疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼序列及其應(yīng)用。所述一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如SEQ?ID?No.1的肽段經(jīng)點(diǎn)突變獲得，所述的點(diǎn)突變?yōu)橄铝兄换騼烧呓Y(jié)合：（1）第63位的S突變?yōu)長(zhǎng)或M；（2）第232位的D突變?yōu)锳。本發(fā)明提供的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體較親本活力大幅提高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，從而進(jìn)一步合成普瑞巴林。
【專(zhuān)利說(shuō)明】疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]普瑞巴林(Pregabalin,簡(jiǎn)稱(chēng)PGB),化學(xué)名為(S) -(+) _3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，屬 Y -氨基丁酸的 3 位異丁基取代物(Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47:3500-3504)。普瑞巴林是一種鈣離子通道調(diào)節(jié)劑，能夠有效抑制與神經(jīng)病理性疼痛、癲癇相關(guān)的神經(jīng)元過(guò)度興奮及神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加(Curr.0pin.Pharmacol.2006, 6:108-113)，已被FDA批準(zhǔn)用于帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病外周神經(jīng)痛、癲癇、纖維肌痛等。與傳統(tǒng)藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數(shù)少、副作用小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性強(qiáng)(Curr.Med.Res.0pin.2006, 22:375-384)，因此被國(guó)際疼痛學(xué)會(huì)(IASP)、歐洲神經(jīng)病學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟(EFNS)和英國(guó)NICE等多個(gè)國(guó)際指南推薦為一線(xiàn)治療藥物。自上市以來(lái)，普瑞巴林全球銷(xiāo)售額快速增長(zhǎng)，成為全球暢銷(xiāo)藥市場(chǎng)的“重磅炸彈”，2012年全球銷(xiāo)售額已突破40億美元，市場(chǎng)前景十分廣闊。
[0003]國(guó)內(nèi)外報(bào)道了大量有關(guān)普瑞巴林及其中間體化學(xué)合成工藝，可歸為、不對(duì)稱(chēng)催化法、手性拆分法手性配體法和手性化合物直接合成法等四大類(lèi)。化學(xué)法由于工藝步驟冗長(zhǎng)、手性拆分試劑昂貴 、反應(yīng)條件苛刻、有毒有害溶劑用量大，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。生物催化法由于反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)成為最受矚目的醫(yī)藥及精細(xì)化學(xué)品合成技術(shù)之一。輝瑞公司開(kāi)發(fā)的普瑞巴林生產(chǎn)工藝引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸
(II)。該手性中間體經(jīng)脫羧、堿性水解、氫化等步驟制得普瑞巴林(I) (Org.Process Res.Dev.2008，12:392-398 ；US20050283023 ；US8134023B2)。
[0004]
【權(quán)利要求】
1.一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如下的肽段經(jīng)點(diǎn)突變獲得:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的點(diǎn)突變?yōu)橄铝兄换騼烧呓Y(jié)合:(I)第63位的S突變?yōu)長(zhǎng)或M ; (2)第232位的D突變?yōu)锳0
2.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
4.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDMGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
5.編碼權(quán)利要求1~4之一所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因?yàn)橄铝兄?SEQ ID N0.4，SEQ IDN0.6，SEQ ID N0.8。
7.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK103981160SQ201410032400
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】鄭裕國(guó), 鄭仁朝, 黎小軍, 馬紅葉, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)