基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統(tǒng)用于肺癌基因治療的制作方法
【專利摘要】開發(fā)安全有效的基因傳遞系統(tǒng)是基因治療在臨床上廣泛應(yīng)用的最大障礙。在此研究中，該發(fā)明開發(fā)了一種基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統(tǒng)作為肺癌基因治療的可替換的基因載體。Sorbitol diacrylate和精胺通過邁克爾加成反應(yīng)制備了高分子聚合物，記為SD-SPE。該聚合物SD-SPE能有效地壓縮DNA為納米顆粒并且有效保護(hù)DNA免受核酶的降解。SD-SPE/DNA復(fù)合物體內(nèi)外均顯示出優(yōu)良的轉(zhuǎn)染效率且毒性低。而且，肺吸入傳遞SD-SPE/Pdcd4復(fù)合物在肺癌模型小鼠K-rasLA1顯著的抑制肺腫瘤。這些結(jié)果證明SD-SPE由于具有優(yōu)良的生物相容性和高的基因傳遞效率，因此將在肺癌基因治療方面將具有巨大的潛力。
【專利說明】基于山梨糖醇-多胺聚合物的基因傳遞系統(tǒng)用于肺癌基因 治療

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用材料，納米技術(shù)和基因遞送領(lǐng)域，特別是涉及基因納米顆粒的制 備和其特殊通路傳遞基因，來用于基因可控釋放的系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療已漸漸地作為治療癌癥的最有希望治療手段之一（Merdan，etal.， 2002)。由于裸基因經(jīng)常會(huì)遭受酶的降解，腎的過濾而清除，細(xì)胞吸收差，不能有效逃離溶 酶體而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，因此，開發(fā)安全有效的基因傳遞系統(tǒng)用于有效載有治療基因進(jìn)入靶點(diǎn) 是基因治療技術(shù)成功與否的關(guān)鍵（Gao, etal.，2003 Jiang，et al.，2007 ;Shen，etal.， 2012)。直到現(xiàn)在，臨床上所用的絕大多數(shù)基因治療都是以修飾后的病毒為載體。但是，病毒 載體本身的免疫原性，嚴(yán)重的毒副作用以及生產(chǎn)上的問題已經(jīng)驅(qū)使科學(xué)家去尋找非病毒載 體（Jiang, etal. ,2007 ;Thomas，etal. ,2003)。近年來，非病毒載體受到人們的廣泛關(guān)注， 因?yàn)檫@些載體制備容易，且穩(wěn)定，容易改造，對所載基因的大小沒有限制，而且與病毒載體 相比相對安全（Lungwitz，etal. ,2005 ;Mintzer，etal. ,2009)。但是，盡管具有這些優(yōu)勢， 與病毒載體相比，現(xiàn)有的非病毒基因載體仍然存在轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)（Jiang，etal.，2007 ; Anderson, etal. ,2003)。
[0003] 聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI)是一種使用最廣泛的非病毒基因載體之 一。由于其在很多類型細(xì)胞內(nèi)具有較高的轉(zhuǎn)染效率，所以被稱為非病毒基因載體"金標(biāo) 準(zhǔn)"（Boussif，etal.，1995 ;Park，etal.，2006 ;Boussif，etal.，1996)。但是，據(jù)報(bào)道，PEI 具有很大的細(xì)胞毒性，而且其細(xì)胞毒性具有分子量依賴性；高分子量的PEI的細(xì)胞毒性較 大（Jiang，etal.，2007 ;Fischer，etal.，1999)。因此，有必要用生物相容性的人內(nèi)源性的 多胺類化合物代替PEI。
[0004] 小分子多胺是基因傳遞的優(yōu)良載體，但是其分子量小，壓縮核酸的能力有限，因 此有必要將其合成聚合物。精胺（spermine，SPE)是多胺小分子的典型代表。它存在于 所有的真核細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)代謝中發(fā)揮一定的作用，所以它是很好的生物相容性的材料 (Allen，etal.，1983 Jiang，etal.，2011)。而且SPE具有四個(gè)胺基，分別是兩個(gè)仲胺和兩 個(gè)伯胺。這些胺基可以與乙烯基通過邁克爾加成反應(yīng)生成具有高緩沖容量的聚精胺類高 分子（Jere，etal.，2009 ;Duan，etal.，2012)。在以前的研究中，我們也報(bào)道過甘油丙氧基 三丙烯酸酯（GPT)和精胺通過上述反應(yīng)生成的聚精胺類高分子作為生物相容性的基因載 體-GPT-SPE (Jiang，etal.，2011)。GPT-SPE聚合物具有低的細(xì)胞毒性和血漿中穩(wěn)定性好的 特點(diǎn)。但是其轉(zhuǎn)染效率仍然較低。
[0005] 另一方面，肺吸入式傳遞基因給肺紊亂疾病提供了治療上的希望，而且較侵入式 的給藥來說具有很多優(yōu)勢，因?yàn)榉挝胧絺鬟f系統(tǒng)可以讓DNA沉淀在肺部，繞過系統(tǒng)循環(huán)， 延長在肺部的滯留時(shí)間（Gautam，etal.，2003)。因此，在此發(fā)明中，我們開發(fā)了一種使用山 梨糖醇乙烯基乙二酯（sorbitol diacrylate, SD)與精胺通過邁克爾加成反應(yīng)合成的基于 聚山梨糖醇-精胺（SD-SPE)的改良基因傳遞系統(tǒng)，因?yàn)橛泻芏嘌芯勘砻骰谏嚼嫣谴嫉?傳遞體可以增加吸入式肺腫瘤基因傳遞的轉(zhuǎn)染效率（Higashi, etal. ,2009 ;Maiti，etal.， 2007)。另外，山梨糖醇廣泛存在于植物中，由于其具有良好的水溶性和無毒性，在食品工業(yè) 得到廣泛的應(yīng)用（Maiti，etal.，2007)。在此發(fā)明中，對SD-SPE/DNA復(fù)合物的物理化學(xué)性 質(zhì)進(jìn)行了表征，它們的細(xì)胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)也進(jìn)行了表征。而且考 察了肺吸入后的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率和毒性。而且，SD-SPE/Pdcd4的抑制腫瘤的能力在肺癌腫瘤 模型小鼠 K-rasul上得到驗(yàn)證。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種有效地介導(dǎo)DNA遞送到靶細(xì)胞中的聚合物。本發(fā)明制 備的基于聚山梨糖醇-精胺的高分子材料能有效地壓縮DNA而且更有效地傳遞到細(xì)胞內(nèi)， 然后很好地釋放DNA。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供一種用來有效地進(jìn)行DNA遞送的生物相容性的聚 合物，從而減少載體的細(xì)胞毒性。
[0008] 本發(fā)明的更重要的一個(gè)目的在于提供一種用來把治療基因遞送到肺腫瘤模型小 鼠靶部位的方法。
[0009] 上述以及其他目的是通過合成一種聚合物來實(shí)現(xiàn)的，其中所述的聚合物是甘油丙 氧基三丙烯酸酯與多胺分子（包括精胺，亞精胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯戊胺，五 乙烯六胺，以及低分子量的PEI300,600,1200,1800)通過邁克爾加成反應(yīng)來合成山梨糖 醇-多胺聚合物。此外，該聚合物介導(dǎo)了 DNA或治療基因轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞和肺腫瘤模型動(dòng) 物中。該轉(zhuǎn)染方法和復(fù)合物實(shí)現(xiàn)了這些目標(biāo)，與此同時(shí)產(chǎn)生了較少的細(xì)胞毒性且通過STC 介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制和納米顆粒的內(nèi)吞機(jī)制顯著地提高了轉(zhuǎn)染效率。
[0010] 因此，通過將增吞片段（山梨糖醇）與多胺分子偶聯(lián)成交替聚合物。靶向片段優(yōu) 選山梨糖醇，多胺分子優(yōu)選精胺。采用增吞片段的目的在于使得用于基因遞送的細(xì)胞顯著 的吞噬復(fù)合物。山梨糖醇前體與多胺分子之比可通過改變反應(yīng)條件來調(diào)整。本發(fā)明合成的 SD-SPE聚合物中多胺分子仍然保持著仲胺和叔胺，所以能夠與核酸一起形成穩(wěn)定且可溶的 復(fù)合物，因而能有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)染。與PEI25K相比，該SD-SPE聚合物具有較低的細(xì)胞毒性。 進(jìn)一步研究了 SD-SPE聚合物的基因轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞毒性并且與PEI25K進(jìn)行了比較。舉例來 說，SD-SPE/GFP復(fù)合物較PEI25K/GFP轉(zhuǎn)染效率高，這表明山梨糖醇片段充當(dāng)了增加內(nèi)吞機(jī) 制的角色。利用氣霧法吸入傳遞SD-SPE/Pdcd4復(fù)合物在K-ras ul肺癌模型小鼠呈現(xiàn)出顯 著地抑制肺腫瘤效果。
[0011] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟如下：
[0012] SD-SPE聚合物的合成按照之前報(bào)道的邁克爾加成的方法（Jiang，etal.，2011)。 具體如下：2.5mol/L SD和2.7mol/L SPE分別溶解于2mL DMSO中，然后SD溶液慢慢滴加 到SPE溶液中，然后在80°C下攪拌24h。所得產(chǎn)物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分 子量3500的透析帶在4°C下透析24h。最后SD-SPE聚合物凍干，保存在-20°C下備用。
[0013] 所有的SD-SPE/DNA復(fù)合物均是新鮮制備，具體方法是，將DNA溶液加到等體積下 的聚合物溶液中，輕輕地潤旋Imin,室溫下保持30min。
[0014] 本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明制備的基于聚山梨糖醇-精胺的聚合物能 有效地與核酸形成復(fù)合物，并且具有很低的細(xì)胞毒性和顯著地轉(zhuǎn)染效率，在肺癌模型小鼠 K-raSul顯著地抑制肺腫瘤，在基因投遞領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明按照實(shí)施例1合成的SD-SPE聚合物的合成與表征：㈧SD-SPE反應(yīng) 的示意圖，（B)SD-SPE在重水中的 1H NMR，S=1.6-1.8ppm(-CH2-，SPE)，4.2-4.3(-CH2-，SD)， (C) GPC 分析。
[0016] 圖2是本發(fā)明按照實(shí)施例3制備的SD-SPE/DNA復(fù)合物的表征：(A) SD-SPE/DNA在 不同重量比下的瓊脂糖凝膠色譜，（B)DNA的保護(hù)和釋放評價(jià)，（C)SD-SPE/DNA復(fù)合物在重 量比為10下的透射電鏡照片，⑶復(fù)合物的動(dòng)態(tài)光散射，（E) SD-SPE/DNA復(fù)合物在不同重量 比下的電勢分布，（F) SD-SPE/DNA復(fù)合物在重量比為10下的粒子表面電荷。
[0017] 圖3是本發(fā)明按照實(shí)施例3制備的SD-SPE聚合物在不同濃度兩種細(xì)胞不同 時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞毒性：（A)A549細(xì)胞，24,（B) 16HBE14〇-細(xì)胞，24h，（OA549細(xì)胞，72h， (D) I6HBEHo-細(xì)胞，Mh (mean土 SD，η=3)。
[0018] 圖4是本發(fā)明按照實(shí)施例3制備的SD-SPE/DNA復(fù)合物在Α459細(xì)胞中的體外基因 轉(zhuǎn)染：(A)SD-SPE/pGL3復(fù)合物在A549細(xì)胞中在不同重量比下轉(zhuǎn)染研究（mean土SD，n=3)， (B) SD-SPE/pGL3復(fù)合物在16HBE14〇-細(xì)胞中在不同重量比下轉(zhuǎn)染研究（mean土SD，n=3)， (C) SD-SPE/GFP復(fù)合物在A549細(xì)胞上的GFP表達(dá)分析。共聚焦激光掃描顯微圖片（scale bar=20 μ m)，（D) SD-SPE/pGL3 復(fù)合物在 A549 細(xì)胞中緩沖容量研究（mean土 SD，n=3)，（E)洛 霉素 Al基因轉(zhuǎn)染的效果，（F)聚山梨醇活性被SC58236抑制的基因轉(zhuǎn)染效果。
[0019] 圖5是本發(fā)明按照實(shí)施例3制備的SD-SPE/Pdcd4復(fù)合物在肺腫瘤模型小鼠 K-rasul的體內(nèi)抑制腫瘤：(A)轉(zhuǎn)染效率研究：BALB/c小鼠肺吸入不同重量比的SD-SPE/GFP 復(fù)合物后GFP表達(dá)的觀察。（magnification :200X，scale bar = 100 μ m)，治療效率研究： 肺腫瘤模型小鼠 K-raSul肺吸入不同重量比的SD-SPE/Pdcd4復(fù)合物后肺癌腫瘤數(shù)量的評 價(jià)：(B)總的腫瘤數(shù)量，（C)大于Imm的肺癌數(shù)量（n=4, **p〈0. 01)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 將SD溶解于重量體積比10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE溶解于重量體積比 10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE與SD的物質(zhì)的量比為I : 1. 1，然后SD溶液慢慢滴加到 SPE溶液中，然后在80°C下攪拌24h。所得產(chǎn)物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分子 量3500的透析帶在4°C下透析24h。最后SD-SPE共聚物凍干，保存在-20°C下備用。
[0022] 實(shí)施例2
[0023] SD-SPE聚合物的結(jié)構(gòu)鑒定和分子量表征
[0024] SD-SPE聚合物通過氫核磁鑒定結(jié)構(gòu)。分子量通過凝膠滲透色譜在690nm處檢測。 柱溫為25°C，流速0. 5mL/min，流動(dòng)相為0. 5M乙酸銨溶液。
[0025] 實(shí)施例3
[0026] SD-SPE/DNA復(fù)合物的制備
[0027] 所有的SD-SPE/DNA復(fù)合物均是新鮮制備，具體方法是，將DNA溶液加到等體積下 的聚合物溶液中，輕輕地潤旋Imin,室溫下保持30min。
[0028] 實(shí)施例4
[0029] 聚合物對DNA壓縮和保護(hù)能力的考察
[0030] 聚合物對DNA壓縮和保護(hù)能力通過電泳表征。聚合物/DNA的質(zhì)量比為0. 1到10， 加入上樣顏料，最后的體積為12 μ L。為了評價(jià)聚合物對DNA的保護(hù)能力，DNaseI作為降解 酶。復(fù)合物被加到1%瓊脂糖凝膠中，用TAE緩沖液作為電解質(zhì)，50V下跑40min。
[0031] 實(shí)施例5
[0032] 復(fù)合物的表征
[0033] 復(fù)合物的形貌通過透射電鏡觀察。取1滴SD-SPE/DNA復(fù)合物滴到銅網(wǎng)上，用1 % 乙酸雙氧鈾溶液染色l〇s。銅網(wǎng)干燥IOmin中在電鏡下觀察。
[0034] 復(fù)合物的大小和表面電荷使用動(dòng)態(tài)光散射測定。每個(gè)樣品為2mL，其中DNA濃度為 40ug/mL〇
[0035] 實(shí)施例6
[0036] 細(xì)胞毒性
[0037] 采用A549和16HBE140-細(xì)胞系評價(jià)根據(jù)實(shí)施例1合成的SD-SPE的細(xì)胞毒性。A549 和16HBE140-細(xì)胞分別為人肺癌細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞。在37°C下，在5% CO2培養(yǎng)箱 (Thermo Scientific)的RPMI1640培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。將兩種細(xì)胞IX IO4個(gè)細(xì)胞/孔的量 接種在96孔平底板中，孵育18h后，用不同濃度的聚合物處理24或72h。之后用20 μ LCell Titer96?Aqueous One Solution Reagent來處理3h后，用ELISA plate reader(GLR1000， Genelabs Diagnostics, Singapore)在 570nm 進(jìn)行測試。
[0038] 實(shí)施例7
[0039] 轉(zhuǎn)染
[0040] 采用A549和16HBE14〇-細(xì)胞系評價(jià)根據(jù)實(shí)施例1合成的SD-SPE的體外轉(zhuǎn)染效率。 A549和16HBE140-細(xì)胞分別為人肺癌細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞。在37°C下，在5% CO2培 養(yǎng)箱（Thermo Scientific)的RPMI1640培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。對轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來說，將兩種細(xì)胞 10 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在24孔平底板中，孵育18h后，用聚合物/pGL3復(fù)合物在無血 清或含10%血清的培養(yǎng)基置換，接著孵育4h。之后用新鮮的培養(yǎng)基替換，再于37°C下孵育 24h。熒光素酶活性測定按照生產(chǎn)廠家的方法。BCA蛋白測試試劑盒用于提取蛋白，其濃度 用 Che miluminometer(Autolumat，LB953 ;EG&G Berthold，Germany)測定。為了評價(jià)聚合 物的緩沖容量，用DMSO稀釋的洛霉素 Al被加到每個(gè)孔中。孵育IOmin后，評價(jià)其轉(zhuǎn)染效率。 為了弄清楚SD-SPE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染機(jī)制，一種C0X-2抑制劑SC58236被用來抑制SD-SPE的滲 透能力。使用DMSO溶解后的10 μ M SC58236預(yù)處理Ih后，再轉(zhuǎn)染SD-SPE/pGL3后測其轉(zhuǎn) 染效率。
【權(quán)利要求】
1. 一種非病毒陽離子轉(zhuǎn)基因載體，其特征是SD-SPE二元組成的聚陽離子載體，其結(jié)構(gòu) 式加下?
2. 權(quán)利要求1所述的聚合物陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征是以SD和多胺分子 為結(jié)構(gòu)單元，交替連接成聚合物，構(gòu)建成納米聚陽離子載體結(jié)構(gòu)，反應(yīng)式如下：
反應(yīng)式中，（1)是SD結(jié)構(gòu)式，（2)是典型的多胺分子：精胺結(jié)構(gòu)式，（3)是最終產(chǎn)物 SD-SPE的結(jié)構(gòu)式。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征是所述反應(yīng)步驟如 下： 將SD溶解于重量體積比10-20倍量的二甲基亞砜中，SPE溶解于重量體積比10-20倍 量的二甲基亞砜中，SPE與SD的摩爾比例為1 : 1-1.5 : 1，然后將SD溶液慢慢滴加到SPE 溶液中，然后在4-100°C下攪拌24h。所得產(chǎn)物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分子量 3500-12000的透析帶在4°C下透析24h。最后將SD-SPE聚合物凍干，保存在-20°C下備用。 所用到的溶劑是二甲基亞砜，也可以是醇類包括甲醇、乙醇等。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的聚陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征為：多胺 分子包括精胺，亞精胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯戊胺，五乙烯六胺，以及低分子量 的 PEI300,600,1200,1800。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征為：SD為兩段為雙 鍵的山梨糖醇前體，主要山梨糖醇。SD也可以是末端含兩個(gè)以上的雙鍵的山梨糖醇前體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征為：透析袋的分子 量在3500-12000范圍內(nèi)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚陽離子轉(zhuǎn)基因載體的合成方法，其特征為：反應(yīng)溫度在 4-100°C范圍內(nèi)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的聚陽離子載體作為基因載體的應(yīng)用。
9. 一種含有權(quán)利要求1的聚合物與含報(bào)告基因、抗癌基因的能在真核細(xì)胞中重組表達(dá) 的核酸形成的復(fù)合物。
10. 權(quán)利要求9的復(fù)合物，其中所述的核酸含有編碼遺傳標(biāo)記的DNA序列，所述的遺傳 標(biāo)記選擇綠色熒光蛋白基因和PdccM基因。
11. 一種轉(zhuǎn)染帶有能增加細(xì)胞內(nèi)吞的方法，所述的方法包括使所說的細(xì)胞與權(quán)利要求 9的復(fù)合物在一定條件下接觸，其中在所述的條件下所說的復(fù)合物進(jìn)入到所說的細(xì)胞中并 且釋放所說的復(fù)合物的核酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的能增加細(xì)胞內(nèi)吞能力的片段為含有山梨糖醇 前體的反應(yīng)物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的細(xì)胞為肺細(xì)胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的細(xì)胞為肺癌細(xì)胞。
15. -種通過吸入方式給藥的基因傳遞系統(tǒng)，所述的方法包括使所說的模型動(dòng)物與權(quán) 利要求9的復(fù)合物通過呼吸吸入，將復(fù)合物進(jìn)入到所說的模型動(dòng)物中并且能發(fā)揮治療作 用。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所說的模型動(dòng)物為肺腫瘤模型動(dòng)物K-rasU1。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104338148SQ201310315438
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】姜虎林, 金有慶, 邢磊 申請人:中國藥科大學(xué)