一種獲得微環(huán)dna的親本質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒及其應(yīng)用。該親本質(zhì)粒是在出發(fā)載體pEGFP-N1-attB質(zhì)粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表達(dá)盒構(gòu)建而成，所述attR片段插入出發(fā)載體限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位點(diǎn)之間，所述attL片段插入出發(fā)載體的限制性內(nèi)切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位點(diǎn)之間，所述ΦC31整合酶基因表達(dá)盒插入出發(fā)載體的限制性內(nèi)切酶AflⅢ的酶切位點(diǎn)。利用該親本質(zhì)粒能夠快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得用于穩(wěn)定整合的微環(huán)DNA，后續(xù)的轉(zhuǎn)基因操作方法簡單易行，具有重要的生物學(xué)意義及實(shí)際應(yīng)用價值。
【專利說明】-種獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 微環(huán)DNA載體（Minicircle DNA Vector)是一種超螺旋的DNA分子，它 是親本質(zhì)粒（Parental Plasmid, PP)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組的產(chǎn)物。在重組酶的 作用下，親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€環(huán)狀DNA，一個含有大量的細(xì)菌骨架序列，稱為微質(zhì) 粒（Miniplasmid，MP);另一個則是僅含有目的基因的真核表達(dá)框架，即微環(huán)DNA (Minicircle，MC)。與傳統(tǒng)質(zhì)粒載體相比，微環(huán)DNA作為載體具有安全性好、攜帶的目 的基因表達(dá)水平高、轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)時間長等優(yōu)點(diǎn)（Darquet AM, Cameron B，Wils P，et al. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery:supercoiled minicircle. Gene Ther,1997, 4:1341-1319. Chen ZY,He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther, 2003, 8:495-500.Bigger Bff, Tolmachov 0, Collombet JM, et al.An araC-controlled bacterial ere expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy. J Biol Chem, 2001, 276:23018-23027.)。
[0003] 已有報道利用LR克隆酶（Invitrogen, Cat. No. 11791-020)成功獲得微環(huán)DNA 載體（Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al.Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Pro Natl Acad Sci U S A, 2011，108 (19) : 7902-7907)。上述報道方法為：構(gòu)建親本質(zhì)粒時連入attL和attR片段， 在體外LR克隆酶的作用下attL和attR片段發(fā)生重組，生成微質(zhì)粒和微環(huán)DNA，微質(zhì)粒在 限制性內(nèi)切酶作用下被破壞，最后通過切膠回收獲得微環(huán)DNA，然而該方法存在如下缺點(diǎn)： 1、LR克隆酶價格昂貴，200 μ 1體系用量大，成本較高；2、微環(huán)DNA經(jīng)過膠回收純化得到，損 失大，獲得量少；3、步驟繁瑣，LR反應(yīng)后還要進(jìn)行限制性酶切將微載體破壞，造成后續(xù)微環(huán) DNA純化回收的困難。因此很有必要對如何高效、快速、經(jīng)濟(jì)地利用LR克隆酶獲得微環(huán)DNA 載體的方法進(jìn)行研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對目前利用LR克隆酶獲得微環(huán)DNA的步驟 較繁瑣以及微環(huán)DNA獲得量較低的缺陷，提供一種獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)基因的 方法和應(yīng)用，利用本發(fā)明所述的親本質(zhì)粒可以高效、快速、經(jīng)濟(jì)地得到微環(huán)DNA，并且高效、 快速地獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種獲得微環(huán)DNA的親 本質(zhì)粒，其特征在于，所述親本質(zhì)粒是在真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒中插入attR 片段和attL片段以及OC31整合酶基因表達(dá)盒構(gòu)建而成，其中所述attR片段插入 pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Spe I和Dra III的酶切位點(diǎn)之間，所述attL片段插入 pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Afl III和Ase I的酶切位點(diǎn)之間，所述OC31整合酶基 因表達(dá)盒插入pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Afl III的酶切位點(diǎn)。
[0006] 其中所述表達(dá)盒為本領(lǐng)域常規(guī)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒較佳地包括合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序 列，以及轉(zhuǎn)錄終止信號，還包括有助于實(shí)現(xiàn)表達(dá)或?qū)崿F(xiàn)表達(dá)所需的其他因子，如表達(dá)增強(qiáng)子 元件。其中所述OC31整合酶基因表達(dá)盒較佳地為鏈霉菌噬菌體Φ031整合酶基因表達(dá)盒， 所述表達(dá)盒或其他外源基因表達(dá)盒在親本質(zhì)粒的位置為任何位置，只要不影響該親本質(zhì)粒 的其他功能以及外源基因的表達(dá)即可。
[0007] 其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是指調(diào)節(jié)與其連接的核酸序列轉(zhuǎn)錄的具有調(diào)控功能的核 酸序列。當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"可 操作地連接"于所述核酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或表達(dá)控制序列較佳地包括啟動子、增強(qiáng)子、 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、位于蛋白編碼基因前的起始密碼子、內(nèi)含子剪接信號以 及終止密碼子。
[0008] 其中所述"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列"是指核酸序列，其功能是控制一個或多個編碼序列的 轉(zhuǎn)錄，并且對于編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向而言位于其上游，并且在結(jié)構(gòu)上由DNA 依賴性RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DNA序列決定，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因 子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的作用是直接或間接調(diào)節(jié) 由啟動子轉(zhuǎn)錄的任何其他核酸序列，包括衰減子、增強(qiáng)子或者沉默子。其中所述啟動子較佳 地包括組成型啟動子，誘導(dǎo)型啟動子和/或組織特異性啟動子。其中所述組成型啟動子是 在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中有活性的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是受到生理或 發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，例如通過應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑進(jìn)行調(diào)節(jié)的啟動子。組織特異性啟動子僅在 特定類型的組織或細(xì)胞中有活性。本發(fā)明所述OC31整合酶基因表達(dá)盒中的啟動子為常規(guī) 啟動子，較佳地為真核啟動子，更佳地為PGK啟動子；其中所述外源基因表達(dá)盒中的啟動子 為常規(guī)啟動子，較佳地為真核啟動子，更佳地為CMV啟動子。
[0009] 其中所述OC31整合酶基因?yàn)槌Ｒ?guī)的OC31整合酶基因，所述OC31整合 酶基因較佳地為小鼠密碼子優(yōu)化的OC31整合酶基因 （Raymond CS and Soriano P. High-efficiency FLP and PhiC31site-specific recombination in mammalian cells. PLoS one, 2007, 2:el62.)或者鏈霉菌噬菌體OC31整合酶。其中所述attL片段與 attR片段為本領(lǐng)域常規(guī)核酸序列，所述attR片段和attL片段較佳地是指λ噬菌體的attP 位點(diǎn)和細(xì)菌基因組中attB位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)重組后產(chǎn)生的核酸序列。所述attL片段與attR 片段的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為人工合成序列即得。
[0010] 本發(fā)明所述attR片段的制備方法較佳地為：利用attR-up引物和attR-down引 物，以attR單鏈序列和attRrc單鏈序列為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)即得。
[0011] 其中所述attR-up引物的序列較佳地如序列表中SEQ ID NO: 1所示，所述引物含 有Spe I限制性酶切位點(diǎn)；其中所述attR-down的序列較佳地如序列表中SEQ ID N0:2所 示，該引物含有Dra III限制性酶切位點(diǎn)。其中所述引物的制備方法為常規(guī)制備方法，較佳地 為人工全序列合成。
[0012] 其中所述attR單鏈序列為本領(lǐng)域常規(guī)序列，所述attR單鏈序列較佳地為序列表 中SEQ ID N0:3所示（125bp);所述attRrc單鏈序列為本領(lǐng)域常規(guī)序列，所述attRrc單鏈 序列較佳地為序列表中SEQIDN0:4所示（125bp)。本發(fā)明所述attR單鏈序列和attR;rc 序列的制備方法為常規(guī)制備方法，較佳地為人工全序列合成。
[0013] 其中所述的PCR反應(yīng)為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)的體系較佳地為： 模板 attR 單鏈和 attRrc 單鏈各 5ng，引物 attR-up 和 attR-down (10 μ M)各 1 μ 1，ExTaq 酶（5υ/μ 1) 0· 25μ 1，lOXExTaq Buffer5y 1，dNTP (2. 5mM) 4μ 1，加 ddH20 至 50μ 1。
[0014] 其中所述PCR的程序較佳地為：（1)94°C變性30s ;(2)55°C復(fù)性30s，（3)72°C延 伸30s，步驟（1)?（3)循環(huán)26次；（4) 72°C，延伸2min。
[0015] 其中所述attL片段為常規(guī)，所述attL片段的制備方法較佳地為：將attL單鏈和 attLrc單鏈各稀釋成100?150 μ Μ的溶液，將溶液等摩爾混合，放置在100°C沸水的燒杯 中自然冷卻到20?40°C即得。
[0016] 其中所述attL單鏈序列較佳地為序列表中SEQ ID N0:5所示（107bp，5'端含 Afllll限制性酶切粘末端）；其中所述attLrc單鏈較佳地為序列表中SEQ ID N0:6所示 (105bp，5'端含Asel限制性酶切粘末端）。其中所述attL單鏈和attLrc單鏈的制備方法 為常規(guī)制備方法，較佳地為人工合成全序列即得。
[0017] 其中所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒以出發(fā)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，所述出發(fā)載體為 本領(lǐng)域常規(guī)載體，較佳地為真核表達(dá)載體，更佳地為pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒。
[0018] 其中所述的出發(fā)載體較佳地還包括熒光蛋白，所述熒光蛋白為常規(guī)熒光蛋白，較 佳地為綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白，本發(fā)明所述出發(fā)載體包含的熒光蛋白更佳地為增強(qiáng) 型綠色熒光蛋白（EGFP)。
[0019] 本發(fā)明所述親本質(zhì)粒的構(gòu)建方法為常規(guī)構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法較佳地 為：首先在pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Spe I和Dra III位點(diǎn)中插入attR序 列構(gòu)建pEGFP-Nl-attB-attR載體；其次在pEGFP-Nl-attB-attR載體的限制性內(nèi)切 酶Afl III和Ase I位點(diǎn)中插入attL序列，構(gòu)建pEGFP-Nl-attB-attR-attL載體；最 后將所得pEGFP-Nl-attB-attR-attL利用限制性內(nèi)切酶Af 1 III酶切后獲得線性化 pEGFP-Nl-attB-attR-attL質(zhì)粒，將所得線性化質(zhì)粒補(bǔ)平后去磷酸化，與線性化OC31整合 酶基因表達(dá)盒連接，即得pEGFP-Nl-attB-attR-attL-C>C31親本質(zhì)粒。
[0020] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為：一種包含如上所述的親本 質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0021] 其中所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體是指含有本發(fā)明所述親本質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。其中所述重 組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法較佳地為：將上述親本質(zhì)粒pEGFP-Nl-attB-attR-attL-〇C31轉(zhuǎn) 化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要 能滿足使所述轉(zhuǎn)親本質(zhì)粒穩(wěn)定地自行復(fù)制，且其所攜帶的外源基因可被有效表達(dá)即可。其 中所述宿主微生物較佳地為：大腸埃希氏菌（E.coli)，更佳地為大腸埃希氏菌DH5ci或大 腸埃希氏菌T0P10。將前述親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH5ci中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的重組表 達(dá)轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，其較佳地包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法、熱激法或電轉(zhuǎn) 法。
[0022] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為：一種轉(zhuǎn)基因方法，其中所述 轉(zhuǎn)基因方法包括以下步驟：
[0023] (1)在如上述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中插入外源基因；
[0024] (2)將步驟（1)所得的獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒中加入LR克隆酶進(jìn)行LR重組反 應(yīng),得到包含微環(huán)DNA和表達(dá)Φ031整合酶的微質(zhì)粒的LR重組體系，所述LR重組反應(yīng)的條 件為：20?30°C，反應(yīng)3?14小時；
[0025] (3)利用所得LR重組體系轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0026] 步驟（1)為在如上所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中插入外源基因。 其中所述插入外源基因的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為通過在上述獲得微環(huán)DNA的親 本質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行克隆插入外源基因即得插入外源基因 的親本質(zhì)粒。
[0027] 步驟（2)為：將步驟（1)所得的獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒中加入LR克隆酶進(jìn)行LR 重組反應(yīng)，得到包含微環(huán)DNA和表達(dá)Φ031整合酶的微質(zhì)粒的LR重組體系，所述LR重組反 應(yīng)的條件為：20?30°C，反應(yīng)3?14小時。
[0028] 其中所述LR克隆酶為常規(guī)LR克隆酶，是指能夠催化LR重組反應(yīng)的LR克隆酶。所 述LR重組反應(yīng)為常規(guī)LR重組反應(yīng)，即attL序列和attR序列之間發(fā)生重組反應(yīng)。其中所 述LR克隆酶的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為市售可得。
[0029] 其中所述LR重組反應(yīng)的溫度更佳地為25°C，LR重組反應(yīng)的反應(yīng)時間更佳地為4 小時。
[0030] 其中所述LR重組體系中微環(huán)DNA和表達(dá)OC31整合酶的質(zhì)粒的摩爾比為1:1，共 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞時，在所述LR重組體系中可添加表達(dá)Φ031整合酶的質(zhì)粒，使共轉(zhuǎn)染體系中 微環(huán)DNA與表達(dá)OC31整合酶的質(zhì)粒的摩爾比較佳地為1:1?1:100,更佳地為1:5。
[0031] 其中所述轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞較佳地為真核細(xì)胞，更佳地為貼壁生長的真核細(xì)胞，優(yōu)選 地為具有假attp位點(diǎn)的真核細(xì)胞。所述真核細(xì)胞較佳地包括來自于人、小鼠、大鼠、果蠅、 兔、羊和牛的真核細(xì)胞，更佳地包括：HeLa細(xì)胞，牛耳皮膚成纖維細(xì)胞和羊耳皮膚成纖維細(xì) 胞。
[0032] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四為：如上所述的親本質(zhì)粒在制 備轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒能夠廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因治療領(lǐng) 域。所述應(yīng)用較佳地為將所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒經(jīng)LR重組反應(yīng)后所得的微環(huán)DNA 作為轉(zhuǎn)基因載體將外來基因?qū)胨拗骷?xì)胞的基因組中。
[0034] 其中所述轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將具有潛在應(yīng)用價值的基因通過一定方式導(dǎo)入培養(yǎng)的 細(xì)胞中，使有應(yīng)用價值的蛋白高效表達(dá)的一種生物工程技術(shù)，更佳地為利用本發(fā)明所述獲 得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒攜帶具有潛在應(yīng)用價值的基因通過一定方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而達(dá) 到獲得有應(yīng)用價值的蛋白的目的。
[0035] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之五為：如上所述的親本質(zhì)粒在制 備基因治療藥物中的應(yīng)用。
[0036] 其中所述基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入 人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的一種生物醫(yī)學(xué)新 技術(shù)，更佳地為利用本發(fā)明所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒通過LR重組反應(yīng)所得的微環(huán)DNA 載體，該微環(huán)DNA載體不含細(xì)菌骨架序列，安全性較高。微環(huán)DNA能夠?qū)⑵鋽y帶的正?；?或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞以糾正基因缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而 達(dá)到治療疾病的目的。
[0037] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0038] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0039] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：利用本發(fā)明提供的獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒經(jīng)LR重 組反應(yīng)后，該LR重組體系中的微環(huán)DNA載體對靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作時具有較高的轉(zhuǎn)基因 效率，外源基因的轉(zhuǎn)染率和整合效率均大幅提高，表達(dá)量也增加。利用該親本質(zhì)粒獲得的微 環(huán)DNA載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作無需太多昂貴的LR克隆酶，僅使用少量LR克隆酶即可；所得LR 重組體系無需純化，可直接用于轉(zhuǎn)基因操作，操作方法簡單易行。利用本發(fā)明提供的獲得微 環(huán)DNA的親本質(zhì)粒能夠快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得用于穩(wěn)定整合外源基因的微環(huán)DNA，具有重 要的生物學(xué)意義及實(shí)際的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31親本質(zhì)粒的構(gòu)建策略圖。
[0041] 圖2為pEGFP-Nl-attB_attR-attL-C>C31親本質(zhì)粒的LR重組反應(yīng)示意圖。通過 將該親本質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)即得到微環(huán)DNA和表達(dá)Φ031整合酶的微質(zhì)粒。
[0042] 圖3為attR雙鏈PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中泳道1為PCR產(chǎn)物，泳道2 為 100bp marker。
[0043] 圖4為Pvu II酶切含有OC31整合酶基因的pPGKPhiC31obpA質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電 泳圖譜。其中泳道1為1Kb marker，泳道2為酶切產(chǎn)物。
[0044] 圖5為EcoR I限制性酶切pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31親本質(zhì)粒瓊脂糖凝 膠電泳圖譜。其中 1-13 泳道分別為：2kl5,2kl4,2kl2,2kll，2kl0,2k8，lKbmarker，2k7， 2k6,2k5,2k3,2k2 和 2kl。
[0045] 圖6為EcoR I限制性酶切LR重組反應(yīng)體系瓊脂糖凝膠電泳圖。其中泳道1為LR 重組反應(yīng)體系，泳道2為1Kb marker。
[0046] 圖7為微環(huán)DNA載體轉(zhuǎn)染率測定結(jié)果圖。其中1為微環(huán)DNA載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞， 2為pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。
[0047] 圖8為微環(huán)DNA載體整合率測定結(jié)果圖。其中1為微環(huán)DNA載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞， 2為pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。
[0048] 圖9為OC31整合酶載體分別與微環(huán)DNA載體（以"MC"表示）或pEGFP-Nl-attB 質(zhì)粒載體（以"C"表示)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞所得細(xì)胞克隆的基因組中EGFP部分片段PCR產(chǎn)物瓊 脂糖凝膠電泳圖譜。其中卜13泳道分別為：水，2k8 (親本質(zhì)粒，陽性對照)，100bp marker, MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, Cl，C2, C3, C4 和 C5。
[0049] 圖10為OC31整合酶載體分別與微環(huán)DNA載體（以"MC"表示）或pEGFP-Nl-attB 質(zhì)粒載體（以"C"表示)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞所得細(xì)胞克隆基因組中attB部分片段PCR產(chǎn)物瓊脂 糖凝膠電泳圖譜。其中1-13泳道分別為：水，2k8(親本質(zhì)粒，其中attB位點(diǎn)完整，作為PCR 反應(yīng)的陽性對照），l〇〇bp marker，MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, Cl，C2, C3, C4 和 C5。
[0050] 圖11為OC31整合酶載體分別與微環(huán)DNA載體（以MC表示)或pEGFP-Nl-attB質(zhì) 粒載體（以C表示)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞所得細(xì)胞克隆基因組中LR重組部分片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖 凝膠電泳圖譜。其中1-8泳道分別為：MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, LR重組體系（PCR反應(yīng)的陽 性對照)，lOObp marker和C1 (其中不含LR位點(diǎn)，為陰性對照)。
[0051] 圖12為OC31整合酶載體分別與微環(huán)DNA載體或pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn) 染HeLa細(xì)胞所獲細(xì)胞克隆中目的基因 EGFP表達(dá)量的流式細(xì)胞儀測定結(jié)果圖。其中1為微 環(huán)DNA載體整合HeLa細(xì)胞克隆的平均熒光強(qiáng)度，2為pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒整合HeLa細(xì)胞克 隆的平均熒光強(qiáng)度。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。所述室溫為20?40°C。
[0053] 以下實(shí)施例中，所用到的含有目的基因綠色熒光蛋白（EGFP)和attB位點(diǎn)的質(zhì)粒 pEGFP-Nl-attB及含有目的基因 ΤΡ0的質(zhì)粒pPlA3-hTP0由上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所提供。其 中，質(zhì)粒pEGFP-Nl-attB的構(gòu)建方法請參考專利號為ZL200510111476. 3的中國發(fā)明專利， pPlA3-hTP0的構(gòu)建參考寧云山等的方法（寧云山等，ΤΡ0內(nèi)含子V可顯著增強(qiáng)人血小板生 成素基因在乳腺細(xì)胞中的表達(dá)，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2007,23(07) :537-541)。 含鏈霉菌噬菌體OC31整合酶基因的質(zhì)粒pPGKPhiC31obpA購于Addgene (Addgene Plasmid#13795)〇
[0054] 使用的HeLa細(xì)胞購自中科院生化細(xì)胞所。LR克隆酶購自Invitrogen公司（Cat. No. 11791-020)。引物及attL和attR各自兩條單鏈都合成于Invitrogen公司。PCR純化 試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司。
[0055] 蛋白酶K購自Invitrogen公司；DMS0購自Sigma-Aldrich公司；Tris飽和酌·購 自上海沓瑪生物科技有限公司；氯仿為無錫市東風(fēng)化工廠出品；異戊醇為上海試劑一廠生 產(chǎn)；醋酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇由常熟市楊園化工有限公司生產(chǎn)。
[0056] 以下實(shí)施例中，如非特別說明，所用試劑均購自NEB公司。
[0057] 實(shí)施例1親本質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0058] 本發(fā)明所述pEGFP-Nl-attB_attR-attL-C>C31質(zhì)粒的構(gòu)建策略如圖1所示，在 pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒上依次連入attR序列，attL序列和OC31整合酶基因。
[0059] 1、連入attR片段
[0060] 引物設(shè)計(jì)：attR-up (含有Spel限制性酶切位點(diǎn)），其序列如序列表中SEQ ID NO: 1 所示；
[0061] attR-down (含有Dra III限制性酶切位點(diǎn)），其序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
[0062] PCR擴(kuò)增獲得attR雙鏈片段。
[0063] attR 和 attRrc 單鏈由 Invitrogen 公司合成。
[0064] attR序列，其序列如序列表中SEQ ID N0:3所示（125bp);
[0065] attRrc序列，其序列如序列表中SEQ ID N0:4所示（125bp)。
[0066] PCR反應(yīng)體系（50 μ 1):模板attR和 attRrc 單鏈各 5ng，引物attR-up 和 attR-down (10μΜ)各 1μ l，ExTaq 酶（5υ/μ 1)0. 25μ l，10XExTaq Buffer5y l，dNTP (2· 5πιΜ)4μ 1， 加 ddH20 至 50 μ 1。
[0067] PCR 反應(yīng)程序：（1)94°C變性 30s ;(2)55°C復(fù)性 30s，（3)72°C延伸 30s，步驟（1)? (3)循環(huán) 26 次；（4)72°C，延伸 2min。
[0068] 將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過PCR后得到了目的 條帶雙鏈attR (144bp)。
[0069] 將擴(kuò)增獲得的雙鏈attR和pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒分別進(jìn)行Spe I和Dra III雙酶切， 酶切條件均為：37°C，酶切2小時。酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化后再進(jìn)行連接。連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆。利用上述PCR方法驗(yàn)證質(zhì)粒中連接上attR片段后，送博尚 生物技術(shù)有限公司測序，序列完全正確。確認(rèn)pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒已連接上attR片段。
[0070] 2、連入attL片段
[0071] Invitrogen公司合成獲得attL的兩條單鏈：
[0072] attL(107bp，5'端含Afl III限制性酶切粘末端），其序列如序列表中SEQ ID N0:5 所示；
[0073] attLrc(105bp，5'端含Ase I限制性酶切粘末端），其序列如序列表中SEQ ID NO :6所示。
[0074] 將所得attL和attLrc單鏈各稀釋成濃度為100 μ Μ的溶液，將所得溶液等摩爾混 合，放置在l〇〇°C沸水的燒杯中自然冷卻到20?40°C，即可獲得雙鏈attL序列，所得attL 序列摩爾濃度為50 μ M，質(zhì)量濃度為1734. 6ng/μ 1，將其濃度稀釋成17. 35ng/μ 1。
[0075] 將pEGFP-Nl-attB-attR質(zhì)粒用Af 1 III和Ase I雙酶切，酶切條件為37°C，水浴加 熱2小時。酶切產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化，測濃度為82. 7ng/ μ 1，再進(jìn)行連接。
[0076] 連接體系（20μ 1)為：10XT4DNA Ligase Buffer2y 1，雙鏈 attL(17. 35ng/ μ 1)3. 1 μ 1，pEGFP-Nl-attB-attR 載體（82. 7ng/y 1)2. 4μ 1，T4Ligasel μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。反應(yīng)條件：在16°C PCR儀器中過夜反應(yīng)。
[0077] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆，送博尚生物技術(shù)有限公司測序，序列完全正 確，確認(rèn)pEGFP-Nl-attB-attR質(zhì)粒已連接上attL片段。
[0078] 3、連入OC31整合酶基因
[0079] ?仰11酶切含有〇〇31整合酶基因的？?6即11扣31(^4質(zhì)粒，目的片段為2.91〇3。酶 切體系為：DNA (pPGKPhiC31obpA 質(zhì)粒）24μ g、Pvu II酶（2〇υ/μ 1)8μ l、10Xbuffer8y 1、 加 ddH20至80 μ 1。酶切條件為37°C，水浴加熱2小時。
[0080] 純化酶切產(chǎn)物：膠回收試劑盒純化Pvu II酶切產(chǎn)物。回收結(jié)果：產(chǎn)物濃度52. lng/ μ 1，產(chǎn)物體積40 μ 1。酶切的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。Pvu II酶可切出2907bp、 187bp、2514bp三條帶（圖中有一條約550bp非特異性酶切產(chǎn)生的條帶)，將2. 9Kb條帶切下 回收。
[0081] Afl III 酶切 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 質(zhì)粒，目的片段 4. 4Kb。酶切體系為： DNA (pEGFP-Nl-attB-attR-attL 質(zhì)粒）10 μ g、酶（5U/μ 1) 12 μ 1、10Xbufferl2 μ 1、 100XBSA1. 2μ 1、加 ddH20至120μ 1，酶切條件為37°C，水浴加熱2小時。
[0082] PCR純化試劑盒回收Afl III酶切產(chǎn)物，即線性化的pEGFP-Nl-attB-attR-attL質(zhì) 粒?；厥战Y(jié)果：產(chǎn)物濃度213. 8ng/μ 1，產(chǎn)物體積35 μ 1。
[0083] 補(bǔ)平線性化的 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 質(zhì)粒，補(bǔ)平體系：10Xbuffer5 μ 1、 0· 1%BSA5 μ 1、dNTP (2. 5mM) 5 μ 1、DNA33. 5 μ 1、T4DNA 聚合酶 2 μ 1。
[0084] 補(bǔ)平反應(yīng)步驟為：
[0085] a.將所述 4 個組分（10 Xbuffer5 μ 1、0· 1%BSA5 μ 1、dNTP (2. 5mM) 5 μ 1、DNA (pEGFP-Nl-attB-attR-attL 質(zhì)粒）33. 5μ 1)混勻，70°C lOmin 預(yù)變性，移入 37°C水浴中降 溫。
[0086] b.加入T4DNA聚合酶，混勻，37°C水浴15min。
[0087] c.用振蕩器劇烈震蕩使酶失活。利用PCR純化試劑盒回收補(bǔ)平產(chǎn)物，回收結(jié)果： 產(chǎn)物濃度為120. lng/μ 1，產(chǎn)物體積為50 μ 1。
[0088] 將所得純化的補(bǔ)平產(chǎn)物去磷酸化，去磷酸化反應(yīng)體系：DNA43. 5 μ 1、CIP (牛小腸堿 性磷酸酶)2μ l、10Xbuffer35y 1，反應(yīng)條件：37°C水浴lh。利用PCR純化試劑盒回收去磷 酸化產(chǎn)物，回收結(jié)果：產(chǎn)物濃度115. 7ng/μ 1，產(chǎn)物體積30 μ 1。
[0089] 連接體系：回收酶切所得片段16μ 1、去磷酸化pEGFP-Nl-attB-attR-attL載體 1μ l、10Xbuffer2y 1、連接酶 1μ 1，PCR 儀中 16°C過夜。
[0090] 在卡那霉素抗性平板上得到16個克隆(編號2kl?2kl6)，抽提質(zhì)粒后選 取大小合適的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I限制性酶切，檢測OC31整合酶基因是否正確插入 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 質(zhì)粒載體。
[0091] 用EcoR I限制性酶切所得質(zhì)粒，酶切條件為37°C，水浴加熱2小時。酶切產(chǎn) 物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。若所得片段正確插入載體，則能切出1.2Kb 和6. 1Kb的條帶，從圖5中可知第6泳道編號為2k8的質(zhì)粒酶切結(jié)果正確，送博尚生物 技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果顯示OC31整合酶基因無突變正確插入載體，成功獲得 pEGFP-Nl-attB-attR-attL- Φ C31 質(zhì)粒。
[0092] 實(shí)施例2LR重組反應(yīng)
[0093] 反應(yīng)體系（10μl)為以下組分：DNA(實(shí)施例l制備所得2k8質(zhì)粒）200ng、10XTE bufferlyl、LR克隆酶（LR clonase)2yl、加 ddH20至10μ1。也可在質(zhì)粒抽提時用1XTE buffer溶解質(zhì)粒（2k8)，此時反應(yīng)體系（10μ 1)為：DNA(2k8質(zhì)粒）200ng、LR克隆酶（LR clonase) 2 μ 1、補(bǔ)加 1 XTE buffer 至 10 μ 1。
[0094] 反應(yīng)條件：PCR儀中25°C保溫處理3h?14h，該質(zhì)粒的LR克隆反應(yīng)過程如圖2所 /_J、1 〇
[0095] 用EcoR I限制性酶切LR反應(yīng)體系。若pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31質(zhì)粒發(fā) 生LR重組反應(yīng)，則能切出2. 1Kb (微環(huán)DNA)和5. 2Kb的(微質(zhì)粒）兩條帶，若為原始親本質(zhì) 粒則能切出1.2Kb和6. 1Kb的兩條帶。酶切體系為：EcoR I酶1μ l、10Xbuffer2y 1、LR 反應(yīng)體系10 μ 1、ddH20至20 μ 1，反應(yīng)條件：37°C水浴2h。
[0096] 將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示。從電泳圖可看出5. 2Kb的條 帶亮度明顯高于6. 1Kb的條帶，而1. 2Kb條帶太弱幾乎看不到，說明大部分親本質(zhì)粒都發(fā)生 了 LR重組反應(yīng)。
[0097] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞
[0098] 用 GenJet?Plus DNA In Vitro Tranfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑（SignaGen Laboratories，Cat. No. SL100499)轉(zhuǎn)染實(shí)施例2所得的LR反應(yīng)體系到12孔板中的HeLa細(xì) 胞。
[0099] 轉(zhuǎn)染步驟：
[0100] (1)用 750μ 1 無血清 DMEM (GIBCO, Cat. No. 11995-073)為 Hela 細(xì)胞換液。
[0101] (2)準(zhǔn)備兩個1.5ml EP管，分別標(biāo)記為A管和B管。若為實(shí)驗(yàn)組，則A管中依次 加入無血清 DMEM38y 1，LR 重組反應(yīng)體系 10μ 1，pPGKPhiC31obpA 質(zhì)粒（200ng/y 1) 3μ 1， 吹打3?4下混勻。若為對照組，則Α管中依次加入無血清DMEM38 μ 1，pEGFP-Nl-attB質(zhì) 粒（lOOng/μ 1) 1. 39μ 1，pPGKPhiC31obpA 質(zhì)粒（200ng/y 1) 3· 72μ 1，吹打 3 ?4 下混勻。 實(shí)驗(yàn)組與對照組的Β管相同，都分別依次加入無血清DMEM38 μ 1，轉(zhuǎn)染試劑4 μ 1，吹打3? 4下混勻。
[0102] (3 )將Β管混合液加到Α管中，吹打3?4下混勻。
[0103] (4)將混合液室溫放置20min (小于30min即可）。
[0104] (5)將所得混合液均勻滴加入12孔板中。
[0105] (6)將12孔板放入培養(yǎng)箱中，于37°C，5%C02 (體積比）條件下培養(yǎng)24h后換液，可 測轉(zhuǎn)染率。
[0106] 轉(zhuǎn)染體系如表1所示：
[0107] 表1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒體系 [0108]

【權(quán)利要求】
1. 一種獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒，其特征在于，所述親本質(zhì)粒是在真核表達(dá)載體 pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒中插入attR片段和attL片段以及OC31整合酶基因表達(dá)盒構(gòu)建而成， 其中所述attR片段插入pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Spe I和Dra III的酶切位點(diǎn) 之間，所述attL片段插入pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Afl III和Ase I的酶切位點(diǎn) 之間，所述OC31整合酶基因表達(dá)盒插入pEGFP-Nl-attB質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶Afl III的酶 切位點(diǎn)。
2. 如權(quán)利要求1所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒，其特征在于，所述attR片段為λ噬菌 體attR片段，所述attL片段為λ噬菌體attL片段。
3. 如權(quán)利要求1所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒，其特征在于，所述ΦC31整合酶基因表 達(dá)盒中的啟動子片段為PGK啟動子片段。
4. 一種包含如權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化 體。
5. -種轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因方法包括以下步驟： (1) 在權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中插入外源 基因； (2) 將步驟（1)所得的獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒中加入LR克隆酶進(jìn)行LR重組反應(yīng)，得 到包含微環(huán)DNA和表達(dá)Φ031整合酶的微質(zhì)粒的LR重組體系，所述LR重組反應(yīng)的條件為： 20?30°C，反應(yīng)3?14小時； (3) 利用所得LR重組體系轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟（2)所述LR重組體系中微環(huán)DNA 與表達(dá)OC31整合酶的質(zhì)粒的摩爾比為1:1?1:100。
7. 如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟（3)所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒在制備轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng) 用。
9. 如權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述獲得微環(huán)DNA的親本質(zhì)粒在制備基因治療藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】A61K48/00GK104232676SQ201310229687
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】馬晴雯, 劉瀏, 曾凡一 申請人:上海市兒童醫(yī)院, 上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司