黑海參糖胺聚糖在制備防治血栓栓塞疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了黑海參糖胺聚糖在制備防治血栓栓塞疾病藥物中的應(yīng)用。動(dòng)物試驗(yàn)證明，重均分子量為大于20,000Da的黑海參解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的黑海參海參糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈劑量依賴性，與肝素及低分子肝素比較，其隨劑量增加凝血作用遞增緩和，并且在同一劑量下隨著重均分子量增加起效時(shí)間延遲的同時(shí)藥效持續(xù)時(shí)間增加。天然分子段的海參糖胺聚糖在一定劑量下持續(xù)藥效時(shí)間可達(dá)16小時(shí)。相對肝素類藥物以及維生素K拮抗劑類藥物更具安全性。臨床上用于血栓栓塞疾病治療視窗寬，安全性高，具有良好的開發(fā)研究價(jià)值。
【專利說明】黑海參糖胺聚糖在制備防治血栓栓塞疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黑海參的海參糖胺聚糖的醫(yī)藥用途，具體涉及重均分子量為大于 20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海參糖胺聚糖在制備血栓栓塞性疾病藥物 中的應(yīng)用，血栓栓塞疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病、靜脈血栓栓塞性疾病、血液高凝狀 態(tài)以及預(yù)防手術(shù)后的血栓形成或治療手術(shù)后的血栓。
【背景技術(shù)】
[0002] 中老年人群體血粘稠度逐漸增加，血小板聚集帶生血栓（如冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈） 的可能性增大，血栓栓塞疾病已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類特別是中老年人健康的常見的疾 病。血栓形成，是導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)等動(dòng)脈疾病以及靜脈血栓栓塞性疾病發(fā)生和患者死 亡的主要原因。防治血栓形成藥物可按其作用機(jī)制分為抗凝血藥物、抗血小板藥物和直接 溶血栓藥物等，臨床上均能用于預(yù)防和治療血栓形成。其中抗凝藥物是通過影響凝血因子， 從而防止血栓形成或復(fù)發(fā)。抗凝藥物對已經(jīng)形成的血栓無溶解作用，但可以防止血栓擴(kuò)展 和新血栓形成，有利于促進(jìn)血栓早期自溶?，F(xiàn)有的抗凝藥種類繁多，但大多數(shù)是西藥抗凝藥 且其副作用較大，使用時(shí)需反復(fù)檢測血凝狀況，以避免引起出血，另外給藥方式繁復(fù)，更重 要的是該類抗凝藥物存在著安全隱患。例如目前使用廣泛的抗凝藥物肝素、低分子肝素、法 華林等使用過程需要檢測血凝狀況，過量或者不同體質(zhì)的人使用易致各種出血，存在嚴(yán)重 安全隱患。
[0003] 因此，鑒于人口的老齡化、心血管疾病發(fā)病率的增加，以及現(xiàn)有抗凝藥物在臨床用 于血栓栓塞性疾病預(yù)防和治療的廣泛性以及其安全隱患的嚴(yán)重性。從中藥中篩選、分離更 具療效性、安全性防治血栓栓塞性疾病，是預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的一種必然趨勢。
[0004] 海參是棘皮動(dòng)物門海參綱海參屬動(dòng)物。全世界約有1100多種海參，中國約有140 多種，絕大多數(shù)是不能食用的。中國可食用海參占一半，達(dá)20種。海參同人參、燕窩、魚翅 齊名，是世界八大珍品之一。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材。據(jù)《本草綱目拾遺》 中記載：海參，味甘咸，補(bǔ)腎，益精髓，攝小便，壯陽療痿，其性溫補(bǔ)，足敵人參，故名海參?，F(xiàn) 代研究表明，海參具有防治動(dòng)脈血栓形成、防治動(dòng)脈硬化、增強(qiáng)免疫力以及抗腫瘤等作用。
[0005] 黑海參(學(xué)名：Holothuria atra)為海參科海參屬的動(dòng)物。分布于印度-西太平 洋區(qū)域、臺灣國以及中國的海南島、西沙群島等地，一般棲息于珊瑚礁區(qū)以及平靜、海草多 和有機(jī)質(zhì)豐富的沙底。在我國南海海域的潮間帶和珊瑚礁的砂底常成群出現(xiàn)，其口中流出 的白色線狀粘液可用于治外傷出血、止痛，去內(nèi)臟后的全體可作滋補(bǔ)品用于婦女補(bǔ)奶，但其 體壁薄且品質(zhì)遠(yuǎn)不如刺參，是最次的食用海參。近年來的許多研究表明，海參糖胺聚糖是海 參體壁中含有的一種酸性粘多糖是海參所特有的。海參糖胺聚糖具有顯著的抗血小板聚集 以及抗凝作用。優(yōu)選本發(fā)明的海參選自黑海參、玉足海參、糟海參、二色桌片參、梅花參、白 底輻肛參，優(yōu)選黑海參、玉足海參。其中，黑海參產(chǎn)于我國南海北海等地，分布廣泛、資源豐 富、價(jià)格適宜，而且海參糖胺聚糖含量豐富，是理想的原材料。
[0006] 海參糖胺聚糖具有顯著抗凝血、抗血小板聚集、降低血粘度、纖溶、調(diào)節(jié)血脂等生 物活性，可用于治療血栓栓塞性疾病，試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)海參糖胺聚糖不同分子量段具有的活 性，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑海參中提起的糖胺聚糖活性較目前已經(jīng)報(bào)道的糖胺聚糖活性較高， 而對于黑海參糖胺聚糖以及解聚糖胺聚糖的抗凝血活性研究目前未見文獻(xiàn)報(bào)告，尤其是對 于黑海參的天然分子段樣品以及降解產(chǎn)物皮下注射的抗凝血活性未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種黑海參糖胺聚糖在制備防治血栓栓塞疾病藥物中的應(yīng) 用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足臨床應(yīng)用的需要。
[0008] 動(dòng)物試驗(yàn)證明，重均分子量為大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖或天然分子段 的海參糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈劑量依賴性，與肝素及低分子肝素 比較，其隨劑量增加凝血作用遞增緩和，并且在同一劑量下隨著重均分子量增加起效時(shí)間 延遲的同時(shí)藥效持續(xù)時(shí)間增加。天然分子段的海參糖胺聚糖在一定劑量下持續(xù)藥效時(shí)間可 達(dá)16小時(shí)。
[0009] 因此，所述重均分子量為大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海 參糖胺聚糖中的一段或者一段以上，可用于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病藥物的制備，可 用于治療動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病藥物的制備，可用于靜脈血栓栓塞性疾病藥物的制備， 可用于治療靜脈血栓栓塞性疾病藥物的制備，可用于防治血液高凝狀態(tài)藥物的制備，可用 于預(yù)防手術(shù)后的血栓形成或治療手術(shù)后的血栓藥物的制備。
[0010] 所述的"重均分子量大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海參糖 胺聚糖"指的是，重均分子量大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖任意一重均分子量或天然 分子段的海參糖胺聚糖，或者是重均分子量大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖任意一重 均分子量或天然分子段的海參糖胺聚糖的多段混合物；
[0011] 所述重均分子量的定義如下：重均分子量（Weight-average Molecular Weight): 所有合成高分子化合物的分子量以及大多數(shù)天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它 們是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的統(tǒng)計(jì)平均分 子量，即為重均分子量。
[0012] 重均分子量是采用高效液相凝膠色譜法測試的。
[0013] 優(yōu)選的：所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為：20, OOODa?22, 300Da、 29,250Da ?32,500Da、39,050Da ?42，100Da、45,800Da ?50,000Da、54,506Da ? 57,450Da、57,500Da ?65,400Da、65,500Da ?75,400Da、75,500Da ?86,000Da、 86, 050Da ?96, 000Da、96, 050Da ?102, OOODa 中的任意一段；
[0014] 特別優(yōu)選的，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量為：
[0015] 20, OOODa ?22, 300Da、29, 250Da ?32, 500Da、39, 050Da ?42, 100Da、45, 800Da ? 50, 000Da、54,600Da ?57, 00Da、57, 600Da ?65, 000Da、65, 600Da ?75, 300Da、75, 600Da ? 85, 500Da、86, 200Da ?95, 500Da、96, lOODa ?101, 500Da 中的任意一段；
[0016] 上述的解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海參糖胺聚糖均為黑海參的解聚海參 糖胺聚糖或天然分子段的黑海參糖胺聚糖；
[0017] 所述藥物，包括治療有效量的所述的解聚海參糖胺聚糖和藥學(xué)上可接受的載體， 所述藥學(xué)上可接受的載體選自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮 或氯化鈉的一種以上，優(yōu)選甘露醇；
[0018] 所述的藥物為靜脈或皮下注射給藥的注射液或者是凍干粉針劑；
[0019] 分子量大于20, OOODa的黑海參解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海參糖胺聚 糖，皮下注射給藥量為大鼠 lmg/kg?100mg/kg，優(yōu)選2mg/kg?80mg/kg ;靜脈注射給藥量 為大鼠 〇· lmg/kg ?40mg/kg，優(yōu)選 0· 2mg/kg ?30mg/kg ;
[0020] 所述藥物中，所述解聚海參糖胺聚糖的純度為90?99. 99%，優(yōu)選92%以上，為 了達(dá)到更理想的效果更優(yōu)選94%以上；所述的天然分子段的海參糖胺聚糖的純度為90? 99. 99%，優(yōu)選92%以上，為了達(dá)到更理想的效果，更優(yōu)選95%以上；
[0021] 所述純度為重量純度。
[0022] 所述的解聚海參糖胺聚糖的多分散度為1?2,優(yōu)選1?1. 6,更優(yōu)選1?1. 4 ;
[0023] 所述多分散度指的是本領(lǐng)域常用的衡量聚合物分子量分布的指數(shù)，用于表征聚合 物分子量分布的寬度。多分散度在本文或其他文獻(xiàn)中又被稱多分散指數(shù)、多分散性或分布 寬度指數(shù)，是重均分子量（Mw)與數(shù)均分子量（Μη)之比，即Mw / Μη。這個(gè)比值隨分子量分 布寬度而變化。在單分散時(shí)，Mw / Μη等于1，隨著分子量分布變寬，Mw / Μη值逐漸變大。
[0024] 所述解聚海參糖胺聚糖可采用商業(yè)化產(chǎn)品，如哈爾濱紅杉生物制藥有限公司生產(chǎn) 的海參糖胺聚糖和解聚海參糖胺聚糖，或采用如下的方法制備：
[0025] (1)將酶加入絞碎的海參，在進(jìn)行酶解和沉淀，收集海參糖胺聚糖粗品，對海參糖 胺聚糖粗品進(jìn)行純化和脫色，收集海參糖胺聚糖；
[0026] 所述海參選自黑海參；
[0027] 所述的酶為水解蛋白酶和復(fù)合胰酶，水解蛋白酶可采用商業(yè)化產(chǎn)品，如諾維信(沈 陽）生物技術(shù)有限公司的Alcalase，復(fù)合胰酶可采用商業(yè)化產(chǎn)品，如無錫市雪梅酶制劑科技 有限公司的雪梅牌復(fù)合胰酶，水解蛋白酶的用量為海參重量的2%，復(fù)合胰酶的用量為海參 重量的2?3% ;
[0028] (2)將重量濃度為5%醋酸和3%的雙氧水加入步驟（1)的產(chǎn)物降解，收集重均分子 量為大于20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖；
[0029] 所述藥物的制備方法，為制劑領(lǐng)域常規(guī)的方法，如《中藥制劑手冊》記載的方法，獲 得所述的注射液或凍干粉針劑；
[0030] 本發(fā)明的含有解聚海參糖胺聚糖藥物可通過皮下或者靜脈注射的方法施加于需 要治療的患者，給藥劑量由醫(yī)師根據(jù)患者的具體情況(如年齡、體重、性別、患病時(shí)間、身體 狀況等）確定。一般而言，以解聚海參糖胺聚糖計(jì)，皮下給藥劑量為〇. 1?50mg/kg，優(yōu)選 0· 2?45mg/kg，靜脈給藥的給藥劑量為0· 01?30mg/kg，優(yōu)選0· 05?20mg/kg。
[0031] ( 3)將所需分子量段的海參糖胺聚糖以及解聚海參糖胺聚糖采用凝膠柱收集所需 分子量段。
[0032] 所述的凝膠吸附柱，如Sephadex-G100凝膠吸附柱、Sephadex_G50凝膠吸附柱或 Sephadex_G200,所述Sephadex-G100凝膠吸附柱，可以采用美國GE公司的葡聚糖凝膠柱。
[0033] 海參糖胺聚糖是海參體壁中含有的一種酸性粘多糖，是海參所特有的。本發(fā)明發(fā) 現(xiàn)，海參糖胺聚糖具有顯著抗凝血、抗血小板聚集、降低血粘度、纖溶、調(diào)節(jié)血脂等生物活 性，可用于治療血栓性疾病。
[0034] 海參糖胺聚糖通過進(jìn)一步解聚成為不同分子量段的解聚海參糖胺聚糖，其呈現(xiàn)不 同的抗凝血活性，且隨著劑量增加其抗凝血活性遞增趨勢緩和，相對肝素類藥物以及維生 素 K拮抗劑類藥物更具安全性。臨床上用于血栓栓塞疾病治療視窗寬，安全性高，具有良好 的開發(fā)研究價(jià)值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035] 圖1黑海參一海參糖胺聚糖和解聚海參糖胺聚糖的純度圖：
[0036] 圖1-1黑海參一天然分子段的海參糖胺聚糖的純度圖；
[0037] 圖1-2重均分子量為21，254Da的純度圖
[0038] 圖1-3重均分子量為31，887Da的純度圖
[0039] 圖1-4重均分子量為40, 682Da的純度圖
[0040] 圖1-5重均分子量為48, 769Da的純度圖
[0041] 圖1-6重均分子量為54, 962Da的純度圖；
[0042] 圖1-7重均分子量為60. 588Da的純度圖；
[0043] 圖1-8重均分子量為70, 398Da的純度圖；
[0044] 圖1-9重均分子量為79, 825Da的純度圖；
[0045] 圖1-10重均分子量為90, 627Da的純度圖；
[0046] 圖1-11重均分子量為100, 156Da的純度圖；
[0047] 圖2為黑海參一海參糖胺聚糖和解聚海參糖胺聚糖的分子量測試報(bào)告。
[0048] 圖2-1黑海參一天然分子段的糖胺聚糖的分子量測試報(bào)告；
[0049] 圖2-2重均分子量為21，254Da的分子量測試報(bào)告
[0050] 圖2-3重均分子量為31，887Da的分子量測試報(bào)告
[0051] 圖2_4重均分子量為40, 682Da的分子量測試報(bào)告
[0052] 圖2_5重均分子量為48, 769Da的分子量測試報(bào)告
[0053] 圖2_6重均分子量為54, 962Da的分子量測試報(bào)告；
[0054] 圖2_7重均分子量為60. 588Da的分子量測試報(bào)告；
[0055] 圖2-8重均分子量為70, 398Da的分子量測試報(bào)告；
[0056] 圖2_9重均分子量為79, 825Da的分子量測試報(bào)告；
[0057] 圖2-10重均分子量為90, 627Da的分子量測試報(bào)告；
[0058] 圖2_11重均分子量為100, 156Da的分子量測試報(bào)告；
[0059] 圖3黑海參一解聚海參糖胺聚糖體外抗凝血?jiǎng)┝颗c凝血時(shí)間的線性關(guān)系圖。
[0060] 圖3-1DHG-1體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0061] 圖3-2DHG-2體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 解聚海參糖胺聚糖的提取方法是指提取自海參的海參糖胺聚糖，經(jīng)降解和解聚后 產(chǎn)生解聚糖胺聚糖，收集所需分子量的解聚海參糖胺聚糖。從海參體壁中提取海參糖胺聚 糖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，如中國專利ZL200910305363. 5。
[0063] 實(shí)施例1
[0064] 海參糖胺聚糖的提?。?br>
[0065] 海參糖胺聚糖的提?。?br>
[0066] 稱取黑海參藥材0. 5kg，水浸16h。將海參體壁淋干水分，絞碎，稱重并補(bǔ)水至4kg， 置60°C水浴中，加入6mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8. 2±0. 2,加入20ml水解蛋白酶Alcalase (諾維信(沈陽）生物技術(shù)有限公司）攪拌，酶解4小時(shí)，85°C以上滅活10分鐘，冷卻。5°C離 心，收集上清液，加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至2. 5±0. 2,4°C冷藏2小時(shí)，離心，收集上清液，力口 入6mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7. 5±0. 2,加入0. 8倍體積的乙醇，4°C靜置12h。
[0067] 離心，收集沉淀稱重，加10倍重量的蒸餾水，加熱至85°C ±2°C，待完全溶解后， 加入6mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至9. 0±0. 2,加入氯化|丐至溶液中氯化|丐濃度達(dá)到3% (w/v)， 升溫至92°C保持15分鐘，冷卻至室溫，4°C離心，收集上清液，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH至 11.0±0. 1，離心，收集上清液，用6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0±0. 1，加1倍體積乙醇，4°C冷藏 12h ；
[0068] 冷藏液離心，收集沉淀稱重，加2倍體積蒸餾水，加熱使其充分溶解，加乙酸鉀使 其最終濃度為2mol/L，4°C靜置12h。離心，收集沉淀稱重，加2倍體積蒸餾水，加熱使其充 分溶解，加乙酸鉀使其最終濃度為2mol/L，4°C靜置12h。離心，沉淀用冷2mol/L乙酸鉀溶 液洗滌三次，然后依次用80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇洗滌，待乙醇揮發(fā)盡后80°C干燥，稱 重，得粗品A。
[0069] 粗品A加0. 05mol/L、pH6. 0的HAc-NaAc緩沖液溶解制成2%溶液上柱，溶液通過 纖維素層析柱后，用1. 5倍柱體積的0. 4mol/LNaCl的HAc-NaAc緩沖液（pH6. 0±0. 1)洗 漆，再用lmol/LNaCl的HAc-NaAc緩沖液（ρΗ6· 0±0· 1)洗脫，根據(jù)紫外檢測儀在220nm處 數(shù)值的變化速度收集洗脫液，置60°C水浴中，用NaOH調(diào)pH至11 ±0. 1，按體積量加入3%雙 氧水，保持4小時(shí)，冷卻，離心，收集上清液，用HC1調(diào)pH至7. 2±0. 1，加1倍量乙醇，4°C靜 置 12h。
[0070] 離心，收集沉淀，依次用80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇洗漆，得粗品B。
[0071] 粗品B用蒸餾水溶解成5%的溶液，用截留分子量1萬的超濾膜濃縮至原體積的 1/2,補(bǔ)加水至原體積，再超濾至1/2體積，再加水重復(fù)一次，超濾液冷凍干燥，得海參糖胺 聚糖，
[0072] 該實(shí)例得到的海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純度 為99.0%的純品（圖譜見圖1-1)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量109, 401Da，D值為1. 27(圖譜見圖2-1)
[0073] 實(shí)施例2
[0074] 解聚海參糖胺聚糖的制備
[0075] 實(shí)施例2-1
[0076] 將上述實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙 氧水使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚42h。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0077] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在20, OOODa?22, OOODa，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0078] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-2)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量21254, D值為1. 29 (圖譜見圖2-2)
[0079] 實(shí)施例2-2
[0080] 將上述實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙 氧水使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚30h。將該溶液用0. lmol/1的氫氧 化鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖 的粗品。
[0081] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在22, lOODa?35, OOODa，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0082] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-3)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，T0S0H)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量31887, D值為1. 37 (圖譜見圖2-3)
[0083] 實(shí)施例2-3
[0084] 將上述實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙 氧水使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚20h。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0085] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在35, lOODa?45, 000Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0086] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-4)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，T0S0H)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量40682, D值為1. 35 (圖譜見圖2-4)
[0087] 實(shí)施例2-4
[0088] 將上述海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水使溶液中 雙氧水的濃度為3%, 40°C進(jìn)行控制解聚12h。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化鈉中和至中性， 加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品。
[0089] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在45, lOODa?53, 000Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0090] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-5)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，T0S0H)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量48769, D值為1. 38 (圖譜見圖2-5)
[0091] 實(shí)施例2-5
[0092] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水 使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚8h20min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0093] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過s印hadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在54, 506Da?57, 450Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0094] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-6)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量54, 962Da，D值為1. 37(圖譜見圖2-6)
[0095] 實(shí)施例2-6
[0096] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水 使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚5h30min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0097] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在57, 500Da?65, 400Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0098] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-7)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量60, 588Da，D值為1. 36(圖譜見圖2-7)
[0099] 實(shí)施例2-7
[0100] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水 使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚3h30min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0101] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex-G75柱，用0. 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在65, 500Da?75, 400Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0102] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-8)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量70, 398Da，D值為1. 31 (圖譜見圖2-8)
[0103] 實(shí)施例2-8
[0104] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水 使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚2h25min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0105] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在75, 500Da?86, 000Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0106] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-9)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，TOSOH)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量79, 825Da，D值為1. 34(圖譜見圖2-9)
[0107] 實(shí)施例2-9
[0108] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水 使溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚lh40min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化 鈉中和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的 粗品。
[0109] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在86, 050Da?96, OOODa，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0110] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99.0%的純品（圖譜見圖1-10)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，T0S0H)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量90, 627Da，D值為1. 32(圖譜見圖2-10)
[0111] 實(shí)施例 2-10
[0112] 將實(shí)施例1中的海參糖胺聚糖純品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的雙氧水使 溶液中雙氧水的濃度為3%，40°C進(jìn)行控制解聚40min。將該溶液用0. lmol/1的氫氧化鈉中 和至中性，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，離心，得到解聚海參糖胺聚糖的粗品。
[0113] 該粗品干燥，溶于5倍重量的水中，過sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化鈉進(jìn) 行洗脫，脫去鹽及小分子雜質(zhì)，脫鹽后的樣品冷凍干燥既得55g解聚海參糖胺聚糖，其分子 量都在96, 050Da?102, 000Da，D值< 1. 5,純度為98%以上。
[0114] 該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖，經(jīng)示差折光檢測器（RID-10A，島津）可得到純 度為99. 0%的純品（圖譜見圖1-11)，經(jīng)該實(shí)例得到的解聚海參糖胺聚糖經(jīng)凝膠柱（TSK gel G4000PWXL，T0S0H)色譜分析知該產(chǎn)品的重均分子量100, 156Da，D值為1. 29 (圖譜見圖 2-11)
[0115] 實(shí)施例3
[0116] 將以上獲得的40. 0g海參糖胺聚糖或者解聚海參糖胺聚糖加入80g甘露醇、加入 注射用水l〇〇〇ml溶解，經(jīng)過超濾、灌裝、凍干，得到1000瓶注射用海參糖胺聚糖或者解聚海 參糖胺聚糖的凍干粉針劑。
[0117] 實(shí)施例4
[0118] 海參糖胺聚糖和解聚海參糖胺聚糖的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0119] 4.1體外抗凝血實(shí)驗(yàn)
[0120] 4. 1.1試驗(yàn)材料
[0121] 供試樣品：
[0122] 名稱：解聚海參糖胺聚糖，以下縮寫：DHG ;DHG_1 (實(shí)施例2-6)、DHG-2 (實(shí)施例 2-7);配制：精密吸取后以注射用生理鹽水稀釋至所需濃度。
[0123] 試驗(yàn)動(dòng)物
[0124] 品系：兔；來源：上海陳行實(shí)驗(yàn)用兔有限公司；性別：雄性；體重：1850克；動(dòng)物合 格證號：SCXK (滬）2008-0010。
[0125] 4. 1.2試驗(yàn)儀器
[0126] 血小板聚集凝血因子分析儀（型號LG-PABER北京世帝科學(xué)儀器公司）。
[0127] 4. 1.3實(shí)驗(yàn)方法
[0128] 實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，于樣品池中分別加入兔血漿80 μ 1、0. 9%氯化鈉溶液10 μ 1，預(yù)熱180s 后，加入1%氯化鈣溶液1〇μ 1，立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，用血小板聚集凝血因子分析儀開 始計(jì)算時(shí)間，記錄各樣品池凝結(jié)時(shí)間，即為空白。
[0129] 精密量取對照品溶液，用0. 9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度的溶液，即為不同濃度 的樣品溶液 DHG-1 (10. 0μ g/ml ?200. 0μ g/ml)、DHG-2 (8· 0μ g/ml ?120. 0μ g/ml)。
[0130] 用10 μ 1不同濃度的樣品溶液代替10 μ 10. 9%氯化鈉溶液，分別測定各濃度的樣 品溶液的血漿凝結(jié)時(shí)間。每個(gè)濃度平行測定4次，求平均值。
[0131] 4. 1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0132] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品終濃度在 DHG-K10· 0μ g/ml ?140. 0μ g/ml)、DHG-2(8. 0μ g/ ml?120.0 μ g/ml)劑量范圍內(nèi)，隨劑量增加凝血時(shí)間延長，凝血時(shí)間延長遞增趨勢緩和。 因此，解聚海參糖胺聚糖組合物用于抗凝血更具安全性，可控性。
[0133] 表1-1 DHG-1體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0134]
【權(quán)利要求】
1. 重均分子量大于20, OOODa的黑海參解聚海參糖胺聚糖或天然分子段的黑海參糖胺 聚糖中的一段或者一段以上，在制備防治動(dòng)脈血栓栓塞疾病藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述血栓栓塞疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化血 栓性疾病、靜脈血栓栓塞性疾病、血液高凝狀態(tài)、手術(shù)后形成的血栓或者是預(yù)防手術(shù)后血栓 的形成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的重均分子量大于20, OOODa的解 聚海參糖胺聚糖或天然分子段的海參糖胺聚糖指的是，重均分子量大于20, OOODa的解聚 海參糖胺聚糖任意一重均分子量或天然分子段的海參糖胺聚糖，或者是重均分子量大于 20, OOODa的解聚海參糖胺聚糖任意一重均分子量或天然分子段的海參糖胺聚糖的多段混 合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量 為：20,000Da ?22,300Da、29,250Da ?32,500Da、39,050Da ?42，100Da、45,800Da ? 50,000Da、54,506Da ?57,450Da、57,500Da ?65,400Da、65,500Da ?75,400Da、 75, 500Da ?86, 000Da、86, 050Da ?96, 000Da、96, 050Da ?102, OOODa 中的任意一段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述解聚海參糖胺聚糖的重均分子量 為：20,000Da ?22,300Da、29,250Da ?32,500Da、39,050Da ?42，100Da、45,800Da ? 50, 000Da、54,600Da ?57, 00Da、57, 600Da ?65, 000Da、65, 600Da ?75, 300Da、75, 600Da ? 85, 500Da、86, 200Da ?95, 500Da、96, lOODa ?101, 500Da 中的任意一段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物，包括治療有效量的 所述的解聚海參糖胺聚糖和藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為靜脈或皮下注射給藥的注 射液或者是凍干粉針劑。
【文檔編號】A61P7/02GK104147039SQ201310175154
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月13日
【發(fā)明者】王志國, 劉全海, 董玉瓊 申請人:上海開潤生物醫(yī)藥有限公司, 哈爾濱紅豆杉生物制藥有限公司