專利名稱：環(huán)狀甲基化dna中的定點(diǎn)誘變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種定點(diǎn)誘變的新方法。
背景技術(shù)：
在研究DNA序列改變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響的領(lǐng)域，定點(diǎn)誘變是一種功 能強(qiáng)大的工具?？刹捎枚喾N方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變(見(jiàn)例如美國(guó)專利 6，391,548,7，132,265和6，713，285，包含在此作為參考)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 作為循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)己被廣泛地應(yīng)用于該領(lǐng)域，其中利用誘變引物引入所需 突變(見(jiàn)Allemandou et al., J Biomed Biotechnol S， 202-207， (2003); An et al" Appl Microbiol Biotechnol S 68， 774-778, (2005); Jeltsch et al" Methods Mol Biol S 182, 85-94 (2002); Hall, et al. Protein Eng. 4:601 (1991); Hemsley, et al. Nucleic Acids Research 17:6545-6551 (1989); Ho, et al. Gene 77:51-59 (1989); Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990); Jones, et al. Nature 344:793-794 (1990); Jones, et al. Biotechniques 12:528-533 (1992); Landt， et al. Gene 96:125-128 (1990); Nassal, et al. Nucleic Acids Research 18:3077-3078 (1990); Nelson, et al. Analytical Biochemistry 180:147-151 (1989); Vallette, et al. Nucleic Acids Research 17:723-733 (1989); Watkins, et al. Biotechniques 15:700-704 (1993); Weiner， et al. Gene 126:35-41 (1993);和Yao， et al. PCR Methods and Applications 1:205-207 (1992)，包含在此作為參考)。
基于這種方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增后，選擇已突變的DNA并去除母鏈質(zhì) 粒DNA是定點(diǎn)誘變技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵步驟，并且這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)各種不同 的方式實(shí)現(xiàn)。目前最常用的方法包括1)在PCR反應(yīng)時(shí)，用羥基甲基化dCTP 替換dCTP，然后利用限制性內(nèi)切酶消化僅僅去除非羥甲基化的母鏈DNA; 2) 同時(shí)突變質(zhì)粒上的目的基因和抗生素抗性基因，從而使質(zhì)粒獲得不同的抗 生素抗性，這種新的抗生素抗性便于選擇所需的突變;3 )引入所需突變后， 利用只切割甲基化DNA的限制性內(nèi)切酶Dpnl消化掉甲基化DNA模板，從 而保留了含有突變的非甲基化DNA; 4)利用另外的連接反應(yīng)使已突變的 PCR產(chǎn)物環(huán)化，提高突變DNA的轉(zhuǎn)化效率。上述方法可以在以下專利中找到美國(guó)專利號(hào)6,673,610， 5,789,166， 5,780,270， 5,354,670和5,071,743， 包含在此作為參考。此外， 一些體內(nèi)和體外的定點(diǎn)誘變篩選方法也在一些 文獻(xiàn)中提及。例如，非擴(kuò)增性體內(nèi)定點(diǎn)誘變方法，該方法是載體生長(zhǎng)過(guò)程 中，將dUTP摻入到親代DNA鏈中，并通過(guò)dut+, ung+大腸桿菌進(jìn)行篩選(見(jiàn) Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:488-492 (1985))。其他的體外篩選突 變DNA鏈的方法包括l)單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的缺失(Deng， et al. Analytical Biochemistry 200:81-88 (1992)) ; 2)固相技術(shù)(即母鏈DNA吸附于 固相)(Hultman， et al. Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990); ^Veiner, et al. Gene 126:35-41 (1993)); 3)甲基化堿基的摻入(Taylor et al. Nucleic Acids Research 13:8765-8785 (1985); Vandeyar, et al. Gene 65:129-133 (1988))等等。 所有參考文獻(xiàn)包含在此作為參考。
在上述所有的誘變方法中，把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌是擴(kuò)增質(zhì)粒的共同 方法，通常也是最后一個(gè)步驟。然而，為了便于篩選突變的DNA，所有這 些方法必須在PCR擴(kuò)增之前或之后添加額外的步驟，諸如體外酶消化。目 前正在使用的各種不同類型的定點(diǎn)誘變方法都需要更多的額外步驟以完成 對(duì)突變DNA的篩選過(guò)程，因此需要花費(fèi)更多的人力，物力和時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
為了給研究人員提供省時(shí)省力高效率的定點(diǎn)誘變方法，本發(fā)明提供了 一種篩選突變DNA以及去除母鏈質(zhì)粒DNA的新方法。該發(fā)明的方法比任 何現(xiàn)有的定點(diǎn)誘變方法更簡(jiǎn)單，可以更有效率地應(yīng)用在各種不同類型的定 點(diǎn)誘變中，例如取代突變，插入突變和缺失突變。
不受任何理論限制，本發(fā)明主要是基于甲基化DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甲基化酶 缺陷大腸桿菌(例如，Dam和Dcm缺陷大腸桿菌(Dam-Dcm-))的效率極低的 現(xiàn)象。甲基化DNA在Dam-Dcm-大腸桿菌中的復(fù)制效率很低；相反，非甲 基化DNA在Dam-Dcm-大腸桿菌中具有非常高的復(fù)制效率，因而具有非常 高的轉(zhuǎn)化效率。
因此，本發(fā)明為將特定的目的定點(diǎn)突變引入靶環(huán)狀甲基化核酸提供了 一種簡(jiǎn)便、有效的方法，其中包括
(a)利用DNA聚合酶、互補(bǔ)的誘變引物，非甲基化dNTP以及所選 待誘變的甲基化環(huán)狀核酸進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);(b) 用步驟(a)中生成的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化甲基化酶缺陷大腸桿菌菌 株，在這種甲基化酶缺陷的大腸桿菌菌株中突變的非甲基化核酸有效復(fù)制；
(c) 從所述大腸桿菌菌株中回收突變的非甲基化核酸。 本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，利用部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)引物對(duì)作為誘變引
物對(duì)，其中所述的引物對(duì)包含合意的突變諸如取代、插入或缺失，從而對(duì) 耙DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變?nèi)〈?。所述的突變位于所述引物的互補(bǔ)或非互補(bǔ) 區(qū)。
在本發(fā)明方法中，用待誘變的環(huán)狀甲基化母鏈DNk分子作為利用誘變 引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板。PCR通過(guò)變性、退火和延伸的循環(huán) 利用非甲基化dNTP進(jìn)行。然后將含有甲基化母鏈DNA模板和非甲基化突 變的子鏈DNA的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DNA甲基化酶缺陷的宿主細(xì)胞。通常選 擇Dam-Dcm-大腸桿菌作為甲基化酶缺陷的宿主細(xì)胞。因?yàn)榧谆告?DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌中的復(fù)制效率極低，而非甲基化DNA子鏈 復(fù)制效率非常高，所以含有突變的非甲基化DNA子鏈得到充分富集。
本發(fā)明方法中的甲基化酶缺陷細(xì)胞可以是任何一種甲基化酶缺陷細(xì) 胞。優(yōu)選，所述甲基化酶是Dam和Dcm。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶缺陷 可以是瞬時(shí)性的。另一實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶 缺陷是永久性的。
另一實(shí)施方案中，所述的甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶缺陷是 可誘導(dǎo)的。另一實(shí)施方案中，所述的甲基化酶缺陷大腸桿菌中的甲基化酶 缺陷可以是非誘導(dǎo)性的。
本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷細(xì)胞是Dam和Dcm缺陷 的大腸桿菌，并且所述的缺陷可以是非誘導(dǎo)性和永久性的。
更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的甲基化酶缺陷大腸桿菌 是菌株ER2925或SK383。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)狀甲基化核酸在體外甲基化。
另一實(shí)施方案中，所述環(huán)狀甲基化核酸在體內(nèi)甲基化。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，步驟(a)中的引物對(duì)在5，端和域3'端互補(bǔ)。
另一實(shí)施方案中，步驟(a)中的引物完全互補(bǔ)。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中步驟(a)中所述的DNA聚合酶是溫度穩(wěn)定性的。
本發(fā)明另一方面提供了一種將突變引入所選待誘變的DNA分子的試 劑盒。該試劑盒含有但不限于甲基化酶缺陷細(xì)胞，優(yōu)選甲基化酶缺陷的大 腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明的詳細(xì)目的、方法及優(yōu)勢(shì)將在下面的發(fā)明內(nèi)容詳述、權(quán)利要求 書和附圖及其說(shuō)明等部分中進(jìn)一步詳述。


圖1.本發(fā)明的定點(diǎn)誘變方案的圖示
步驟(a)顯示利用親代甲基化質(zhì)粒作為定點(diǎn)誘變的模板。虛線代表甲基 化修飾的鏈。步驟(b)顯示兩條用于引入突變的互補(bǔ)引物分別與模板DNA中 相對(duì)應(yīng)的鏈退火。X代表合意的突變。已摻入突變的非甲基化子鏈DNA通 過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)合成。實(shí)線代表非甲基化鏈。步驟(c)顯示聚合酶鏈反應(yīng)的 產(chǎn)物，其中含有甲基化、非甲基化和半甲基化的雙鏈DNA。步驟(d)顯示PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化甲基化酶缺陷大腸桿菌的結(jié)果。甲基化DNA和半甲基化DNA的 復(fù)制受到抑制；而非甲基化突變子鏈DNA有效復(fù)制，從而隨后得到富集。
圖2.兩個(gè)引物中誘變位點(diǎn)的選擇舉例
圖中X代表誘變位點(diǎn)。 一個(gè)X代表一個(gè)或多個(gè)取代、插入或缺失或其 組合。本圖解舉例說(shuō)明了當(dāng)利用兩個(gè)引物進(jìn)行誘變時(shí)，誘變位點(diǎn)可以位于 引物對(duì)的互補(bǔ)區(qū)，也可以位于引物對(duì)的非互補(bǔ)區(qū)，但是誘變位點(diǎn)的選擇并 不局限于此。定點(diǎn)誘變的引物對(duì)可以在5 '端部分互補(bǔ)(A)或完全互補(bǔ)(B)， 也可以在3 '端部分互補(bǔ)(C),但互補(bǔ)的形式并不局限于上述3種情況。
圖3.不同的Dam-Dcm-大腸桿菌菌株獲得相似的誘變效率
3-核苷酸取代(引物1#和引物2#)以及l(fā)l-核苷酸缺失(引物7#: gtgtcaggcccttgaaaggaattccatcagagttgaatg
弓I物#8: cctttcaagggcctgacacttttcttgaagtctcttcttc)的誘變反應(yīng)利用相應(yīng)的弓| 物對(duì)進(jìn)行，其中利用Fip2質(zhì)粒作為模板并利用KOD HiFi DNA聚合酶。PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入兩個(gè)大腸桿菌Dam-Dcm-菌株，ER2925和SK383，并測(cè)定誘變 效率。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供有效地將特定的定點(diǎn)突變引入耙環(huán)狀甲基化核酸的方法， 所述方法包括
(a)利用DNA聚合酶、互補(bǔ)的誘變引物，非甲基化dNTP以及所選待誘 變的環(huán)狀甲基化核酸進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);
(b訴步驟(a)中生成的PCR產(chǎn)物的混合物轉(zhuǎn)化甲基化酶缺陷大腸桿菌 菌株，在這種甲基化酶缺陷的大腸桿菌菌株中突變的非甲基化核酸有效復(fù) 制；
(c)從甲基化酶缺陷大腸桿菌菌株中回收突變的非甲基化核酸。 本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"甲基化酶"是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTases)，其功能是把 甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到腺嘌呤或胞嘧啶殘基上。甲基化酶在原核生物 和真核生物中廣泛存在。當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)的特定堿基被甲基化時(shí)，切割可能 被阻斷或阻礙，所以在使用限制性內(nèi)切酶切割DNA時(shí)需要考慮到甲基化的 影響。
在原核生物中，限制/修飾體系可以保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制性內(nèi) 切酶裂解，其中甲基化酶常常被認(rèn)為是限制/修飾體系中的一個(gè)要素。大多 數(shù)實(shí)驗(yàn)室的大腸桿菌菌株含有三種位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶。 一種DNA 甲基化酶由&m基因編碼(Dam甲基化酶)，功能是把甲基轉(zhuǎn)移到GATC序列 中的腺苷酸的N6位上(Marinus, et al. J. Bacteriol. 114， 1143-1150 (1973); Geier， et al. J. Biol. Chem. 254, 1408—1413 (1979))。另一種DNA甲基化酶是 Dcm甲基化酶，由dcm基因編碼，可以甲基化CCAGG和CCTGG序列中的 內(nèi)部胞嘧啶殘基的C5位點(diǎn)(Marinus， et al. J. Bacteriol. 114， 1143—1150 (1973); May, et al. J. Bacteriol. 123,768-770 (1975))。還有一種甲基化酶被稱為EcoKI 甲基化酶(M.EcoKI),功能是對(duì)AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT序列中的 腺嘌呤核苷酸進(jìn)行修飾。如果甲基化識(shí)別位點(diǎn)與內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)重疊，從 表達(dá)Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶的菌株中分離提取出來(lái)的DNA中的部分 或全部的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)均可為切割抗性的。
幾乎所有實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的大腸桿菌菌株都為Dam+Dcm+，而且大部分大腸 桿菌菌株是]VrEcoKI。
本發(fā)明中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"定點(diǎn)誘變"是指在DNA分子序列中某一特定的 位點(diǎn)產(chǎn)生突變的過(guò)程。所述特定位點(diǎn)的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究中的需要而決定。 用于定點(diǎn)誘變的DNA分子通常是指環(huán)狀DNA分子如質(zhì)粒等。一般情況下，定點(diǎn)誘變要求待突變基因的野生型的序列是已知的。這種突變技術(shù)也被稱 為"位點(diǎn)特異性誘變"或"寡核苷酸定向誘變"。
因此，"定點(diǎn)突變"是指利用定點(diǎn)誘變技術(shù)在DNA分子序列上某特定
位點(diǎn)產(chǎn)生的突變。該突變的位置根據(jù)不同的需要而確定。
本發(fā)明中使用的"甲基化酶缺陷大腸桿菌"指的是其中DNA甲基化酶 功能缺陷的大腸桿菌。這種DNA甲基化酶功能缺陷的原因是DNA甲基化 酶基因由于各種因素所導(dǎo)致的DNA甲基化酶基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平降低和/ 或甲基化酶活性在蛋白質(zhì)水平上的降低。甲基化酶缺陷是可誘導(dǎo)的，或者 不可誘導(dǎo)的；可以是瞬時(shí)性的缺陷，或是永久性的缺陷，又或者任何上述 的組合(見(jiàn)下文)。DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌內(nèi)合成時(shí)不能被有效地甲 基化，而在非甲基化酶缺陷大腸桿菌中可以被甲基化。
本發(fā)明的每一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的方法利用甲基化酶缺陷大 腸桿菌作為一種篩選工具，有效地去除甲基化DNA母鏈，而突變的非甲基 化DNA子鏈被特異地富集。本發(fā)明方法省時(shí)省力即可實(shí)現(xiàn)合意的誘變，減 少了不必要的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)花費(fèi)。因此，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)(l)廣泛的兼 容性(2)高誘變效率，和(3)簡(jiǎn)單性。
每一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的方法涉及到利用甲基化DNA作為突 變的靶。 一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的甲基化DNA在體外獲得。 一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明的甲基化DNA在體內(nèi)獲得。另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的甲 基化DNA是在體外和體內(nèi)獲得的DNA分子的組合。例如，DNA的體外甲 基化可通過(guò)體外甲基化酶反應(yīng)或者在體外合成的過(guò)程中摻入甲基化的 dNTP來(lái)實(shí)現(xiàn)。體內(nèi)DNA的甲基化也可以輕松地實(shí)現(xiàn)，例如在內(nèi)源性表達(dá) 甲基化酶的真核細(xì)胞或原核細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行DNA復(fù)制。本發(fā) 明的一些實(shí)施方案中，利用實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的大腸桿菌菌株產(chǎn)生甲基化DNA， 所述大腸桿菌菌株例如但不限于含有甲基化酶Dam和Dcm的DH5 a ， ToplO ， XL1-Blue等，其中的甲基化酶Dam和Dcm可以把甲基轉(zhuǎn)移到腺 嘌呤或胞嘧啶殘基。眾所周知，甲基化酶Dam和Dcm是廣泛存在于原核生 物中的兩種主要的DNA甲基化酶。它們通常被鑒定為限制/修飾系統(tǒng)中的 基本元素，可以保護(hù)宿主DNA不被體內(nèi)限制性內(nèi)切酶所切割。目前已知幾 kb長(zhǎng)度的DNA中包含了大量的Dam甲基化位點(diǎn)(平均256個(gè)堿基有1個(gè)) 或Dcm甲基化位點(diǎn)(平均512個(gè)堿基有1個(gè))，其中許多位點(diǎn)能夠被大腸桿菌中表達(dá)的Dam和Dcm甲基化酶所甲基化。此外， 一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明的方法中所應(yīng)用的靶誘變DNA序列是雙鏈的；其他實(shí)施方案中，所述靶 誘變DNA序列是單鏈的。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變可以是目的DNA序列中的一或多個(gè)取 代，也可以是插入或缺失。 一些其他實(shí)施方案中，所述的突變可為更復(fù)雜 的突變，包括一種以上類型的突變組合。 一些實(shí)施方案中，所述的突變包 括所有三種類型取代、插入和缺失。本發(fā)明的方法利用兩種或兩種以上 的引物引入突變。優(yōu)選使用兩個(gè)引物。這兩個(gè)引物在5'端和/或3'末端序列 部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。所要摻入的突變位于一條或兩個(gè)引物中，可以位于 兩引物的互補(bǔ)區(qū)，也可以位于非互補(bǔ)區(qū)(圖2)。 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如果 利用兩個(gè)部分互補(bǔ)的引物，所述突變位于兩個(gè)引物的互補(bǔ)區(qū)中。另一優(yōu)選 實(shí)施方案中，如果利用兩個(gè)部分互補(bǔ)的一物，所述突變位于一或兩個(gè)引物 的非互補(bǔ)區(qū)。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，如果利用兩個(gè)完全互補(bǔ)的引物，所述 突變位于兩個(gè)引物的中間區(qū)域。
本發(fā)明方法中使用的引物可為化學(xué)合成的引物，其可以商購(gòu)獲得。優(yōu) 選，利用非甲基化dNTP合成所述引物。本發(fā)明方法對(duì)引物純化度的要求與 普通的PCR反應(yīng)相同， 一般來(lái)說(shuō)，引物的脫鹽柱純化就可以滿足反應(yīng)條件。 而且沒(méi)有必要使引物5'端磷酸化。
本發(fā)明中通常的引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)核苷酸到50個(gè)核苷酸，通常在 25個(gè)核苷酸到45個(gè)核苷酸之間。如果是插入突變，引物長(zhǎng)度可能會(huì)長(zhǎng)于 50個(gè)核苷酸。兩個(gè)引物互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度通常在10個(gè)核苷酸到50個(gè)核苷酸左 右。設(shè)計(jì)引物對(duì)的方法是本領(lǐng)域已知的。
在本發(fā)明中,最初步驟一般是誘變引物對(duì)與靶核酸鏈雜交，為了使誘變 引物對(duì)與目的DNA序列充分退火，需要進(jìn)行充分的變性反應(yīng)。模板甲基化 DNA的充分變性很容易實(shí)現(xiàn)，例如，可以加熱變性或者化學(xué)變性。優(yōu)選， 甲基化的模板DNA加熱到94。C至98。C，持續(xù)30分鐘或以下。更優(yōu)選，模 板甲基化DNA在98°C加熱30分鐘。本領(lǐng)域已知，充分變性的兩個(gè)目的是 l)使雙鏈模板完全變性，使引物對(duì)與模板鏈充分退火;2)降低模板DNA的轉(zhuǎn) 化效率，最終增加本發(fā)明方法的誘變率。
變性后，利用非甲基化dNTP進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。在本發(fā)明的所有實(shí)施 方案中，誘變引物與甲基化DNA模板的相應(yīng)鏈退火，然后延伸引物，合成兩條含有突變的新子鏈DNA。產(chǎn)生雜合的半甲基化雙鏈DNA形式，這種 半甲基化雙鏈DNA包括一條甲基化的模板DNA鏈和一條非甲基化的子鏈。 本發(fā)明方法中使用非甲基化dNTP以確保子鏈DNA為非甲基化形式。在隨 后的PCR反應(yīng)循環(huán)中，a)引物可以和上一次PCR循環(huán)反應(yīng)中合成的相應(yīng)子 鏈退火，形成雙鏈DNA分子，進(jìn)入下一次PCR循環(huán)反應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)增；和/或 b)兩條互補(bǔ)的子鏈退火，直接形成雙鏈DNA分子。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案 中，應(yīng)用5'端部分互補(bǔ)的兩個(gè)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)得到的突變雙 鏈DNA分子分別來(lái)源于上述的a)和b)。另一實(shí)施方案中，應(yīng)用完全互補(bǔ)的 引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)得到的突變雙鏈DNA分子僅僅來(lái)源于b)。在 這種情況下，PCR的產(chǎn)量不會(huì)成倍增加，因?yàn)樽渔淒NA單鏈不能作為其互 補(bǔ)引物的模板進(jìn)行下一周期的循環(huán)反應(yīng)。優(yōu)選PCR的循環(huán)數(shù)不超過(guò)30個(gè)循 環(huán)，更優(yōu)選不超過(guò)20個(gè)循環(huán)。通常復(fù)雜突變諸如長(zhǎng)核苷酸取代和/或插入和 /或缺失需要更多個(gè)PCR循環(huán)。具體的PCR循環(huán)數(shù)要根據(jù)不同突變反應(yīng)中 模板的濃度、引物退火的溫度、鹽離子的濃度和DNA聚合酶的擴(kuò)增效率而 決定。最少循環(huán)數(shù)是能夠合成足夠的非甲基化突變雙鏈DNA分子的循環(huán) 數(shù)，從而使DNA聚合醇所引發(fā)的隨機(jī)突變機(jī)率減少到最低。
本發(fā)明的實(shí)施方案中所使用的DNA聚合酶可以是溫度穩(wěn)定型的，也可 以是非溫度穩(wěn)定型的。 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶是溫度穩(wěn)定 型聚合酶。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA聚合酶是高保真 (high-fidelity)DNA聚合酶，以減少DNA聚合酶所引發(fā)的隨機(jī)突變機(jī)率。適 用于本發(fā)明的示例性DNA聚合酶包括但不僅限于Taq聚合酶、pfii聚合酶、 pfk聚合酶、KOD聚合酶等。在本發(fā)明中，不同DNA聚合酶可以混合使用， 這種混合的DNA聚合酶可能是不同種類的DNA聚合酶混合物，也可能是 同一種類DNA聚合酶的野生型和其功能突變體的混合物。例如， 一個(gè)實(shí)施 方案中，DNA聚合酶的混合物包括兩種不同的聚合酶， 一種DNA聚合酶 有5'-3'外切酶活性，另一種缺乏5'-3'外切酶活性。另一實(shí)施方案中，聚合酶 的混合物包含同種聚合酶野生型和突變體，其中一種有5'- 3'外切酶活性， 而另一種沒(méi)有。如何使用聚合酶混合物的說(shuō)明可以在美國(guó)專利5436149中 找到，也可參考以下文獻(xiàn)(Cheng et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91:5695-9 (1994)和Barnes Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91:2216-2220 (1994》。
本發(fā)明中，PCR產(chǎn)物是雙鏈DNA混合物，其中包括l)兩條鏈都是甲基化母鏈DNA(非突變的)；2)—條鏈?zhǔn)羌谆告淒NA(非突變的)，另一條是 非甲基化子鏈DNA(突變的);3)兩條鏈都是非甲基化子鏈DNA(突變的)。PCR 產(chǎn)物不需要進(jìn)行任何純化以及酶消化等處理，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，從而 使突變的DNA分子得以富集和回收。 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中被轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌細(xì)胞為甲基化酶缺陷細(xì)胞。在這種甲基化酶缺陷細(xì)胞 中，甲基化和半甲基化的DNA分子不能有效地復(fù)制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率極低； 而非甲基化DNA分子在甲基化酶缺陷細(xì)胞中復(fù)制效率非常高，極大地提高 了轉(zhuǎn)化效率。已經(jīng)有文獻(xiàn)證明，半甲基化DNA質(zhì)粒的甲基化位點(diǎn)使復(fù)制的 初始階段受到抑制(Russell， D.W. and Zinder, N,D. (1987) Cell 50, 1071-1079)。因此，甲基化DNA在甲基化酶缺陷大腸桿菌細(xì)胞中第一輪復(fù)制 結(jié)束后成為半甲基化DNA，而其進(jìn)一步的復(fù)制被抑制。通過(guò)轉(zhuǎn)化甲基化酶 缺陷細(xì)胞，PCR產(chǎn)物中只有上述3)的DNA分子得到復(fù)制和富集，而上述l) 和2)中的DNA分子的復(fù)制受到抑制，從而不能被富集。
為了區(qū)分含有兩條鏈都是非甲基化子鏈DNA(所需的DNA)的細(xì)胞和含 有的兩條鏈都不是或僅一條鏈?zhǔn)欠羌谆渔淒NA(不需要的DNA)的細(xì)胞 以及不含有任何相關(guān)鏈的細(xì)胞，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中應(yīng)用了一種選擇 性標(biāo)記，在DNA模板中把表達(dá)該選擇性標(biāo)記的基因與待誘變的基因連接。 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記通常為抗生素抗性基因，例如，氨芐青 霉素耐藥性基因，卡那霉素耐藥性基因，四環(huán)素耐藥性基因，氯霉素耐藥 性基因等。這些抗生素抗性基因在聚合酶鏈反應(yīng)中被完整地合成入子鏈 DNA。將上述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入甲基化酶缺陷大腸桿菌后，那些不 能復(fù)制的DNA分子就不能使所轉(zhuǎn)化的甲基化酶缺陷大腸桿菌獲得充分的抗 生素抗性，因此含有不需要的DNA的大腸桿菌細(xì)胞不能形成菌落。與此相 反，只有那些含有需要的DNA分子的細(xì)胞才能形成菌落，因?yàn)樗鲂枰?DNA分子可以在甲基化酶缺陷細(xì)胞中有效復(fù)制，抗生素抗性得以傳遞給下 一代細(xì)胞，進(jìn)而形成菌落。因此在本發(fā)明的方法中轉(zhuǎn)化功能不僅僅意味著 轉(zhuǎn)化本身，而且也是選擇和富集突變DNA。
大腸桿菌中的甲基化酶包括，但不僅限于，dam甲基化酶，dcm甲基 化酶等。細(xì)胞中可以同時(shí)有一種或多種甲基化酶缺陷。 一個(gè)實(shí)施方案中， 同時(shí)缺乏dam和dcm(Dam-Dcm-)。適宜Dam-Dcm-大腸桿菌菌株的例子包 括，但并不僅限于，ER2925, SK383， JM110，和GM1915等。本發(fā)明中，甲基化酶缺陷可以是永久性的，也可以是瞬時(shí)性的。永久 性甲基化酶缺陷可以通過(guò)如下方法破壞大腸桿菌的基因組而獲得，所述方 法例如，但不僅限于，甲基化酶基因的缺失和/或敲除；在甲基化酶基因內(nèi) 部或其周圍取代和/或插入一段核苷酸，從而使甲基化酶基因的表達(dá)受到抑 制或產(chǎn)生移碼突變；構(gòu)成性表達(dá)甲基化酶抑制劑，使其活性受到抑制；構(gòu) 成性表達(dá)一種特異性降解甲基化酶的蛋白酶；構(gòu)成性表達(dá)甲基化酶的抗體 從而中和甲基化酶的活性等等。瞬時(shí)性甲基化酶缺陷是指在某一特定的時(shí) 間段細(xì)胞表現(xiàn)為甲基化酶缺陷。瞬時(shí)性甲基化酶缺陷可以通過(guò)下述方法獲 得，但不僅限于，例如，甲基化酶在基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中受到瞬 時(shí)抑制；通過(guò)瞬時(shí)的方法使甲基化酶瞬時(shí)性失活，例如快速降解、使其快 速飽和、瞬時(shí)性中和、瞬時(shí)性分隔或聚集。瞬時(shí)性甲基化酶缺陷的時(shí)間應(yīng) 該足夠長(zhǎng)，使得所需DNA分子得到充分的富集同時(shí)抑制不需要的DNA。
在本發(fā)明的一些其他實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷可以是非誘導(dǎo)性的， 也可以是誘導(dǎo)性的。對(duì)于涉及誘導(dǎo)性甲基化酶缺陷的實(shí)施方案中，甲基化 酶缺陷是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的(但不僅限于下述方法)，例如，化學(xué)試劑誘導(dǎo)、 藥物誘導(dǎo)、蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)等。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷 可以是非誘導(dǎo)性、誘導(dǎo)性、永久性、瞬時(shí)性的各種不同類型的組合。因此， 本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，甲基化酶缺陷可以是非誘導(dǎo)性永久性缺陷、誘 導(dǎo)性永久性缺陷、非誘導(dǎo)性瞬時(shí)性缺陷和誘導(dǎo)性瞬時(shí)性缺陷。上述這些技 術(shù)已經(jīng)被普通的實(shí)驗(yàn)室工作人員所掌握。目前廣泛使用的Dam-Dcm-大腸桿 菌菌株，如ER2925， SK383屬于非誘導(dǎo)性永久性甲基化酶缺陷。
上述方法主要描述了雙鏈DNA分子作為誘變的靶標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可容易地將本發(fā)明方法應(yīng)用于向單鏈環(huán)狀甲基化DNA中引入突變。在本發(fā) 明的實(shí)施方案中，如果應(yīng)用單鏈環(huán)狀DNA作為誘變的靶標(biāo)，所需要的引物 仍然是如上所述的兩個(gè)部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的引物，方法與前面所述的相 同。
本發(fā)明另一個(gè)方面是提供了一種用于進(jìn)行本發(fā)明的定點(diǎn)誘變方法的試 劑盒。該試劑盒可能包含一些應(yīng)用本發(fā)明方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變時(shí)所必要的試 劑和手冊(cè)。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒至少要包含甲 基化酶缺陷的大腸桿菌細(xì)胞、對(duì)照引物及對(duì)照模板。而在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方案中，該試劑盒可能包含甲基化酶缺陷大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、DNA聚合酶、三磷酸核苷酸、甲基化酶、濃縮的反應(yīng)緩沖液等。本發(fā)明優(yōu)選的
試劑盒包括DNA聚合酶、甲基化酶缺陷大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、對(duì)照引物對(duì)
及對(duì)照模板、三磷酸核苷酸、濃縮的反應(yīng)緩沖液。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是該方法的簡(jiǎn)單性。即在產(chǎn)生突變的鏈后不 需要額外的篩選步驟，而目前所應(yīng)用的大多數(shù)定點(diǎn)誘變方法都需要一個(gè)關(guān)
鍵的步驟，例如，特異性消化非突變的母鏈DNA分子。在本發(fā)明方法中， 進(jìn)行宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時(shí)，該步驟還具有篩選和回收突變子鏈DNA分子的 功能。不同的甲基化狀態(tài)使得非突變的母鏈DNA分子和突變的子鏈DNA 分子在甲基化酶缺陷細(xì)胞中通過(guò)不同的轉(zhuǎn)化效率和復(fù)制能力而區(qū)分開(kāi)來(lái)。 本發(fā)明利用甲基化酶缺陷細(xì)胞作為一種選擇性的工具來(lái)有效地去除甲基化 母鏈DNA，而突變的非甲基化子鏈DNA被特異性富集。因此，篩選和回 收步驟被整合到單一的轉(zhuǎn)化步驟中，這一特點(diǎn)成為本發(fā)明中最顯著的優(yōu)勢(shì)。 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于本發(fā)明廣泛地兼容于大多數(shù)常見(jiàn)的克隆系 統(tǒng)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室復(fù)制擴(kuò)增質(zhì)粒DNA所使用細(xì)胞是內(nèi)源性表達(dá)甲基化酶的 細(xì)胞。因此，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA不用經(jīng)過(guò)任何體外甲基化處 理就可以作為本發(fā)明方法中的DNA分子模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變。大多數(shù)細(xì)胞都 適用于環(huán)狀待誘變DNA分子的體內(nèi)甲基化，其中大腸桿菌細(xì)胞是優(yōu)選的。 另外，環(huán)狀待誘變DNA分子也可以在體外通過(guò)甲基化酶催化進(jìn)行甲基化反 應(yīng)而成為甲基化環(huán)狀DNA分子。
實(shí)施例
下面所闡述的實(shí)施例子在此僅僅為本發(fā)明提供了一個(gè)更清晰的理解方 式，并不意味著本發(fā)明僅僅局限于某一方面。
下述實(shí)例的目的是對(duì)被克隆到編碼卡那霉素耐藥性的質(zhì)粒中的Fip2基 因進(jìn)行定點(diǎn)誘變。質(zhì)粒的長(zhǎng)度為5kb，在大腸桿菌DH5d中復(fù)制并被純化。 DH5a組成性表達(dá)甲基化酶，使得所述的質(zhì)粒在體內(nèi)甲基化，純化的質(zhì)粒 可以直接作為本發(fā)明方法中的模板。
實(shí)施例1:
在Fip2定點(diǎn)誘變的方法中使用部分互補(bǔ)引物，其中誘變位點(diǎn)位于其中 一個(gè)引物的非互補(bǔ)區(qū)，所述方法步驟如下1)合成兩個(gè)在5'端部分互補(bǔ)的引物，其中所述突變?cè)诜腔パa(bǔ)區(qū)中，用于引入
3個(gè)核苷酸的取代，從而產(chǎn)生了 EcoRV酶切位點(diǎn)(大寫字母代表3個(gè)核苷酸的取代突變，粗體代表正向和反向引物的互補(bǔ)區(qū))
弓l物l: 5'-cccttgaaaggaaaaattctg GaTAtccatcagag-3'， 禾口
弓I物2: 5'誦cagaatttttcctttcaagggcctgacacttttc-3';
2) 制備反應(yīng)溶液
2.5 U 1 10x反應(yīng)緩沖液(BD Biosciences)10ng Fip2質(zhì)粒(GM Biosciences, Inc)0.5iU引物1 (20y M)0.5 iU引物2(20uM)
1 U 1 10mM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補(bǔ)加雙蒸水使最終的反應(yīng)體積達(dá)到25 y 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad，)中保溫步驟2)制備的反應(yīng)溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當(dāng)95。C 5min的步驟開(kāi)始時(shí)，進(jìn)入下一步；
4) 步驟95°C 5min開(kāi)始時(shí)加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應(yīng)體系中，其中在加入聚合酶的過(guò)程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94。C 30sec, 60°C 15sec, 72°C 50sec進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反
應(yīng)；
6)把PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50u 1 ER2925感受態(tài)細(xì)胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細(xì)胞中加入2.5 U 1PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；
c) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉(zhuǎn)化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時(shí)；禾口
e) 將整個(gè)反應(yīng)液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。
誘變的效率由小量制備的生長(zhǎng)的集落經(jīng)EcoRV酶切的結(jié)果決定。預(yù)期的誘變效率為大約80%。實(shí)施例2:
在Fip2定點(diǎn)誘變的方法中使用部分互補(bǔ)的誘變引物，誘變位點(diǎn)位于兩個(gè)引物的互補(bǔ)區(qū)，所述方法步驟如下
l)合成兩個(gè)在5'端部分互補(bǔ)的引物，其中所述突變?cè)诨パa(bǔ)區(qū)用于引入3個(gè)核
苷酸的取代，從而產(chǎn)生了 EcoRV酶切位點(diǎn)(大寫字母代表3個(gè)核苷酸的取代
突變，粗體代表正向和反向引物的互補(bǔ)區(qū))取代取代
弓l物3: 5'-ggaaaaattctgGaTAtccatcagagttgaatgaaaag-3'，國(guó)禾口弓I物4: 5'-ctctgatggaTAtCcagaatttttcctttcaagggc-3';
2) 制備反應(yīng)溶液
2.5 lU 10x反應(yīng)緩沖液(BD Biosciences)10ng Fip2質(zhì)粒(GM Biosciences, Inc)0.5ul弓l物1 (20 y M)0.5ul引物2(20 yM)
1 y 1 lOmM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補(bǔ)加雙蒸水使最終的反應(yīng)體積達(dá)到25 u 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad,)中保溫步驟2)制備的反應(yīng)溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當(dāng)95。C 5min的步驟開(kāi)始時(shí)，進(jìn)入下一步；
4) 步驟95°C 5min開(kāi)始時(shí)加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應(yīng)體系中，其中在加入聚合酶的過(guò)程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94°C 30sec， 60 。C 15sec， 72 °C 50sec進(jìn)行18個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反
應(yīng)；
6)把PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50 U 1 ER2925感受態(tài)細(xì)胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細(xì)胞中加入2.5 n 1 PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；
c) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉(zhuǎn)化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時(shí)；和e)將整個(gè)反應(yīng)液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。
誘變的效率由小量制備的生長(zhǎng)的集落經(jīng)EcoRV酶切的結(jié)果決定。預(yù)期的誘變效率為大約80%。
實(shí)施例3:
根據(jù)本發(fā)明的方法步驟，用兩個(gè)完全互補(bǔ)的引物誘變Fip2，步驟如下
1) 合成兩個(gè)完全互補(bǔ)的引物，其中突變用于引入1個(gè)核苷酸的取代(大
寫字母)
弓l物5: 5'-gagctcctgaccgCgaaccaccagctgaaag-3'，禾口弓I物6: 5'-ctttcagctggtggttcGcggtcaggagctc畫3';
2) 制備反應(yīng)溶液
2.5 ti 1 10x反應(yīng)緩沖液(BD Biosciences)lOng Fip2質(zhì)粒(GM Biosciences, Inc)0.5 ul弓l物1(20 yM)0.5 ul引物2(20 uM)
1 ii 110mM dNTP(每種dNTP 2.5 mM)(BD Biosciences)
補(bǔ)加雙蒸水使最終的反應(yīng)體積達(dá)到25 P 1;
3) 在98。C在PCR儀(PTC-200 thermocycler， Bio-Rad,)中保溫步驟2)制備的反應(yīng)溶液30分鐘，并在95。C保溫5分鐘使模板變性，當(dāng)95。C 5min的步驟開(kāi)始時(shí)，進(jìn)入下一步；
4) 步驟95°C 5min開(kāi)始時(shí)加入0.5單位KOD HiFi DNA聚合酶(BDBiosciences)到反應(yīng)體系中，其中在加入聚合酶的過(guò)程中將試管一直保持在PCR儀中；
5)按照94°C 30sec， 60°C 15sec， 72°C 50sec進(jìn)行17個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反
應(yīng)；
6)把PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌ER2925(New England Biolabs)中，其中ER2925為Dam-Dcm-菌株，步驟如下
a) 50 U 1 ER2925感受態(tài)細(xì)胞在冰上緩慢融化；
b) 向步驟5的感受態(tài)細(xì)胞中加入2.5 U 1 PCR產(chǎn)物，渦旋數(shù)次輕柔地混勻，冰上保溫所得混合物5分鐘；c) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)在42。C熱休克30秒，冰上保溫2分鐘；
d) 向轉(zhuǎn)化體系中加入250ulSOC培養(yǎng)液，37。C振搖l小時(shí)；禾口
e) 將整個(gè)反應(yīng)液鋪于含有卡那霉素(500ng/mL)的LB平板上，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。
誘變的效率由小量制備的生長(zhǎng)的集落經(jīng)EcoRV酶切的結(jié)果決定。預(yù)期的突變效率為大約50%。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種向所選環(huán)狀甲基化核酸中引入定點(diǎn)突變的方法，包括(a)利用DNA聚合酶、互補(bǔ)的誘變引物、非甲基化dNTP和所選待誘變的環(huán)狀甲基化核酸進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；(b)把步驟(a)中所獲得的PCR產(chǎn)物的混合物轉(zhuǎn)化入甲基化酶缺陷大腸桿菌，其中經(jīng)誘變的非甲基化核酸在甲基化酶缺陷大腸桿菌中有效復(fù)制；(c)從所述大腸桿菌回收經(jīng)誘變的非甲基化核酸。
2. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是可誘導(dǎo)性的。
3. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是不可誘導(dǎo)性的。
4. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是永久性的。
5. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中所述甲基化酶缺陷大 腸桿菌的甲基化酶缺陷是瞬時(shí)性的。
6. 按照權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述甲基化酶缺陷細(xì)胞 是Dam和Dcm缺陷大腸桿菌。
7. 按照權(quán)利要求6所述的方法，其中所述Dam和Dcm的缺陷是非誘導(dǎo)性 的和永久性的。
8. 按照權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述甲基化酶缺陷大腸桿菌菌 株是ER2925或SK383。
9. 按照權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述環(huán)狀甲基化核酸是 在體外被甲基化的。
10. 按照權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述環(huán)狀甲基化核酸 是在體內(nèi)被甲基化的。
11. 按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述引物是 部分互補(bǔ)的。
12. 按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述引物是 彼此完全互補(bǔ)的。
13. 按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述誘變位 點(diǎn)位于引物的互補(bǔ)區(qū)和/或非互補(bǔ)區(qū)。
14. 按照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述DNA 聚合酶是溫度穩(wěn)定型的。
15. 向所選待誘變DNA分子中引入突變的試劑盒，所述試劑盒含有但 不限于甲基化酶缺陷細(xì)胞，優(yōu)選甲基化酶缺陷大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲基化的環(huán)狀DNA分子的定點(diǎn)誘變的新方法，其中通過(guò)利用誘變引物對(duì)和甲基化酶缺陷大腸桿菌使甲基化的環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生定點(diǎn)誘變。本方法選用的誘變引物對(duì)是5′端或3′端部分或完全互補(bǔ)的誘變引物對(duì)。首先，誘變引物與其相對(duì)應(yīng)的甲基化環(huán)狀雙鏈DNA分子(母鏈)的互補(bǔ)鏈退火；然后，利用DNA聚合酶和非甲基化的dNTP進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生突變的非甲基化子鏈DNA分子；最后，把含甲基化母鏈DNA分子和突變的非甲基化子鏈DNA分子的聚合酶鏈反應(yīng)混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入甲基化酶缺陷的大腸桿菌。甲基化的母鏈DNA分子的復(fù)制在甲基化酶缺陷宿主細(xì)胞中受到抑制。相反，非甲基化子鏈DNA分子(含有突變)在甲基化酶缺陷宿主細(xì)胞中高效率復(fù)制，從而得到有效的富集和回收。另外，本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法引入定點(diǎn)誘變的試劑盒。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101600797SQ200780051140
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者苗 喬 申請(qǐng)人:苗 喬