經(jīng)修飾的人類生長激素多肽與其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)修飾的人類生長激素多肽，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2，包含一個非天然編碼氨基酸的hGH多肽，所述非天然編碼氨基酸在SEQ?ID?NO:2位置35的殘基位置處經(jīng)取代，所述人類生長激素多肽通過肟鍵共價連接于一個30kDa直鏈聚乙二醇分子，所述肟鍵是形成于所述非天然編碼氨基酸以及所述聚乙二醇分子之間；其中所述非天然編碼氨基酸為對乙?；?苯丙氨酸。
【專利說明】經(jīng)修飾的人類生長激素多肽與其用途
[0001 ] 本發(fā)明主張2004年2月2日申請的美國臨時專利申請案第60/541，528號、2004年6月18日申請的美國臨時專利申請案第60/581，314號、2004年6月18日申請的美國臨時專利申請案第60/581，175號、2004年6月18日申請的美國臨時專利申請案第60/580，885號和2004年12月22日申請的題為60/638，616的美國臨時專利申請案的優(yōu)先權(quán)，所述申請案的說明書以全文引用的方式并入本文中。
_2] 分案說明
[0003]本申請案是申請日為2005年I月28日，申請?zhí)枮?00580003786.1 (國際申請?zhí)枮镻CT/US2005/002724)，發(fā)明名稱為經(jīng)修飾的人類生長激素多肽與其用途的專利申請的分
案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及經(jīng)至少一種非天然編碼氨基酸修飾的生長激素多肽。
【背景技術(shù)】
[0005]生長激素(GH)超基因家族(Bazan，F(xiàn).1mmunologyTodayll:350-354(1991);Mott, H.R.和 Campbell, 1.D.Current Opinion in StructuralBiology5.114—121 (1995) , Silvsnnoinsn, 0.和 Ihl6, J.N.(1996) SIGNALING by the HejiatopoieticCyt0KINE REOTTOKS)代表一組具有類似結(jié)構(gòu)特征的蛋白。這個蛋白家族的各成員包含四螺旋束，其為圖1中所示者的通用結(jié)構(gòu)。雖然所述家族的更多成員尚未識別，但所述家族的一些成員包括以下各物:生長激素、催乳激素、胎盤催乳素、促紅細(xì)胞生成素(EP0)、血小板生成素(TP0)、白細(xì)胞間介素-2 (IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12(?35亞單元)、11-13、11-15、制瘤素1睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、a干擾素、3干擾素、、干擾素、《干擾素、T干`擾素、e干擾素、粒細(xì)胞群落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞群落刺激因子(M-CSF)和心臟營養(yǎng)素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。GH超基因家族的成員具有類似的二級和三級結(jié)構(gòu)，雖然其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的結(jié)構(gòu)特征使得易于識別基因家族的新成員。家族成員hGH、EP0、IFNa -2和G-CSF的通用結(jié)構(gòu)分別展示于圖2、3、4和5中。
[0006]GH超基因家族的一個成員為人類生長激素(hGH)。人類生長激素參與正常人類生長及發(fā)育的許多調(diào)控。這種天然產(chǎn)生的單鏈垂體激素是由191個氨基酸殘基組成且具有大約22kDa的分子量。hGH展現(xiàn)多種生物效應(yīng)，尤其包括線性生長(體質(zhì)發(fā)生)、生乳、活化巨噬細(xì)胞和類胰島素及致糖尿病的效應(yīng)(Chawla，R.等人，Ann.Rev.Med.34:519-547(1983) ;Isaksson, 0?等人,Ann.Rev.Physiol.，47:483-499(1985) ; Hughes, J.和 Friesen, H., Ann.Rev.Physiol, 47:469-482 (1985))。
[0007]hGH 的結(jié)構(gòu)是眾所周知的(Goeddel，D.等人，Nature281:544-548 (1979))，并且hGH的三維結(jié)構(gòu)已由X射線結(jié)晶學(xué)解析(de Vos, A.等人，Science255:306-312 (1992))。蛋白具有緊湊的球狀結(jié)構(gòu)，其包含四個兩性a螺旋束，從N末端起始被稱為A-D，其由環(huán)接合。hGH還含有四個半胱氨酸殘基，其參與兩個分子內(nèi)二硫鍵:C53與C165配對且C182與C189配對。激素并未經(jīng)糖基化且已在大腸桿菌中以分泌形式表達(dá)(Chang，C等人，Gene55:189-196 (1987))。
[0008]已識別hGH的多種天然產(chǎn)生的突變體。這些突變體包括hGH-V(Seeberg, DNAl: 239 (1982);美國專利第 4，446，235,4, 670，393 和 4，665，180 號，其以引用的方式并入本文中)和含有hGH的殘基32-46缺失的20_kDa hGH (Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta925:314 (1987) ; Lewis, U.等人，J.Biol Chem.，253:2679-2687 (1978))。此外，已報導(dǎo)多種hGH變異體，其是由轉(zhuǎn)錄后、翻譯后、分泌性、代謝加工型及其它生理過程產(chǎn)生(Baumann, G., Endocrine Reviewsl2:424 (1991))。
[0009]hGH的生物效應(yīng)是源自其與特異性細(xì)胞受體的相互作用。激素為包括胎盤催乳素和催乳激素的同源蛋白家族的成員。然而，hGH在家族成員中是不尋常的，因為其展現(xiàn)廣泛的物種特異性并與經(jīng)克隆的軀體原(Leung, D.等人，Nature330:537-543 (1987))受體或催乳激素(Boutin，J.等人，Cell53:69-77(1988))受體相結(jié)合?；诮Y(jié)構(gòu)和生化研究，已提出催乳性和軀體原性結(jié)合域的功能圖譜(Cunningham, B.和Wells, J., Proc.Natl.Acad.Sc1.88:3407(1991) )。hGH受體為造血/細(xì)胞激素/生長因子受體家族的一員，所述家族包括數(shù)種其它生長因子受體，諸如白細(xì)胞間介素(IL)-3、-4和-6受體、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落刺激因子(GM-CSF)受體、促紅細(xì)胞生成素(EPO)受體以及G-CSF受體。參看Bazan, Proc.Natl.Acad.Sci USA87:6934-6938 (1990)。細(xì)胞激素受體家族的成員含有四個保守性半胱氨酸殘基和正好位于跨膜區(qū)外側(cè)的色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸基元。認(rèn)為保守性序列涉及于蛋白-蛋白相互作用中。例如參看Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184:485-490(1992)。hGH與其受體(hGHbp)的胞外域之間的相互作用是最為人所了解的激素-受體相互作用之一。高解析度X射線結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)(Cunningham, B.等人，Science, 254:821-825(1991))已展示hGH具有兩個受體結(jié)合位點并使用分子上獨特的位點依次結(jié)合兩個受體分子。所述兩個受體結(jié)合位點被稱為位點I和位點II。位點I包括螺旋D的羧基末端和部分螺旋A以及A-B環(huán)，而位點II涵蓋螺旋A的氨基末端區(qū)和部分螺旋C。GH與其受體的結(jié)合依次發(fā)生，位點I首先結(jié)合。位點II然后嚙合第二 GH受體，導(dǎo)致受體二聚作用和引起對激素的細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號通路的活化。其中已將G120R取代引入位點II中的hGH突變蛋白能夠結(jié)合單一 hGH受體，但不能二聚兩種受體。突變蛋白充當(dāng)體外hGH拮抗劑，推測其是通過占據(jù)受體位點同時不會活化細(xì)胞內(nèi)信號通路(Fuh，G.等人，Science256:1677-1680 (1992))。
[0010]重組hGH是用作治療劑且已批準(zhǔn)用于治療多種適應(yīng)癥。hGH缺乏引起侏儒癥，例如其已通過外源投用激素而成功治療十年以上。除hGH缺乏外，hGH還被批準(zhǔn)用于治療腎衰竭(兒童中)、特納氏綜合癥和AIDS患者中的惡病質(zhì)。最近，食品及藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)hGH用于治療非GH依賴性身材矮小。hGH當(dāng)前還被研究以用于治療衰老、老年人虛弱、短腸綜合癥和充血性心臟衰竭。
[0011]重組hGH當(dāng)前是作為每日可注射產(chǎn)品銷售，當(dāng)前市場上的五種主要產(chǎn)品為:Humatrope? (Eli Lilly&C0.)>Nutropin? (Genentech)>Norditropin? (Novo-Nordisk)、Genotropin? (Pfizer)和 Saizen/Serostim? (Serono)0 然而，對于使用生長激素作為治療劑的顯著難題為蛋白具有短的體內(nèi)半衰期，且因此其必須通過每日皮下注射來投用以達(dá)到最大效率(MacGillivray 等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.81:1806-1809 (1996)。顯著努力是集中于通過降低生產(chǎn)成本、使投藥對患者而言更容易、改良功效及安全性概況和產(chǎn)生將提供競爭優(yōu)勢的其它特性來改良hGH促效劑和拮抗劑的投用。舉例而言，Genentech和Alkermes先前銷售Nutropin D印ot?，其為用于兒科生長激素缺乏癥的hGH儲存調(diào)配物。雖然所述儲存物允許更低頻率的投藥(每2-3周一次，而不是每日一次)，但其也與不當(dāng)?shù)母弊饔糜嘘P(guān)，諸如降低的生物利用性和注射位點處疼痛，并且在2004年從市場撤柜。另一產(chǎn)品Pegvisomant?(Pfizer)最近也已通過FDA批準(zhǔn)。Pegvisomant?為hGH的基因工程類似物，其用作指定用于治療肢端肥大癥的高度選擇性生長激素受體拮抗劑(van der Lely等人，The Lancet358:1754-1759 (2001)。雖然Pegvisomant?中的數(shù)個氨基酸側(cè)鏈殘基經(jīng)聚乙二醇(PEG)聚合物衍生，但所述產(chǎn)品仍然每日一次投藥，表明醫(yī)藥特性并非最佳。除聚乙二醇化和儲存調(diào)配物之外，包括hGH的吸入和口服劑型的其它投藥途徑處于臨床前初期及臨床開發(fā)階段，且尚未有投藥途徑通過FDA批準(zhǔn)。因此，需要展現(xiàn)生長激素活性并且還提供較長的血清半衰期且因此提供更佳的hGH治療水平和增加的治療劑半衰期的多肽。
[0012]共價連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)是一種增加水溶性和生物利用性、增加血清半衰期、增加治療劑半衰期、調(diào)節(jié)免疫原性、調(diào)節(jié)生物活性或延長許多生物活性分子(包括蛋白、肽且尤其是疏水性分子)的循環(huán)時間的方法。PEG已經(jīng)廣泛用于藥品中、用于人工移植上并用于其中生物相容性、毒性缺少和免疫原性缺少具重要性的其它應(yīng)用中。為最大化PEG的所要特性，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高以賦予通常與PEG聚合物連接有關(guān)的有利特征，諸如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，而不會不利地影響母體分子的生物活性。
[0013]PEG衍生物經(jīng)常經(jīng) 由反應(yīng)性化學(xué)官能基與生物活性分子連接，所述官能基諸如為賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端和碳水化合物部分。蛋白及其它分子通常具有有限數(shù)目的可用于聚合物連接的反應(yīng)性位點。通常，最適合于經(jīng)由聚合物連接進(jìn)行修飾的位點在受體結(jié)合中扮演重要角色，并且為分子生物活性的保留所必需。因此，聚合物鏈與生物活性分子上所述反應(yīng)性位點的無差別連接通常引起經(jīng)聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低甚或全部損失。R.Clark等人，(1996).L Biol.Chem., 271:21969-21977。為形成具有足以賦予靶分子所要優(yōu)勢的聚合物分子量的接合物，先前技術(shù)方法通常已經(jīng)包括將眾多聚合物臂隨機(jī)連接于所述分子，由此增加母體分子的生物活性降低甚或完全損失的風(fēng)險。
[0014]形成用于將PEG衍生物連接于蛋白的基因座的反應(yīng)性位點受蛋白結(jié)構(gòu)支配。包括酶的蛋白是由具有通用結(jié)構(gòu)H2N--CHR--COOH的各種a氨基酸序列組成。一種氨基酸的a氨基部分(H2N-)接合到鄰近氨基酸的羧基部分(一C00H)以形成酰胺鍵，其可表示為一(NH--CHR--CO)n--,其中下標(biāo)“n”可等于幾百或幾千。由R代表的片段可含有用于蛋白生物活性并用于連接PEG衍生物的反應(yīng)性位點。
[0015]舉例而言，在氨基酸賴氨酸的情況下，在e位置以及a位置中存在一NH2部分。在堿性PH條件下S-NH2不發(fā)生反應(yīng)。蛋白的PEG衍生領(lǐng)域中大多數(shù)技術(shù)已針對開發(fā)PEG衍生物以用于連接于蛋白中所存在的賴氨酸殘基的S-NH2部分。"PolyethyleneGlycol and Derivatives for Advanced PEGylation^j Nektar Molecular EngineeringCatalog, 2003，第1_17頁。然而，這些PEG衍生物都具有共同局限，即其不能選擇性安裝在蛋白表面上所存在的通常眾多的賴氨酸殘基中。在賴氨酸殘基對例如存在于酶活性位點中的蛋白活性具重要性的情況下，或者在賴氨酸殘基在調(diào)節(jié)蛋白與其它生物分子的相互作用方面起作用的情況下(如同在受體結(jié)合位點的情況下)，其可為顯著限制。
[0016]現(xiàn)有蛋白聚乙二醇化方法的第二大且同等重要的復(fù)雜情況是PEG衍生物可與除所要者之外的殘基經(jīng)歷不當(dāng)副反應(yīng)。組氨酸含有反應(yīng)性亞氨基部分(在結(jié)構(gòu)上表示為一N(H)―)，但許多與e--NH2反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)也可與一N(H)--反應(yīng)。類似地，氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈具有游離巰基，其在結(jié)構(gòu)上表示為-SH。在某些情況下，在賴氨酸的e -NH2基團(tuán)上對準(zhǔn)的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應(yīng)。如此可產(chǎn)生經(jīng)PEG衍生的生物活性分子的復(fù)雜異質(zhì)混合物，并且有可能破壞所針對的生物活性分子的活性。需要開發(fā)允許在蛋白內(nèi)的單一位點處引入化學(xué)官能基的PEG衍生物，其然后使得一種或一種以上PEG聚合物能夠在蛋白表面上經(jīng)明確定義且可預(yù)測的特異性位點處選擇性偶合到生物活性分子。
[0017]除賴氨酸殘基之外，在所屬領(lǐng)域中已經(jīng)對開發(fā)針對其它氨基酸鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的經(jīng)活化PEG試劑投入顯著努力。例如參看美國專利第6，610，281號(其以引用的方式并入本文中)和〃Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation^, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003,第 1-17 頁。使用定點突變形成法和所屬領(lǐng)域中已知的其它技術(shù)，可將半胱氨酸殘基位點選擇性地引入蛋白結(jié)構(gòu)中，且所得游離巰基部分可與具有硫醇反應(yīng)性官能基的PEG衍生物反應(yīng)。然而，這種方法很復(fù)雜，因為引入游離巰基會使所得蛋白的表達(dá)、折疊和穩(wěn)定性變得復(fù)雜。因此，需要具有將化學(xué)官能基引入生物活性分子中的方式，所述生物活性分子能夠使一種或一種以上PEG聚合物與蛋白選擇性偶合，同時與蛋白中通常所發(fā)現(xiàn)的巰基及其它化學(xué)官能基相容(即不參加與其的不當(dāng)副反應(yīng))。
[0018]從所屬領(lǐng)域的取樣可以看到，經(jīng)開發(fā)用于連接于蛋白側(cè)鏈、尤其是賴氨酸氨基酸側(cè)鏈上的一NH2部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分的許多所述衍生物已經(jīng)證實在其合成和使用上存在問題。一些衍生物與蛋白形成不穩(wěn)定的鍵合，其在含水環(huán)境中(諸如在血流中)經(jīng)受水解且因此分解、降解或在其它方面不穩(wěn)定。一些衍生物形成較穩(wěn)定的鍵合，但在形成鍵合之前仍經(jīng)受水解，其意謂PEG衍生物上的反應(yīng)基可在蛋白連接之前經(jīng)失活。一些衍生物具有些許毒性且因此較不適合`于體內(nèi)使用。一些衍生物反應(yīng)太慢而在實際上不適用。一些衍生物通過連接于負(fù)責(zé)蛋白活性的位點而導(dǎo)致蛋白活性損失。一些衍生物在其將連接的位點中并不具有特異性，其也可導(dǎo)致所要活性損失和缺少結(jié)果的再現(xiàn)性。為克服與以聚(乙二醇)部分修飾蛋白相關(guān)的難題，已經(jīng)開發(fā)較穩(wěn)定(例如美國專利第6，602，498號，其以引用的方式并入本文中)或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(yīng)(例如美國專利第6，610，281號，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。在所屬領(lǐng)域中顯然需要直到被喚醒以選擇性反應(yīng)以形成穩(wěn)定化學(xué)鍵之前在生理環(huán)境中一直為化學(xué)惰性的PEG衍生物。
[0019]最近，已經(jīng)報導(dǎo)蛋白科學(xué)中完全新型的技術(shù)，其很有希望克服許多與蛋白的位點特異性修飾相關(guān)的局限。特定而言，已經(jīng)向原核生物大腸桿菌(E.coli)(例如L.Wang等人,(2001), Science292:498-500)和真核生物釀酒酵母(S.cerevisiae)(例如 J.Chin 等A,Science301:964-7 (2003))的蛋白生物合成機(jī)構(gòu)中加入新型組分，其使得能夠?qū)⒎腔蚓幋a的氨基酸體內(nèi)并入蛋白中。使用這一方法，已將具有新穎化學(xué)、物理或生物特性的多種新型氨基酸(包括光親和標(biāo)記和可光致異構(gòu)化的氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效地及高保真度地在大腸桿菌中和酵母中并入回應(yīng)于琥珀密碼子TAG的蛋白中。例如參看J.ff.Chin 等人,(2002), Journal of the American Chemical Societyl24:9026-9027; J.ff.Chin, &P.G.Schultz, (2002)，ChemBioCheml1:1135-1137;J.ff.Chin 等人，(2002)，PNASUnited States of America99:1102Q-11024;和 L.Wang, &P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm..1-10。這@研究已經(jīng)證明有可能詵擇件目.常規(guī)地引入化學(xué)官能基,諸如酮基、炔基和疊氮部分，其在蛋白中未發(fā)現(xiàn)、對于在20種常見的基因編碼的氨基酸中所發(fā)現(xiàn)的所有官能基呈化學(xué)惰性并且可用于有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定的共價鍵合。
[0020]將非基因編碼的氨基酸并入蛋白中的能力允許引入可提供天然產(chǎn)生的官能基的有價值替代物的化學(xué)官能基，諸如賴氨酸的e -NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等。已知某些化學(xué)官能基對于在20種常見的基因編碼的氨基酸中所發(fā)現(xiàn)的官能基呈惰性，但顯著且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵合。舉例而言，在所屬領(lǐng)域中已知疊氮基和乙炔在催化量的銅存在下于含水條件下經(jīng)歷Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)。例如參看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67:3057-3064;和 Rostovtsev 等人，(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41:2596-2599。舉例而言，通過將疊氮部分引入蛋白結(jié)構(gòu)中，能夠并入對于在蛋白中所發(fā)現(xiàn)的胺、巰基、羧酸、羥基呈化學(xué)惰性，但也與乙炔部分順利且有效地反應(yīng)以形成環(huán)加成產(chǎn)物的官能基。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基在其它蛋白側(cè)鏈存在下和生理條件下仍為化學(xué)惰性和無反應(yīng)性。
[0021]本發(fā)明尤其解決與GH多肽的活性和產(chǎn)生相關(guān)的問題，也解決具有改良生物或藥理學(xué)特性(諸如改良的治療劑半衰期)的hGH多肽的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明提供GH超基因家族成員，其包括包含一種或一種以上非天然編碼氨基酸的hGH多肽。
[0023]在一些實施例中`，hGH多肽包含一種或一種以上翻譯后修飾。在一些實施例中，hGH多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實施例中，hGH多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子或至少一種額外hGH多肽連接。
[0024]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實施例中，第二多肽為hGH多肽。
[0025]在一些實施例中，hGH多肽包含至少兩種與包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物連接的氨基酸。在一些實施例中，至少一種氨基酸為非天然編碼氨基酸。
[0026]hGH的區(qū)域可說明如下，其中在中間行中指定hGH中的氨基酸位置:
[0027]螺旋A螺旋B螺旋C螺旋D
[0028][I—5]—[6—33]—[34—74]—[75—96]—[97—105]—[106—129]—[130—153]—[154—183]—[184—191]
[0029]N末端 A-B環(huán) B-C環(huán) C-D環(huán)C末端。
[0030]在一些實施例中，在如下對應(yīng)于hGH中的二級結(jié)構(gòu)的以下區(qū)域的一個或一個以上中的任何位置并入一種或一種以上非天然編碼氨基酸:SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:1或3的對應(yīng)氨基酸的1-5 (N末端)、6-33 (A螺旋)、34-74 (A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，A-B環(huán))、75-96 (B螺旋)、97-105 (B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，B-C環(huán))、106-129 (C螺旋)、130-153(C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，C-D環(huán))、154-183 (D螺旋)、184-191 (C末端)。在其它實施例中，在選自由hGH SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸的殘基1_5、32_46、97-105、132-149和184-191組成的群組的位置取代非天然編碼氨基酸。在一些實施例中，在hGH中以下位置的一個或一個以上中并入一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:位置I之前(即 N 末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、I44、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即蛋白的羧基末端)(SEQ ID NO:2 或 SEQ IDNO:l或3的對應(yīng)氨基酸)。
[0031]在一些實施例中，在以下位置的一個或一個以上中取代一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、
142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和 187CSEQ ID NO:2 或 SEQ ID N0:1 或3 的
對應(yīng)氨基酸)。
[0032]在一些實施例中，在以下位置的一個或一個以上中取代一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、I11、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186 或 187 (SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:1 或 3 的對應(yīng)氨基酸)。
[0033]在一些實施例中，在以下位置的一個或一個以上中取代一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145 和 155 (SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:1 或 3 的對應(yīng)氨基酸)。
[0034]在一些實施例中，在以下位置的一個或一個以上中取代一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:30、74或103(SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，在以下位置的一個或一個以上中取代一種或一種以上的非天然編碼氨基酸:35、92、
143、145(SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:1 或 3 的對應(yīng)氨基酸)。
[0035]在一些實施例中，這些位置的一個或一個以上中的非天然編碼氨基酸連接于水溶性聚合物，包括(但不限于)以下位置:位置I之前(即N末端)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I11、I12、I13、I15、I16、I19、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即蛋白的羧基末端)(SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，這些位置的一個或一個以上中的非天然編碼氨基酸連接于水溶性聚合物:30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸)。在一些實施例中，這些位置的一個或一個以上中的非天然編碼氨基酸連接于水溶性聚合物:35、92、143、145(SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸)。[0036]人類GH 拮抗劑包括(但不限于)在 1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127具有取代或在位置I (即N末端)具有添加或其任何組合(SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:1或3的對應(yīng)氨基酸或任何其它GH序列)的拮抗劑。
[0037]在一些實施例中，hGH多肽包含調(diào)節(jié)hGH多肽對hGH多肽受體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含增加hGH多肽穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽在hGH SEQ ID NO: 2中包含選自由F10A、F10H、FlOI ;M14W、M14Q、M14G ;H18D、H21N、G120A ;R167N、D171S、E174S ;F176Y、I179T 或其任何組合組成的群組的氨基酸取代。在一些實施例中，+hGH多肽包含調(diào)節(jié)hGH多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含調(diào)節(jié)hGH多肽的血清半衰期或循環(huán)時間的取代、添加或缺失。
[0038]在一些實施例中，hGH多肽包含增加hGH多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含增加在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的hGH多肽的溶解度的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含增加宿主細(xì)胞中或體外合成的hGH多肽的表達(dá)的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含氨基酸取代G120A。包含這種取代的hGH多肽保留促效劑活性并保留或改良宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實施例中，hGH多肽包含增加hGH多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。
[0039]在一些實施例中，hGH多肽中的氨基酸取代可以天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生氨基酸進(jìn)行，只要至少一個取代是以非天然編碼氨基酸進(jìn)行即可。
[0040]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、置氣基或炔基。
[0041]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu):
[0042]`
【權(quán)利要求】
1.一種包含一個非天然編碼氨基酸的人類生長激素多肽，其氨基酸序列為SEQ IDNO: 2，所述非天然編碼氨基酸在SEQ ID NO: 2位置35的殘基位置處經(jīng)取代，所述hGH多肽通過肟鍵共價連接于一個30kDa直鏈聚乙二醇分子，所述肟鍵是形成于所述非天然編碼氨基酸以及所述聚乙二醇分子之間；`其中所述非天然編碼氨基酸為對乙酰基-苯丙氨酸。
【文檔編號】A61K38/27GK103755800SQ201310628151
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2004年2月2日
【發(fā)明者】丘霍松, 托馬斯·丹尼爾, 理查德·迪馬什, 安娜-瑪麗亞·A.·海斯·普特南, 特洛伊·威爾遜, 比·查·西姆, 戴維·利青格 申請人:Ambrx公司