蛋白；1，2，3道分別為5，10和4微克純化后的TLL蛋白。圖4是本發(fā)明實施例I中疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TLL的pH曲線示意圖。圖5是本發(fā)明實施例I中疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TLL的溫度曲線示意圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備I.微生物和質粒材料用于克隆的大腸桿菌DH5 a由Invitrogen公司提供。用于提供脂肪酶基因資源和高效表達宿主為里氏木霉 RUT C-30,從 American Type Culture Collection(ATCC)購買，起始質粒pBluescipt KS( 一 )從Stratagene公司購買。2.疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TTL)基因的人工合成及表達質粒的構建委托Life Technologies Corporation采用本領域常規(guī)的化學方法人工合成了編碼疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(LipA)基因(SEQ ID NO. I)，合成的基因編碼更加符合里氏木霉高效表達的基因編碼。為了克隆的方便，5’端增加了 SpeI酶切位點而3’端增加了 XhoI 酶切位點。LipA DNA片段和里氏木霉表達質粒pT3C(編碼號，EF127533，Li et al.， 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 :1264-1275)由 SpeI 和 XhoI 限制性內切酶降解后， 用瓊脂糖凝膠電泳分離，LipA降解后的條帶及pT3C降解后的10. Okb和0. 7kb的兩條帶。 將LipA的0. 9kb和pT3C的10. Okb條帶從膠中切割并提純，然后將它們用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5 a通透細胞，通過分析八個轉化子中的質粒，然后通過順序測定獲得了編碼LipA的里氏木霉表達質粒。需要說明的是在原始pT3C質粒中3’端為PstI位點， 通過突變轉換成了 XhoI位點，這里構建的質粒為pTrTLL(見圖I)。3.里氏木霉的轉化與脂肪酶高產菌株的篩選本發(fā)明使用了里氏木霉RUT C-30為宿主細胞，采用化學轉化的方法(Penttila et al. ,1987 Gene 61 =155-164)將用EcoRI限制內切酶降解后的pTrTLL質粒片段轉入宿主細胞，然后在含有潮霉素B的土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，潮霉素B從Roche公司購買，5天后將生長旺盛的菌落接種置PDA培養(yǎng)基上，通過6天生長和發(fā)芽，將孢子再轉移到新鮮PDA培養(yǎng)基上，以分離純化傳代穩(wěn)定的轉化子。通過此方法，得到12個傳代穩(wěn)定的轉化子，將這些轉化子的孢子接種在木霉纖維素酶誘導培養(yǎng)液，此培養(yǎng)液PH 4. 8，用乳糖作為誘導物，在三角瓶中培養(yǎng)6天后，采樣離心，取上清液，用聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PA6E)加考馬斯藍染色，通過此分析，發(fā)現12個轉化子中，第二和八號轉化子產生一條大約30，000 道爾頓的蛋白條帶(見圖2)。而且采用中國脂肪酶國家標準分析方法(GB/T 23535-2009) 測得的脂肪酶活力如表一所示?？梢钥闯?，SDS-PAGE膠上30，000道爾頓條帶的深淺與酶活水平高度相關。進一步證明30，000道爾頓的蛋白為本發(fā)明的脂肪酶。表一里氏木霉表達疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TLL基因轉化子培養(yǎng)液中脂肪酶活力
編號活力(U/ml)I2. 53216權利要求
1.一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建；3)里氏木霉的轉化與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶高產菌株的篩選；4)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的分離與提純。
2.如權利要求I所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟I)中， 合成的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的序列如SEQ ID NO. I所示，合成的基因編碼更加符合里氏木霉高效表達的基因編碼。
3.如權利要求I所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟2)具體為將步驟I)所得的產物由SpeI和XhoI限制性內切酶降解后，用瓊脂糖凝膠分離，純化回收連接，然后通過T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5ci通透細胞，通過分析篩選提取質粒，完成疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建。
4.如權利要求I所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟3)具體為首先，用EcoRI降解步驟2)構建的質粒形成質粒片段，采用化學轉化方法將該質粒片段轉入里氏木霉RUT C-30宿主細胞；然后在含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將生長旺盛的菌落接種置PDA培養(yǎng)基上，通過生長和發(fā)芽，將孢子再轉移到新鮮PDA培養(yǎng)基上，以分離純化轉代穩(wěn)定的轉化子，將這些轉化子的孢子接種在木霉纖維素酶誘導培養(yǎng)液，培養(yǎng)后，采樣離心，取上清液進行SDS-PAGE電泳分析。
5.如權利要求4所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述木霉纖維素酶誘導培養(yǎng)液的PH值為4. 8，用乳糖作為誘導物。
6.如權利要求I所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，其特征在于，步驟4)完成后，得到的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示。
7.一種采用權利要求1-6任一項所述的制備方法制得的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶。
8.—種如權利要求7所述的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在制備面制食品中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述面制食品為饅頭。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的制備方法，包括如下步驟1)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因的合成；2)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶表達質粒的構建；3)里氏木霉的轉化與疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶高產菌株的篩選；4)疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的分離與提純。本發(fā)明還公開了上述疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在制備面制食品中的應用。
文檔編號C12N15/80GK102604913SQ20121009746
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權日2012年4月5日
發(fā)明者唐鵬, 張民, 張珊嘉, 李新良, 段園園, 王錫珍, 馬天畫 申請人:上海尤特爾生化有限公司, 湖南尤特爾生化有限公司