專(zhuān)利名稱(chēng)：用于心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)管理的遺傳標(biāo)記物的制作方法
用于心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)管理的遺傳標(biāo)記物
背景技術(shù)：
心律不齊是一類(lèi)醫(yī)學(xué)病癥，其中心臟的電活動(dòng)不規(guī)律，或與正常 相比更快或更慢。某些心律不齊是危及生命的，可以引起心臟停止或 突然死亡。其它的會(huì)引起或傾向于引起其它惡化的癥狀或疾病，包括
中風(fēng)。纖顫是一種嚴(yán)重形式的心律不齊，其中由于收縮性細(xì)胞的功能 缺乏統(tǒng)一性而使心肌出現(xiàn)不規(guī)則的或振顫運(yùn)動(dòng)。纖顫可以影響心房(心
房纖顫(AF)或心房撲動(dòng)(AF1))或心室(心室纖顫(VF))。
心房纖顫(AF)是涉及兩個(gè)小的、位于上部的心臟腔室(心房) 的異常的心臟節(jié)律(心律不齊)。正常心臟中的心跳，在竇房結(jié)在心 房中產(chǎn)生的電通過(guò)心臟傳播、并引起心肌收縮和泵出血液之后開(kāi)始。 在AF中，竇房結(jié)的有規(guī)律的電脈沖被混亂的、快速的電脈沖所代替， 導(dǎo)致了不規(guī)則的心跳。
心房纖顫是最常見(jiàn)心律不齊。發(fā)生心房纖顫的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡而增 加——AF在80歲時(shí)影響4%的個(gè)體。個(gè)體可以在AF和正常節(jié)律之間 自發(fā)輪換(突發(fā)性心房纖顫)，或者可能持續(xù)地以AF作為主要心臟節(jié) 律而不返回正常節(jié)律(慢性心房纖顫)。心房纖顫通常是無(wú)癥狀的， 但是可能導(dǎo)致心悸、昏厥、胸痛或甚至心力衰竭的癥狀。當(dāng)心房纖顫 導(dǎo)致心率太快或太慢時(shí)，這些癥狀特別常見(jiàn)。此外，心房的不穩(wěn)定運(yùn) 動(dòng)導(dǎo)致血流淤積(停滯)，增加了從心臟向腦部和其它區(qū)域移動(dòng)的血 液凝塊的風(fēng)險(xiǎn)。因此，AF是心房纖顫的最可怕的并發(fā)癥——中風(fēng)的重 要風(fēng)險(xiǎn)因素。
心房纖顫的癥狀可以用減慢心率的藥物進(jìn)行治療。幾種藥物以及 心臟電復(fù)律可用于將AF轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｐ呐K節(jié)律。外科和基于支架的療法
15也可用于在某些個(gè)體中預(yù)防心房纖顫?；加蠥F的人通常被給藥血液稀 釋劑例如華法林，以保護(hù)它們免于中風(fēng)。
任何具有兩次或以上被鑒定的心房纖顫的突然的患者，被說(shuō)成是 具有復(fù)發(fā)的心房纖顫。根據(jù)發(fā)病何時(shí)不經(jīng)過(guò)治療就結(jié)束，而將它進(jìn)一 步分類(lèi)為突發(fā)性的和持久性的。當(dāng)心房纖顫在7天內(nèi)自發(fā)終止時(shí)，最 普遍在24小時(shí)內(nèi)自發(fā)終止，它被說(shuō)成是突發(fā)性的。持久性的或慢性的
心房纖顫是發(fā)病超過(guò)7天的AF。突發(fā)性與慢性或已確立的AF的區(qū)分 是基于AF的復(fù)發(fā)史和目前發(fā)作的時(shí)間長(zhǎng)度(Levy S., / C^^/ovwc 8 Suppl, S78-82 (1998))。
孤立性心房纖顫(LAF)被定義為不存在心肺疾病的臨床或超聲 心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)的情況下的心房纖顫。
心房纖顫通常伴有與心率快或栓塞有關(guān)的癥狀。快速的、不規(guī)則 的心率可能被感受為心悸、運(yùn)動(dòng)不耐，并有時(shí)產(chǎn)生呼吸短促的心絞痛 和充血癥狀或浮腫。有時(shí)，心律不齊伴隨著中風(fēng)發(fā)作或短暫性缺血性 發(fā)作(TIA)而被鑒定。在常規(guī)的身體檢查或心電圖(ECG/EKG)上檢 測(cè)到心房纖顫是不常見(jiàn)的，因?yàn)樵谀承┎±兴赡苁菬o(wú)癥狀的。突 發(fā)性心房纖顫是短暫發(fā)生的心律不齊，因此難以診斷。突然發(fā)作可能 發(fā)生在睡眠或運(yùn)動(dòng)時(shí)，它們的突然發(fā)作的本質(zhì)可能需要長(zhǎng)時(shí)間的ECG 監(jiān)測(cè)(例如Holter監(jiān)測(cè)器)來(lái)進(jìn)行診斷。
當(dāng)懷疑心跳不規(guī)律時(shí)，可以在常用的診斷方法一一心電圖上診斷 心房纖顫。特征性的發(fā)現(xiàn)包括缺少P波，在其位置中的混亂的電活性， 以及由于脈沖向心室的不規(guī)則傳導(dǎo)導(dǎo)致的R-R間期的不規(guī)律性。如果 懷疑是突發(fā)性AF，可以使用Holter監(jiān)測(cè)來(lái)記錄突然發(fā)作(連續(xù)進(jìn)行ECG 記錄24小時(shí)或以上)。
盡管許多AF病例沒(méi)有確定的原因，但它可能是各種其它問(wèn)題的結(jié)果(參見(jiàn)下文)。因此，對(duì)腎功能和電解質(zhì)，以及促甲狀腺激素和 血液計(jì)數(shù)進(jìn)行了例行測(cè)定。通常也進(jìn)行胸部X-射線檢査。在伴有胸痛 的急性發(fā)作的AF中，可以進(jìn)行心臟肌鈣蛋白或其它損傷心肌的標(biāo)記物
的檢測(cè)。通常還進(jìn)行凝結(jié)研究(INR/aPTT)，因?yàn)榭赡苓M(jìn)行抗凝結(jié)藥 物治療。經(jīng)食道的超聲心動(dòng)圖可以有助于鑒定任何心臟內(nèi)血栓(Fuster V.,等，C7rcw/a"o".; 104, 2118-2150 (2001))。
心房撲動(dòng)(AF1)的特征為心房中的異?？焖傩呐K節(jié)律。出現(xiàn)心房 撲動(dòng)的患者同樣也經(jīng)歷心房纖顫，反之亦然(Waldo， A.， /Vogr CWY^owwc/^yeaw, 48:41-56 (2005))。因此，機(jī)械上或生物學(xué)上，AF 和AF1可能是高度相關(guān)的。
AF (和AF1)與幾種心臟原因相關(guān)，但是在可能發(fā)生在正常心臟 中。已知的關(guān)聯(lián)包括高血壓、二尖瓣狹窄(例如由風(fēng)濕性心臟病或 二尖瓣脫垂引起)、二尖瓣回流、心臟外科手術(shù)、冠狀動(dòng)脈病、肥厚 型心肌病、過(guò)量飲酒("狂飲"或"假期心臟")、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、 迷走神經(jīng)過(guò)度刺激、通常由于過(guò)量進(jìn)食("暴食")、肺病(例如肺 炎、肺癌、肺栓塞、肉狀瘤病)、心包炎、極度情感混亂和先天性心 臟病。
心臟的正常電傳導(dǎo)系統(tǒng)允許由心臟竇房結(jié)(SA結(jié))產(chǎn)生的脈沖傳 播到并刺激心肌(心臟的肌肉)。當(dāng)心肌受到刺激時(shí)，它收縮。正是 對(duì)心肌的有序刺激使得心臟有效地收縮，從而將血液泵到身體中。在 心房纖顫中，由竇房結(jié)產(chǎn)生的提供心臟有節(jié)律的收縮的規(guī)則的脈沖， 被心房組織的較大區(qū)域產(chǎn)生的快速的隨機(jī)產(chǎn)生的放電所淹沒(méi)。心房中 有組織的電脈沖產(chǎn)生心房收縮；缺少這樣的脈沖，正如在心房纖顫中 那樣，導(dǎo)致血流停滯、特別是在心房附屬部分中，并容易發(fā)生血液凝 結(jié)。從心房中中移出凝塊將引起栓塞，產(chǎn)生的損傷取決于血液循環(huán)將 它帶到何處。栓塞到達(dá)腦部產(chǎn)生心房纖顫的最可怕的并發(fā)癥一一中風(fēng)， 而栓塞也可能駐留在腸系膜循環(huán)(為腹部器官供血的循環(huán))或指頭中，
17產(chǎn)生器官特異性損傷。
心房纖顫的治療針對(duì)兩個(gè)主要目標(biāo) 防止暫時(shí)循環(huán)不穩(wěn)定；(ii) 防止中風(fēng)。實(shí)現(xiàn)前者的最常用方法包括心率和節(jié)律控制，而抗血凝通
常是后者所需要的方法(Prystowsky E. N.， Jm /C^y//o/. ;85， 3D-11D (2000); van Walraven C,等，兒m仏288, 2441-2448 (2002))。心率控
制、即將心率降低到正常水平的常用方法，包括P阻斷劑(美托洛爾)、 強(qiáng)心苷(例如地高辛)和鈣通道阻斷劑(例如維拉帕米)。所有這些 藥物通過(guò)減緩脈搏從心房的產(chǎn)生以及從心房向心室的傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮作 用。其它常用的藥物包括奎尼丁、氟卡尼、普羅帕酮、丙吡胺 (disopyramide)、索他洛爾和胺碘酮。節(jié)律控制可以通過(guò)心臟電復(fù)律、 即通過(guò)施加DC電擊，或通過(guò)心臟化學(xué)復(fù)律，使用藥物例如胺碘酮、普 羅帕酮和氟卡尼來(lái)實(shí)現(xiàn)。
用于中風(fēng)的預(yù)防性措施包括抗凝血?jiǎng)?。代表性的抗凝血藥劑的?子是達(dá)肝素(例如法安明)、達(dá)那肝素(例如Orgaran)、依諾肝素(例 如Lovenox)、肝素(各種不同的)、Tinzaparin (例如Innohep)、華 法林(例如Coumadin)。某些患有孤立性心房纖顫的患者有時(shí)用阿司 匹林或氯吡格雷進(jìn)行治療。有證據(jù)表明，阿司匹林和氯吡格雷當(dāng)一起 使用時(shí)是有效的，但組合的效能仍然低于華法林(ConnollyS.等，Lancet.; 367,1903-1912 (2006)) (2)。新的抗凝劑希美加曲(ximelagatran)已經(jīng) 被顯示與華法林具有同等的預(yù)防中風(fēng)的效能，沒(méi)有與華法林相關(guān)的困 難的監(jiān)測(cè)過(guò)程，并可能具有較少的不利的出血現(xiàn)象。不幸的是， ximegalatran和其它類(lèi)似的抗血凝藥物(通常被稱(chēng)為凝血酶直接抑制劑) 還沒(méi)有被廣泛批準(zhǔn)。
確定誰(shuí)應(yīng)該和不應(yīng)該接受華法林的抗血凝治療，不是直截了當(dāng)?shù)摹?CHADS2分值是用于確定中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)(以及因此誰(shuí)應(yīng)該進(jìn)行抗血凝治療) 的最好的被批準(zhǔn)的方法。UKNICE準(zhǔn)則代替了使用算法的選擇。存在 的問(wèn)題是如果患者的年中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)低于2%，那么與使用華法林有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)將超過(guò)患中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)(GageB.F.等，S^oAre 29， 1083-1091 (1998))。
心房纖顫有時(shí)可以通過(guò)治療來(lái)控制。但是，心房纖顫的自然趨勢(shì) 是變成慢性病癥。慢性AF導(dǎo)致增加的死亡風(fēng)險(xiǎn)。患有心房纖顫的患者 具有明顯增加的中風(fēng)的機(jī)會(huì)。
心房纖顫常見(jiàn)于老年人。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于老年個(gè)體的比例不斷 增加，在下一個(gè)50年中，患有心房纖顫的患者的數(shù)量可能增加(Go A. S.等，J^ma., 285, 2370-2375 (2001)) (3)。在Framingham研究中，在 40歲及以上年齡的男性和女性中，在一生中發(fā)生AF的風(fēng)險(xiǎn)是四分之 一。在一生中AF的風(fēng)險(xiǎn)是高的(六分之一)。根據(jù)國(guó)家醫(yī)院出院調(diào)査
(1996年到2001年)關(guān)于包含AF作為主要出院診斷的病例的數(shù)據(jù)， 發(fā)現(xiàn)45%的患者是男性，男性的平均年齡為66.8歲，女性為74.6歲。 入院的種族分類(lèi)被發(fā)現(xiàn)是71.2%的白人，5.6%的黑人，2%的其它種族， 以及20%未明。此外，非洲裔美國(guó)人患者的平均年齡比其它種族更年 青。在男性中的發(fā)病率范圍從年齡為15-44歲的患者的每年每十萬(wàn)人中 20.58人，到85歲及以上年齡的患者的每年每十萬(wàn)人中1203人。從 1996-2001年，以AF作為首要列明的診斷的住院治療人數(shù)，增加了34y。。
中風(fēng)是常見(jiàn)的嚴(yán)重疾病。在美國(guó)，每年有超過(guò)600,000人遭受中 風(fēng)，有超過(guò)160,000人死于與中風(fēng)相關(guān)的原因(Sacco， R丄.等，Stroke 28, 1507-17 (1997))。此外，在美國(guó)，每年有超過(guò)300,000人出現(xiàn)暫時(shí)性 缺血性發(fā)作，這是一種溫和形式的中風(fēng)。在西方國(guó)家，中風(fēng)是嚴(yán)重喪 失勞動(dòng)能力的主導(dǎo)原因，以及死亡的第三主導(dǎo)原因(Bonita, R.,i^"c^ 339,342-4 (1992))。超過(guò)40歲的人在生命期中中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)10%。
中風(fēng)的臨床表現(xiàn)型是復(fù)雜的，但是可以寬泛地分成缺血性(占 80-卯％)和出血性中風(fēng)(10-20%) (Caplan, L.R. Caplan 's Stroke: A Clinical Approach,《Caplan 中風(fēng)臨床方法》，1-556 (Butterworth-Heinemann, 2000))。缺血性中風(fēng)被進(jìn)一步細(xì)分成大血管阻塞性疾病(在本文中稱(chēng)為頸動(dòng)脈中風(fēng))，它通常由于頸總動(dòng)脈和頸 內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化引起，以及小血管阻塞性疾病，它被認(rèn)為是腦 中的小的末端動(dòng)脈的非動(dòng)脈粥樣硬化狹窄，以及由通常在心房纖顫或 缺血性(動(dòng)脈粥樣硬化)心臟病的背景下從心臟產(chǎn)生的血液凝塊造成
的心源性中風(fēng)(Adams，H. P., Jr.等，Stroke 24, 35-41 (1993))。因此， 看來(lái)中風(fēng)不是一種疾病，而是反映出不同病源性機(jī)制的疾病的異源組 (Alberts, MJ. Ge""/c51 o/ Cere6n9wwcw/ar Z)/^cwe《腦血管疾病的遺傳 學(xué)》，386 (Futura Publishing Company, Inc., New York, 1999); Hassan, A. & Markus， H. S. 5ra/" 123， 1784- 812 (2000))。但是，所有形式的中風(fēng) 具有共同的風(fēng)險(xiǎn)因子，例如高血壓、糖尿病、高血脂和吸煙(Sacco, R丄. 等，S^oA:e 28, 1507-17 (1997); Leys, D.等，7Vewro/. 249, 507-17 (2002))。中風(fēng)的家族史也是一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子，表明存在可以與環(huán) 境因子相互作用的遺傳因子(Hassan, A. & Markus, H. S. 5ra/" 123, 1784-812 (2000); Brass, L.M. & Alberts, MJ. BflH/Zeres C7/". 7VeMro/. 4， 221-45 (1995))。
常見(jiàn)形式的中風(fēng)的遺傳決定因素仍然大部分未知的。有特定基因 中的突變可以引起罕見(jiàn)的孟德?tīng)栃问降闹酗L(fēng)的例子，例如CADASIL(伴 皮質(zhì)下梗塞和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病)中的A^&W 基因(Tournier-Lasserve， E.等，A^aA 3， 256-9 (1993); Joutel, A.
等，Mm^e 383， 707-10 (1996))、冰島型遺傳性伴淀粉樣病變的腦出血 中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Palsdottir， A.等，2, 603-4 (1988))、荷蘭型遺傳性腦出血中的APP (Levy, E.等，Sc/e"ce 248, 1124-6 (1990))和遺傳性海綿狀血管瘤患者中的/^/77基因(Gunel, M. 等，iVoc. Ato/. Jem/. 92, 6620-4 (1995); Sahoo, T.等，/fwm. Mo/,
Ge"". 8,2325-33 (1999))。這些罕見(jiàn)形式的中風(fēng)中沒(méi)有一種發(fā)生在動(dòng) 脈粥樣硬化的背景下，因此，相應(yīng)的基因不可能在更通常伴隨動(dòng)脈粥 樣硬化發(fā)生的常見(jiàn)形式的中風(fēng)中發(fā)揮作用。
對(duì)于衛(wèi)生護(hù)理系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，非常重要的是開(kāi)發(fā)預(yù)防中風(fēng)的策略。一旦中風(fēng)發(fā)生之后，在受中風(fēng)影響的血管所供應(yīng)的腦部的大部分區(qū)域中 將發(fā)生不可逆的細(xì)胞死亡。不幸的是，死亡的神經(jīng)元不能夠復(fù)活或用 干細(xì)胞群體代替。因此，需要一開(kāi)始就防止中風(fēng)發(fā)生。盡管我們己經(jīng) 知道了某些增加中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)因子(上面列出的)，但對(duì)于確定參 與中風(fēng)的遺傳因子以便更精確地確定中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)，仍存在有尚未滿(mǎn)足 的醫(yī)學(xué)需求。此外，如果易感性等位基因在普通人群中是常見(jiàn)的，根 據(jù)它們的存在預(yù)測(cè)疾病的特異性低的話，則為了對(duì)疾病狀態(tài)的易感性 進(jìn)行有意義的預(yù)測(cè)，還需要其它的位點(diǎn)、例如保護(hù)性位點(diǎn)。對(duì)用于預(yù) 防第一次中風(fēng)或在以前發(fā)生過(guò)中風(fēng)或暫時(shí)性缺血性發(fā)作的個(gè)體中預(yù)防 再次中風(fēng)的治療性藥劑，也存在著極大的需求。
AF是中風(fēng)的獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子，使風(fēng)險(xiǎn)增加大約5倍?？蓺w因于
AF的中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)隨年齡而增加。AF對(duì)所有中風(fēng)中的大約15-20%負(fù)責(zé)。 AF也是中風(fēng)復(fù)發(fā)和中風(fēng)嚴(yán)重性的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。最近的報(bào)告顯示，患 有AF并且沒(méi)有用抗凝血?jiǎng)┲委煹娜?，?fù)發(fā)中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加了 2.1倍， 復(fù)發(fā)嚴(yán)重中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加了 2.4倍。已報(bào)道，患有由AF引起的中風(fēng)的 人與患有其它原因引起的中風(fēng)的人相比，臥床不起的可能性是2.23倍。
對(duì)于導(dǎo)致對(duì)AF和中風(fēng)的增加的傾向性的易感性因子的理解，存 在著需求。AF的風(fēng)險(xiǎn)變體的鑒定，可用于例如評(píng)估哪個(gè)個(gè)體對(duì)于AF 和隨后的中風(fēng)有特別高的風(fēng)險(xiǎn)。此外，可以對(duì)患有AF的個(gè)體或AF和 /或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)易感性變體的攜帶者進(jìn)行預(yù)防性治療。最后，AF和/或 中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)變體的鑒定，可以導(dǎo)致藥物療法的新的靶的鑒定，以及新 的治療性措施的開(kāi)發(fā)。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)了某些遺傳標(biāo)記物顯示出與心律不齊、特別是心 房纖顫和心房撲動(dòng)以及中風(fēng)是相關(guān)聯(lián)的。該發(fā)現(xiàn)可用于本文描述的各 種方法、步驟、裝置、介質(zhì)和試劑盒中，涉及了診斷和/或確定易感性 的方法和步驟、對(duì)相關(guān)變體進(jìn)行基因分型的方法、預(yù)測(cè)對(duì)治療型藥劑的反應(yīng)的方法、預(yù)測(cè)預(yù)后的方法、監(jiān)測(cè)治療的進(jìn)展的方法、以及在這 些方法中使用的系統(tǒng)和試劑盒。
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及了在人類(lèi)個(gè)體中確定對(duì)心律不齊或中風(fēng) 的易感性的方法，方法包括在從個(gè)體獲得的核酸樣品中確定至少一個(gè) 多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，其中至少一個(gè)多 態(tài)性標(biāo)記物選自表5中顯示的多態(tài)性標(biāo)記物、以及與其連鎖不平衡的 標(biāo)記物，其中至少一個(gè)等位基因的存在或不存在的確定，是個(gè)體中對(duì) 心律不齊或中風(fēng)易感性的指示。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性
標(biāo)記物位于LD區(qū)塊C04中，顯示在本文的SEQ ID NO: 50中。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表9中顯示的標(biāo)記物，以 及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物選 自標(biāo)記物rs2220427 (SEQ ID NO: 1)和標(biāo)記物rsl0033464 (SEQ ID NO:41)，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表19中顯示的標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，方 法還包括在個(gè)體中評(píng)估含有至少兩個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)單倍型 的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及在人類(lèi)個(gè)體中確定對(duì)心律不齊或中風(fēng)的易 感性的方法，包括確定在源自于個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)組中是否存在至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因，其中至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo) 記物選自表5中顯示的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，其中 至少一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的存在的確定，表明了個(gè)體中對(duì)心律不齊或中 風(fēng)的增加的易感性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基因型數(shù)據(jù)組包含關(guān)于標(biāo)記物身份以及個(gè)體 的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的等位基因狀態(tài)的信息，即關(guān)于個(gè)體攜帶的
標(biāo)記物的兩個(gè)等位基因的身份的信息和/或關(guān)于個(gè)體是否是至少一個(gè)多 態(tài)性標(biāo)記物的特定風(fēng)險(xiǎn)等位基因的攜帶者的信息?；蛐蛿?shù)據(jù)組可以 包含關(guān)于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物、包括兩個(gè)或兩個(gè)以上標(biāo)記物、三個(gè)或三個(gè)以上標(biāo)記物、五個(gè)或五個(gè)以上標(biāo)記物、 一百個(gè)或以上標(biāo)記物等的等 位基因信息。在某些實(shí)施方案中，基因型數(shù)據(jù)組包含了來(lái)自個(gè)體的全 基因組評(píng)估的含有成百上千個(gè)標(biāo)記物、或甚至一百萬(wàn)個(gè)或以上標(biāo)記物 的基因型信息。
另一方面，本發(fā)明涉及了一種方法，包括對(duì)來(lái)自人類(lèi)個(gè)體的核酸
進(jìn)行分析，以確定與具有SEQIDNO:50中顯示的序列的基因組序列相 關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因或單倍型的存在或 不存在的步驟；以及根據(jù)至少一個(gè)標(biāo)記物或單倍型的存在或不存在， 來(lái)確定個(gè)體中心律不齊或中風(fēng)的遺傳指標(biāo)的狀態(tài)的步驟。因此，個(gè)體 的基因型和/或單倍型狀態(tài)被用作個(gè)體中心律不齊、包括心房纖顫和心 房撲動(dòng)以及中風(fēng)的指標(biāo)。
本發(fā)明還涉及了在人類(lèi)個(gè)體中評(píng)估對(duì)心律不齊或中風(fēng)的易感性的 方法，包括在來(lái)自個(gè)體的核酸中篩選SEQ ID NO: 50中與心律不齊或中 風(fēng)在人類(lèi)群體中的增加的發(fā)病率相關(guān)的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物或單倍 型；其中核酸中至少一個(gè)多態(tài)性的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物等位基因或風(fēng)險(xiǎn)單倍型 的存在的確定，將個(gè)體鑒定為對(duì)心律不齊和/或中風(fēng)具有升高的易感性， 其中核酸中至少一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物等位基因或風(fēng)險(xiǎn)單倍型的不存在，將 個(gè)體鑒定為不具有升高的易感性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的過(guò)程或方法需要含有SEQ ID NO: 50 中顯示的LD區(qū)塊C04的連續(xù)的核酸片段或其互補(bǔ)序列的至少一個(gè)多 態(tài)性標(biāo)記物或單倍型，其中片段的大小小于500個(gè)核苷酸，并與LD區(qū) 塊C04的互補(bǔ)區(qū)段特異性雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段的大小大于 15個(gè)核苷酸而小于400個(gè)核苷酸，其中片段與SEQ ID NO:50中顯示的 LD區(qū)塊C04的互補(bǔ)區(qū)段特異性雜交。
在可選的實(shí)施方案中，多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型賦予的易感性是降 低的易感性，即本發(fā)明的標(biāo)記物和單倍型賦予了個(gè)體發(fā)生心律不齊、包括心房纖顫和心房撲動(dòng)以及中風(fēng)的降低的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)這樣的實(shí)施
方案中，降低的易感性的特征為比值比(OR)或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)小于 0.8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低的易感性的特征為比值比(OR)小于 0.7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低的易感性的特征為OR或RR小于0.6。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低的易感性的特征為OR或RR小于0.5。其 它的實(shí)施方案涉及其它的OR或RR值，包括值為0.9、 0.85、 0.75、 0.65、 0.55等。
本發(fā)明的另一方面涉及用于在人類(lèi)個(gè)體中評(píng)估對(duì)與心律不齊和/ 或中風(fēng)有關(guān)的癥狀的易感性的標(biāo)記物的鑒定方法，方法包括鑒定SEQ ID NO: 50中的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物、或與SEQ ID NO: 50中的至少 一個(gè)標(biāo)記物連鎖不平衡的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物，確定被診斷患有心 律不齊和/或中風(fēng)的個(gè)體的樣品的基因型狀態(tài)和對(duì)照個(gè)體的樣品的基因 型狀態(tài)，其中在被診斷患有心律不齊和/或中風(fēng)的個(gè)體中至少一個(gè)多態(tài) 性的至少一個(gè)等位基因的頻率，與對(duì)照樣品中至少一個(gè)等位基因的頻 率相比的顯著差異，表明了至少一個(gè)多態(tài)性可用于評(píng)估對(duì)心律不齊和/ 或中風(fēng)的易感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在被診斷患有心律不齊和/或中 風(fēng)的個(gè)體中至少一個(gè)多態(tài)性的至少一個(gè)等位基因的頻率，與對(duì)照樣品 中至少一個(gè)等位基因的頻率相比的增加，表明了至少一個(gè)多態(tài)性可用
于評(píng)估對(duì)心律不齊的增加的易感性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在被診斷 患有心律不齊和/或中風(fēng)的個(gè)體中至少一個(gè)多態(tài)性的至少一個(gè)等位基因 的頻率，與對(duì)照樣品中至少一個(gè)等位基因的頻率相比的降低，表明了 至少一個(gè)多態(tài)性可用于評(píng)估對(duì)心律不齊和/或中風(fēng)的降低的易感性、或 保護(hù)性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，頻率的顯著差異是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量值來(lái) 表征的。在一個(gè)實(shí)施方案中，統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量值是P-值。在具體的實(shí)施方 案中，顯著的P-值是小于0.05、小于O.Ol、小于0.001、小于0.0001、 小于0.00001、小于0.000001、小于0.0000001、或小于0.00000001。 在其它實(shí)施方案中，顯著的差異由具有特定置信區(qū)間(CE)值的比值 比(OR)或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)來(lái)表征。另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)從人類(lèi)個(gè)體獲得的核酸樣品進(jìn)行基因分 型的方法，包括確定樣品中預(yù)測(cè)心律不齊和/或中風(fēng)的增加的風(fēng)險(xiǎn)至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，其中至少一 個(gè)標(biāo)記物選自表5中顯示的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物， 其中至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在的確 定，可以預(yù)測(cè)個(gè)體中心律不齊和/或中風(fēng)的增加的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，基因分型使用選自等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性 引物延伸、等位基因特異性擴(kuò)增、核酸測(cè)序、5'-外切核酸酶消化、分 子信標(biāo)分析、寡核苷酸連接分析、大小分析以及單鏈構(gòu)象分析的方法 來(lái)進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法包括等位基因特異性探針雜交。 優(yōu)選情況下，基因分型的方法包括使用位于至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物兩 側(cè)的核苷酸引物對(duì)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增含有至少一個(gè)多態(tài) 性標(biāo)記物的核酸的區(qū)段。在基因分型的優(yōu)選方法中，進(jìn)行了下面的步 驟
1. 將核酸的拷貝與檢測(cè)寡核苷酸探針和增強(qiáng)子寡核苷酸探針在 允許寡核苷酸探針與核酸特異性雜交的條件下相接觸；其中
a) 檢測(cè)寡核苷酸探針長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸，并與含有至少一個(gè)多 態(tài)性位點(diǎn)、其核苷酸序列在SEQIDNO:50中給出的核酸的第一個(gè)區(qū)段 特異性雜交；
b) 檢測(cè)寡核苷酸探針在其3'末端含有可檢測(cè)標(biāo)記，在其5'末端含 有淬滅基團(tuán)；
c) 增強(qiáng)子寡核苷酸長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸，并與相對(duì)于寡核苷酸探 針5'方向的核苷酸序列的第二個(gè)區(qū)段互補(bǔ)，以便當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都與 核酸雜交時(shí)，增強(qiáng)子寡核苷酸位于檢測(cè)寡核苷酸探針的3'方向；以及
d) 在第一個(gè)區(qū)段和第二個(gè)區(qū)段之間存在單個(gè)堿基缺口，使得當(dāng)寡 核苷酸探針和增強(qiáng)子寡核苷酸探針都與核酸雜交時(shí)，在寡核苷酸之間 存在單個(gè)堿基缺口-，
2. 使用當(dāng)檢測(cè)探針與核酸雜交時(shí)將從檢測(cè)探針的3'末端裂解可 檢測(cè)標(biāo)記以釋放游離的可檢測(cè)標(biāo)記的內(nèi)切核酸酶來(lái)處理核酸；以及
測(cè)量游離的可檢測(cè)標(biāo)記，其中游離的可檢測(cè)標(biāo)記的存在表明檢測(cè)
25探針與核酸的第一個(gè)區(qū)段特異性雜交，并表明多態(tài)性位點(diǎn)的序列與檢 測(cè)探針互補(bǔ)。
本發(fā)明的另一方面涉及在人類(lèi)個(gè)體中確定對(duì)心律不齊或中風(fēng)的易 感性的方法，方法包括在從個(gè)體獲得的核酸樣品中確定至少一個(gè)多態(tài) 性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的身份，其中至少一個(gè)標(biāo)記物選自與 PITX2基因相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物，其中至少一個(gè)等位基因的存在表明了個(gè) 體中對(duì)心律不齊或中風(fēng)的易感性。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及了另一個(gè)對(duì)心房纖顫、心房撲動(dòng)或中 風(fēng)的至少一個(gè)其它生物標(biāo)記物進(jìn)行評(píng)估的步驟，其中從標(biāo)記物獲得的 遺傳信息的合并提供了對(duì)心房纖顫、心房撲動(dòng)或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在 某些這樣的實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物是遺傳標(biāo)記物或單倍型，即顯示 出或被設(shè)想與心房纖顫、心房撲動(dòng)或中風(fēng)的增加的或降低的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān) 的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。在其它實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物是蛋白生物標(biāo)記物。 在某些實(shí)施方案中，蛋白生物標(biāo)記物選自纖維蛋白D-二聚體、凝血酶 原活化片段1.2 (F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合物(TAT)、纖維 蛋白肽A (FPA)、脂蛋白相關(guān)的磷脂酶A2 (Ip-PLA2) 、 (3-血小板球 蛋白、血小板因子4、 P-選擇素、von Willebrand因子、利尿鈉肽前體 (BNP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9) 、 PARK7、 二磷酸核苷激酶 (NDKA) 、 tau、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、B型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子、 星形神經(jīng)膠質(zhì)蛋白S-100b、神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白、C-反應(yīng)性蛋白、 血清淀粉樣肽A、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、血管和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子、腫 瘤壞死因子cc和白介素，包括白介素-1、 -6和-8。在一個(gè)實(shí)施方案中， 至少一個(gè)生物標(biāo)記物包括祖細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，測(cè)定了一個(gè)以 上的生物標(biāo)記物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物從個(gè)體的血漿中測(cè) 量。其它的實(shí)施方案還涉及了將非遺傳信息進(jìn)行合并，在個(gè)體中進(jìn)行 心房纖顫、心房撲動(dòng)或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷或預(yù)后。非遺傳信息可 以包括年齡、發(fā)病時(shí)的年齡、性別、種族、以前的疾病診斷例如心律 不齊(例如心房纖顫)和中風(fēng)的診斷、個(gè)體的醫(yī)學(xué)史、疾病的家族史、
26生物化學(xué)測(cè)量和臨床測(cè)量(例如血壓、血清脂含量)。通過(guò)本技術(shù)領(lǐng) 域的專(zhuān)業(yè)人員已知的方法，這種來(lái)自各種不同的遺傳標(biāo)記物、或遺傳 標(biāo)記物加上非遺傳標(biāo)記物的合并的信息的分析是可能的。在一個(gè)實(shí)施 方案中，通過(guò)邏輯回歸進(jìn)行了分析以計(jì)算總風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明還涉及了在人類(lèi)個(gè)體中診斷對(duì)中風(fēng)的增加的易感性的方 法，包括下列步驟(a)確定個(gè)體是否經(jīng)歷過(guò)與心房纖顫、心房撲動(dòng)或 短暫性缺血性發(fā)作有關(guān)的癥狀；(b)確定來(lái)自個(gè)體的核酸樣品是否含有 選自表5中顯示的標(biāo)記物以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物中的至少一個(gè) 多態(tài)性標(biāo)記物的風(fēng)險(xiǎn)等位基因的至少一個(gè)拷貝；其中與心房纖顫、心 房撲動(dòng)和/或短暫性缺血性發(fā)作有關(guān)的癥狀的存在，以及風(fēng)險(xiǎn)等位基因 的至少一個(gè)拷貝的存在，表明了中風(fēng)的增加的易感性。
另一方面，本發(fā)明涉及評(píng)估個(gè)體對(duì)預(yù)防和/或緩解與心律不齊和/ 或中風(fēng)相關(guān)的癥狀的治療藥劑的反應(yīng)的可能性的方法，包括在從個(gè) 體獲得的核酸樣品中確定至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因 的存在或不存在，其中至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表9中顯示的標(biāo)記 物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，其中至少一個(gè)標(biāo)記物的至少一個(gè) 等位基因的存在的確定，表明了對(duì)心律不齊和/或中風(fēng)治療藥劑發(fā)生陽(yáng) 性反應(yīng)的可能性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥劑是抗凝血?jiǎng)?、抗心律失常藥劑、?率控制藥劑、心臟復(fù)律藥劑或心臟節(jié)律控制藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，治療藥劑選自華法林、肝素、低分子量肝素、因子X(jué)a抑制劑和凝 血酶抑制劑、鈉通道阻斷劑、(3阻斷劑、鉀通道阻斷劑和鈣通道阻斷劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥劑選自華法林、ximelagatran、肝素、 依諾肝素、達(dá)肝素、亭扎肝素、阿地肝素、那屈肝素、瑞維肝素、磺 達(dá)肝素、艾卓肝素、來(lái)匹盧定、比伐盧定、阿加曲班、達(dá)那類(lèi)肝素、 丙吡胺、莫雷西嗪、普魯卡因胺、奎尼丁、利多卡因、美西律、妥卡胺、苯妥英、恩卡尼、氟卡胺、普羅帕酮、阿馬林、西苯唑啉、地他 義銨、艾司洛爾、普萘洛爾、美托洛爾、烯丙洛爾、阿替洛爾、卡維
地洛、比索洛爾、醋丁洛爾、納多洛爾、吲哚洛爾、拉貝洛爾、oxprenotol、
噴布洛爾、噻嗎洛爾、倍他洛爾、卡替洛爾、索他洛爾、左旋布諾洛 爾、胺碘酮、阿齊利特、溴芐銨、多非利特、替地沙米、伊布利特、
司美利特、N-乙酰普魯卡因胺、鹽酸尼非卡蘭、維納卡蘭(vernakalant)、 氨巴利特、維拉帕米、米貝拉地爾、地爾硫卓、地高辛、腺苷酸、伊 布利特、胺碘酮、普魯卡因胺、丙胺苯丙酮和氟卡胺。
本發(fā)明的另一方面涉及對(duì)被診斷有心律不齊和/或中風(fēng)的個(gè)體的 預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，方法包括在從個(gè)體獲得的核酸樣品中確定至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，其中至少一 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表9中顯示的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo) 記物，其中至少一個(gè)等位基因的存在的確定，表明了個(gè)體中心律不齊 和/或中風(fēng)的更糟的預(yù)后。
監(jiān)測(cè)經(jīng)歷了心律不齊和/或中風(fēng)治療的個(gè)體的治療進(jìn)展的方法也 在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，該方法包括在從個(gè)體獲得的核酸樣品中確定至 少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，其中至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表9中顯示的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的 標(biāo)記物，其中至少一個(gè)等位基因的存在的確定，表明了個(gè)體的治療結(jié) 果。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，例如在本發(fā)明的各種不同方法、應(yīng) 用、步驟、裝置和試劑盒中，心律不齊的表現(xiàn)型的進(jìn)一步特征為心房 纖顫或心房撲動(dòng)。本發(fā)明人已經(jīng)確定，本文描述的AF風(fēng)險(xiǎn)變體所賦予 的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于發(fā)病年齡早的個(gè)體來(lái)說(shuō)比發(fā)病年齡晚的個(gè)體更大。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，心房纖顫或心房撲動(dòng)的進(jìn)一步特征為在個(gè)體中的 發(fā)病年齡小于80歲。在另一個(gè)實(shí)施方案中，心房纖顫或心房撲動(dòng)的進(jìn) 一步特征為在個(gè)體中的發(fā)病年齡小于70歲。在另一個(gè)實(shí)施方案中，心房纖顫或心房撲動(dòng)的進(jìn)一步特征為在個(gè)體中的發(fā)病年齡小于60歲。在 本發(fā)明的可選實(shí)施方案中，其它的年齡截止值也是可能的，并也被考
慮到了，包括但不限于年齡截止值小于75歲、小于65歲、小于55歲。 此外，在發(fā)病或診斷時(shí)的年齡大于55、 60、 65、 70、 75或80歲也被 考慮到了，并包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此癥狀的診斷或疾病發(fā)作時(shí) 的年齡范圍包括但不限于50-80歲、55-75歲、60-80歲、65-75歲，等等。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，中風(fēng)被進(jìn)一步表征為缺血性中風(fēng)。 在其他實(shí)施方案中，中風(fēng)表現(xiàn)型的特征可以是一種或多種缺血性中風(fēng) 亞表型大動(dòng)脈粥樣硬化(LAA)、心源性卒中(CES)和小血管疾病 (SVD)。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，連鎖不平衡(LD)由特定的定量截 止值確定。正如在本文中詳細(xì)描述的，連鎖不平衡可以由測(cè)量值例如 一和ID'I來(lái)定義。因此，本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及由特定的^和/或ID'l 值所指明的某個(gè)范圍內(nèi)的測(cè)量值所定義的連鎖不平衡的標(biāo)記物。在一 個(gè)這樣的實(shí)施方案中，LD的特征為 一的數(shù)值大于0.1。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，LD的特征為—的數(shù)值大于0.1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LD的 特征為 一的數(shù)值大于0.5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LD的特征為一的數(shù) 值大于0.8。 ^的其它截止值也被考慮到了，正如在本文中更詳細(xì)描述 的。在某些實(shí)施方案中，LD用 一和/或ID'l的某些截止值來(lái)表征。在一 個(gè)這樣的實(shí)施方案中，LD的特征為一和/或ID'I分別大于0.2和0.8。這 些或其它LD的度量值的其它組合和排列對(duì)于實(shí)施本發(fā)明來(lái)說(shuō)也是可 能的，并且也被考慮到了，并包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的過(guò)程、應(yīng)用或方法還包括給被確定 具有發(fā)生心律不齊或中風(fēng)的增加的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，施用含有至少一種有 效治療或預(yù)防心律不齊或中風(fēng)、或預(yù)防與心律不齊或中風(fēng)有關(guān)的癥狀 的治療性藥劑的組合物。因此，本發(fā)明可用于確定個(gè)體是否適合于特定的治療模式。
在本文描述的各種不同方法和過(guò)程中使用的試劑盒也包含在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。因此， 一種情況下，本發(fā)明涉及在人類(lèi)個(gè)體中評(píng)估對(duì)心 律不齊和/或中風(fēng)的易感性的試劑盒，試劑盒包含用于在個(gè)體的基因組 中選擇性檢測(cè)至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的試劑，其
中多態(tài)性標(biāo)記物選自其序列顯示在SEQ ID NO:50中的區(qū)段中的多態(tài)性 標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，其中至少一個(gè)等位基因的存 在表明了對(duì)心律不齊和/或中風(fēng)的易感性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表5中顯示的標(biāo) 記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表9中顯示 的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至 少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自標(biāo)記物rs2220427 ( SEQ ID NO: 1)和 rsl0033464 (SEQIDNO:41)，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表19中顯示的標(biāo)記物。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自D4S406 (SEQ ID NO:45) 、 rs263術(shù)3 (SEQ ID NO:33 ) 、 rs2200733 (SEQ ID NO:28)、 rs2220427 (SEQIDNO: 1 ) 、 rsl0033464( SEQ ID NO:41 )和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑含有至少一個(gè)與個(gè)體的 基因組的含有至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的區(qū)段雜交的連續(xù)的寡核苷酸、 緩沖液和可檢測(cè)標(biāo)記。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑含有至少一對(duì)與從對(duì)象獲得的基因組 核酸區(qū)段的反向鏈雜交的寡核苷酸，其中每個(gè)寡核苷酸引物對(duì)被設(shè)計(jì) 成能選擇性擴(kuò)增個(gè)體的基因組中包含一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的片段，其中 片段的大小為至少30個(gè)堿基對(duì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)寡核苷 酸與個(gè)體的基因組完全互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為 大約18到大約50個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸的長(zhǎng)度 為20-30個(gè)核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒含有a. 長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸的檢測(cè)寡核苷酸探針；
b. 長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸的增強(qiáng)子寡核苷酸探針；以及 C.內(nèi)切核酸酶；
其中檢測(cè)寡核苷酸探針與其核苷酸序列在SEQ ID NO: 2中給出核 酸的含有至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的第一個(gè)區(qū)段特異性雜交；其中檢測(cè)寡 核苷酸探針在其3'末端含有可檢測(cè)標(biāo)記，在其5'末端含有淬滅基團(tuán)； 其中增強(qiáng)子寡核苷酸長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸，并與相對(duì)于寡核苷酸探針 5'方向的核苷酸序列的第二個(gè)區(qū)段互補(bǔ)，以便當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都與核酸 雜交時(shí)，增強(qiáng)子寡核苷酸位于檢測(cè)寡核苷酸探針的3'方向；其中在第 一個(gè)區(qū)段和第二個(gè)區(qū)段之間存在單個(gè)堿基缺口，使得當(dāng)寡核苷酸探針 和增強(qiáng)子寡核苷酸探針都與核酸雜交時(shí)，在寡核苷酸之間存在單個(gè)堿 基缺口；并且其中當(dāng)檢測(cè)探針與核酸雜交時(shí)，使用內(nèi)切核酸酶處理核 酸將從檢測(cè)探針的3'末端裂解可檢測(cè)標(biāo)記，以釋放游離的可檢測(cè)標(biāo)記。
本文描述的用于預(yù)測(cè)心律不齊(例如AF和心房撲動(dòng))和中風(fēng)的 風(fēng)險(xiǎn)的多態(tài)性標(biāo)記物可用作診斷標(biāo)記物。因此， 一種情況下，本發(fā)明 涉及寡核苷酸探針在制造用于在人類(lèi)個(gè)體中診斷和/或評(píng)估心律不齊和 /或中風(fēng)的易感性的診斷試劑中的應(yīng)用，其中探針與其核苷酸序列在 SEQIDNO:50中給出核酸的含有至少一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)段雜交，其 中片段的長(zhǎng)度為15-500個(gè)核苷酸。
在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，多態(tài)性位點(diǎn)選自表5中顯示的多態(tài)性 標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQ ID NO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1)、 rsl0033464 (SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。
用于儲(chǔ)存關(guān)于本文描述的疾病相關(guān)的標(biāo)記物的信息的計(jì)算機(jī)可讀 介質(zhì)，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)這樣的情況下，本發(fā)明涉及計(jì)算 機(jī)可讀介質(zhì)，其上儲(chǔ)存有至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的識(shí)別符；該至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因在多個(gè)被診斷患有心房纖顫、心 房撲動(dòng)和/或中風(fēng)的個(gè)體中的頻率的指示符；以及該至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo) 記物的至少一個(gè)等位基因在多個(gè)參比個(gè)體中的頻率的指示符；其中至
少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表5中顯示的多態(tài)性標(biāo)記物，以及與其連鎖
不平衡的多態(tài)性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自
D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQIDNO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1) 、 rsl0033464 (SEQ ID NO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。
本發(fā)明還涉及了用于在人類(lèi)個(gè)體中測(cè)定心律不齊和/或中風(fēng)的遺
傳指示符的裝置，包含計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器以及儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)可讀
存儲(chǔ)器中的例行程序；其中例行程序適用于在處理器上執(zhí)行，以分析
至少一個(gè)人類(lèi)個(gè)體的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的基因型和/或單倍型數(shù)
據(jù)，其中該至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表5中顯示的標(biāo)記物，以及與
其連鎖不平衡的標(biāo)記物，并根據(jù)標(biāo)記物或單倍型數(shù)據(jù)產(chǎn)生輸出，其中
輸出包括作為人類(lèi)個(gè)體的心律不齊和/或中風(fēng)的遺傳指示符的至少一個(gè)
標(biāo)記物或單倍型的風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，例行程序還包含測(cè)
定多個(gè)被診斷患有心律不齊和/或中風(fēng)的個(gè)體中至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物 的至少一個(gè)等位基因或至少一個(gè)單倍型的頻率的指示符，以及多個(gè)參
比個(gè)體中至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因或至少一個(gè)單倍 型的頻率的指示符，并在其基礎(chǔ)上計(jì)算至少一個(gè)等位基因和/或單倍型 的風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量值；其中個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量值的計(jì)算，是基于個(gè)體的至少一 個(gè)標(biāo)記物和/或單倍型狀態(tài)，與多個(gè)被診斷患有心房纖顫、心房撲動(dòng)和/ 或中風(fēng)的個(gè)體的至少一個(gè)標(biāo)記物和/或單倍型信息的計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)的比 較。在某些實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量值被表示為比值比(OR)或相對(duì)風(fēng) 險(xiǎn)(RR)，正如在本文中更詳細(xì)描述的。
本文描述的在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的用于預(yù)測(cè)心律不齊和中風(fēng)的多態(tài)性 標(biāo)記物、以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，都可用于實(shí)施本發(fā)明的各種 不同情況。因此，盡管本發(fā)明人使用了特定的多態(tài)性標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)4
32號(hào)染色體上的特定區(qū)域與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng))和中 風(fēng)的關(guān)聯(lián)性，但評(píng)估與那些標(biāo)記物強(qiáng)烈連鎖不平衡的標(biāo)記物也是同樣 有用的。因此，在本發(fā)明的方法、應(yīng)用、試劑盒、步驟、裝置和介質(zhì) 的一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法或步驟的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記
物或單倍型，包含了在表5 (例如表5A和5B)中顯示的至少一個(gè)標(biāo)記
物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)
多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型包括表9中顯示的至少一個(gè)標(biāo)記物，以及與其
連鎖不平衡的標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物或
單倍型包含表5中顯示的至少一個(gè)標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至 少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型包含表9中顯示的至少一個(gè)標(biāo)記物。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表4中顯示的標(biāo)記物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物選自標(biāo)記物rs2220427 (SEQ ID NO:l)和標(biāo)記物rsl0033464 (SEQIDNO:41)，以及與其連鎖不平衡 的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表19中 顯示的標(biāo)記物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物或單倍型，包含至少一個(gè)標(biāo) 記物D4S406 (SEQ ID IMO:45) 、 rs2723296 (SEQ ID NO:35)、 rsl6997168 (SEQ IDNO:36) 、 rs2723316 (SEQ ID NO:37) 、 rs6419178
(SEQIDNO:38) 、 rsl448817 (SEQIDNO:39) 、 rs263術(shù)3 (SEQID NO:33) 、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO:l)、 rsl3105878(SEQ ID NO: 40) 、 rsl0033464(SEQ ID NO:41) 、 rsl3141190
(SEQIDNO:42) 、 rs3853444 (SEQIDNO:43)和rs4576077 (SEQID NO:44)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物或單倍型包含至少一 個(gè)標(biāo)記物D4S406 (SEQIDNO:45) 、 rs2634073 (SEQIDNO:33)、 rs2200733 (SEQIDNO:28) 、 rs2220427 (SEQIDNO: 1) 、 rsl0033464
(SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQIDNO:51)。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，至少一個(gè)標(biāo)記物選自rsl0033464、 rs2200733、 rsl3143308和 rs2220427，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物D4S406的等位基因-2、 -4和/或-8、 標(biāo)記物rs2723296的等位基因G、標(biāo)記物rsl6997168的等位基因T、標(biāo) 記物rs2723316的等位基因T、標(biāo)記物rs6419178的等位基因A、標(biāo)記 物rsl 1448817的等位基因G、標(biāo)記物rs2634073的等位基因A、標(biāo)記物 rs2200733的等位基因T、標(biāo)記物rs2220427的等位基因T、標(biāo)記物 rsl3105878的等位基因C、標(biāo)記物rsl0033464的等位基因T、標(biāo)記物 rsl3141190的等位基因A、標(biāo)記物rs3853444的等位基因A、和/或標(biāo)記 物rs4576077的等位基因T的存在，表明了個(gè)體中心律不齊或中風(fēng)的增 加的易感性。
在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)變體(即多態(tài)性標(biāo)記物(例 如SNP)的特定等位基因或特定單倍型)所賦予的易感性是增加的易 感性，即本發(fā)明的標(biāo)記物和單倍型賦予了個(gè)體發(fā)生心律不齊、包括心 房纖顫和心房撲動(dòng)、以及中風(fēng)的增加的風(fēng)險(xiǎn)。易感性典型情況下通過(guò) 度量比值比(OR)、或可選地通過(guò)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)來(lái)表征。在一個(gè)實(shí) 施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.3。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.4。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)為至少1.5。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR)或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR) 為至少1.6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加的易感性的特征為比值比(OR) 或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)為至少1.8。其它的實(shí)施方案涉及了其它的OR值或 相當(dāng)?shù)腞R值，包括值1.25、 1.35、 1.45、 1.55等。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及了特定的種族或血統(tǒng)。在一個(gè)這樣的 實(shí)施方案中，人類(lèi)個(gè)體具有選自非洲黑人種族、亞洲種族、高加索人 種族、西班牙人種族和阿拉伯人種族的血統(tǒng)。在特定實(shí)施方案中，種 族是自己報(bào)告的。在其它實(shí)施方案中，血統(tǒng)通過(guò)特定的種族特異性遺 傳標(biāo)記物的評(píng)估來(lái)確定。
附圖簡(jiǎn)述
34從下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的更具體的描述，本發(fā)明的上述 以及其它的目標(biāo)、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。


圖1顯示了對(duì)CEPH群體(HapMap數(shù)據(jù))在含有本發(fā)明的變體 的區(qū)域中的連鎖不平衡(LD)作圖。LD區(qū)塊C04 (NCBIBuild35中 4號(hào)染色體上111,954,811-112,104,250的位置)在圖上用黑框顯示。圖 中顯示了 LD的兩種度量，即位于圖1的左上部分的D'和圖的右下部 分的r2。
圖2顯示了在LD區(qū)塊中相關(guān)區(qū)域的單倍型結(jié)構(gòu)的示意圖。深色 (左邊)圓圈的面積與冰島組中單倍型的單倍型頻率成比例，淺色(右 邊)圓圈的面積與香港組中的單倍型頻率成比例。顯示在圖的中間的 居中的單倍型，不再能夠確定存在于兩個(gè)群體中的任何一個(gè)中(其估 算的頻率低于0.2%，不能與基因分型誤差區(qū)分開(kāi))。
圖3是rs2200733和rs 10033464鄰近的200kb的基因組區(qū)域的概 況。它包含了預(yù)測(cè)的ESTs，在CEUHapMap樣品中三種主要類(lèi)型的等 價(jià)的SNPs的位置，以及在各種不同種族的HapMap樣品中區(qū)域的LD 結(jié)構(gòu)的概況。
圖4顯示了 PITX2在人類(lèi)心臟和主動(dòng)脈中表達(dá)的Northern印跡分 析。PITX2 cDNA克隆HU3_p983E0327D被用作探針，分別檢測(cè)了左 心房和主動(dòng)脈中的1.8、 2禾B 3 kb的轉(zhuǎn)錄本以及2.2和3 kb的PITX2轉(zhuǎn)
錄本。第l道胎心，第2道整個(gè)心臟，第3道主動(dòng)脈，第4道 心尖，第5道左心房，第6道右心房，第7道左心室，第8道
右心室。印跡使用PITX2 cDNA克隆(HU3_p983E0327D)探測(cè)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的描述如下。
定l
在本發(fā)明的文本中，下面的術(shù)語(yǔ)將具有所指示的意義
本文描述的心房纖顫(AF)是指按照已建立的醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所通常定義的AF。 AF按ICD-10分類(lèi)在類(lèi)別148中，按ICD-9分類(lèi)在類(lèi)別427.3 中。
本文描述的心房撲動(dòng)(AF1)是指按照已建立的醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所通常定 義的AF1。AF1按ICD-10分類(lèi)在類(lèi)別148中，按ICD-9分類(lèi)在類(lèi)別427.3 中。
本文描述的"多態(tài)性標(biāo)記物"、有時(shí)被稱(chēng)為"標(biāo)記物"，是指基 因組多態(tài)性位點(diǎn)。每種多態(tài)性標(biāo)記物具有至少兩個(gè)序列變體，其特征 為多態(tài)性位點(diǎn)上的特定等位基因。因此，與多態(tài)性標(biāo)記物的遺傳關(guān)聯(lián) 表明存在與該具體多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)特定等位基因的關(guān)聯(lián)。標(biāo) 記物可以含有在基因組中發(fā)現(xiàn)的任何變體類(lèi)型的任何等位基因，包括 SNPs、微衛(wèi)星、插入、缺失、重復(fù)和易位。
"等位基因"是指染色體上給定位點(diǎn)(位置)的核苷酸序列。因 此，多態(tài)性標(biāo)記物等位基因是指染色體上標(biāo)記物的組成(即序列)。 來(lái)自個(gè)體的基因組DNA對(duì)于任何給定的多態(tài)性標(biāo)記物來(lái)說(shuō)含有兩個(gè)等 位基因，代表了每條染色體上標(biāo)記物的每個(gè)拷貝。
在本文中，在群體中(自然群體或合成的群體，例如合成分子的 文庫(kù))其上可能存在一種以上序列的核苷酸位置被稱(chēng)為"多態(tài)性位點(diǎn)"。
"單核苷酸多態(tài)性"或"SNP"是當(dāng)基因組中特定位置上的單個(gè) 核苷酸在物種的成員之間或一個(gè)個(gè)體中成對(duì)的染色體之間不同時(shí)發(fā)生 的DNA序列變異。大多數(shù)SNP多態(tài)性具有兩個(gè)等位基因。在這種情 況下，每個(gè)個(gè)體或者是多態(tài)性的一個(gè)等位基因的純合子(即個(gè)體的兩 個(gè)染色體拷貝在SNP位置處具有同樣的核苷酸)，或者個(gè)體是雜合子 (即個(gè)體的兩條姊妹染色體含有不同的核苷酸)。在本文中報(bào)告的SNP
的命名是指官方的參考SNP (rs) ID身份標(biāo)簽，是由國(guó)家生物技術(shù)信息 中心(National Center for Biotechnological Information) (NCBI)為每個(gè)獨(dú)特的SNP指定的。
本文描述的"變體"是指與參比DNA不同的DNA區(qū)段。"標(biāo)記 物"或"多態(tài)性標(biāo)記物"按照本文的定義，是變體。與參比不同的等 位基因被稱(chēng)為"變體"等位基因。
"微衛(wèi)星"是在特定位點(diǎn)具有多個(gè)小的長(zhǎng)度為2-8個(gè)核苷酸的堿 基重復(fù)(例如CA重復(fù))的多態(tài)性標(biāo)記物，其中重復(fù)長(zhǎng)度的數(shù)量在總?cè)?體中是變化的。"indel"是常見(jiàn)的多態(tài)性形式，含有一般只有幾個(gè)核 苷酸長(zhǎng)的小的插入或缺失。
本文描述的"單倍型"是指基因組DNA的一個(gè)區(qū)段，其特征為沿 著該區(qū)段排列有等位基因的特定組合。對(duì)于二倍體生物例如人類(lèi)來(lái)說(shuō)， 單倍型含有每個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物或位點(diǎn)的等位基因?qū)Φ囊粋€(gè)成員。在某 些實(shí)施方案中，單倍型可以含有兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因、三個(gè)或三 個(gè)以上等位基因、四個(gè)或四個(gè)以上等位基因、或五個(gè)或五個(gè)以上等位 基因。
本文描述的術(shù)語(yǔ)"易感性"包含了增加的易感性和降低的易感性。 因此，本發(fā)明的特定多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型的特征可以是心房纖顫 或中風(fēng)的增加的易感性(即增加的風(fēng)險(xiǎn))，被表征為相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR) 或比值比(OR)大于1。或者，本發(fā)明的標(biāo)記物和/或單倍型的特征可 以是心房纖顫或中風(fēng)的降低的易感性(即降低的風(fēng)險(xiǎn))，被表征為相 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)小于1。
"核酸樣品"是從個(gè)體獲得的含有核酸的樣品。在某些實(shí)施方案、 即特定多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型的檢測(cè)，核酸樣品包含基因組DNA。 這樣的核酸樣品可以從任何含有基因組DNA的來(lái)源獲得，包括例如血 液樣品、羊水樣品、腦脊液樣品，或來(lái)自皮膚、肌肉、口腔或結(jié)膜粘 膜、胎盤(pán)、胃腸道或其它器官的組織樣品。術(shù)語(yǔ)"心房纖顫和/或中風(fēng)治療藥劑"是指可用于緩解或預(yù)防與心 房纖顫(AF)、心房撲動(dòng)(AF1)或中風(fēng)相關(guān)的癥狀的藥劑，在本文中 有更詳細(xì)的描述。
本文中描述的術(shù)語(yǔ)"與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/
或中風(fēng)相關(guān)的核酸"是指己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與心律不齊、例如心房纖顫(AF)、 心房撲動(dòng)(AF1)或中風(fēng)相關(guān)的核酸。這包括但不限于本文描述的標(biāo)記 物和單倍型，以及與其強(qiáng)烈連鎖不平衡(LD)的標(biāo)記物和單倍型。在 一個(gè)實(shí)施方案中，與心房纖顫、心房撲動(dòng)或中風(fēng)相關(guān)的核酸是指被發(fā) 現(xiàn)與心房纖顫和中風(fēng)有關(guān)的LD區(qū)塊C04。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與心 房纖顫、心房撲動(dòng)或中風(fēng)相關(guān)的核酸是指PITX2基因。
本文描述的術(shù)語(yǔ)"LD區(qū)塊C04"是指4號(hào)染色體上位于NCBI(國(guó) 立生物技術(shù)信息中心)Build 35中的111,954,811-112,104,250的位置之 間的連鎖不平衡(LD)區(qū)塊，其基因組序列顯示在SEQIDNO:50中。
本文描述的"片段"是指核酸或蛋白序列的區(qū)段。片段的大小小
于它們的參比點(diǎn)，即大小為iooo個(gè)核苷酸的參比核酸分子的片段的大
小小于1000個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸片段通常大小超過(guò)5個(gè)核苷酸， 典型情況下大小超過(guò)15個(gè)核苷酸，其上限由它們的參比核苷酸或核苷 酸片段的實(shí)際用途來(lái)決定。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用作 雜交探針的核苷酸片段的大小大于15個(gè)核苷酸并小于大約500個(gè)核苷 酸。其它的大小范圍適用于本發(fā)明的其它核苷酸片段和蛋白或肽片段。
本文描述的術(shù)語(yǔ)"PITX2"是指染色體4q25上的成對(duì)同源異型結(jié) 構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子2基因。該基因也被稱(chēng)為腦垂體同源異形盒2 (PTX2) 、 rieg bicoid相關(guān)的同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子1 (RIEG1) 、 solurshin 和all-l反應(yīng)性基因1 (ARP1)。本發(fā)明涉及觀察到人類(lèi)基因組的染色體4q25上的某些多態(tài)性標(biāo)記
物，被發(fā)現(xiàn)與心律不齊和中風(fēng)有關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，
染色體4q25上的多態(tài)性標(biāo)記物與心律不齊性心房纖顫(AF)和心房撲 動(dòng)(AF1)和中風(fēng)相關(guān)。正如在本文中進(jìn)一步詳細(xì)描述的，這些觀察與 診斷和治療方法、應(yīng)用、試劑盒和系統(tǒng)有著重要的、意想不到的牽連。
在賦予對(duì)AF的易感性的遺傳變體的全基因組掃描中，在染色體 4q25上發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與AF相關(guān)的標(biāo)記物。對(duì)于標(biāo)記物rs2220427和 rs2220733發(fā)現(xiàn)了與AF的最顯著的關(guān)聯(lián)性，二者都給出了接近10力的 p-值(表2)，以及雖然較小但明顯顯著的與中風(fēng)的關(guān)聯(lián)性(表3)。 大量的標(biāo)記物作為這些標(biāo)記物的完美的替代物被鑒定到，包括微衛(wèi)星 標(biāo)記物D4S406 (表l)和許多SNP標(biāo)記物(表4)。
對(duì)結(jié)果的進(jìn)一步精煉，發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性信號(hào)出現(xiàn)在標(biāo)記物rs2200733 和rsl0033464 (表7)、以及與那些標(biāo)記物連鎖不平衡的標(biāo)記物(包括 但不限于表9中列出的SNP標(biāo)記物)的、用遺傳學(xué)術(shù)語(yǔ)來(lái)說(shuō)的中心。
最初在冰島人群體中進(jìn)行的觀察在獨(dú)立的冰島人AF/AF1組、瑞典 人AF組和美國(guó)AF組中進(jìn)行了重復(fù)(表7)。當(dāng)將冰島人樣品合并時(shí)， 與rs2200733的關(guān)聯(lián)性是明確的(OR = 1.72，尸=3.3 x 10—41)，與 rsl0033464的關(guān)聯(lián)性也大大超過(guò)了基因組范圍上顯著性的閾值(OR = 1.39， P-6.9xl(T11)。假設(shè)乘法模型，兩個(gè)變體合并的群體歸因風(fēng)險(xiǎn) (PAR)在歐洲人血統(tǒng)的群體中是大約20%。此外，關(guān)聯(lián)性也在來(lái)自 香港的中國(guó)人AF組中進(jìn)行了重復(fù)(表7)。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于冰島人樣品來(lái)說(shuō)，AF/AF1的診斷年齡與兩 個(gè)SNPs rs2200733和rsl0033464相關(guān)。因此，對(duì)于每個(gè)rs2200733等 位基因T來(lái)說(shuō)診斷的發(fā)生早2.28年，對(duì)于每個(gè)rsl0033464等位基因T 來(lái)說(shuō)診斷發(fā)生早1.10年(組合的P-1.29x 1(T6)。這種效應(yīng)由在診斷 年齡較小的個(gè)體中兩個(gè)變體的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)所表明，盡管即使在診斷年齡超過(guò)80歲的個(gè)體中風(fēng)險(xiǎn)仍然是顯著的(表8)。在美國(guó)組中觀察到 了類(lèi)似的發(fā)病年齡的效應(yīng)(表8)。
發(fā)明人還觀察到了變體與AF1之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)性，它們看起來(lái)比 與AF的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)。與被診斷患有AF1的冰島患者的亞組(N=116) 的關(guān)聯(lián)性顯示了這一點(diǎn)(對(duì)于rs2200733來(lái)說(shuō)OR^2.60， 95%置信區(qū)間 (CI) =1.83-3.68，尸-7.5xl(T8，對(duì)于rsl0033464來(lái)說(shuō)OR = 1.94， 95% CI=1.26-3.00，尸=麓8)。事實(shí)上，對(duì)于rs2200733來(lái)說(shuō)，這些確定的 AF1病例的OR顯著高于具有AF表型的病例的OR (P = 0.0026),對(duì) 于rsl0033464來(lái)說(shuō)，接近于明顯高(P = .084)。與SNPs rs2200733 和rsl0033464的關(guān)聯(lián)性說(shuō)明了這些AF和AF1都具有顯著遺傳風(fēng)險(xiǎn)因 子的結(jié)果。
本發(fā)明人還進(jìn)一步確定了與AF/AF1相關(guān)的變體也與中風(fēng)、特別是 缺血性中風(fēng)相關(guān)(表21)。標(biāo)記物rs2200733在缺血性中風(fēng)和缺血性 中風(fēng)(IS)心源性中風(fēng)亞表型(CES)中得到了顯著的重復(fù)。在對(duì)其它 的冰島IS病例和對(duì)照(總共1,943個(gè)病例/25，708個(gè)對(duì)照)以及4個(gè)大 的IS病例/對(duì)照重復(fù)組(4,294個(gè)病例/3，709個(gè)對(duì)照)進(jìn)行基因分型之 后，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記物和標(biāo)記物rsl0033464與AF是主要病因的CES關(guān)聯(lián) 性最強(qiáng)(rs2200733: OR= 1.53， P=1.5x 10-12; rsl0033464: OR=1.27， =5.9xl0-4)(表21)。
在含有rs2200733和rsl0033464的LD區(qū)塊中不存在已知的基因 (圖3)。該LD區(qū)塊含有一個(gè)剪接EST (DA725631)和兩個(gè)單外顯 子ESTs (DB324364和AF017091)。來(lái)自各種組織的cDNA文庫(kù)的 RT-PCR沒(méi)有檢測(cè)到這些ESTs的表達(dá)(表16)。位于鄰近上游LD區(qū) 塊中的尸/7X2基因是與風(fēng)險(xiǎn)變體最接近的基因。含有尸/7X2基因的LD 區(qū)塊中的幾個(gè)標(biāo)記物與表18中顯示的對(duì)AF和Afl顯示出關(guān)聯(lián)性的標(biāo) 記物相關(guān)。因此，可能P/7X2基因中的變體是潛在的病因變體?？蛇x 地，有可能本文描述的本發(fā)明的變體影響了 PITX2的功能、穩(wěn)定性、表達(dá)、翻譯后修飾、剪接、信使穩(wěn)定性，或通過(guò)其它的方式影響了基 因，導(dǎo)致了對(duì)與心房纖顫、心房撲動(dòng)和/或中風(fēng)相關(guān)的病癥的傾向性。 該基因編碼的蛋白、成對(duì)同源異型結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2，是AF/AF1的目
的候選物，因?yàn)橐阎ㄟ^(guò)指導(dǎo)心臟的不對(duì)稱(chēng)形態(tài)發(fā)生在心臟發(fā)育中
發(fā)揮重要作用(Franco, D" 7>e"& CaWo而c MW 13: 157-63 (2003))。 此外，在小鼠中，敲除模型Pitx2已經(jīng)被顯示抑制了左心房中竇房結(jié)形 成的缺省途徑。在所有容易進(jìn)入的組織例如血液和脂肪組織中，尸/7X2 的mRNA表達(dá)非常低，妨礙了對(duì)基因型和表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)性的研 究。/V7X2上游的下一個(gè)基因是^W^尸，是負(fù)責(zé)在血管內(nèi)皮中分解血 管緊張肽II的氨肽酶。該基因的表達(dá)更加廣泛，但是與AF相關(guān)的變體 顯示出與其在血液和脂肪組織中的表達(dá)沒(méi)有相關(guān)性。沒(méi)有其它已注解 的基因位于有關(guān)聯(lián)的變體的上游400kb區(qū)域和下游1.5Mb區(qū)域中。
標(biāo)記激浙卓倍遭伊仿
當(dāng)在個(gè)體間進(jìn)行比較時(shí)，群體中的基因組序列是不相同的。相反， 個(gè)體間在基因組中的許多位置上表現(xiàn)出了基因組序列變異性。這種序 列的變化通常被稱(chēng)為多態(tài)性，在每個(gè)基因組中有許多這樣的位點(diǎn)。例 如，人類(lèi)基因組表現(xiàn)出在平均每500個(gè)堿基對(duì)就發(fā)生序列變異。最常 見(jiàn)的序列體包括基因組中單一堿基位置的堿基變化，這種序列變體或 多態(tài)性，通常被稱(chēng)為單核苷酸多態(tài)性("SNPs")。這些SNPs據(jù)信是 在單個(gè)突變事件中發(fā)生的，因此通?？赡茉诿總€(gè)SNP位點(diǎn)存在兩個(gè)可 能的等位基因；原始的等位基因和突變的等位基因。由于自然遺傳漂 移并可能也由于選擇壓力，最初的突變產(chǎn)生了多態(tài)性，其特征為在任 何給定的群體中其等位基因的特定頻率。在人類(lèi)基因組中發(fā)現(xiàn)了許多 其它類(lèi)型的序列變異，包括微衛(wèi)星、插入、缺失、倒置和拷貝數(shù)變化。 多態(tài)性微衛(wèi)星在特定位點(diǎn)含有多個(gè)小的堿基重復(fù)(例如CA重復(fù)，互補(bǔ) 鏈上的TG重復(fù))，重復(fù)的長(zhǎng)度的數(shù)量在總?cè)后w中是變化的。概括地說(shuō)， 多態(tài)性位點(diǎn)的每個(gè)版本的序列都代表了多態(tài)性位點(diǎn)的特定等位基因。 這些序列變體都可以被稱(chēng)為多態(tài)性，它們發(fā)生在特定多態(tài)性位點(diǎn)，表
明了所述序列變體的特征。概括地說(shuō)，多態(tài)性可以包含任何數(shù)量的特定等位基因。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多態(tài)性的特征為在 任何給定群體中存在兩種或兩種以上等位基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 多態(tài)性的特征為存在三種或三種以上等位基因。在其它實(shí)施方案中， 多態(tài)性的特征為四種或四種以上等位基因、五種或五種以上等位基因、 六種或六種以上等位基因、七種或七種以上等位基因、九種或九種以 上等位基因或十種或十種以上等位基因。所有這樣的多態(tài)性都可用于 本發(fā)明的方法和試劑盒中，因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在某些情況下，對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)處不同等位基因進(jìn)行參比而不選擇 參比等位基因?；蛘?，對(duì)于特定多態(tài)性位點(diǎn)可以指定參比序列。參比 等位基因有時(shí)被稱(chēng)為"野生型"等位基因，它通常被選為第一個(gè)被測(cè) 序的等位基因或來(lái)自"未受影響的"個(gè)體(例如沒(méi)有顯示出性狀或疾 病表型的個(gè)體)的等位基因。
本文指稱(chēng)的SNP標(biāo)記物的等位基因，根據(jù)在使用的SNP分析中出 現(xiàn)在多態(tài)性位點(diǎn)上的堿基A、 C、 G或T進(jìn)行指稱(chēng)。本文使用的SNPs 的等位基因編碼如下1= A， 2=C， 3=G， 4=T。但是，本技術(shù)領(lǐng)域的 專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在每種情況下，通過(guò)分析或讀取相反的DNA鏈， 可以測(cè)量到互補(bǔ)的等位基因。因此，對(duì)于其特征為A/G多態(tài)性的多態(tài) 性位點(diǎn)(多態(tài)性標(biāo)記物)來(lái)說(shuō)，使用的分析方法可以被設(shè)計(jì)成特異性 檢測(cè)兩種可能的堿基即A和G中的一種或兩種的存在?？蛇x地，通過(guò) 設(shè)計(jì)分析方法，使得它被設(shè)計(jì)成檢測(cè)DNA模板上的相反鏈，可以測(cè)量 到互補(bǔ)堿基T和C的存在。從定量來(lái)說(shuō)(例如根據(jù)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn))，從任 一條DNA鏈(+鏈或-鏈)測(cè)量獲得的結(jié)果是相同的。
典型情況下，對(duì)特定序列指定參比序列。與參比不同的等位基因 有時(shí)被稱(chēng)為"變體"等位基因。本文使用的變體序列是指與參比序列 不同但是基本上相似的序列。本文描述的多態(tài)性遺傳標(biāo)記物處的等位 基因是變體。其它的變體可以包含影響到多肽的變化。當(dāng)與參比核苷 酸序列進(jìn)行比較時(shí)，序列差異可以包括單個(gè)核苷酸或一個(gè)以上核苷酸的插入或缺失，從而導(dǎo)致閱讀框移碼；至少一個(gè)核苷酸的變化，導(dǎo)致 了所編碼的氨基酸的變化；至少一個(gè)核苷酸的變化，導(dǎo)致產(chǎn)生了未成 熟的終止密碼子；幾個(gè)核苷酸的缺失，導(dǎo)致了核苷酸編碼的一個(gè)或多 個(gè)氨基酸的缺失； 一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的插入，例如通過(guò)不對(duì)稱(chēng)重組或 基因轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致了閱讀框編碼序列的中斷；序列的全部或一部分的復(fù) 制；易位；或核苷酸序列的重排。這樣的序列變化可以改變核酸編碼 的多肽。例如，如果核酸序列中的變化導(dǎo)致了閱讀框移碼，閱讀框移 碼可以導(dǎo)致編碼的氨基酸的變化，和/或?qū)е庐a(chǎn)生了未成熟的終止密碼 子，導(dǎo)致產(chǎn)生了截短的多肽。可選地，與疾病或性狀有關(guān)的多態(tài)性可 以是一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的同義變化(即變化不導(dǎo)致氨基酸序列的變 化)。這樣的多態(tài)性可能例如改變剪接位點(diǎn)、影響mRNA的穩(wěn)定性或 運(yùn)輸，或影響轉(zhuǎn)錄或編碼的多肽的翻譯。也可以改變DNA，以增加在 體細(xì)胞水平上發(fā)生結(jié)構(gòu)變化、例如擴(kuò)增或缺失的可能性。參比核苷酸 序列編碼的多肽是具有特定的參比氨基酸序列的"參比"多肽，由變 體等位基因編碼的多肽被稱(chēng)為具有變異的氨基酸序列的"變體"多肽。 序列或參比序列可以表示雙鏈DNA的(+)或(-)方向。正如專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員 所熟知的，這樣的序列是相關(guān)的，彼此為反向互補(bǔ)序列。
單倍型是指DNA的區(qū)段，其特征為沿著區(qū)段排列有等位基因的特 定組合。對(duì)于二倍體生物例如人類(lèi)來(lái)說(shuō)，單倍型含有每個(gè)多態(tài)性標(biāo)記 物或位點(diǎn)的一對(duì)等位基因中的一個(gè)成員。在某些實(shí)施方案中，單倍型 可以含有兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因、三個(gè)或三個(gè)以上等位基因、四個(gè) 或四個(gè)以上等位基因、或五個(gè)或五個(gè)以上等位基因，每個(gè)等位基因?qū)?應(yīng)于區(qū)段上的特定多態(tài)性標(biāo)記物。單倍型可以含有在多態(tài)性位點(diǎn)上具 有特定等位基因的各種多態(tài)性標(biāo)記物、例如SNPs和微衛(wèi)星的組合。因 此，單倍型含有各種不同遺傳標(biāo)記物等位基因的組合。
特定多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型的檢測(cè)可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知 的檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的序列的方法來(lái)完成。例如，可以使用用于基因分 型的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)SNPs和/或微衛(wèi)星標(biāo)記物的存在，例如基于熒光的
43技術(shù)(Chen, X.等，Ge"owe 7 " ^Y": 492-98 (1999))，利用PCR、 LCR、 巢式PCR以及其它用于核酸擴(kuò)增的技術(shù)?？捎糜赟NP基因分型的具體 的方法包括但不限于TaqMan基因分型分析方法和SNPlex平臺(tái) (Applied Biosystems)、質(zhì)i普(例如來(lái)自Sequenom的MassARRAY系 統(tǒng))、微型測(cè)序方法、實(shí)時(shí)PCR、 Bio-Plex系統(tǒng)(BioRad) 、 CEQ和 SNPstream系統(tǒng)(Beckman)、分子倒置探針陣列技術(shù)(例如Affymetrix GeneChip)以及BeadArray技術(shù)(例如Illumina GoldenGate禾B Infinium 分析方法)。通過(guò)這些以及其它本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員可用的方法， 可以鑒定出多態(tài)性標(biāo)記物包括微衛(wèi)星、SNPs或其它類(lèi)型的多態(tài)性標(biāo)記 物的一個(gè)或多個(gè)等位基因。
在本文描述的某些方法中，對(duì)所研究的任何特定疾病或性狀具有 增加的易感性(即增加的風(fēng)險(xiǎn))的個(gè)體，是在其中鑒定到了賦予對(duì)疾 病或性狀的增加的易感性的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)特定 等位基因或單倍型(即風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物等位基因或單倍型)的個(gè)體。在一 種情況下，風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物或單倍型是賦予了對(duì)疾病或性狀的明顯增加的 風(fēng)險(xiǎn)(或易感性)的標(biāo)記物或單倍型。在一個(gè)實(shí)施方案中，與標(biāo)記物 或單倍型相關(guān)的顯著性通過(guò)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)來(lái)測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，與標(biāo)記物或單倍型相關(guān)的顯著性通過(guò)比值比(OR)來(lái)測(cè)量。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，顯著性通過(guò)百分比來(lái)度量。在一個(gè)實(shí)施方案中， 顯著增加的風(fēng)險(xiǎn)被測(cè)量為風(fēng)險(xiǎn)(相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)和/或比值比)為至少1.2，包 括但不限于至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少 1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、至少3.0、至少4.0和至 少5.0。在具體的實(shí)施方案中，至少1.2的風(fēng)險(xiǎn)(相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)和/或比值比) 是顯著的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少1.3的風(fēng)險(xiǎn)是顯著的。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，至少1.4的風(fēng)險(xiǎn)是顯著的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至 少大約1.5的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)是顯著的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少大約1.7 的風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加是顯著的。但是，也考慮到了其它的截止值，例如 至少1.15、 1.25、 1.35等，這些截止值也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其它實(shí) 施方案中，風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加是至少大約20%，包括但不限于大約25%、30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 550/0、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 100%、 150%、 200%、 300%和500%。在一個(gè)具體 的實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加是至少20%。在其它實(shí)施方案中，風(fēng) 險(xiǎn)的顯著增加是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、 至少80%、至少90%和至少100%。但是，也考慮到了本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān) 業(yè)技術(shù)人員認(rèn)為適合于表征本發(fā)明的其它截止值或范圍，它們也在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的風(fēng)險(xiǎn)多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型，是在具有疾病或性狀(例 如心律不齊或中風(fēng))(受影響的)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中至少一個(gè)標(biāo)記物的至 少一個(gè)等位基因或單倍型的出現(xiàn)頻率，與它在對(duì)比組(對(duì)照)中的出 現(xiàn)頻率相比更高的標(biāo)記物或單倍型，其中標(biāo)記物或單倍型的存在表明 了對(duì)疾病或性狀的易感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照組可以是群體樣 品，即來(lái)自總?cè)后w的隨機(jī)樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照組由一組 沒(méi)有患病的個(gè)體代表。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些沒(méi)有患病的對(duì)照的特 征可以是不存在一種或多種與特定疾病相關(guān)的癥狀。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，沒(méi)有患病的對(duì)照組的特征為沒(méi)有一種或多種疾病特異性風(fēng)險(xiǎn)因 子。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的風(fēng)險(xiǎn)因子是至少一種環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子。 代表性的環(huán)境因子是已知影響或被考慮到影響發(fā)生特定疾病或性狀的 風(fēng)險(xiǎn)的天然產(chǎn)品、礦物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。其它環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子是與生 活方式有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子，包括但不限于飲食習(xí)慣、主要居住地的地理 位置和職業(yè)性風(fēng)險(xiǎn)因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)因子是至少一種 遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。
簡(jiǎn)單的相關(guān)性檢驗(yàn)的例子是在2x2表格上進(jìn)行的Fisher-精確檢驗(yàn)。 給定一組染色體，使用含有兩種標(biāo)記物或單倍型、含有一種標(biāo)記物或 單倍型而不含另一種、以及不含有標(biāo)記物或單倍型的染色體的數(shù)量， 構(gòu)建出2x2表格。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)疾病或性狀具有降低的易感性(即降低的風(fēng)險(xiǎn))的個(gè)體，是在其中鑒定到了賦予對(duì)疾病或性狀的降 低的易感性的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)特定等位基因或單 倍型的個(gè)體。賦予降低的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物等位基因和/或單倍型也被說(shuō)成 是保護(hù)性的。在一種情況下，保護(hù)性標(biāo)記物或單倍型是賦予了對(duì)疾病 或性狀的明顯降低的風(fēng)險(xiǎn)(或易感性)的標(biāo)記物或單倍型。在一個(gè)實(shí) 施方案中，顯著降低的風(fēng)險(xiǎn)被測(cè)量為相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)小于0.9，包括但不限于
小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、 小于0.2和小于0.1。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，顯著降低的風(fēng)險(xiǎn)是小 于0.7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，顯著降低的風(fēng)險(xiǎn)是小于0.5。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，顯著降低的風(fēng)險(xiǎn)是小于0.3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn) (或易感性)的降低是至少20%，包括但不限于至少25%、至少30%、 至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、 至少65%、至少70%、至少75%、至少80°/。、至少85%、至少90%、 至少95%和至少98%。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)的顯著降低是至 少大約30%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)的顯著降低是至少大約50%。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，風(fēng)險(xiǎn)的顯著降低是至少大約70%。但是，也考 慮到了本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員認(rèn)為適合于表征本發(fā)明的其它截止 值或范圍，它們也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在被研究的群體中存在標(biāo)記 物的兩個(gè)等位基因，其中一個(gè)等位基因被發(fā)現(xiàn)在群體中具有性狀或疾 病的個(gè)體組中的頻率高于對(duì)照組，而標(biāo)記物的另一個(gè)等位基因被發(fā)現(xiàn) 在具有性狀或疾病的個(gè)體組中的頻率低于對(duì)照組。在這種情況下，標(biāo)
記物的一個(gè)等位基因(被發(fā)現(xiàn)在具有性狀或疾病的個(gè)體中頻率增加的 等位基因)將是有風(fēng)險(xiǎn)的等位基因，而另一個(gè)等位基因?qū)⑹潜Ｗo(hù)性等 位基因。
遂徵不乎欽
重組這種自然現(xiàn)象，對(duì)于每對(duì)染色體來(lái)說(shuō)在每次減數(shù)分裂事件過(guò) 程中平均發(fā)生一次，代表了自然界為序列(因此也為生物學(xué)功能)提供變異的一種方式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基因組中的重組不是隨機(jī)發(fā)生的；相 反，在重組率的頻率上存在很大的變化，產(chǎn)生了具有高重組頻率的小 區(qū)域(也被稱(chēng)為重組熱點(diǎn))和具有低重組頻率的較大的區(qū)域，這通常 被稱(chēng)為連鎖不平衡(LD)區(qū)塊(Myers, S.等，S/oc/^/w Soc 7>ww 34:526-530 (2006); Jeffreys, A丄，等，GeW 29:217-222 (2001); May, C.A.等，淑訓(xùn)G匿"1:272-275(2002))。
連鎖不平衡(LD)是指兩個(gè)遺傳元件的非隨機(jī)的搭配。例如，如 果特定遺傳元件(例如多態(tài)性標(biāo)記物的等位基因，或單倍型)在群體 中出現(xiàn)的頻率為0.25 (25%)，另一個(gè)元件出現(xiàn)的頻率為0.25 (25%)， 假設(shè)元件隨機(jī)分配，那么一個(gè)個(gè)體具有兩個(gè)元件的預(yù)計(jì)的發(fā)生率為 0.125 (12.5%)。但是，如果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)元件一起出現(xiàn)的頻率高于0.125， 那么元件被說(shuō)成是連鎖不平衡的，因?yàn)樗鼈儍A向于以比根據(jù)它們獨(dú)立 的出現(xiàn)頻率(例如等位基因或單倍型頻率)預(yù)測(cè)的比例更高的比例一 起遺傳。粗略地說(shuō)，LD—般與兩個(gè)元件之間的重組事件的頻率相關(guān)。 群體中等位基因或單倍型的頻率可以通過(guò)對(duì)群體中的個(gè)體進(jìn)行基因分 型并確定群體中每個(gè)等位基因或單倍型出現(xiàn)的頻率來(lái)測(cè)定。對(duì)于二倍 體群體例如人類(lèi)群體來(lái)說(shuō)，個(gè)體一般對(duì)每個(gè)遺傳元件(例如標(biāo)記物、 單倍型或基因)具有兩個(gè)等位基因。
為了評(píng)估連鎖不平衡(LD)的強(qiáng)度已經(jīng)提出了許多不同的測(cè)量方 法。大多數(shù)捕獲成對(duì)的雙等位基因位點(diǎn)之間關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度。LD的兩個(gè)重 要的成對(duì)度量是r2 (有時(shí)稱(chēng)為A2)和ID'I。兩種度量的范圍都是從0 (沒(méi) 有不平衡)到1 ("完全"不平衡)，但是它們的解釋稍微有些不同。 ID'I被定義為如果僅存在兩個(gè)或三個(gè)可能的單倍型則等于1，如果所有 四個(gè)可能的單倍型都存在則小于1。因此，小于l的ID'I值表明在兩個(gè) 位點(diǎn)之間可能在歷史上已經(jīng)發(fā)生過(guò)重組(回復(fù)突變也能導(dǎo)致ID，I小于1， 但是對(duì)于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來(lái)說(shuō)，通常認(rèn)為這種情況發(fā)生的可 能性比重組低)。度量 一表示兩個(gè)位點(diǎn)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，如果只 出現(xiàn)兩個(gè)單倍型則取值為1。
47r2度量大概是相關(guān)性作圖的最具相關(guān)性的度量，因?yàn)樵凇蜋z測(cè) 易感性位點(diǎn)與SNPs之間的關(guān)聯(lián)性所需的樣品大小之間存在簡(jiǎn)單的反 比關(guān)系。這些度量是針對(duì)成對(duì)位點(diǎn)定義的，但是對(duì)某些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，可
能需要確定在含有許多多態(tài)性位點(diǎn)的整個(gè)區(qū)域上LD有多強(qiáng)(例如測(cè)試 在位點(diǎn)之間或群體范圍內(nèi)LD的強(qiáng)度是否有顯著的差別，或者區(qū)域中的 LD比在特定模型下預(yù)測(cè)的更高還是更低)。對(duì)整個(gè)區(qū)域的LD的測(cè)量 不是直接進(jìn)行的，而是使用一種方法測(cè)量r，這種方法是在群體遺傳學(xué) 中開(kāi)發(fā)的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，r測(cè)量了在特定的群體模型下為了產(chǎn)生在數(shù)據(jù)中 觀察到的LD將需要多少重組。這種類(lèi)型的方法也可能可以為確定LD 數(shù)據(jù)是否為重組熱點(diǎn)的存在提供了證據(jù)的難題提供統(tǒng)計(jì)學(xué)上嚴(yán)格的方 法。對(duì)于本文描述的方法和過(guò)程來(lái)說(shuō)，顯著的—值可以是至少0.1，例 如至少O.l、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、 0.45、 0.5、 0.55、 0.6、 0.65、 0,7、 0.75、 0.8、 0.85、 0.9、 0.91、 0.92、 0.93、 0.94、 0.95、 0.96、 0.97、 0.98、 0.99或1.0。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，顯著的rM直可以是 至少0.2?？蛇x地，本文描述的連鎖不平衡是指其特征為ID'I的值為至 少0.2，例如0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.85、 0.9、 0.95、 0.96、 0.97、 0.98、 0.99的連鎖不平衡。因此，連鎖不平衡表示了不同標(biāo)記物的等位 基因之間的相關(guān)性。它由相關(guān)性系數(shù)或ID，沐度量(一最高為1.0， |D，| 最高為1.0)。連鎖不平衡可以如本文描述在單一人類(lèi)群體中測(cè)定，或 者可以在含有來(lái)自一個(gè)以上人類(lèi)群體的個(gè)體的樣品集合中測(cè)定。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，LD在來(lái)自一個(gè)或多個(gè)HapMap群體(高加索 人，非洲人，日本人，中國(guó)人)的樣品中，按照(http:〃www.hapmap.org) 的定義來(lái)測(cè)定。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，LD在HapMap樣品的CEU 群體中測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LD在YRI群體中測(cè)定。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，LD在來(lái)自冰島人群體的樣品中測(cè)定。
如果在群體水平上基因組中的所有多態(tài)性是一致的，那么它們中 每個(gè)單獨(dú)的多態(tài)性將需要在關(guān)聯(lián)性研究中進(jìn)行調(diào)查。但是，由于多態(tài) 性之間的連鎖不平衡，緊密連鎖的多態(tài)性是強(qiáng)烈相關(guān)的，這減少了在關(guān)聯(lián)性研究中為了觀察到顯著相關(guān)性所需調(diào)査的多態(tài)性的數(shù)量。LD的 另一個(gè)結(jié)果是，許多多態(tài)性由于它們是強(qiáng)烈相關(guān)的，可能給出關(guān)聯(lián)性信號(hào)。
已經(jīng)在基因組范圍內(nèi)產(chǎn)生了基因組LD譜圖，這樣的LD譜圖已經(jīng) 被建議用作框架對(duì)疾病基因進(jìn)行作圖(Risch, N. & Merkiangas, K, 5We"ce 273:1516-1517 (1996); Maniatis, N.等，/Voc 7VaW ^cac/"&4 99:2228-2233 (2002); Reich，DE等，A^wre 411:199-204 (2001))。
現(xiàn)在已經(jīng)確定，人類(lèi)基因組的許多部分可以被分成一系列不連續(xù) 的含有幾個(gè)共同的單倍型的單倍型區(qū)塊；對(duì)于這些區(qū)塊來(lái)說(shuō)，連鎖不 平衡數(shù)據(jù)幾乎沒(méi)有提供表明重組的證據(jù)(參見(jiàn)例如Wall.， J.D.和 Pritchard, J.K.,淑匿i ev/縮￥:587-597 (2003); Daly, M.等， 淑匿":229-232 (2001); Gabriel, S.B.等，Sc/置e腐:2225-2229 (2002);Patil， N.等，S"'匿e廁:1719-1723 (2001); Dawson, E.等，淑匿 福:544-548 (2002); Phillips, M.S.等，淑訓(xùn)":382-387 (2003))。
有兩種主要的方法用于定義這些單倍型區(qū)塊區(qū)塊可以被定義為
具有有限的單倍型多樣性的DNA區(qū)域(參見(jiàn)例如Daly, M.等，7Va&"
":229-232 (2001); Patil, N.等，Sc/置e "(1719-1723 (2001); Dawson, E.等，A^m^e WS:544-548 (2002); Zhang， K.等，iVoc. Wfl〃，力c"cf.
tAS^4 99:7335-7339 (2002))，或者定義為使用連鎖不平衡鑒定的具 有延長(zhǎng)的歷史上重組的過(guò)渡區(qū)之間的區(qū)域(參見(jiàn)例如Gabriel, S.B.等， Scie騰 296:2225-2229 (2002) ; Phillips, M.S.等，胸訓(xùn) W:382-387 (2003); Wang, N.等，顛.i/畫(huà).G匿t 77:1227-1234 (2002); Stumpf, MP.，和Goldstein, D.B., Cw".所o/. /3:1-8 (2003))。更 近些時(shí)候，在人類(lèi)基因組范圍上重組率的精細(xì)圖的和相應(yīng)的熱點(diǎn)的圖 譜已經(jīng)被產(chǎn)生(Myers, S.等，5We"ce 310:321-32324 (2005); Myers, S. 等，Soc 7>ww 34:526530 (2006))。圖譜顯示出在基因組范圍 內(nèi)的重組中存在大量變化，在熱點(diǎn)處重組率高達(dá)10-60 cM/Mb，而在過(guò)渡區(qū)中接近于0，因此代表了有限單倍型多樣性和高LD的區(qū)域。因此， 譜圖可用于將單倍型區(qū)塊/LD區(qū)塊定義為重組熱點(diǎn)兩翼的區(qū)域。在本文
中使用的術(shù)語(yǔ)"單倍型區(qū)塊"或"LD區(qū)塊"包含了由任何上述的特征、
或本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員用于定義這種區(qū)域所用的其它可選方法定義 的區(qū)塊。
使用單個(gè)標(biāo)記物或含有多個(gè)標(biāo)記物的單倍型，單倍型區(qū)塊可用于 對(duì)表型和單倍型狀態(tài)之間的相關(guān)性進(jìn)行作圖?？梢栽诿總€(gè)單倍型區(qū)塊
中鑒定主要的單倍型，然后可以鑒定一組"標(biāo)簽"SNPs或標(biāo)記物(在 單倍型中進(jìn)行辨別所需的最小組的SNPs或標(biāo)記物)。這些標(biāo)簽SNPs 或標(biāo)記物然后可用于評(píng)估來(lái)自個(gè)體組的樣品，以便鑒定表型和單倍型 之間的相關(guān)性。如果需要，可以對(duì)鄰近的單倍型區(qū)塊同時(shí)進(jìn)行評(píng)估， 因?yàn)樵趩伪缎蛥^(qū)塊之間也可能存在連鎖不平衡。
因此，顯然，對(duì)于任何給定的觀察到的與基因組中的多態(tài)性標(biāo)記 物的關(guān)聯(lián)性來(lái)說(shuō)，可能基因組中的其它標(biāo)記物也顯示出關(guān)聯(lián)性。這是 基因組范圍內(nèi)LD的不均衡分布的自然結(jié)果，正如通過(guò)重組率的大的變 化所觀察到的。因此，在某種意義上，用于檢測(cè)關(guān)聯(lián)性的標(biāo)記物代表 了與給定疾病或性狀有關(guān)的基因組區(qū)域(即單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊)的 "標(biāo)簽"，并因此可用于本發(fā)明的方法和試劑盒中。在被發(fā)現(xiàn)與疾病 或性狀有關(guān)的區(qū)域中可以存在有一個(gè)或多個(gè)引起結(jié)果的(功能性)變 體或突變。這樣的變體可能賦予比用于檢測(cè)關(guān)聯(lián)性的標(biāo)簽標(biāo)記物觀察 到的更高的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)或比值比(OR)。因此，如本文所述，本 發(fā)明涉及了用于檢測(cè)與疾病的關(guān)聯(lián)性的標(biāo)記物，以及與標(biāo)記物連鎖不 平衡的標(biāo)記物。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，與本文所述的標(biāo) 記物和/或單倍型連鎖不平衡的標(biāo)記物可以被用作替代標(biāo)記物。在一個(gè) 實(shí)施方案中，替代標(biāo)記物具有比最初被發(fā)現(xiàn)與本文所述的疾病相關(guān)的 標(biāo)記物或單倍型更小的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)和/或比值比(OR)值。在其 它實(shí)施方案中，替代標(biāo)記物具有比最初被發(fā)現(xiàn)與本文所述的疾病相關(guān) 的標(biāo)記物所最初測(cè)定的更大的RR或OR值。這樣的實(shí)施方案的一個(gè)例子是與最初被發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的更常見(jiàn)的變體(>10%群體頻率)、例 如本文描述的變體連鎖不平衡的稀有的或相對(duì)稀有的(<10%等位基因 群體頻率)變體。鑒定和使用這些標(biāo)記物用于檢測(cè)本文描述的本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性，可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員熟知的常規(guī)方法來(lái) 進(jìn)行，因此也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
與本文顯示的與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng))和中風(fēng)有 關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物連鎖不平衡的某些多態(tài)性標(biāo)記物，有可能位于本文SEQ
ID NO: 50中顯示的序列所定義的LD區(qū)塊C04的物理邊界之外。這是 所述區(qū)域中歷史上的重組率的結(jié)果，歷史上的重組可能導(dǎo)致產(chǎn)生了強(qiáng) 烈連鎖不平衡的區(qū)域(LD區(qū)塊)，它帶有與區(qū)塊內(nèi)的標(biāo)記物連鎖不平 衡的區(qū)塊外的剩余標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)?利用它們與在本文中顯示出的與心律不齊和中風(fēng)相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物的遺 傳關(guān)系，它們同樣可用于實(shí)施本發(fā)明。這樣的標(biāo)記物的例子顯示在表 18中(rs7668322 (SEQIDNO:46) 、 rs2197815 (SEQIDNO:47)、 rs6831623 (SEQIDNO:48) 、 rs2595110 (SEQIDNO:49))。
卓舒微率顏定
患者和對(duì)照組中單倍型的頻率可以使用期望最大化算法來(lái)估算 (Dempster A.等，《/ 兄5, 39:1-38 (1977))。可以使用這種算 法來(lái)操作丟失的基因型和階段的不確定性。在虛假設(shè)下，患者和對(duì)照 被假定具有同樣的頻率。使用或然性方法，測(cè)試可選的假說(shuō)，其中候 選的風(fēng)險(xiǎn)單倍型、可以包含本文描述的標(biāo)記物、被允許在患者中比對(duì) 照中具有更高的頻率，而兩個(gè)組中其它單倍型的頻率的比率被假設(shè)是
相同的。在兩種假說(shuō)下分別將或然性最大化，并使用相應(yīng)的l-df或然 性比率統(tǒng)計(jì)數(shù)值來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
為了在連鎖區(qū)域中尋找有風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)性標(biāo)記物，研究了例如被基 因分型的標(biāo)記物的所有可能組合的關(guān)聯(lián)性，只要那些標(biāo)記物分布在可 實(shí)踐的區(qū)域中。可以將合并的患者和對(duì)照組隨機(jī)分成兩組，其大小與
51原始的患者和對(duì)照組相等。然后重復(fù)標(biāo)記物和單倍型分析，確定記錄 到的最顯著的p-值。這種隨機(jī)化的流程可以被重復(fù)例如超過(guò)100次， 以構(gòu)建p-值的經(jīng)驗(yàn)性分布。在優(yōu)選實(shí)施方案中，p-值〈0.05是顯著的標(biāo) 記物和/或單倍型關(guān)聯(lián)性的指示。
卓燈麥分折
進(jìn)行單倍型分析的一種通用方法包括將基于或然性的推論用于
NEstedMOdels (Gretarsdottir S.等，A^aA 35:131-38 (2003))。該
方法在NEMO程序中執(zhí)行，允許使用許多多態(tài)性標(biāo)記物、SNPs和微衛(wèi) 星。所述方法和軟件被特別設(shè)計(jì)用于病例-對(duì)照研究，其目的是鑒定賦 予了不同風(fēng)險(xiǎn)的單倍型組。它也是用于研究LD結(jié)構(gòu)的工具。在NEMO 中，在EM算法的幫助下，直接計(jì)算了最大或然性估算值、或然性比 率和p-值，對(duì)于觀察到的數(shù)據(jù)，將其作為缺失數(shù)據(jù)問(wèn)題進(jìn)行處理。
盡管基于從觀察到的數(shù)據(jù)直接計(jì)算的或然率的或然率比率檢驗(yàn)捕 捉到了由于階段的不確定性和缺失的基因型而丟失的信息，可用于可 靠地給出有效的p-值，但了解由于信息的不完整而丟失了多少信息， 仍然是有趣的。用于單倍型分析的信息測(cè)量測(cè)量描述在Nicolae和Kong (技術(shù)報(bào)告537號(hào)，芝加哥大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)院統(tǒng)計(jì)學(xué)系；S/ome^"， 60(2):368-75 (2004))中，作為為連鎖分析定義的信息測(cè)量的自然延伸， 并在NEMO中執(zhí)行。
對(duì)于單個(gè)標(biāo)記物與疾病的關(guān)聯(lián)性來(lái)說(shuō)，可以使用Fisher精確檢驗(yàn) 來(lái)計(jì)算每個(gè)單獨(dú)等位基因的雙邊p-值。通常來(lái)說(shuō)，除非特別指明，所 有顯示的p-值沒(méi)有對(duì)多重比較進(jìn)行調(diào)整。顯示的頻率(對(duì)于微衛(wèi)星、 SNPs和單倍型來(lái)說(shuō))是與攜帶者頻率相反的等位基因頻率。為了最小 化由于作為連鎖分析的家庭召集的患者的親緣性造成的任何偏差，一 級(jí)和二級(jí)親屬可以從患者名單中消除。此外，通過(guò)擴(kuò)展在Risch， N. & Teng, J. (Ge"omei e、 8:1273-1288 (1998))中描述的偏差調(diào)整步驟， 合并具有親緣關(guān)系的DNA (/^丄)以便它可以適用于普通家族關(guān)系、并呈遞調(diào)整過(guò)的和未調(diào)整的p-值進(jìn)行比較，可以重復(fù)檢驗(yàn)，對(duì)患者間 任何殘留的親緣性進(jìn)行關(guān)聯(lián)性校正。差異一般來(lái)說(shuō)正如預(yù)期一樣非常 小。為了評(píng)估通過(guò)多次檢驗(yàn)校正的單個(gè)標(biāo)記物關(guān)聯(lián)性的顯著性，我們 可以使用同樣的基因型數(shù)據(jù)執(zhí)行隨機(jī)測(cè)試?？梢詫⒒颊吆蛯?duì)照組隨機(jī)
化，將關(guān)聯(lián)性分析重做多次(例如多達(dá)500,000次)，在某些重復(fù)中對(duì)
某些標(biāo)記物等位基因產(chǎn)生的p-值小于或等于我們使用最初的患者和對(duì) 照組時(shí)觀察到的p-值，p-值即是這樣的重復(fù)的分?jǐn)?shù)。
對(duì)于單個(gè)標(biāo)記物和單倍型分析來(lái)說(shuō)，通過(guò)假設(shè)的乘法模型(單倍
型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)模型)可以計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)和群體歸因風(fēng)險(xiǎn)度(PAR) (Terwilliger, J.D. & 。tt, J.， //匿//e^W. 42:337-46 (1992)和Falk， C.T. & Rubinstein, P, J朋，//wm. 5/ 3」:227-33 (1987))，即一個(gè)人
攜帶的兩個(gè)等位基因/單倍型的風(fēng)險(xiǎn)的乘積。例如，如果A相對(duì)于a的 風(fēng)險(xiǎn)是RR，那么純合子AA的人的風(fēng)險(xiǎn)將是雜合子Aa的人的風(fēng)險(xiǎn)的 RR倍，以及純合子aa的人的風(fēng)險(xiǎn)的RR"咅。乘法模型具有簡(jiǎn)化分析 和計(jì)算的良好性質(zhì)一一單倍型在受影響的群體中以及對(duì)照群體中是獨(dú) 立的，即處于Hardy-Weinberg平衡。因此，受影響的和對(duì)照的單倍型 的數(shù)量每個(gè)都具有多項(xiàng)式分布，但是在可選假設(shè)下具有不同的單倍型 頻率。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)于兩個(gè)單倍型&和^來(lái)說(shuō)，風(fēng)險(xiǎn)(/z,)/風(fēng)險(xiǎn)化)=
(/^,)/W/乃)，其中/和P分別是指受影響的群體和對(duì)照群體中的頻率。 盡管如果真正的模型不是乘法的將會(huì)損失一些效能，但除了極端情況 下之外，損失趨于輕微。最重要的是，p-值總是有效的，因?yàn)樗鼈兪轻?對(duì)虛假設(shè)計(jì)算的。
A^MO汙,遂綴不^翁—
成對(duì)標(biāo)記物之間的LD可以使用標(biāo)準(zhǔn)定義的D'和r2來(lái)計(jì)算 (Lewontin, R.， Ge""/" 49:49-67 (1964); Hill， W.G. & Robertson, A. 7Tzeor 4p; /. 22:226-231 (1968))。使用NEMO，通過(guò)最大或然
性來(lái)估算兩個(gè)標(biāo)記物等位基因組合的頻率，通過(guò)或然性比率檢驗(yàn)來(lái)評(píng) 估連鎖不平衡的偏差。通過(guò)平均由邊緣等位基因概率權(quán)重的兩個(gè)標(biāo)記物的所有可能的等位基因組合的值，D'和r2的定義被擴(kuò)展到包含微衛(wèi) 星。當(dāng)對(duì)所有標(biāo)記物組合進(jìn)行作圖以闡明特定區(qū)域中的LD結(jié)構(gòu)時(shí)，我 們將D'作圖于左上角，將p-值作圖于右下角。在LD圖中，如果需要 的話，標(biāo)記物可以等間距作圖而不按照它們的物理位置作圖。
^Ai伊仿浙珍銜學(xué)
正如本文所述，某些多態(tài)性標(biāo)記物和含有這樣的標(biāo)記物的單倍型 被發(fā)現(xiàn)可用于心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng) 估。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以包括使用標(biāo)記物來(lái)診斷對(duì)心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的易感性。多態(tài)性標(biāo)記物的特定等位基因，在患 有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的頻率， 比在沒(méi)有診斷出心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的個(gè)體 中的頻率更高。因此，這些標(biāo)記物等位基因?qū)τ谠趥€(gè)體中檢測(cè)心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))或中風(fēng)、或?qū)π穆刹积R(例如心房纖 顫或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的易感性，具有預(yù)測(cè)價(jià)值。含有風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物、 例如本文描述的標(biāo)記物的單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊中的標(biāo)簽標(biāo)記物，可用 作單倍型區(qū)塊或LD區(qū)塊中其它標(biāo)記物和/或單倍型的替代物。具有等 于1的^值的標(biāo)記物是風(fēng)險(xiǎn)變體的完美的替代物，即一個(gè)標(biāo)記物的基 因型完美地預(yù)測(cè)了另一個(gè)的基因型。具有小于1的—值的標(biāo)記物也可 以作為風(fēng)險(xiǎn)變體的替代物，或者可選地代表相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值等于或可能甚 至高于風(fēng)險(xiǎn)變體的變體。鑒定到的風(fēng)險(xiǎn)變體本身可以不是功能變體， 但是在這種情況下與真正的功能變體連鎖不平衡。本發(fā)明包括了為本 文公開(kāi)的標(biāo)記物評(píng)估這樣的替代標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物被注解、作圖 和列表在專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員熟知的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，或者可選地，可以通過(guò) 對(duì)使用本發(fā)明的標(biāo)記物在一組個(gè)體中鑒定到的區(qū)域或區(qū)域的一部分進(jìn) 行測(cè)序，并在得到的序列組中鑒定多態(tài)性，來(lái)容易地鑒定。結(jié)果，本 技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員可以容易地并且不需要繁瑣的實(shí)驗(yàn)，對(duì)與本文描 述的標(biāo)記物和/或單倍型連鎖不平衡的替代標(biāo)記物進(jìn)行基因分型。與檢 測(cè)到的風(fēng)險(xiǎn)變體連鎖不平衡的標(biāo)簽或替代標(biāo)記物，對(duì)于在個(gè)體中檢測(cè) 與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的關(guān)聯(lián)性或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性，也具有預(yù)測(cè)價(jià) 值。這些與本發(fā)明的標(biāo)記物連鎖不平衡的標(biāo)簽或替代標(biāo)記物也可以包 括其它在單倍型中不同的標(biāo)記物，因?yàn)樗鼈兺瑯訉?duì)于檢測(cè)對(duì)心律不齊 (例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性，具有預(yù)測(cè)價(jià)值。
本發(fā)明的標(biāo)記物和單倍型，例如在表5和9中顯示的標(biāo)記物以及 與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，可單獨(dú)或組合地用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和診斷目的。
因此，即使是在單個(gè)標(biāo)記物造成的風(fēng)險(xiǎn)增加相對(duì)溫和、即在10-30%的 級(jí)別的情況下，關(guān)聯(lián)性也可以具有明顯的暗示。因此，相對(duì)普通的變 體可能對(duì)總的風(fēng)險(xiǎn)有顯著的貢獻(xiàn)(群體歸因風(fēng)險(xiǎn)度高)，或者標(biāo)記物的 組合可用于定義基于標(biāo)記物的組合風(fēng)險(xiǎn)、對(duì)發(fā)生疾病有顯著的組合風(fēng) 險(xiǎn)的個(gè)體組。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)變體(標(biāo)記物和/或單倍 型)被用于總體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些變體選自本文公 開(kāi)的變體。其它實(shí)施方案包括了使用本發(fā)明的變體與其它已知可用于 診斷對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性的變 體的組合。在這樣的實(shí)施方案中，在個(gè)體中確定了多個(gè)標(biāo)記物和/或單 倍型的基因型狀態(tài)，并將個(gè)體的狀態(tài)與相關(guān)變體的群體頻率、或在臨 床健康的對(duì)象例如年齡匹配和性別匹配的對(duì)象中變體的頻率進(jìn)行比 較。然后可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法、例如多變量分析或聯(lián)合風(fēng) 險(xiǎn)分析，來(lái)確定根據(jù)多個(gè)位點(diǎn)處的基因型狀態(tài)所賦予的總的風(fēng)險(xiǎn)。然 后可以將基于這樣的分析進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估用于本文描述的本發(fā)明的方 法和試劑盒中。
如上所述，人類(lèi)基因組的單倍型區(qū)塊結(jié)構(gòu)具有這樣的作用，即與 最初與疾病或性狀相關(guān)的變體連鎖不平衡的大量變體(標(biāo)記物和/或單 倍型)可以用作替代標(biāo)記物，用于評(píng)估與疾病和性狀的關(guān)聯(lián)性。這樣 的替代標(biāo)記物的數(shù)量依賴(lài)于幾種因素，例如區(qū)域中的歷史重組率、區(qū) 域中的突變頻率(即區(qū)域中多態(tài)性位點(diǎn)或標(biāo)記物的數(shù)量)、以及區(qū)域中連鎖不平衡的程度(LD區(qū)塊的大小)。這些標(biāo)記物通常位于使用本文 描述的方法或通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員已知的其它方法確定的所述 LD區(qū)塊或單倍型區(qū)塊的物理邊界內(nèi)。但是，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物和單倍 型關(guān)聯(lián)性延伸到定義的單倍型區(qū)塊的物理邊界之外。在這樣的情況下， 這些標(biāo)記物和/或單倍型也可用作物理上位于定義的單倍型區(qū)塊內(nèi)的標(biāo) 記物和/或單倍型的替代標(biāo)記物和/或單倍型。因此，與本發(fā)明的標(biāo)記物
和單倍型連鎖不平衡(典型的特征為—大于0.1，例如r2大于0.2，包 括一大于0.3，也包括—大于0.4)的標(biāo)記物和單倍型也在本發(fā)明的范 圍之內(nèi)，即使它們?cè)谖锢砩衔挥谒x的單倍型區(qū)塊的邊界之外。這 包括了本文描述的標(biāo)記物(例如表5和表9)，但是也可以包括與表5 和9中列出的一種或多種標(biāo)記物強(qiáng)烈連鎖不平衡(例如特征為 一大于 0.1或0.2，和/或|0'|>0.8)的其它標(biāo)記物。
對(duì)于本文描述的SNP標(biāo)記物來(lái)說(shuō)，與在患者中被發(fā)現(xiàn)是過(guò)量的等 位基因(風(fēng)險(xiǎn)等位基因)相反的等位基因，在心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)患者中被發(fā)現(xiàn)具有降低的頻率。這些標(biāo)記物 和單倍型與這樣的標(biāo)記物連鎖不平衡和/或含有它們，因此對(duì)心律不齊
(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)具有保護(hù)性，即它們賦予了攜 帶有這些標(biāo)記物和/或單倍型的個(gè)體以降低的發(fā)生心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)或易感性。
本發(fā)明的某些變體、包括某些單倍型，在某些情況下包含各種遺 傳標(biāo)記物例如SNPs和微衛(wèi)星的組合。單倍型的檢測(cè)可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng) 域已知的和/或本文描述的用于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的序列的方法來(lái)進(jìn)行。 此外，某些單倍型或標(biāo)記物組與疾病表型之間的關(guān)聯(lián)性可以使用標(biāo)準(zhǔn) 的技術(shù)來(lái)證實(shí)。用于關(guān)聯(lián)性的簡(jiǎn)單檢驗(yàn)的一個(gè)代表性例子是在2x2表 格上進(jìn)行的Fisher精確檢驗(yàn)。
在特定實(shí)施方案中，被發(fā)現(xiàn)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的標(biāo)記物或單倍型(例如列于表5 (表5A和5B)、表9和/或表19中的標(biāo)記物，以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物)，是其中 標(biāo)記物或單倍型在具有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中 風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(受影響的人)中出現(xiàn)的頻率，比它在健康個(gè)體(對(duì)照) 中出現(xiàn)的頻率高的標(biāo)記物或單倍型，其中標(biāo)記物等位基因或單倍型的 存在是心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)或?qū)π穆刹积R (例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾P/或中風(fēng)易感性的指示。在其它實(shí)施方 案中，與一個(gè)或多個(gè)被發(fā)現(xiàn)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))
和/或中風(fēng)有關(guān)的標(biāo)記物(例如列于表5A和5B中的標(biāo)記物等位基因， 以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物)連鎖不平衡的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物，是在具有 心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(受影響 的人)中出現(xiàn)的頻率比它們?cè)诮】祩€(gè)體(對(duì)照)中出現(xiàn)的頻率高的標(biāo) 簽標(biāo)記物，其中標(biāo)簽標(biāo)記物的存在是對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的增加的易感性的指示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與 一個(gè)或多個(gè)被發(fā)現(xiàn)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng) 有關(guān)的標(biāo)記物(例如列于表5A和5B中的標(biāo)記物等位基因，以及與其 連鎖不平衡的標(biāo)記物)連鎖不平衡的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物等位基因(即賦予增 加的易感性)，是含有一個(gè)或多個(gè)在具有心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))禾n/或中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中出現(xiàn)的頻率，比它們?cè)诮】祩€(gè)體(對(duì) 照)中出現(xiàn)的頻率高的等位基因的標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的存在是對(duì)心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾P/或中風(fēng)增加的易感性的指示。
研究薦沐
從普遍意義上講，本發(fā)明的方法和試劑盒可以使用含有來(lái)自任何 來(lái)源、即任何個(gè)體的基因組DNA的樣品。在優(yōu)選實(shí)施方案中，個(gè)體是 人類(lèi)個(gè)體。個(gè)體可以是成年人、兒童或胎兒。本發(fā)明還提供了對(duì)屬于 耙群體的成員的個(gè)體中標(biāo)記物和/或單倍型的評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施方案中， 這樣的靶群體是根據(jù)其它遺傳因子、生物標(biāo)記物、生物物理參數(shù)(例 如體重、BMD、血壓)、或總體健康和/或生活方式參數(shù)(例如疾病或 相關(guān)疾病史、以前對(duì)疾病的診斷、疾病的家族史)，具有發(fā)生疾病的 風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的群體或組。
57本發(fā)明提供了包含特定年齡亞組的個(gè)體的實(shí)施方案，例如超過(guò)40
歲、超過(guò)45歲、或超過(guò)50、 55、 60、 65、 70、 75、 80或85歲的年齡 亞組。本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)應(yīng)于其它的年齡組，例如年齡小于85 歲的個(gè)體，例如小于80歲、小于75歲、或小于70、 65、 60、 55、 50、 45、 40、 35或30歲。其它實(shí)施方案涉及發(fā)病時(shí)的年齡在任何上述年齡 范圍內(nèi)的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，還考慮到了年齡的范圍可以是相 關(guān)的，例如發(fā)病時(shí)的年齡大于45歲但小于60歲。但是，其它的年齡 范圍也被考慮到了，包括由上面列出的年齡值界定的所有范圍。
其它實(shí)施方案涉及了發(fā)病年齡在特定年齡或年齡段的個(gè)體。因此， 遺傳的和非遺傳的傾向性因子可能在什么年齡影響個(gè)體發(fā)生疾病，這 是已知的。對(duì)于心血管疾病、包括心律不齊和中風(fēng)來(lái)說(shuō)，常見(jiàn)的風(fēng)險(xiǎn) 因子可以影響個(gè)體是否以及在什么年齡發(fā)生疾病。因此，本發(fā)明的某 些實(shí)施方案涉及了在某個(gè)年齡段中心律不齊(例如心房纖顫和/或心房 撲動(dòng))或中風(fēng)的發(fā)病年齡或診斷時(shí)的年齡。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有 發(fā)生中心律不齊(例如心房纖顫和/或心房撲動(dòng))或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體 的發(fā)病年齡或診斷年齡在40歲以上。在其它實(shí)施方案中，個(gè)體的發(fā)病 年齡或診斷年齡超過(guò)45歲，或超過(guò)50、 55、 60、 65、 70、 75、 80或 85歲。本發(fā)明的其它實(shí)施方案I涉及了發(fā)病年齡或診斷年齡在85歲以 下，例如在80歲以下、75歲以下或70、 65、 60、 55、 50、 45、 40、 35或30歲以下的個(gè)體。 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含了在80歲以下被診斷 患有心房纖顫或心房撲動(dòng)或中風(fēng)的個(gè)體。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及了 在70歲以下被診斷患有心房纖顫或心房撲動(dòng)或中風(fēng)的個(gè)體。另一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施方案涉及了在60歲以下被診斷患有心房纖顫或心房撲動(dòng)或中風(fēng) 的個(gè)體。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及了在50歲以下被診斷患有心房纖顫 或心房撲動(dòng)或中風(fēng)的個(gè)體。其它實(shí)施方案涉及了發(fā)病年齡在上面描述 的具體年齡段中的個(gè)體。也考慮到了在某些實(shí)施方案中，年齡段可以
是相關(guān)的，例如發(fā)病年齡大于45歲但小于60歲，發(fā)病年齡大于60歲 但小于70歲，發(fā)病年齡大于70歲但小于80歲，或發(fā)病年齡大于60歲但小于80歲。但是，其它的年齡段也被考慮到了，包括由上面列出 的年齡值界定的所有年齡段。
本發(fā)明還涉及了任何性別、男性或女性的個(gè)體。它還提供了涉及 來(lái)自一個(gè)或多個(gè)人類(lèi)種群的人類(lèi)對(duì)象的實(shí)施方案，包括但不限于班圖
人、Mandenk、約魯巴人、San、木布提矮人、奧克尼群島人、Adygel、 俄羅斯人、薩丁尼亞人、托斯卡尼人、莫扎比特人、貝多因人、Dmze、 巴勒斯坦人、俾路支人、布拉灰人、莫克蘭人、信德人、帕坦人、布 魯肖人、哈扎拉人、維吾爾人、kalash、漢族人、傣族人、達(dá)斡爾人、 赫哲族人、拉祜族人、苗族人、鄂倫春族人、畬族人、土家族人、土 族人、錫伯族人、彝族人、內(nèi)蒙古族人、納西族人、柬埔寨人、曰本 人、雅庫(kù)特人、美拉尼西亞人、巴布亞人、加里提亞拿人、Sumi、哥 倫比亞人、瑪雅人和皮瑪族人。本發(fā)明還涉及了歐洲人群體、美洲人 群體、歐亞人群體、亞洲人群體、中/南亞人群體、東亞人群體、中東 人群體、非洲人群體、西班牙人群體和大洋洲人群體。歐洲人群體包 括但不限于瑞典人、挪威人、芬蘭人、俄羅斯人、丹麥人、冰島人、 愛(ài)爾蘭人、凱爾特人、英格蘭人、蘇格蘭人、荷蘭人、比利時(shí)人、法 國(guó)人、德國(guó)人、西班牙人、葡萄牙人、意大利人、波蘭人、保加利亞 人、斯拉夫人、塞爾維亞人、波斯尼亞人、捷克人、希臘人和土耳其 人群體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了含有非洲黑人血統(tǒng)的群體， 例如含有非洲人血統(tǒng)或譜系的人的群體。非洲黑人血統(tǒng)可以通過(guò)自己 報(bào)告確定為非洲裔美國(guó)人(African-Americans )、非裔美國(guó)人 (Afro-Americans)、美國(guó)黑人(BlackAmericans)，是黑色人種的一 個(gè)成員，或黑人人種的一個(gè)成員。例如，非洲裔美國(guó)人或美國(guó)黑人是 居住在北美并且起源于任何非洲黑色人種組的人。在另一個(gè)例子中， 自己報(bào)告的非洲黑人血統(tǒng)的人可以具有至少一個(gè)非洲黑人血統(tǒng)的父 母，或至少一個(gè)非洲黑人血統(tǒng)的祖父母。
59個(gè)體對(duì)象中的種族組成也可以通過(guò)遺傳分析來(lái)確定。血統(tǒng)的遺傳
分析可以使用不連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行，例如在Smith等"m / //wmGe"W74, 1001-13 (2004))中提出的那些。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了如上所述在特定群體中鑒定到 的標(biāo)記物和/或單倍型。本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在對(duì)不同 的群體使用時(shí)，連鎖不平衡(LD)測(cè)量將給出不同的結(jié)果。這是由于 不同人類(lèi)群體的不同群體史，以及在特定基因組區(qū)域中可能導(dǎo)致LD差 異的不同選擇壓力。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)，某些標(biāo)記物例 如SNP標(biāo)記物在一個(gè)群體中是多態(tài)性的但在另一個(gè)群體中不是，這種 情況是熟知的。但是，本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員將使用可用的或如本文 教導(dǎo)的方法，在任何給定的人類(lèi)群體中實(shí)施本發(fā)明。這可以包括評(píng)估 本發(fā)明的LD區(qū)域中的多態(tài)性標(biāo)記物，以便鑒定出那些在特定群體中表 現(xiàn)出最強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的標(biāo)記物。因此，本發(fā)明的有風(fēng)險(xiǎn)變體可以在不同的 單倍型背景上、并以不同的頻率存在于各種不同人類(lèi)群體中。但是， 使用本技術(shù)領(lǐng)域己知的方法和本發(fā)明的標(biāo)記物，可以在任何給定人類(lèi) 群體中實(shí)施本發(fā)明。
遺傳/Jf試游賴(lài)遂
本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到并理解， 一般來(lái)說(shuō)，本文描述 的變體本身不能提供將發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/ 或中風(fēng)的個(gè)體的絕對(duì)鑒定。但是，本文描述的變體表明了攜帶有本發(fā) 明的風(fēng)險(xiǎn)或保護(hù)性變體的個(gè)體將發(fā)生與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的癥狀的增加的和/或降低的可能性。但是，該 信息本身是極具價(jià)值的，正如在下文中更詳細(xì)指出的，因?yàn)樗梢杂?于例如在早期階段啟動(dòng)預(yù)防性措施，進(jìn)行定期的生理和/或心理檢查以 監(jiān)測(cè)癥狀的發(fā)展和/或出現(xiàn)，或計(jì)劃定期的檢査以鑒定所述的病癥，以 便能夠在早期階段實(shí)施治療。
關(guān)于賦予了發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)的遺傳變體的知識(shí)，為使用遺傳測(cè)試辨別具有發(fā)生疾病的增加 的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(即風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者)和具有發(fā)生疾病的降低的風(fēng)險(xiǎn) 的個(gè)體(即保護(hù)性變體的攜帶者)提供了機(jī)會(huì)。對(duì)于屬于上述兩個(gè)組 的個(gè)體來(lái)說(shuō)，遺傳測(cè)試的核心價(jià)值是能夠在早期階段診斷心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的可能性，或心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的傾向性，以及為臨床醫(yī)師提供關(guān)于心律 不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的預(yù)后的信息，以便能夠 實(shí)施最合適的治療。
具有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)家族史的個(gè) 體和風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者可以從遺傳測(cè)試中獲益，因?yàn)閷?duì)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子 的存在的了解、或成為一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子的攜帶者的增加的風(fēng)險(xiǎn)的 證據(jù)，可以為通過(guò)避免或最小化與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的心血管疾病的已知環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子，來(lái)實(shí)行更健康 的生活方式提供增加的激勵(lì)。心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)患者的遺傳測(cè)試，可以進(jìn)一步給出關(guān)于疾病的首要原因的有 價(jià)值的信息，可以幫助臨床醫(yī)生為每個(gè)個(gè)體選擇最適合的療法和藥物 治療。
本發(fā)明還涉及對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng) 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，包括確定個(gè)體是否具有發(fā)生心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的多態(tài)性標(biāo)記物可以單獨(dú)或組合 使用，以及與其它因子、包括其它遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子或生物標(biāo)記物相組合， 用于對(duì)個(gè)體進(jìn)行心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的風(fēng) 險(xiǎn)評(píng)估。許多已知影響個(gè)體對(duì)發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的傾向性的因子， 是心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性因子，它 們對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并可用于這樣的評(píng)估的 中。這些包括但不限于年齡、性別、吸煙狀態(tài)、體育活動(dòng)、腰圍臀圍 比、心律不齊(特別是心房纖顫和/或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的家族史、 以前診斷的心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)、肥胖癥、高甘油三酯血癥、低HDL膽固醇、高血壓、升高的血壓、膽固醇水平、
HDL膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯、載脂蛋白AI和B水平、纖維 蛋白原、鐵蛋白、C反應(yīng)性蛋白和白三烯水平。已經(jīng)與心房纖顫/心房 撲動(dòng)和中風(fēng)相關(guān)聯(lián)的具體的生物標(biāo)記物被討論在Allard等(C//" C/z， 51:2043-2051 (2005))禾Q Becker (J77womZ) 7T^om6o/" 19:71-75 (2005)) 中。它們包括但不限于纖維蛋白D-二聚體、凝血酶原活化片段1.2 (F1.2)、凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合物(TAT)、纖維蛋白肽A (FPA)、 脂蛋白相關(guān)的磷脂酶A2 (Ip-PLA2) 、 (3-血小板球蛋白、血小板因子4、 P-選擇素、von Willebrand因子、利尿鈉肽前體(BNP)、基質(zhì)金屬蛋 白酶-9 (MMP-9) 、 PARK7、 二磷酸核苷激酶(NDKA) 、 tau、神經(jīng) 元特異性烯醇化酶、B型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子、星形神經(jīng)膠質(zhì)蛋白 S-100b、神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白、C-反應(yīng)性蛋白、血清淀粉樣肽A、基 質(zhì)金屬蛋白酶-9、血管和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子、腫瘤壞死因子a和白介 素，包括白介素-1、 -6和-8。循環(huán)系統(tǒng)祖細(xì)胞也已經(jīng)被暗示可以作為 AF的有用的生物標(biāo)記物。在具體的實(shí)施方案中，對(duì)于個(gè)體確定了一個(gè) 以上的生物標(biāo)記物，并與本文描述的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的確定結(jié) 果相結(jié)合。優(yōu)選情況下，測(cè)量來(lái)自個(gè)體的血漿或血清中的生物標(biāo)記物， 可選地，可以在其它含有可測(cè)量量的生物標(biāo)記物的適合的組織中測(cè)量 生物標(biāo)記物，這樣的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法可用于總體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，包括多變量分析或 邏輯回歸。
心房纖顫對(duì)于個(gè)體患者和衛(wèi)生護(hù)理系統(tǒng)整體來(lái)說(shuō)都是非常重要的 疾病。它可能是永久性的病癥，但是也可以是突發(fā)性的并復(fù)發(fā)，在這 種病例中它對(duì)診斷可能非常具有挑戰(zhàn)性。心房纖顫和心房撲動(dòng)的最具 破壞性的并發(fā)癥是衰弱性中風(fēng)的發(fā)生。重要的是，中風(fēng)在永久性和突 發(fā)性心房纖顫中風(fēng)險(xiǎn)是相等的。已經(jīng)重復(fù)地顯示出，使用華法林抗凝 結(jié)的療法在心房纖顫的情況下可以顯著降低中風(fēng)的第一次和進(jìn)一步的 突然發(fā)作。因此，法華令的抗凝結(jié)作用對(duì)于幾乎所有患有心房纖顫的患者來(lái)說(shuō)是用于預(yù)防中風(fēng)的標(biāo)準(zhǔn)療法，不論它們是永久性的還是突發(fā) 性類(lèi)型。唯一不強(qiáng)烈推薦使用華法林的患者是年齡小于65歲的被認(rèn)為 是低風(fēng)險(xiǎn)的患者，即它們不具有器質(zhì)性心臟病，包括沒(méi)有高血壓、沒(méi) 有冠狀動(dòng)脈疾病、沒(méi)有以前的中風(fēng)或暫時(shí)性缺血性發(fā)作史、沒(méi)有糖尿 病。該組患者對(duì)中風(fēng)具有較低的風(fēng)險(xiǎn)，推薦使用阿司匹林進(jìn)行中風(fēng)預(yù) 防。
由于突發(fā)性心房纖顫的本質(zhì)，它可能非常難以診斷。當(dāng)患者由于 疾病相關(guān)的癥狀例如心悸、胸痛、呼吸短促、眩暈、心衰、暫時(shí)性缺 血性發(fā)作或甚至中風(fēng)而尋求醫(yī)學(xué)關(guān)注時(shí)，可能已經(jīng)恢復(fù)到正常的心臟 節(jié)律，從而妨礙了心律不齊的診斷。在這些情況中，頻繁實(shí)施心律監(jiān)
控以診斷病癥。心律通常被連續(xù)監(jiān)測(cè)24到48小時(shí)。不幸的是，心房
纖顫的發(fā)作時(shí)無(wú)法預(yù)料的，使用這種方法經(jīng)常會(huì)錯(cuò)過(guò)。診斷心律不齊、 建立推薦的療法、以及可能防止使人衰弱的第一次或復(fù)發(fā)的中風(fēng)的機(jī) 會(huì)，可能被錯(cuò)過(guò)，導(dǎo)致對(duì)病人的毀滅性結(jié)果。當(dāng)對(duì)心房纖顫的懷疑非 常強(qiáng)時(shí)，有時(shí)可以獲得并使用延長(zhǎng)的和更復(fù)雜的心律監(jiān)測(cè)測(cè)量。這些 測(cè)試是昂貴的，使用現(xiàn)有方法的診斷率通常較低，它們被零散地用于 這種指征。在這些情況下，使用遺傳測(cè)試的其它風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)作用可能是 極其有用的。了解所述個(gè)體攜帶有風(fēng)險(xiǎn)還是保護(hù)性遺傳變體，對(duì)于診 斷和/或治療決定的做出可能是無(wú)法估價(jià)的貢獻(xiàn)。在某些情況下，這種 方式可以避免不必需的測(cè)試和治療，在其它情況下，在更具攻擊性的 診斷方法的幫助下，心律不齊可以被診斷，和/或可以開(kāi)始適當(dāng)?shù)闹委煟?從而消除了后來(lái)的疾病的并發(fā)癥。
發(fā)明方法
在這里描述了對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng) 進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，這些方法包含在本發(fā)明中。本發(fā)明還包含了評(píng) 估個(gè)體對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的治療藥劑 發(fā)生反應(yīng)的可能性的方法，以及用于預(yù)測(cè)治療藥劑對(duì)治療患者心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的有效性的方法。本發(fā)明還
63包含了用于分析來(lái)自對(duì)象的樣品、以檢測(cè)對(duì)心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性的試劑盒。
本發(fā)明的診斷和篩選分析方法
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了通過(guò)檢測(cè)在心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)對(duì)象、或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或 心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感的對(duì)象中出現(xiàn)得更頻繁的遺傳標(biāo)記物的特定 等位基因，來(lái)診斷、或幫助診斷心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感性 的方法。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明是通過(guò)檢測(cè)至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記 物(例如本文描述的標(biāo)記物)的至少一個(gè)等位基因，來(lái)診斷對(duì)心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性的方法。通過(guò)本發(fā) 明描述的方法，特定標(biāo)記物的特定等位基因或單倍型的檢測(cè)，是對(duì)心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感性的指示。這樣的 預(yù)后或預(yù)測(cè)分析也可用于在心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/ 或中風(fēng)的癥狀發(fā)作之前，確定對(duì)象的預(yù)防性治療。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了診斷、例如由專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)人員執(zhí) 行的診斷的臨床應(yīng)用的方法，該方法可以包括評(píng)估或確定遺傳風(fēng)險(xiǎn)變 體及其說(shuō)明。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了由外行人或非專(zhuān)業(yè)醫(yī) 務(wù)人員執(zhí)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(或診斷)的方法。基因分型技術(shù)中的最新技
術(shù)進(jìn)展，包括SNP標(biāo)記物的高通量基因分型、例如分子倒置探針陣列 技術(shù)(例如Affymetrix GeneChip)禾口 BeadArray技術(shù)(例如Illumina GoldenGate和Infmium分析)，已經(jīng)使個(gè)體對(duì)他們自己的基因組的大量 變體、或多達(dá)一百萬(wàn)個(gè)SNPs同時(shí)進(jìn)行評(píng)估成為可能。得到的對(duì)個(gè)體可 用的基因型信息，可以與來(lái)自公開(kāi)的科學(xué)文獻(xiàn)的關(guān)于與各種SNPs有關(guān) 的疾病或性狀風(fēng)險(xiǎn)的信息相比較。因此，本文描述的與疾病相關(guān)的等 位基因的診斷應(yīng)用，可以由健康專(zhuān)業(yè)人員根據(jù)臨床測(cè)試的結(jié)果來(lái)進(jìn)行， 也可以由外行人或非專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)人員，包括通過(guò)SNP基因分型為執(zhí)行 SNPs的評(píng)估提供服務(wù)的個(gè)體，在個(gè)體SNP的基礎(chǔ)上或通過(guò)大規(guī)模的高通量的方法、例如陣列技術(shù)來(lái)進(jìn)行。換句話說(shuō)，根據(jù)遺傳風(fēng)險(xiǎn)對(duì)易感 性進(jìn)行的診斷或評(píng)估，可以由健康專(zhuān)業(yè)人員、遺傳顧問(wèn)、基因分型服 務(wù)提供者或外行人，根據(jù)他/她的基因型的信息以及關(guān)于各種不同風(fēng)險(xiǎn) 因子的出版物，來(lái)做出。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"診斷"和"診 斷易感性"，意指任何可用的診斷方法，包括上面提到的診斷方法。
此外，在某些其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)在心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)患者中比在沒(méi)有診斷出心律 不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的個(gè)體中或總?cè)巳褐谐霈F(xiàn) 頻率低的特定遺傳標(biāo)記物等位基因或單倍型，來(lái)診斷或幫助診斷對(duì)心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾卩/或中風(fēng)的降低的易感性的方法。
正如本文所述和示例的，特定的標(biāo)記物等位基因或單倍型(例如
在表5(表5A和5B)中列出的標(biāo)記物和單倍型，以及與其連鎖不平衡 的標(biāo)記物，例如在表4和/或9中列出的標(biāo)記物以及與其連鎖不平衡的 標(biāo)記物，例如表19中顯示的標(biāo)記物)與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物等位基因或單倍 型是賦予了對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的顯著 風(fēng)險(xiǎn)或易感性的標(biāo)記物等位基因或單倍型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及了在人類(lèi)個(gè)體中診斷對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)的易感性的方法，方法包括在從個(gè)體獲得的核酸樣品中確定 至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，其中至 少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物選自表5A和表5B中列出的多態(tài)性標(biāo)記物，以及 與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)篩 選在表5A和5B中列出的至少一個(gè)標(biāo)記物等位基因或單倍型、或與其 連鎖不平衡的標(biāo)記物，在人類(lèi)個(gè)體中診斷心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物 等位基因或單倍型在患有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或 中風(fēng)或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感的對(duì)象 (受影響的)中出現(xiàn)的頻率，與它在健康的對(duì)象(對(duì)照，例如群體對(duì)照)中出現(xiàn)的頻率相比，更高。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物 等位基因或單倍型的關(guān)聯(lián)性的顯著性的特征為p-值〈0.05。在其它實(shí)施 方案中，關(guān)聯(lián)性的顯著性的特征為p-值更小，例如<0.01、 <0.001、 <0.0001 、 <0.00001 、 <0.000001 、 <0.0000001 、 <0細(xì)00001 或 <0.000000001。
在這些實(shí)施方案中，至少一個(gè)標(biāo)記物等位基因或單倍型的存在是 對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾p/或中風(fēng)的易感性的指示。 這些診斷方法包括檢測(cè)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或 中風(fēng)有關(guān)的至少一個(gè)標(biāo)記物等位基因或單倍型的存在或不存在。本文
描述的單倍型包括各種不同遺傳標(biāo)記物(例如SNPs、微衛(wèi)星)的等位
基因的組合。構(gòu)成特定單倍型的特定遺傳標(biāo)記物等位基因的檢測(cè)，可 以通過(guò)本文描述的和/或本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種不同方法來(lái)進(jìn)行。例如， 遺傳標(biāo)記物可以在核酸水平上(例如通過(guò)直接的核苷酸測(cè)序或通過(guò)其 它本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員已知的方法)檢測(cè)，也可以在氨基酸水平上 檢測(cè)，如果遺傳標(biāo)記物影響了由心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)相關(guān)核酸編碼的蛋白的編碼序列的話(例如，通過(guò)蛋白測(cè)序 或通過(guò)使用識(shí)別這樣的蛋白的抗體的免疫分析)。本發(fā)明的標(biāo)記物等 位基因或單倍型對(duì)應(yīng)于與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或
中風(fēng)有關(guān)的基因組DNA序列的片段。這樣的片段含有所述的多態(tài)性標(biāo) 記物或單倍型的DNA序列，但是也可以含有與標(biāo)記物或單倍型強(qiáng)烈 LD(連鎖不平衡)的DNA區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的區(qū)段含有 由 一值大于0.2和/或ID'l > 0.8所確定的與標(biāo)記物或單倍型連鎖不平衡 的區(qū)段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/ 或中風(fēng)的易感性的診斷可以使用雜交方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如Southern分析、 Northern分析、和/或原位雜交(參見(jiàn)《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) , Ausubel， F.等主編， John Wiley & Sons,包括所有附錄)。來(lái)自測(cè)試對(duì)象或個(gè)體的基因組DNA、 RNA或CDNA生物樣品("測(cè)試樣品")是從懷疑患有心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)、對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾口/ 或中風(fēng)易感或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有傾 向性的對(duì)象("測(cè)試對(duì)象")獲得的。對(duì)象可以是成年人、兒童或胎兒。
測(cè)試樣品可以來(lái)自于任何含有基因組DNA的來(lái)源，例如血液樣品、羊
水樣品、腦脊液樣品、或來(lái)自皮膚、肌肉、口腔或結(jié)膜粘膜、胎盤(pán)、
胃腸道或其它器官的組織樣品。來(lái)自胚胎細(xì)胞或組織的DNA測(cè)試樣品 可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得，例如通過(guò)羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜絨毛取樣。 然后檢測(cè)DNA、 RNA或cDNA樣品。特定標(biāo)記物等位基因的存在可以 通過(guò)特異性針對(duì)特定等位基因的核酸探針的序列特異性雜交來(lái)指示。 一種以上特定標(biāo)記物等位基因或特定單倍型的存在，可以通過(guò)使用幾 種序列特異性核酸探針來(lái)指示，每種探針特異性針對(duì)特定等位基因。 在一個(gè)實(shí)施方案中，單倍型可以通過(guò)特異性針對(duì)特定單倍型的(即與 含有單倍型特征性的特定標(biāo)記物等位基因的DNA鏈特異性雜交的)單 一核酸探針來(lái)指示。序列特異性探針可以被導(dǎo)向以與基因組DNA、RNA 或cDNA雜交。本文使用的"核酸探針"可以是與互補(bǔ)序列雜交的DNA 探針或RNA探針。本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員將了解如何設(shè)計(jì)這樣的探針， 使得只有在測(cè)試樣品的基因組序列中存在特定等位基因時(shí)，才發(fā)生序 列特異性雜交。
為了診斷對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾P/或中風(fēng)的易 感性，通過(guò)將含有與心房纖顫和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸的測(cè)試樣品、例如 基因組DNA樣品，與至少一種核酸探針相接觸來(lái)形成雜交樣品。用于 檢測(cè)mRNA或基因組DNA的探針的非限制性例子是能夠與本文描述 的mRNA或基因組DNA序列雜交的標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以 是例如全長(zhǎng)的核酸分子或其一部分，例如長(zhǎng)度為至少15、 30、 50、 100、 250或500個(gè)核苷酸、在嚴(yán)緊條件下足以與適當(dāng)?shù)膍RNA或基因組DNA 特異性雜交的寡核苷酸。核苷酸探針的長(zhǎng)度可以多達(dá)IOOO個(gè)或以上的 核苷酸，包括多達(dá)500個(gè)核苷酸、400個(gè)核苷酸、300個(gè)核苷酸、200 個(gè)核苷酸或100個(gè)核苷酸。某些實(shí)施方案包含了長(zhǎng)度為15到1000個(gè)核苷酸的核苷酸探針。其它的實(shí)施方案涉及長(zhǎng)度為15到500個(gè)核苷酸、
或長(zhǎng)度為15到400個(gè)核苷酸、或長(zhǎng)度為20到400個(gè)核苷酸的核苷酸 探針的使用。本發(fā)明的核苷酸探針的其它大小范圍也被考慮到了，正 如專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員所熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可以包含本 文描述的LD區(qū)塊C04的核苷酸序列的全部或一部分，可選地含有本 文描述的標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因，或本文描述的至少一個(gè)單倍型， 或者探針可以是與這樣的序列互補(bǔ)的序列。在特定的實(shí)施方案中，核 酸探針是本文描述的SEQ ID NO: 50中顯示的LD區(qū)塊C04的核苷酸序 列的一部分，可選地含有本文描述的標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因，或 一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因或包含本文描述的至少一個(gè)多 態(tài)性標(biāo)記物的單倍型，或者探針可以是這樣的序列的互補(bǔ)序列。其它 適合用于本發(fā)明的診斷分析的探針在本文中進(jìn)行了描述。雜交可以通 過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員熟知的方法來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué) 現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) ， Ausubel, F.等主 編，John Wiley & Sons,包括所有附錄)。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交是 指特異性雜交，即沒(méi)有錯(cuò)配的雜交(精確雜交)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 特異性雜交的雜交條件是高度嚴(yán)緊的。
特異性雜交、如果存在的話，使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)檢測(cè)。如果在核酸 探針與測(cè)試樣品的核酸之間發(fā)生了特異性雜交，那么樣品含有與核酸 探針中存在的核苷酸互補(bǔ)的等位基因。對(duì)于本發(fā)明的任何標(biāo)記物、或 構(gòu)成本發(fā)明的單倍型的標(biāo)記物可以重復(fù)這個(gè)過(guò)程，或者可以同時(shí)使用 多個(gè)探針在同一時(shí)間檢測(cè)一個(gè)以上的標(biāo)記物等位基因。設(shè)計(jì)含有一個(gè) 以上特定單倍型的標(biāo)記物等位基因的單個(gè)探針(例如探針含有與構(gòu)成 特定單倍型的2、 3、 4、 5個(gè)或所有標(biāo)記物互補(bǔ)的等位基因)，也是可 能的。樣品中單倍型的特定標(biāo)記物的檢測(cè)表明樣品源具有特定單倍型 (例如單倍型)，因此對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))禾P/或中 風(fēng)易感。
在另一種雜交方法中，Northern分析(參見(jiàn)《分子生物學(xué)現(xiàn)代方
68法》 (Current Protocols in Molecular Biology) , Ausubel, F.等主編，John Wiley & Sons，同上)被用于鑒定與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)相關(guān)的多態(tài)性的存在。對(duì)于Northern分析來(lái)說(shuō)，RNA測(cè)試樣 品通過(guò)適合的方法從對(duì)象獲得。如本文所述，核酸探針與來(lái)自對(duì)象的 RNA的特異性雜交表明了特定等位基因與探針互補(bǔ)。關(guān)于核酸探針的 使用的代表性的例子，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5,288,611和4,851,330。
此外或可選地，在本文描述的雜交方法中，可以在核酸探針以外 或代替核酸探針而使用肽核酸(PNA)探針。PNA是DNA模擬物，具 有類(lèi)似肽的無(wú)機(jī)骨架例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單位，以及通過(guò)亞甲基 羰基鍵連接到甘氨酸的氮上的有機(jī)堿基(A、 G、 C、 T或U)(參見(jiàn)例 如Nielsen, P.等，S/oco")wg, C&m. 5:3-7 (1994)) 。 PNA探針可以被設(shè) 計(jì)成與懷疑含有一個(gè)或多個(gè)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)相關(guān)的標(biāo)記物等位基因或單倍型的樣品中的分子特異性雜 交。因此，PNA探針的雜交可用于診斷心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中 風(fēng)的易感性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，收集從對(duì)象獲得含有基因組DNA的 測(cè)試樣品，并可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā) 明的標(biāo)記物或單倍型的片段。如本文所述，與心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的特定標(biāo)記物等位基因或單倍型的鑒定， 可以使用各種不同的方法來(lái)進(jìn)行(例如序列分析、限制性消化分析、 特異性雜交、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、電泳分析等)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，診斷通過(guò)使用定量PCR (動(dòng)力學(xué)熱循環(huán))進(jìn)行表達(dá)分析 來(lái)實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)可以使用例如商業(yè)化的技術(shù)，例如TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA)。該技術(shù)可以評(píng)估由與心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽或剪接變體的表達(dá) 或組成中的變化的存在。此外，變體的表達(dá)可以作為物理上或功能上 的差異進(jìn)行定量。在本發(fā)明的另一個(gè)方法中，通過(guò)限制性消化進(jìn)行的分析可用于檢 測(cè)特定的等位基因，如果等位基因?qū)е孪鄬?duì)于參比序列來(lái)說(shuō)產(chǎn)生或消 除了限制性位點(diǎn)的話?？梢赃M(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，
例如按照《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology,局匸上)中的描述來(lái)進(jìn)行。相關(guān)DNA片段的消化圖譜表明了樣 品中特定等位基因的存在或不存在。
序列分析也可用于檢測(cè)與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)相關(guān)的特定等位基因或單倍型(例如表5 (表5A和5B)、表 9和/或表19的多態(tài)性標(biāo)記物)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，特定標(biāo)記 物等位基因或單倍型的存在或不存在的確定，包括了從對(duì)象或個(gè)體獲 得的DNA或RNA的測(cè)試樣品的序列分析?？梢允褂肞CR或其它適合 的方法擴(kuò)增與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的 核酸的一部分，然后可以通過(guò)對(duì)樣品中基因組DNA的多態(tài)性位點(diǎn)(或 單倍型中的多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn))進(jìn)行測(cè)序，來(lái)直接檢測(cè)特定等位基因的 存在。
通過(guò)使用擴(kuò)增的寡核苷酸與等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探 針的斑點(diǎn)印跡雜交(參見(jiàn)例如Saiki， R.等，A^ w"， 324:163-166 (1986))， 等位基因特異性寡核苷酸也可用于檢測(cè)與心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸中特定等位基因的存在(例如表5 (表 5A和5B)、表9和/或表19的多態(tài)性標(biāo)記物)。"等位基因特異性寡核 苷酸"(在本文中也稱(chēng)為"等位基因特異性寡核苷酸探針")是大約 10-500個(gè)堿基對(duì)、大約15-400個(gè)堿基對(duì)、大約15-200個(gè)堿基對(duì)、大約 15-100個(gè)堿基對(duì)、大約15-50個(gè)堿基對(duì)、或大約15-30個(gè)堿基對(duì)的寡核 苷酸，與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸 特異性雜交，并在多態(tài)性位點(diǎn)上含有特定等位基因(例如本文描述的 標(biāo)記物或單倍型)。特異性針對(duì)一個(gè)或多個(gè)特定的與心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸的等位基因特異性寡核苷酸探針，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)制備(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，
(Current Protocols in Molecular Biology), /^J:)?？梢允褂肞CR來(lái)擴(kuò) 增所需區(qū)域。含有擴(kuò)增的區(qū)域的DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行斑點(diǎn)印跡
(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，(Current Protocols in Molecular Biology),廚J:)，并將印跡與寡核苷酸探針相接觸。然后可以檢測(cè)探 針與擴(kuò)增區(qū)域的特異性雜交的存在。等位基因特異性寡核苷酸探針與 來(lái)自對(duì)象的DNA的特異性雜交，是與心律不齊(例如心房纖顫或心房 撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)上特定等位基因的指示(參見(jiàn)例如 Gibbs, R.等，iVwc/e/c^c/^si 仏，〃:2437-2448 (1989)和WO 93/22456)。
通過(guò)加入類(lèi)似物例如鎖核酸(LNAs)，引物和探針的大小可以被 減小到8個(gè)堿基。LNAs是一類(lèi)新的雙環(huán)狀DNA類(lèi)似物，其中呋喃糖 環(huán)中的2'和4'位置通過(guò)O-亞甲基(氧-LNA)、 S-亞甲基(硫-LNA)或 氨基亞甲基(氨基-LNA)基團(tuán)相連接。所有這些LNA變體的共同之處 是與互補(bǔ)核酸的親和性，到目前為止在DNA類(lèi)似物中是被報(bào)道的最高 的。例如特別是所有的氧-LNA九聚體當(dāng)與互補(bǔ)的DNA或RNA復(fù)合時(shí)， 熔點(diǎn)溫度(Tm)分別為64。C和74。C，相反，對(duì)應(yīng)的DNA九聚體與DNA 和RNA的熔點(diǎn)溫度均為28°C。當(dāng)LNA單體與標(biāo)準(zhǔn)的DNA或RNA的 單體組合使用時(shí)，也可以獲得Tm的顯著增加。對(duì)于引物和探針來(lái)說(shuō)， 取決于含有LNA單體的位置(例如在3'末端、5'末端、或在中間)，Tm 可以得到相當(dāng)大的提高。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，與來(lái)自對(duì)象的靶核酸序列區(qū)段互補(bǔ)的寡核 苷酸探針的陣列，可用于在與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸(例如表5A和5B的多態(tài)性標(biāo)記物以及與其連鎖 不平衡的標(biāo)記物)中鑒定多態(tài)性。例如，可以使用寡核苷酸陣列。寡 核苷酸陣列典型地包含多個(gè)連接到基質(zhì)表面上不同已知位置上的不同 的寡核苷酸探針。這些寡核苷酸陣列、也被稱(chēng)為"基因芯片" (Genechips ),在本技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)廣泛描述過(guò)了 (參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān) 利No. 5,143,854、 PCT專(zhuān)利公開(kāi)Nos. WO 90/15070和92/10092)。 一般來(lái)說(shuō)，這些陣列可以使用機(jī)械合成方法或組合了光蝕刻方法和固相 寡核苷酸合成方法的光指導(dǎo)的合成方法，或通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人
員已知的其它方法來(lái)生產(chǎn)(參見(jiàn)例如Fodor, S.等，S"'e"ce, Z5/:767-773 (1991); Pirrung等，美國(guó)專(zhuān)利No.5,143,854 (也參見(jiàn)已出版的PCT申 請(qǐng)No. WO 90/15070);和Fodor. S.等，已出版的PCT申請(qǐng)No. WO 92/10092和美國(guó)專(zhuān)利No. 5,424,186，每個(gè)文件的全部教導(dǎo)在此引為參 考)。使用機(jī)械合成方法合成這些陣列的技術(shù)描述在例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5,384,261中，其全部教導(dǎo)在此引為參考。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以 使用線性陣列。關(guān)于使用寡核苷酸陣列檢測(cè)多態(tài)性的其它描述可以在 例如美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5,858,659和5,837,832中發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)專(zhuān)利的全部 教導(dǎo)在此以其全文引為參考。
本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員可以獲得的其它核酸分析方法可用于檢測(cè) 與心房纖顫和/或中風(fēng)相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)中的特定等位基因(例如表5 (表5A和5B)、表9和/或表19的多態(tài)性標(biāo)記物)。代表性的方法包括 例如直接手動(dòng)測(cè)序(Church和Gilbert,尸rac.胸/.爿c^/.園'W: 1991-1995 (1988); Sanger, F.等，iVoc.胸/.」cad "&4' 7￥:5463-5467
(1977) ; Beavis等，美國(guó)專(zhuān)利No. 5,288,644);自動(dòng)化熒光測(cè)序；單鏈 構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP);均一變性凝膠電泳(CDGE);變性梯度凝 膠電泳(DGGE) ( Sheffield, V.等，/Voc. A^". Jcad Sc/. S6:232-236 (1989));遷移率變動(dòng)分析(Orita, M.等，Prac. Zc"d Sc/. 敝2766-2770 (1989));限制性酶分析(Flavell, R.等，Ce〃， 15:25-41
(1978) ; Geever, R.等；iVoc, A^/.爿cac/. Sc/, L^i 7&5081-5085 (1981)); 異源雙鏈分析；化學(xué)錯(cuò)配裂解(CMC) (Cotton, R.等，尸亂淑"cad
園,S5:4397-4401 (1985)); RNase保護(hù)分析(Myers， R.等，5W眞e, 230:1242-1246 (1985));使用識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的多肽例如大腸桿菌mutS 蛋白；以及等位基因特異性PCR。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性的診斷，在本發(fā)明的遺傳標(biāo)記物或單倍型導(dǎo)致了多肽的組 成或表達(dá)發(fā)生改變的情況下，可以通過(guò)檢査與心律不齊(例如心房纖 顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽的表達(dá)和/或組成來(lái)進(jìn) 行。因此，對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感性 的診斷，在本發(fā)明的遺傳標(biāo)記物或單倍型導(dǎo)致了多肽的組成或表達(dá)發(fā) 生改變的情況下，可以通過(guò)檢測(cè)這些多肽中的一個(gè)、或與心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的另一個(gè)多肽的表 達(dá)和/或組成來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的顯示出與心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的關(guān)聯(lián)性的單倍型和標(biāo)記物，可能通過(guò)它們對(duì)這些 鄰近基因中的一個(gè)或多個(gè)(例如尸/7X2基因)的影響來(lái)發(fā)揮作用。影
響這些基因的可能機(jī)制包括例如影響轉(zhuǎn)錄、影響RNA剪接、改變mRNA 可選剪接形式的相對(duì)量、影響RNA穩(wěn)定性、影響從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的 運(yùn)輸、以及影響翻譯的效率和精確性。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的顯示出與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的相關(guān)性的變體(標(biāo)記物或單倍型)， 影響了鄰近基因的表達(dá)。眾所周知，影響基因表達(dá)的調(diào)控元件可以位 于與基因的啟動(dòng)子區(qū)域相距幾十或幾百kb的位置。因此，通過(guò)分析本 發(fā)明的至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在， 評(píng)估這樣的鄰近基因的表達(dá)水平是可能的。因此設(shè)想，本發(fā)明的標(biāo)記 物或單倍型的檢測(cè)，可用于評(píng)估與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
各種不同的方法可用于檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，包括酶聯(lián)免疫吸附分 析(ELISA)、 Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。評(píng)估了來(lái)自對(duì)象的 測(cè)試樣品中由與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān) 的核酸編碼的多肽在表達(dá)中的變化和/或組成中的變化的存在。由與心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽 在表達(dá)中的變化可以是例如定量的多肽表達(dá)(即產(chǎn)生的多肽的量)的 變化。由與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽的組成的變化是定性的多肽表達(dá)(例如突變體多肽的表 達(dá)或不同剪接變體的表達(dá))的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)心律不齊 (例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感性的診斷，通過(guò)檢測(cè)由與 心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的特
定剪接變體或剪接變體的特定圖譜來(lái)進(jìn)行。
也可以同時(shí)存在這兩種變化(定量的和定性的)。本文中使用的多 肽表達(dá)或組成中的"變化"，是指測(cè)試樣品中多肽的表達(dá)或組成、與對(duì) 照樣品中多肽的表達(dá)或組成相比的變化。對(duì)照樣品是與測(cè)試樣品相應(yīng) 的樣品(例如來(lái)自于同樣類(lèi)型的細(xì)胞)，來(lái)自于沒(méi)有感染心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)、和/或不具有對(duì)心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)易感性的對(duì)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì) 照樣品來(lái)自于不具有本文描述的標(biāo)記物等位基因或單倍型的對(duì)象。同 樣地，與對(duì)照樣品相比，測(cè)試樣品中一個(gè)或多個(gè)不同剪接變體的存在， 或測(cè)試樣品中明顯不同量的不同剪接變體的存在，可以表明對(duì)心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性。在等位基因相對(duì) 于對(duì)照樣品中的參比改變了剪接位點(diǎn)的情況下，與對(duì)照樣品相比，測(cè) 試樣品中多肽的表達(dá)或組成的變化可以指示特定的等位基因。用于檢 測(cè)核酸編碼的多肽的表達(dá)和組成的各種不同的方法對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的 專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并且都可以使用，包括光譜法、比色法、電
泳、等電聚焦和免疫分析(例如David等，美國(guó)專(zhuān)利No. 4,376,110)例 如免疫印跡(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，(Current Protocols in Molecular Biology),特別是第10章，y^J:)。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用能夠與心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽結(jié)合的抗體(例如 具有可檢測(cè)標(biāo)記的抗體)。抗體可以是多克隆的，也可以是單克隆的。 可以使用完整的抗體，也可以使用其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2)。 對(duì)于探針或抗體來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記的"意指包含了通過(guò)將可檢測(cè)物質(zhì) 連接(即物理連接)到探針或抗體上以對(duì)探針或抗體直接標(biāo)記，以及
74通過(guò)與被直接標(biāo)記的另一種試劑進(jìn)行反應(yīng)而對(duì)探針或抗體的間接標(biāo) 記。間接標(biāo)記的例子包括使用標(biāo)記的第二抗體(例如熒光標(biāo)記的第二 抗體)檢測(cè)第一抗體，以及用生物素對(duì)DNA探針進(jìn)行末端標(biāo)記，以便 可以使用熒光標(biāo)記的鏈親和素來(lái)檢測(cè)它。
在這種方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將測(cè)試樣品中與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的核酸編碼的多肽的水平或量， 與對(duì)照樣品中多肽的水平或量進(jìn)行比較。測(cè)試樣品中多肽的水平或量 高于或低于對(duì)照樣品中多肽的水平或量，使得差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著， 表明了核酸編碼的多肽的表達(dá)發(fā)生了變化，并且診斷了負(fù)責(zé)引起表達(dá) 差異的特定等位基因或單倍型。可選地，將測(cè)試樣品中多肽的組成與 對(duì)照樣品中多肽的組成進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)測(cè)試 樣品和對(duì)照樣品中的多肽的水平或量以及組成二者都進(jìn)行評(píng)估。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng)) 和/或中風(fēng)的易感性的診斷，通過(guò)檢測(cè)至少一個(gè)本發(fā)明的標(biāo)記物或單倍
型(例如與表5A和5B中列出的標(biāo)記物以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物 相關(guān)的等位基因)，以及與其它基于蛋白的、基于RNA的或基于DNA 的分析方法相結(jié)合來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的方法也可以與對(duì)象的家族史和風(fēng) 險(xiǎn)因子(例如環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子、生活方式風(fēng)險(xiǎn)因子)的分析組合起來(lái)使 用。
試微
用于本發(fā)明的方法和步驟的試劑盒包含可用于本文描述的任何方 法的組分，包括例如雜交探針，限制性酶(例如用于RFLP分析)，等 位基因特異性寡核苷酸，與本文描述的本發(fā)明的核酸(例如含有至少 一個(gè)本發(fā)明的多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型的基因組區(qū)段)編碼的改變的 多肽、或本文描述的本發(fā)明的核酸編碼的未改變的(天然)多肽結(jié)合 的抗體，用于擴(kuò)增與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng) 有關(guān)的核酸的手段，用于分析與心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的核酸的核酸序列的手段，用于分析與心律不齊(例如 心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的核酸編碼的多肽的氨基酸序列 的手段，等。試劑盒可以包含例如必需的緩沖液、用于擴(kuò)增本發(fā)明的 核酸(例如本文描述的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物)的核酸引物、以及 使用這些引物對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行等位基因特異性檢測(cè)的試劑和必需的 酶(例如DNA聚合酶)。此外，試劑盒可以提供與本發(fā)明的方法組合 使用的分析方法的試劑，例如用于心律不齊(例如心房纖顫或心房撲 動(dòng))和/或中風(fēng)的診斷分析方法的試劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于分析從對(duì)象獲得的樣品、以在 對(duì)象中檢測(cè)心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的存在、 或?qū)π穆刹积R(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的易感性，其中 試劑盒含有在個(gè)體的基因組中選擇性檢測(cè)本發(fā)明的至少一個(gè)多態(tài)性的 至少一個(gè)等位基因所需的試劑。在特定的實(shí)施方案中，試劑含有與個(gè) 體的基因組中含有至少一個(gè)本發(fā)明的多態(tài)性的片段雜交的至少一個(gè)連 續(xù)的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑含有至少一對(duì)與從對(duì)象獲 得的基因組區(qū)段的相反鏈雜交的寡核苷酸，其中每個(gè)寡核苷酸引物對(duì) 被設(shè)計(jì)成選擇性擴(kuò)增個(gè)體的基因組中含有至少一個(gè)多態(tài)性的片段，其
中多態(tài)性選自表5A和5B中列出的多態(tài)性，以及與其連鎖不平衡的多 態(tài)性標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段的大小為至少20個(gè)堿基對(duì)。 這樣的寡核苷酸或核酸(例如寡核苷酸引物)可以使用表明了心律不 齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的多態(tài)性(例如SNPs或微 衛(wèi)星)兩側(cè)的核酸序列的部分來(lái)設(shè)計(jì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒 含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的核酸，能夠?qū)εc心律不齊(例如心房纖顫或心 房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)特定多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型進(jìn)行 等位基因特異性檢測(cè)，以及用于檢測(cè)標(biāo)記的試劑。適合的標(biāo)記包括例 如放射性同位素、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、酶輔助因子標(biāo)記、磁性標(biāo)記、 自旋標(biāo)記、表位標(biāo)記。
在特定實(shí)施方案中，通過(guò)試劑盒的試劑檢測(cè)的多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型包含一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)記物、兩個(gè)或兩個(gè)以上標(biāo)記物、三個(gè)或三 個(gè)以上標(biāo)記物、四個(gè)或四個(gè)以上標(biāo)記物或五個(gè)或五個(gè)以上標(biāo)記物，標(biāo)
記物選自表5A和5B中顯示的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè) 的標(biāo)記物或單倍型包含表5A和5B中顯示的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，被檢測(cè)的標(biāo)記物或單倍型包括表4和9中列出的標(biāo)記物。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的標(biāo)記物或單倍型包括與含有表5A和5B中 列出的標(biāo)記物的組中的至少一個(gè)標(biāo)記物強(qiáng)烈連鎖不平衡的標(biāo)記物組中 的至少一個(gè)標(biāo)記物，其中強(qiáng)烈連鎖不平衡由1"2的值大于0.2所定義。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的標(biāo)記物或單倍型包括與含有表4和9中 列出的標(biāo)記物的組中的至少一個(gè)標(biāo)記物強(qiáng)烈連鎖不平衡的標(biāo)記物組中 的至少一個(gè)標(biāo)記物，其中強(qiáng)烈連鎖不平衡由一的值大于0.2所定義。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的標(biāo)記物或單倍型含有標(biāo)記物rs2220427 (SEQ ID NO: 1)或標(biāo)記物rsl033464 (SEQ ID NO:41)，或與其連鎖 不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的標(biāo)記物或單倍型含 有表19中顯示的至少一個(gè)標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的標(biāo) 記物或單倍型含有標(biāo)記物D4S406 (SEQ IDNO:45)、 rs2634073 (SEQ IDNO:33)、 rs2200733 (SEQ ID NO:28)、 rs2220427 (SEQ ID NO: 1)、 rsl0033464 (SEQIDNO:41)和rsl3143308 (SEQ ID NO:51 )，以及與 其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍型含有 標(biāo)記物D4S406的等位基因-2、 -4和/或-8、標(biāo)記物rs2634073的等位基 因A、標(biāo)記物rs2200733的等位基因T、標(biāo)記物rs2220427的等位基因 T、標(biāo)記物rsl0033464的等位基因T、和/或標(biāo)記物rsl3143308的等位 基因G。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，連鎖不平衡由—的值大于0.1所定 義。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，連鎖不平衡由—的值大于0.2所定義。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于檢測(cè)本發(fā)明的標(biāo)記物的試劑盒含有 與含有被檢測(cè)的SNP多態(tài)性的模板DNA區(qū)段雜交的檢測(cè)寡核苷酸探 針，增強(qiáng)子寡核苷酸探針和內(nèi)切核酸酶。正如前面解釋的，檢測(cè)寡核 苷酸探針在其3'末端含有熒光部分或基團(tuán)，在其5'末端含有淬滅劑， 增強(qiáng)子寡核苷酸按照Kutyavin等(M/c/e/c34:el28 (2006))的描述使用。熒光部分可以是Gig Harbor綠或Yakima黃，或其它適合的 熒光基團(tuán)。檢測(cè)探針被設(shè)計(jì)成與含有被檢測(cè)的SNP多態(tài)性的短核苷酸 序列雜交。優(yōu)選情況下，SNP位于從末端殘基到離檢測(cè)探針的3'末端 -6個(gè)殘基之間的任何位置。增強(qiáng)劑是在檢測(cè)探針3'方向上與DNA模板 雜交的短的寡核苷酸探針。探針被設(shè)計(jì)成當(dāng)兩個(gè)探針都與模板結(jié)合時(shí)， 在檢測(cè)探針和增強(qiáng)子核苷酸探針之間存在單個(gè)核苷酸缺口。缺口產(chǎn)生 了合成的脫堿基位點(diǎn)，可以被內(nèi)切核酸酶例如內(nèi)切核酸酶IV識(shí)別。酶 將染料從完全互補(bǔ)的檢測(cè)探針上切下，但是不能裂解含有錯(cuò)配的檢測(cè) 探針。因此，通過(guò)測(cè)量釋放出的熒光部分的熒光，可以對(duì)由檢測(cè)探針 的核苷酸序列定義的特定等位基因的存在進(jìn)行評(píng)估。
檢測(cè)探針可以具有任何適合的大小，盡管優(yōu)選情況下探針相對(duì)較 短。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針的長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，探針長(zhǎng)度為10-50個(gè)核苷酸，在另一個(gè)實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度 為12-30個(gè)核苷酸。其它長(zhǎng)度的探針也是可能的，并在本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān) 業(yè)人員的普通技能的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，含有SNP多態(tài)性的DNA模板在檢測(cè)前通過(guò) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，用于這種擴(kuò)增的引物被包含在試劑盒 中。在這樣的實(shí)施方案中，被擴(kuò)增的DNA被用作檢測(cè)探針和增強(qiáng)子探 針的模板。
在檢測(cè)探針、增強(qiáng)子探針和/或用于通過(guò)PCR擴(kuò)增模板的引物的某 些實(shí)施方案中，包括了使用修飾的堿基，包括修飾的A和修飾的G。 使用修飾的堿基可用于調(diào)整核苷酸分子(探針和/或引物)與模板DNA 的熔點(diǎn)溫度，例如在含有低百分率G或C堿基的區(qū)域中增加熔點(diǎn)溫度， 其中可以使用具有與其互補(bǔ)的T形成三個(gè)氫鍵的能力的修飾的A，或 者用于在含有高百分率G或C堿基的區(qū)域中降低熔點(diǎn)溫度，例如使用 在雙鏈DNA分子中與其互補(bǔ)的C堿基只能形成兩個(gè)氫鍵的修飾的G 堿基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的堿基被用于設(shè)計(jì)檢測(cè)核苷酸探針。
78在這些方法中可以選擇任何專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員已知的修飾堿基，根據(jù)本文 的教導(dǎo)對(duì)適合的堿基進(jìn)行選擇也在專(zhuān)業(yè)人員的能力范圍內(nèi)，已知的堿 基可以從專(zhuān)業(yè)人員已知的商業(yè)來(lái)源獲得。
在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍型的存在是對(duì)心房纖顫 和/或中風(fēng)的易感性(增加的易感性或降低的易感性)的指示。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍型的存在是對(duì)心房纖顫和/或中風(fēng)治療試 劑的反應(yīng)的指示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍型的存在是對(duì) 心房纖顫和/或中風(fēng)預(yù)后的指示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍 型的存在是對(duì)心房纖顫和/或中風(fēng)治療的進(jìn)展的指示。這樣的治療可以 包括外科干預(yù)、藥物治療或通過(guò)其它手段(例如生活方式改變)。
治療藥劑
本發(fā)明的變體(例如本發(fā)明的標(biāo)記物和/或單倍型，例如表5A和 5B和/或表19中列出的標(biāo)記物)可用于鑒定新的心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的治療性靶。例如，含有與心律不齊(例 如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)相關(guān)的變體(標(biāo)記物和/或單倍型) 的基因或與其連鎖不平衡的基因或它們的產(chǎn)物，以及被這些變體基因 或它們的產(chǎn)物直接或間接調(diào)控或與它們相互作用的基因或它們的產(chǎn) 物，可以成為開(kāi)發(fā)治療性藥劑的靶，以治療心律不齊(例如心房纖顫 或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)、或阻止或延遲與心律不齊(例如心房纖顫或 心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的癥狀的出現(xiàn)。治療性藥劑可以含有一種或
多種例如小的非蛋白和非核酸分子、蛋白、肽、蛋白片段、核酸(DNA、 RNA)、 PNA (肽核酸)，或它們的可以調(diào)節(jié)靶基因或它們的基因產(chǎn)物 的功能和/或水平的衍生物或模擬物。
本發(fā)明的核酸和/或變體、或含有它們的互補(bǔ)序列的核酸，可用作 反義構(gòu)建物以控制細(xì)胞、組織或器官中的基因表達(dá)。與反義技術(shù)有關(guān) 的方法對(duì)于專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的，被描述和綜述在《反義 藥物技術(shù)原理，策略與應(yīng)用》(J"^e""Z>Mg 7fec/mo/ogy:/V/"c^/m, flfeg/es, 0""; /7//( 加.0叫Crooke主編，Marcel Dekker Inc., New York
(2001) )中。 一般來(lái)說(shuō)，反義核酸分子被設(shè)計(jì)成與基因表達(dá)的mRNA 的區(qū)域互補(bǔ)，使得反義分子與mRNA雜交，從而阻斷mRNA翻譯成蛋 白。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)，已知有幾類(lèi)反義寡核苷酸，包 括裂解物和阻斷物。前者與靶RNA位點(diǎn)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)核酸酶(例 如RnaseH或Rnase L)，其裂解耙RNA。阻斷物與耙RNA結(jié)合，通過(guò) 對(duì)核糖體進(jìn)行空間位阻來(lái)抑制蛋白的翻譯。阻斷物的例子包括核酸、 嗎啉代化合物、鎖核酸和甲基膦酸酯(Thompson, i>wgZXscoveo; 7bda_y， 7:912-917 (2002))。反義寡核苷酸可直接用作治療性藥劑，也可用于確 定和證實(shí)基因的功能，例如通過(guò)基因敲除或基因擊落實(shí)驗(yàn)。反義技術(shù) 被進(jìn)一步描述在Lavery等，Cwr, O/ /". i>wg D&cov. ￡>eve/. 6:561-569 (2003)， Stephens等，Cwr. C^". Mo/. rAer. 5:118-122 (2003)， Kurreck，
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本文描述的變體可用于選擇和設(shè)計(jì)特異性針對(duì)特定變體的反義試 劑。使用關(guān)于本文描述的變體的信息，可以設(shè)計(jì)出特異性靶向含有本 發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)變體的mRNA分子的反義寡核苷酸或其它反義分 子。通過(guò)這種方式，含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的變體(標(biāo)記物和/或單倍 型)的mRNA分子的表達(dá)可以被抑制或阻斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，反 義分子被設(shè)計(jì)成與耙核酸的特定等位基因形式(即一個(gè)或幾個(gè)變體(等 位基因和/或單倍型))特異性結(jié)合，從而抑制源自于該特定等位基因 或單倍型的產(chǎn)物的翻譯，但是不與靶核酸分子在特定多態(tài)性位點(diǎn)上的 其它或可選的變體結(jié)合。
由于反義分子可用于失活mRNA以便抑制基因表達(dá)，從而抑制蛋 白表達(dá)，因此分子可用于治療疾病或紊亂，例如心律不齊(例如心房 纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)。方法可以包括用含有與mRNA中的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列的核酶進(jìn)行裂解，以減弱mRNA被翻譯 的能力。這樣的mRNA區(qū)域包括例如蛋白編碼區(qū)，特別是對(duì)應(yīng)于蛋白 的催化活性、底物和/或配體結(jié)合位點(diǎn)或其它功能性結(jié)構(gòu)域的蛋白編碼 區(qū)。
自從最初在線蟲(chóng)(C. e/ega似)中發(fā)現(xiàn)以來(lái)(Fire等，A^Zww 391:806-11 (1998))，在最近的十年中，對(duì)RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象的 研究非?；钴S，在近年中，也在積極推行它在治療人類(lèi)疾病中的潛在 應(yīng)用(綜述在Kim & Rossi, jVa&re i ev. 8:173-204 (2007)中)。
RNA干擾(RNAi)，也被稱(chēng)為基因沉默，其基礎(chǔ)是使用雙鏈RNA分子
(dsRNA)關(guān)閉特定的基因。在細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)雙鏈RNA分子(dsRNA) 被細(xì)胞復(fù)合物加工成小干擾RNA (siRNA)。 siRNA指導(dǎo)蛋白-RNA復(fù) 合物耙向耙mRNA上的特定位點(diǎn)，導(dǎo)致mRNA的裂解(Thompson, Z>wg Z)/"ove^7b^^, 7:912-917 (2002))。典型情況下，siRNA分子長(zhǎng)度為大 約20、 21、 22或23個(gè)核苷酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的 核酸分子，以及將那些分子用于RNA干擾，即作為小干擾RNA分子
(siRNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子的長(zhǎng)度為18-26個(gè)核 苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸，更 優(yōu)選長(zhǎng)度為21、 22或23個(gè)核苷酸。
RNAi介導(dǎo)的基因沉默的另一個(gè)途徑源自于內(nèi)源性編碼的原始微 型RNA (pri-miRNA)轉(zhuǎn)錄本，它在細(xì)胞中被加工以產(chǎn)生前體miRNA (pre-miRNA)。這些miRNA分子從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在這里 經(jīng)歷加工以產(chǎn)生成熟的miRNA分子(miRNA)，它們通過(guò)識(shí)別mRNAs 的3'非翻譯區(qū)中的耙位點(diǎn)，然后通過(guò)加工性P-體降解mRNA，來(lái)直接 抑制翻譯(綜述在Kim & Rossi,i ev. 8:173-204 (2007)中)。
RNAi的臨床應(yīng)用包括摻入合成的siRNA雙鏈體，它們優(yōu)選大小 為20-23個(gè)核苷酸，并優(yōu)選具有2個(gè)核苷酸的3'重疊?；虮磉_(dá)的低是通過(guò)耙mRNA的序列特異性設(shè)計(jì)建立起來(lái)的。幾個(gè)用于這種分子
的最適設(shè)計(jì)和合成的商業(yè)化位點(diǎn)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是已 知的。
其它的應(yīng)用提供了較長(zhǎng)的siRNA分子(典型長(zhǎng)度為25-30個(gè)核苷 酸，優(yōu)選為大約27個(gè)核苷酸)，以及小的發(fā)夾RNAs (shRNAs;典型 長(zhǎng)度為大約29個(gè)核苷酸)。后者是天然表達(dá)的，描述在Amarzguioui 等579:5974-81 (2005))中?；瘜W(xué)合成的siRNAs和shRNAs 是體內(nèi)加工的底物，在某些情況下提供了比較短的設(shè)計(jì)更強(qiáng)有力的基 因沉默(Kim等，A^w"歷o&c/mo/. 23:222-226 (2005); Siolas等，M^w" S/o/ec/mo/. 23:227-231 (2005))。 一般來(lái)說(shuō)，siRNAs提供暫時(shí)的基因表 達(dá)沉默，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞內(nèi)濃度被隨后的細(xì)胞分裂稀釋了。相反，表 達(dá)的shRNAs介導(dǎo)長(zhǎng)期的、穩(wěn)定的靶轉(zhuǎn)錄本的降低，只要shRNA的轉(zhuǎn) 錄發(fā)生就行(Marques等，7VWwre歷Wec/7"o/. 23:559-565 (2006); Bmmmelkamp等，296: 550-553 (2002))。
因?yàn)镽NAi分子、包括siRNA、 miRNA和shRNA、以序列依賴(lài)性 的方式起作用，因此本發(fā)明的變體(例如與LD區(qū)塊C04相關(guān)的標(biāo)記 物和單倍型，例如表5A和5B中列出的標(biāo)記物)可用于設(shè)計(jì)RNAi試 劑，它們識(shí)別含有特定等位基因和/或單倍型(例如本發(fā)明的等位基因 和/或單倍型)的特定核酸分子，同時(shí)不識(shí)別含有其它等位基因或單倍 型的核酸分子。因此，這些RNAi試劑可以識(shí)別并破壞靶核酸分子。與 反義試劑相同，RNAi試劑可用作治療性藥劑(即用于關(guān)閉與疾病相關(guān) 的基因或與疾病相關(guān)的基因的變體)，但是也可以用于對(duì)基因功能進(jìn) 行表征和證實(shí)(例如通過(guò)基因敲除或基因擊落實(shí)驗(yàn))。
RNAi的遞送可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員已知的各種方法來(lái) 進(jìn)行。使用非病毒遞送的方法包括膽固醇、穩(wěn)定的核酸-脂類(lèi)顆粒 (SNALP)、重鏈抗體片段(Fab)、適體和納米顆粒。病毒遞送的方 法包括使用慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。在某些實(shí)施方案中，siRNA分子被化學(xué)修飾以增加它們的穩(wěn)定性。這可以包括在核糖的2'位置的
修飾，包括2'-0-甲基嘌呤和2'-氟代嘧啶，它們提供了對(duì)Rnase活性的 抗性。其它的化學(xué)修飾也是可能的，并為本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員所知。
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導(dǎo)致發(fā)生疾病包括心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中 風(fēng)的增加的傾向性或風(fēng)險(xiǎn)的遺傳缺陷、或引起疾病的缺陷，可以通過(guò) 給帶有缺陷的對(duì)象施用含有修復(fù)序列的核酸片段，在遺傳缺陷的位點(diǎn) 處提供正常的/野生型核苷酸，來(lái)永久地校正。這樣的位點(diǎn)特異性修復(fù) 序列可以包含被操作以促進(jìn)對(duì)象的基因組DNA的內(nèi)源修復(fù)的 RNA/DNA寡核苷酸。修復(fù)序列的施用可以通過(guò)適當(dāng)?shù)妮d體來(lái)進(jìn)行，例 如與聚乙烯亞胺復(fù)合、包裹在陰離子脂質(zhì)體中、病毒載體例如腺病毒 載體、或其它適合于促進(jìn)施用的核酸的細(xì)胞內(nèi)攝入的藥物組合物。然 后可以克服遺傳缺陷，因?yàn)榍逗系墓押塑账嵴T導(dǎo)正常的序列整合到對(duì) 象的基因組中，導(dǎo)致正常的/野生型基因產(chǎn)物的表達(dá)。替換是可繁殖的， 因此提供了永久性的修復(fù)和與疾病或病癥有關(guān)的癥狀的緩解。
本發(fā)明提供了鑒定可用于治療心律不齊、例如心房纖顫或心房撲 動(dòng)、和/或中風(fēng)的化合物或藥劑的方法。因此，本發(fā)明的變體可用作鑒
83定和/或開(kāi)發(fā)治療性藥劑的靶。這樣的方法可以包括分析藥劑或化合物 調(diào)節(jié)含有至少一個(gè)本發(fā)明的變體(標(biāo)記物和/或單倍型)的核酸或核酸 編碼的產(chǎn)物的活性和/或表達(dá)的能力。這反過(guò)來(lái)可用于鑒定抑制或改變 編碼的核酸產(chǎn)物的不需要的活性或表達(dá)的藥劑或化合物。用于執(zhí)行這 樣的實(shí)驗(yàn)的分析方法可以在專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員巳知的基于細(xì)胞的系統(tǒng)或無(wú) 細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。基于細(xì)胞的系統(tǒng)包括天然表達(dá)目標(biāo)核酸分子的細(xì)胞， 或已經(jīng)被遺傳修飾以表達(dá)某些所需核酸分子的重組細(xì)胞。
在患者中變體的基因表達(dá)可以通過(guò)含有變體的核酸序列的表達(dá) (例如含有本發(fā)明的至少一個(gè)變體的基因，它可以被轉(zhuǎn)錄成含有至少
一個(gè)變體的RNA，并進(jìn)一步翻譯成蛋白)、或通過(guò)由于變體影響了正常
轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平或圖譜、例如在基因的調(diào)節(jié)或控制區(qū)域中的變體而 導(dǎo)致的正常/野生型核酸序列的改變的表達(dá)，來(lái)進(jìn)行評(píng)估。用于基因表
達(dá)的分析方法包括直接的核酸分析(mRNA)、表達(dá)的蛋白水平的分析、 或參與途徑例如信號(hào)途徑的并行化合物的分析。此外，對(duì)于信號(hào)途徑 作出響應(yīng)而被上調(diào)或下調(diào)的基因的表達(dá)，也可以被分析。 一個(gè)實(shí)施方 案包括了將報(bào)告基因例如熒光素酶與目標(biāo)基因的調(diào)控區(qū)可操作連接。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞與候選化合物或藥劑相接觸，并測(cè)定 mRNA的表達(dá)，可以鑒定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。將存在候選化合物或藥 劑的情況下mRNA的表達(dá)水平與不存在化合物或藥劑的情況下的表達(dá) 水平進(jìn)行比較。根據(jù)這種比較，用于治療疾病例如心房纖顫、心房撲 動(dòng)和中風(fēng)的候選化合物或藥劑可以被鑒定為調(diào)節(jié)變體基因的基因表達(dá) 的化合物或藥劑。當(dāng)在存在候選化合物或藥劑的情況下與不存在它的 情況下相比，mRNA或編碼的蛋白的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地增加時(shí)，候選 化合物或藥劑被鑒定為核酸表達(dá)的刺激劑或上調(diào)物。當(dāng)在存在候選化 合物或藥劑的情況下與不存在它的情況下相比，核酸的表達(dá)或蛋白水 平統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地降低時(shí)，候選化合物被鑒定為核酸表達(dá)的抑制劑或下 調(diào)物。本發(fā)明還提供了使用通過(guò)藥物(化合物和/或藥劑)篩選鑒定到的 化合物作為基因調(diào)節(jié)劑(即基因表達(dá)的刺激劑和/或抑制劑)來(lái)進(jìn)行治 療的方法。
本發(fā)明的另一方面，提供了藥物包(試劑盒)，藥物包包含治療性 藥劑，以及一套本文公開(kāi)的給人類(lèi)施用治療性藥劑以診斷性測(cè)試本發(fā) 明的一種或多種變體的說(shuō)明書(shū)。治療性藥劑可以是小分子藥物、抗體、 肽、反義或RNAi分子，或其它治療性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，被鑒 定為本發(fā)明的至少一種變體的攜帶者的個(gè)體被要求服用處方劑量的治 療性藥劑。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，被鑒定為本發(fā)明的至少一個(gè)變 體的純合的攜帶者的個(gè)體被要求服用處方劑量的治療性藥劑。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，被鑒定為本發(fā)明的至少一個(gè)變體的非攜帶者的個(gè)體被 要求服用處方劑量的治療性藥劑。
伊仿對(duì)潛^性藥淑賄應(yīng)游^虔絲效方法、盧M治^^遂展游方法
正如本技術(shù)領(lǐng)域已知的，個(gè)體對(duì)具體的療法(例如治療性藥劑或 治療方法)可能有不同的響應(yīng)。藥物基因組學(xué)致力于由于藥物特性的 改變和/或藥物作用的異?；蜃兓?，遺傳變異(例如本發(fā)明的變體(標(biāo) 記物和/或單倍型))是如何影響藥物響應(yīng)的問(wèn)題。因此，響應(yīng)差異的基 礎(chǔ)可以部分通過(guò)遺傳學(xué)方法來(lái)確定。由于遺傳變異影響藥物響應(yīng)而產(chǎn) 生的臨床結(jié)果，在某些個(gè)體中(例如本發(fā)明的遺傳變體的攜帶者或非 攜帶者)可能導(dǎo)致藥物的毒性或藥物的治療失敗。因此，本發(fā)明的變 體可以確定治療性藥劑和/或方法作用于身體的方式，或者身體代謝治 療性藥劑的方式。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，多態(tài)性位點(diǎn)上特定等位基因或單倍型 的存在是對(duì)特定治療方式的不同、例如不同響應(yīng)率的指示。這意味著 被診斷患有心律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的患者， 以及攜帶有本發(fā)明的多態(tài)性的某些等位基因或單倍型(例如本發(fā)明的有風(fēng)險(xiǎn)和保護(hù)性等位基因和/或單倍型)的患者，將對(duì)特定的治療、藥 物和/或用于治療疾病的其它療法具有較好的、或較糟的響應(yīng)。因此， 標(biāo)記物等位基因或單倍型的存在或不存在，可以幫助確定對(duì)患者應(yīng)該 使用什么療法。例如，對(duì)于新診斷的患者來(lái)說(shuō)，可以評(píng)估本發(fā)明的標(biāo) 記物或單倍型的存在(例如如本文描述的通過(guò)測(cè)試源自于血液樣品的 DNA)。如果患者對(duì)標(biāo)記物等位基因或單倍型陽(yáng)性(也就是說(shuō)存在標(biāo)記 物的至少一個(gè)特定等位基因或單倍型)，那么醫(yī)生可以推薦一種特定的 療法，而如果患者對(duì)標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因或單倍型陰性，那么 可以推薦不同的療法過(guò)程(可以包括推薦進(jìn)行除了連續(xù)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn) 展之外，不進(jìn)行即時(shí)的療法)。因此，患者的攜帶者狀態(tài)可用于幫助確 定是否應(yīng)該進(jìn)行特定的治療方式。價(jià)值在于能夠在早期階段診斷疾病、 以選擇最適合的療法的可能性，并給臨床醫(yī)生提供關(guān)于疾病的預(yù)后/攻 擊性的信息，以便能夠使用最適合的療法。
心房纖顫和心房撲動(dòng)的治療一般針對(duì)兩個(gè)主要目標(biāo)(i)預(yù)防中 風(fēng)和(ii)治療癥狀。
W相層像
在心房纖顫中，抗血凝是用于預(yù)防中風(fēng)的選擇療法，并被表明適 合于絕大多數(shù)患有這種心律不齊的患者。唯一不強(qiáng)烈推薦使用抗血凝 的患者是年齡小于65歲的被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)的患者，即它們不具有器質(zhì) 性心臟病，沒(méi)有高血壓、沒(méi)有以前的中風(fēng)或暫時(shí)性缺血性發(fā)作史、沒(méi) 有糖尿病。該組總體來(lái)說(shuō)對(duì)中風(fēng)具有較低的風(fēng)險(xiǎn)，推薦使用阿司匹林 進(jìn)行中風(fēng)預(yù)防。對(duì)于所有其它患者來(lái)說(shuō)，不論心房纖顫是永久性的、 復(fù)發(fā)突發(fā)性的還是復(fù)發(fā)永久性的，都建議使用抗血凝療法。不能歸納 出出現(xiàn)首次突發(fā)性心房纖顫的發(fā)作的患者應(yīng)該被如何治療，而是需要 根據(jù)每個(gè)患者的個(gè)人情況來(lái)決定。即使當(dāng)感覺(jué)到患有心房纖顫的患者 在使用抗心律不齊療法(控制節(jié)律)后維持了竇性心律時(shí)，也建議使 用抗血凝療法，因?yàn)檫@種類(lèi)型的抗心律不齊療法不能影響中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。^"逾/凝^/。正如上面詳細(xì)描述的，在心房纖顫中，推薦使用抗血 凝來(lái)預(yù)防心源性腦栓塞和中風(fēng)。研究得最廣泛的口服抗血凝劑是華法 林，這種藥物被普遍推薦用于心房纖顫中的長(zhǎng)期口服抗血凝治療。華 法林除了出血之外幾乎沒(méi)有副作用，但是在療法過(guò)程中需要定期仔細(xì) 地監(jiān)測(cè)血液值(以測(cè)量抗血凝的效果)?？诜寡齽╋@示出在患有心 房纖顫的患者中預(yù)防中風(fēng)的前途，并且具有不需要象華法林那樣定期
監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ximdagatran引起了無(wú)法解釋的肝損傷， 并在2006年從市場(chǎng)上撤回。幾種藥劑可用于靜脈內(nèi)和/或皮下療法，包 括肝素和低分子量肝素(例如依諾肝素、達(dá)肝素、亭扎肝素、阿地肝 素、那屈肝素和瑞肝素)。當(dāng)需要快速起始抗血凝作用，或者如果在高 風(fēng)險(xiǎn)患者中口服抗血凝療法必需被中斷、或者例如由于一系列步驟使 得在其它患者中口服抗血凝療法長(zhǎng)于一周時(shí)，推薦使用這些藥物治療。 其它的腸胃外抗血凝劑也是可用的，但是不特別推薦用在心房纖顫的 療法中；例如因子X(jué)a抑制劑磺達(dá)肝素和艾卓肝素、凝血酶抑制劑 lepimdin、比伐蘆定和阿加曲班以及達(dá)那肝素。
"y #拔控^。用于控制心房纖顫的癥狀的醫(yī)藥和外科療法按照 患者個(gè)體量身定做，包括使用藥物進(jìn)行心率和/或節(jié)律控制、射頻切除 和/或外科手術(shù)。
/力心淳不一齊藥激。 一般來(lái)說(shuō)，抗心律不齊藥劑被用于抑制心臟心 律不齊、包括心房纖顫和心房撲動(dòng)特征性的心臟異常節(jié)律?？剐穆刹?齊藥劑的一種分類(lèi)方法是Vaughan Williams分類(lèi)，其中定義了五種主要 的抗心律不齊藥劑。I類(lèi)藥劑是快速鈉通道阻斷劑，并基于阻斷的動(dòng)力 學(xué)和強(qiáng)度以及他們對(duì)復(fù)極化的影響進(jìn)行亞分類(lèi)。Ia類(lèi)型包括丙吡胺、 莫雷西嗪、普魯卡因胺和奎尼丁。 Ib類(lèi)型的藥劑是利多卡因、美西律、 妥卡尼和苯妥英。Ic類(lèi)型的藥劑是恩卡胺、氟卡胺、普羅帕酮、阿馬 靈、西苯唑啉和地他銨。n類(lèi)型的藥劑是(3阻斷劑，它們阻斷兒茶酚胺 對(duì)p-腎上腺素能受體的效應(yīng)。(3阻斷劑的例子是艾司洛爾、普萘洛爾、 美托洛爾、阿普洛爾、阿替洛爾、卡維地洛、比索洛爾、醋丁洛爾、納多洛爾、心得靜、拉貝洛爾、氧烯洛爾、噴布洛爾、噻嗎洛爾、倍 他洛爾、卡替洛爾、索他洛爾和左旋布諾洛爾。III類(lèi)型的藥劑具有混 合的性質(zhì)，但是總的來(lái)說(shuō)是鉀通道阻斷劑，并延長(zhǎng)復(fù)極化。該類(lèi)型中 的藥物是胺碘酮、阿齊利特、溴芐銨、多非利特、替地沙米、伊布利 特、司美利特、索他洛爾、N-乙酰普魯卡因胺、鹽酸尼非卡蘭、維那 卡蘭和氨巴利特。IV類(lèi)型的藥劑是鈣通道阻斷劑，包括維拉帕米、米 貝拉地爾和地爾硫卓。最后，V類(lèi)型含有混雜的抗心律不齊藥物，包 括地高辛和腺苷。
心率挖虔y。心率控制的維持的藥理學(xué)測(cè)量包括P阻斷劑、鈣通道
阻斷劑和地高辛。所有這些藥物減緩了通過(guò)房室結(jié)的電傳導(dǎo)，并減緩 了心室速率對(duì)快速心房纖顫的反應(yīng)。某些主要用于節(jié)律控制的抗心律
不齊藥物(參見(jiàn)下文)也減緩房室結(jié)傳導(dǎo)速度，因此也減緩了心室的 心率反應(yīng)。這些包括某些III類(lèi)型的和Ic類(lèi)型的藥物，例如胺碘酮、索 他洛爾和氟卡胺。
心i 復(fù)律。從心房纖顫或心房撲動(dòng)的心律復(fù)律到竇性心律，可以 使用同步直流電心臟復(fù)律來(lái)電學(xué)實(shí)現(xiàn)，或使用藥物例如伊布利特、胺 碘酮、普魯卡因胺、普羅帕酮和氟卡胺來(lái)完成。
心靴^
用于維持竇性心律、即心律控制的藥物，主要包括來(lái)自III、 Ia和 Ic類(lèi)型的抗心律不齊藥物例子是來(lái)自III類(lèi)型的索他洛爾、胺碘酮和多 非利特，來(lái)自Ia類(lèi)型的丙吡胺、普魯卡因胺和奎尼丁，以及來(lái)自Ic類(lèi) 型的氟卡胺和普羅帕酮。使用這些抗心律不齊藥物的治療是復(fù)雜的， 可能是危險(xiǎn)的，應(yīng)該在特別訓(xùn)練過(guò)使用這些藥物的醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行。 許多抗心律不齊的藥物具有嚴(yán)重的副作用，只應(yīng)該在特定人群中使用。 例如，Ic類(lèi)型的藥物不應(yīng)該用于患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者，即使它們 可以抑制心房纖顫，它們實(shí)際上可以在心房撲動(dòng)中促進(jìn)快速心室反應(yīng)。 Ia類(lèi)型的藥物在沒(méi)有結(jié)構(gòu)性心臟病的患者中應(yīng)該用作最后的手段。索
88他洛爾(與大部分ni類(lèi)型的抗心律不齊藥物一樣)，可以導(dǎo)致QT間期
的顯著延長(zhǎng)、特別是在患有腎衰的患者中，并促進(jìn)了嚴(yán)重的心室性心 律不齊。索他洛爾和多非利特以及Ia類(lèi)型的藥物都需要在住院患者的 基礎(chǔ)上開(kāi)始，以監(jiān)測(cè)QT間期。盡管胺碘酮通常具有好的耐受性并被廣
泛使用，但在長(zhǎng)期療法中，胺碘酮具有許多嚴(yán)重的副作用。
遺傳#/試_勿/ ^以直接嚴(yán)賄洽#游選^
當(dāng)個(gè)體出現(xiàn)第一次(被診斷的)突發(fā)性心房纖顫的發(fā)作，并且或
者自發(fā)轉(zhuǎn)變成竇性心律、或者在發(fā)作后48小時(shí)內(nèi)經(jīng)歷了電復(fù)律或化學(xué) 復(fù)律時(shí)，開(kāi)始或者不開(kāi)始抗血凝療法的決定，根據(jù)所討論患者的風(fēng)險(xiǎn) 情況和管理醫(yī)生的偏好性而各不相同。這可能是難以作出的選擇，因 為對(duì)患者進(jìn)行抗血凝療法對(duì)于患者的生活來(lái)說(shuō)有巨大的影響。通常在 這樣的情況下選擇不進(jìn)行抗血凝療法，這可能對(duì)患者沒(méi)有顯著的結(jié)果。 另一方面，患者后來(lái)可能發(fā)生中風(fēng)，對(duì)其進(jìn)行預(yù)防的機(jī)會(huì)因此可能錯(cuò) 過(guò)了。在這樣的情況下，了解到患者是風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者可能是極其 重要的，支持了抗血凝療法的開(kāi)始。
在65歲以下被診斷患有心房纖顫并被認(rèn)為具有低的中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)、即 沒(méi)有器質(zhì)性心臟病、沒(méi)有高血壓、沒(méi)有糖尿病并且以前沒(méi)有中風(fēng)史的 個(gè)體， 一般僅僅用阿司匹林治療來(lái)預(yù)防中風(fēng)，而不使用抗血凝療法。 如果這樣的患者被發(fā)現(xiàn)是本文描述的風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者，這可以被認(rèn) 為是支持了比推薦的更早開(kāi)始抗血凝療法。這將是合理的考慮，因?yàn)?從心房纖顫導(dǎo)致的中風(fēng)的結(jié)果可能是毀滅性的。
缺血性中風(fēng)根據(jù)被懷疑的病因一般被分類(lèi)成5種亞類(lèi)；大動(dòng)脈動(dòng) 脈粥樣硬化、小動(dòng)脈阻塞、心源性栓塞(大部分由于心房纖顫)、其它 已確定病因的中風(fēng)和未確定病因(沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病因或存在一種以上似乎 合理的病因)的中風(fēng)。重要的是，由于心源性栓塞引起的中風(fēng)具有最 高的復(fù)發(fā)率，最容易使人喪失行動(dòng)能力，并與最低的存活率相關(guān)。因 此，必須不能忽視作為中風(fēng)的主要病因的心房纖顫，特別是因?yàn)橹委煷胧└鶕?jù)亞類(lèi)而變化。因此，如果個(gè)體被診斷患有中風(fēng)或暫時(shí)性缺血 性發(fā)作，并且盡管標(biāo)準(zhǔn)逐步建立，但合理的病因還沒(méi)有被鑒定出來(lái)， 那么了解到患者是風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者可能是極有價(jià)值的，并且支持了 或者開(kāi)始進(jìn)行抗血凝治療，或者開(kāi)始更具攻擊性的診斷測(cè)試，以試圖 診斷心房纖顫。
此外，本發(fā)明的標(biāo)記物可用于增加臨床試驗(yàn)的能力和有效性。因 此，是本發(fā)明的至少一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)變體的攜帶者的個(gè)體、即是賦予發(fā)生心 律不齊(例如心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)的增加的風(fēng)險(xiǎn)的至少一 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的攜帶者的個(gè)體，可能更可能對(duì) 特定的治療方式、例如上面描述的治療方式做出響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，攜帶有特定的治療(例如小分子藥物)所靶向的途徑和/或代謝 網(wǎng)絡(luò)中的基因的風(fēng)險(xiǎn)變體的個(gè)體，更可能是治療的響應(yīng)者。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，攜帶有其表達(dá)和/或功能被風(fēng)險(xiǎn)變體改變的基因的個(gè)體， 更可能是靶向該基因、其表達(dá)或其基因產(chǎn)物的治療方式的響應(yīng)者。本 應(yīng)用可以提高臨床試驗(yàn)的安全性，但是也可以增加臨床試驗(yàn)證明出統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著的效能的機(jī)會(huì)，否則這種效能僅限于群體的某些亞組。因此， 這種試驗(yàn)的一個(gè)可能的結(jié)果是，某些遺傳變體例如本發(fā)明的標(biāo)記物和 單倍型的攜帶者，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地可能顯示出對(duì)治療性藥劑的陽(yáng)性響應(yīng)， 即當(dāng)按照處方服用治療性藥劑或藥物時(shí)，經(jīng)歷了與心律不齊(例如心 房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)有關(guān)的癥狀的緩解。
另一方面，本發(fā)明的標(biāo)記物和單倍型可用于指導(dǎo)對(duì)特定個(gè)體的藥 物試劑的選擇。利用本發(fā)明的風(fēng)險(xiǎn)變體，可以實(shí)現(xiàn)治療方式的個(gè)性化 選擇、生活方式的改變或二者的組合。因此，關(guān)于本發(fā)明的特定標(biāo)記 物的個(gè)體狀態(tài)的信息，在靶基因或基因產(chǎn)物受到本發(fā)明的風(fēng)險(xiǎn)變體影 響的情況下，可用于選擇治療選項(xiàng)。變體的某些組合可能適合于治療 選項(xiàng)的一種選擇，而其它基因變體組合可以靶向其它治療選項(xiàng)。根據(jù) 需要，這樣的變體組合可以包括一種變體、兩種變體、三種變體或四 種或四種以上的變體，以臨床可靠的精確性確定治療模式的選擇。
90##"教溈^游/^賴(lài)
本發(fā)明還涉及本文描述的與心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng)) 和中風(fēng)有關(guān)聯(lián)的多態(tài)性標(biāo)記物和單倍型的計(jì)算機(jī)執(zhí)行的應(yīng)用。這樣的 應(yīng)用可以用于儲(chǔ)存、操作或分析在本發(fā)明的方法中有用的基因型數(shù)據(jù)。 一個(gè)例子涉及在可讀介質(zhì)上儲(chǔ)存來(lái)自于個(gè)體的基因型信息，以便能夠 給第三方(例如個(gè)體)提供基因型信息，或用于從基因型數(shù)據(jù)衍生信 息，例如通過(guò)將基因型數(shù)據(jù)與關(guān)于對(duì)心律不齊(例如心房纖顫和心房 撲動(dòng))和中風(fēng)的增加的易感性有貢獻(xiàn)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的信息進(jìn)行比較， 并在這些比較的基礎(chǔ)上報(bào)告結(jié)果。
一種這樣的情況涉及計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。 一般來(lái)說(shuō)，這樣的介質(zhì)有 能力儲(chǔ)存(i)至少一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型的識(shí)別信息；(ii)在患
有心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng))禾n/或中風(fēng)的個(gè)體中該至少一
個(gè)標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的頻率、或單倍型的頻率的指示符；以 及在參比群體中該至少一個(gè)標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的頻率、或單 倍型的頻率的指示符。參比群體可以是無(wú)疾病的個(gè)體的群體?？蛇x地， 參比群體是來(lái)自總?cè)后w的隨機(jī)樣品，因此充分地代表了群體。頻率指 示符可以是計(jì)算出的頻率、等位基因和/或單倍型拷貝的計(jì)數(shù)、或?qū)嶋H 頻率的歸一化的或操作過(guò)的值，它們適合用于特定的介質(zhì)。
其它關(guān)于個(gè)體的信息也可以?xún)?chǔ)存在介質(zhì)上，例如血統(tǒng)信息、性別 信息、身體屬性或特征(包括身高和體重)、生物化學(xué)測(cè)量值(例如血 壓、血脂水平、空腹葡萄糖水平、胰島素反應(yīng)測(cè)量值)、生物標(biāo)記物結(jié) 果、或其它希望與特定個(gè)體的基因型狀態(tài)一起儲(chǔ)存或操作的有用信息。
本發(fā)明還涉及適合用于測(cè)定或操作遺傳數(shù)據(jù)的裝置，這些遺傳數(shù) 據(jù)可用于確定人類(lèi)個(gè)體中對(duì)心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng))和 中風(fēng)的易感性。這樣的裝置可以包含計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器，以及儲(chǔ)存在 計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器中的用于操作數(shù)據(jù)的例行程序，以及用于產(chǎn)生含有遺傳數(shù)據(jù)的測(cè)量值的輸出的例行程序。這樣的測(cè)量值可以包括例如等 位基因或單倍型頻率、基因型計(jì)數(shù)、性別、年齡、表現(xiàn)型信息的值，
比值比(OR)或相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)、群體可歸因風(fēng)險(xiǎn)(PAR)的值，或
其它作為原始基因型數(shù)據(jù)的直接統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)或基于遺傳數(shù)據(jù)的計(jì)算值的 有用信息。
上述的應(yīng)用都可以使用本發(fā)明的標(biāo)記物和單倍型來(lái)進(jìn)行實(shí)踐，這 些標(biāo)記物和單倍型已經(jīng)在評(píng)估對(duì)心律不齊(例如心房纖顫和心房撲動(dòng)) 和中風(fēng)的易感性的方法中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。因此， 一般來(lái)說(shuō)，這
些應(yīng)用可以被減少到使用表5、表4、表9和表19中列出的標(biāo)記物、 以及與其連鎖不平衡的標(biāo)記物，來(lái)進(jìn)行實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo) 記物或單倍型出現(xiàn)在其序列顯示在SEQ ID NO: 50中的基因組區(qū)段中。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物和單倍型包括選自表19所示的標(biāo)記物的 至少一個(gè)標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物和單倍型包括至少一 個(gè)選自D4S406(SEQ ID NO:45 )、rs2634073( SEQ ID NO:33)、rs2200733 (SEQ IDNO:28)、 rs2220427 (SEQIDNO: 1)、 rsl0033464 (SEQID NO:41)禾B rsl3143308 (SEQIDNO:51)的至少一種標(biāo)記物，任選地包 括與其連鎖不平衡的標(biāo)記物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，連鎖不平衡 由r2的數(shù)值大于0.1來(lái)定義。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，連鎖不平 衡由r2的數(shù)值大于0.2來(lái)定義。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物或單倍 型含有選自標(biāo)記物D4S406中的等位基因-2、 -4和/或-8、標(biāo)記物 rs2634073的等位基因A、標(biāo)記物rs2200733的等位基因T、標(biāo)記物 rs2220427的等位基因T、標(biāo)記物rsl0033464的等位基因T、和/或標(biāo)記 物rsl3143308的等位基因G的至少一個(gè)等位基因。
拔虔浙豬
本文描述的核酸和多肽可用于上面描述的本發(fā)明的方法和試劑盒中。
本文使用的"分離"的核酸分子，是與正常情況下位于基因或核苷酸序列兩側(cè)(例如在基因組序列中)的核酸分開(kāi)的，和/或已經(jīng)從其 它轉(zhuǎn)錄的序列中(例如在RNA文庫(kù)中)完全或部分純化出的核酸分子。 例如，本發(fā)明的分離的核酸，相對(duì)于它自然發(fā)生的復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境、 或通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)基、或化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其它化 學(xué)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以是基本上分離的。在某些情況下，分離的物質(zhì)將形 成組合物(例如含有其它物質(zhì)的粗提液)、緩沖系統(tǒng)或試劑混合物的 一部分。在其它情況下，物質(zhì)可以被純化到例如通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠
電泳(PAGE)或柱層析(例如HPLC)測(cè)定時(shí)基本上均一。本發(fā)明的 分離的核酸分子可以占所有存在的大分子物質(zhì)的至少大約50%、至少 大約80。/?；蛑辽俅蠹s90%(摩爾數(shù)的基礎(chǔ)上)。對(duì)于基因組DNA來(lái)說(shuō)， 術(shù)語(yǔ)"分離的"也可以指從與基因組DNA天然關(guān)聯(lián)的染色體分離出的 核酸分子。例如，分離的核酸分子可以含有少于大約250 kb、 200 kb、 150 kb、 100 kb、 75 kb、 50 kb、 25 kb、 10 kb、 5 kb、 4 kb、 3 kb、 2 kb、 1 kb、 0.5 kb或O.l kb的、在核酸分子所源自的細(xì)胞的基因組DNA中 位于核酸分子兩側(cè)的核苷酸。
核酸分子可以與其它編碼或調(diào)節(jié)序列融合，并仍被當(dāng)作是分離的。 因此，載體中包含的重組DNA包含在本文使用的"分離的"的定義內(nèi)。 分離的核酸分子也包含異源宿主細(xì)胞或異源生物體中的重組DNA分 子，以及溶液中的部分純化的或基本上純化的DNA分子。"分離的" 核酸分子也包括本發(fā)明的DNA分子的體內(nèi)和體外RNA轉(zhuǎn)錄本。分離 的核酸分子或核苷酸序列可以包括化學(xué)合成的或通過(guò)重組方法產(chǎn)生的 核酸分子或核苷酸序列。這樣的分離的核苷酸序列可用于例如編碼的 多肽的制造、作為探針用于分離同源序列(例如從其它哺乳動(dòng)物物種)、 用于基因作圖(例如通過(guò)與染色體原位雜交)、或用于檢測(cè)組織(例 如人類(lèi)組織)中基因的表達(dá)，例如通過(guò)Northern印跡分析或其它雜交 技術(shù)。
本發(fā)明還涉及了在高度嚴(yán)緊雜交條件下、例如用于選擇性雜交的 條件下，與本文描述的核苷酸序列雜交的核酸分子(例如與含有本文描述的標(biāo)記物或單倍型相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列特異性雜交的 核酸分子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了在在高度嚴(yán)緊雜交和清
洗條件(例如用于選擇性雜交的條件)下，與含有LD區(qū)塊C04 (SEQ ID NO: 50)的核苷酸序列的核苷酸序列雜交的變體。這樣的核酸分子 可以通過(guò)等位基因特異性或序列特異性雜交(例如在高度嚴(yán)緊條件下) 來(lái)檢測(cè)和/或分離。用于核酸雜交的嚴(yán)緊條件和方法對(duì)于專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)是眾所周知的(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(a^7TW iVo/oco/s Mo/ecw/ar BZo/ogyJ， Ausubel， F.等，John Wiley & Sons, (1998)，以及Kraus, M.和Aaronson, S., M"/w^五wzy/no/., 200:546-556 (1991)，在此以其全文引為參考)。
兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列的百分同一性可以通過(guò)出于最適比較的 目的將序列進(jìn)行比對(duì)(例如可以在第一個(gè)序列的序列中引入缺口)來(lái) 確定。然后比較相應(yīng)位置上的核苷酸或氨基酸，兩個(gè)序列之間的百分 同一性是序列共有的同樣的位置的數(shù)量的函數(shù)(即％同一性=同一的 位置的數(shù)量/總的位置的數(shù)量x100)。在某些實(shí)施方案中，出于比較目 的進(jìn)行比對(duì)的序列的長(zhǎng)度是參比序列的長(zhǎng)度的至少30%、至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。 兩個(gè)序列的實(shí)際比較可以通過(guò)眾所周知的方法來(lái)進(jìn)行，例如使用數(shù)學(xué) 算法。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性的例子描述在Karlin， S.和Altschul， S.,AAa" ^cac/. Sc/. 7&4,卯:5873-5877 (1993)中。這樣的算法被整 合在NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，描述在Altschul, S.等， 7V"c/e〖c 25:3389-3402 (1997)中。在使用BLAST和帶缺口
BLAST程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如NBLAST)的缺省參數(shù)。參 見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于序列比較的 參數(shù)可以被設(shè)置為分值=100，字長(zhǎng)=12，或可以是不同的(例如W=5 或W=20)。
其它的例子包括了 Myers和Miller, CABIOS (1989)的算法，在 Torellis, A.和Robotti, C., Com;n^ ^ / /. B/os"',川:3-5 (1994)中描述的ADVANCE和ADAM算法；以及在Pearson, W.和Lipman, D.,Wa". 」cfld t/&4， S5:2444-48 (1988)中描述的FASTA。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以使用GCG軟件包 (Accelrys, Cambridge, UK)中的GAP程序來(lái)完成。
本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，它們含有的片段或一部分在高 度嚴(yán)緊條件下，與含有或包含LD區(qū)塊C04 (SEQIDNO:50)的核苷 酸序列、或含有或包含LD區(qū)塊C04 (SEQIDNO:50)的核苷酸序列 的互補(bǔ)序列的核苷酸序列的核酸雜交，其中核苷酸序列含有本文描述 的標(biāo)記物和單倍型中包含的至少一個(gè)多態(tài)性等位基因。本發(fā)明的核酸 片段的長(zhǎng)度為至少大約15、至少大約18、 20、 23或25個(gè)核苷酸，可 以是30、 40、 50、 100、 200、 500、 1000、 10,000個(gè)或以上的核苷酸長(zhǎng)。
本發(fā)明的核酸片段在例如本文描述的分析方法中被用作探針或引 物。"探針"或"引物"是以堿基特異性的方式與核酸分子的互補(bǔ)鏈雜 交的寡核苷酸。除了DNA和RNA之外，這樣的探針和引物包括多肽 核酸(PNA)，它描述在Nielsen, P.等，Sc/e"ce 2^:1497-1500 (1991)中。 探針或引物含有與核酸分子的至少大約15個(gè)、典型為大約20-25個(gè)、 在某些實(shí)施方案中大約40、 50或75個(gè)連續(xù)的核苷酸雜交的核苷酸序 列區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針或引物含有本文描述的至少一個(gè)多 態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因或至少一個(gè)單倍型，或其互補(bǔ)序列。 在特定實(shí)施方案中，探針或引物可以含有100個(gè)或以下的核苷酸；例 如，在某些實(shí)施方案中從6到50個(gè)核苷酸，或例如從12到30個(gè)核苷 酸。在其它實(shí)施方案中，探針或引物與連續(xù)的核苷酸序列或連續(xù)的核 苷酸序列的互補(bǔ)序列至少70%同一、至少80%同一、至少85%同一、 至少90%同一或至少95%同一。在另一個(gè)實(shí)施方案中，探針或引物能 夠與連續(xù)的核苷酸序列或連續(xù)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列選擇性雜交。 通常情況下，探針或引物還含有標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、 酶標(biāo)記、酶輔助因子標(biāo)記、磁性標(biāo)記、自旋標(biāo)記和表位標(biāo)記。本發(fā)明的核酸分子、例如本文描述的那些，可以使用專(zhuān)業(yè)技術(shù)人 員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定和分離?？梢詫U(kuò)增的DNA標(biāo)記
(例如放射性標(biāo)記)并用作探針，篩選來(lái)自人類(lèi)細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。 cDNA可以源自于mRNA并包含在適合的載體中?？梢苑蛛x到相應(yīng)的 克隆，在體內(nèi)切除后可以獲得DNA，然后可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有的 方法在任一或兩個(gè)方向上對(duì)克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序，以鑒定編碼具 有適合分子量的多肽的正確的閱讀框架。使用這些以及類(lèi)似的方法， 可以對(duì)多肽和編碼多肽的DNA進(jìn)行分離、測(cè)序和進(jìn)一步的表征。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的分離的核酸序列在Southern凝膠中可以用作 分子量標(biāo)準(zhǔn)品，并作為被標(biāo)記的染色體標(biāo)記物以對(duì)相關(guān)基因位置進(jìn)行 作圖。核酸序列也可用于與患者中的內(nèi)源DNA序列進(jìn)行比較，以鑒定 心律不齊(心房纖顫或心房撲動(dòng))和/或中風(fēng)、或?qū)π穆刹积R(心房纖 顫或心房撲動(dòng))禾P/或中風(fēng)的易感性，以及例如作為探針用于雜交和發(fā) 現(xiàn)相關(guān)的DNA序列或從樣品中扣除已知的序列(例如扣除雜交)。核 酸序列還可以用于產(chǎn)生引物用于遺傳指紋法、使用免疫技術(shù)產(chǎn)生抗多 肽抗體、和/或作為抗原產(chǎn)生抗DNA抗體或引發(fā)免疫應(yīng)答。
拔伴
還提供了特異性結(jié)合一種形式的基因產(chǎn)物但是不結(jié)合另一種形式 的基因產(chǎn)物的多克隆抗體和/或單克隆抗體。還提供了與含有多態(tài)性位 點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)的變體或參比基因產(chǎn)物的一部分結(jié)合的抗體。本文使用 的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白的免疫活性部分， 即含有與抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。與本發(fā)明的多肽特 異性結(jié)合的分子，是與該多肽或其片段結(jié)合、但是與樣品、例如天然 含有多肽的生物學(xué)樣品中的其它分子基本上不結(jié)合的分子。免疫球蛋 白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab')2片段，可以通過(guò)用 酶例如胃蛋白酶處理抗體來(lái)產(chǎn)生。本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多肽結(jié)合 的多克隆和單克隆抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆 抗體組合物"是指一群抗體分子，只含有一種能夠與本發(fā)明的多肽的
96特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，單克隆抗體組合物典 型地表現(xiàn)出對(duì)與其發(fā)生免疫反應(yīng)的本發(fā)明的特定多肽的單一結(jié)合親和 性。
多克隆抗體可以按照以前的描述通過(guò)用所需的免疫原例如本發(fā)明 的多肽或其片段免疫適當(dāng)?shù)膶?duì)象來(lái)制備?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)隨時(shí)間 監(jiān)測(cè)被免疫的對(duì)象中的抗體滴度，例如使用固定化的多肽的酶聯(lián)免疫 吸附分析(ELISA)。如果需要，可以從哺乳動(dòng)物(例如從血液)中分 離針對(duì)多肽的抗體分子，并通過(guò)眾所周知的技術(shù)例如蛋白A層析進(jìn)一
步純化以獲得IgG級(jí)份。在免疫后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，例如當(dāng)抗體滴度最高
時(shí)，可以從對(duì)象獲得生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆
抗體，例如最初由Kohler和Milstein, A^w" 256:495-497 (1975)描述的 雜交瘤技術(shù)、人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，/mmtmo/. 7bd">;4: 72 (1983)) 、 EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，《單克隆抗體與癌癥療法》
(Mowoc/(9"a/ ^W6o(i/ej1 Cawcer 77zera"y) , Alan R. Liss,1985， Inc.， 卯.77-96)或trioma技術(shù)。用于生產(chǎn)雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(一 般來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)《免疫學(xué)現(xiàn)代方法》(C"we"http://VWoco/"w/mww"o/ogy ) (1994) Coligan等主編，John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。簡(jiǎn) 單來(lái)說(shuō)，將永生的細(xì)胞系(典型為骨髓瘤)與用來(lái)自上述的免疫原免 疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(典型為脾細(xì)胞)融合，并篩選獲得的雜交 瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，以鑒定產(chǎn)生與本發(fā)明的多肽結(jié)合的單克隆抗體 的雜交瘤。
多種眾所周知的用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的方案中的任何 一種都可用于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明的多肽的單克隆抗體(參見(jiàn)例如《免疫 學(xué)現(xiàn)代方法》(Cwrewf尸raZoco/s /w扁wo/ogy^ , 同上；Galfre等， A^we 266:55052 (1977); R.H. Kenneth,《單克隆抗體生物學(xué)分析中 的新次兀》(Mo"oc/owa/ y4""6oWes.' j臉w D/wews/o" /" 勘a/戸W , Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 以及 Lerner, Fa/e SZo/. MW. 54:387-402 (1981))。此外，普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這種方法的許多變化形式也將可以使用。
或者，為了制備分泌單克隆抗體的雜交瘤，可以通過(guò)用多肽篩選 重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))，從而分離與 多肽結(jié)合的免疫球蛋白文庫(kù)成員，來(lái)鑒定和分離針對(duì)本發(fā)明的多肽的 單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是可商購(gòu)的(例
如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)No. 27-9400-01;以及 StratageneSw^/ZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)No. 240612)。此外， 特別適合用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的例子可以在下 列文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5,223,409,PCT
發(fā)明者丹尼爾·古德布雅爾特森, 安娜·海爾格多蒂爾 申請(qǐng)人:解碼遺傳學(xué)私營(yíng)有限責(zé)任公司