專利名稱：一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及其N-末端氨基酸序列，本發(fā)明還涉及灰星鯊軟骨血管生成抑制因子在制備抑制血管生成、防治腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管生成在人體發(fā)育和組織修復(fù)等正常生理過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征之一。1970年，F(xiàn)olkman認(rèn)為腫瘤的生長依賴于新生血管的生成,而通過抑制腫瘤的血管生成可達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，已有的研究證明當(dāng)腫瘤的體積達(dá)到疒3 mm2以上時(shí)就必須依賴新生血管為其繼續(xù)增殖提供必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，而此時(shí)抑制腫瘤的血管生成,就會(huì)切斷腫瘤的營養(yǎng)供給,導(dǎo)致腫瘤的退化、萎縮。因此，以抗血管生成為主的腫瘤生物治療研究成為近十多年來抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。與常規(guī)抗腫瘤藥物相比，腫瘤血管生成抑制劑具有許多優(yōu)勢:處于增生狀態(tài)的血管有相對(duì)較高的靶分子表達(dá)，故腫瘤血管生成抑制劑治療腫瘤具有良好的特異性。實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移均須依賴血管生成，因而抗血管治療具有廣譜性。血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血流中，藥物可直接發(fā)揮作用，故劑量小、療效高、副作用相對(duì)較輕。內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。因此，抗血管生成的腫瘤治療策略在未來的腫瘤治療中將發(fā)揮重要的作用。申請(qǐng)人:研究發(fā)現(xiàn)，以灰星鯊軟骨為原料，制備血管生成抑制因子的研究處于空白階段，而灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1在制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用更是未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的N-末端氨基酸序列，具有這種N-末端氨基酸序列的灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1顯示強(qiáng)抑制血管生成活性。本發(fā)明的目的尚在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的藥理性質(zhì)，以利用于制備藥物。本發(fā)明為解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于該血管生成抑制因子的N末端15個(gè)氨基酸殘基的排列順序?yàn)?DPGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO:1，亦即 Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys SEQ ID NO: 1，分子量為 11.9 kDa，最適 pH 為 7.0-8.5，穩(wěn)定 pH 為5.0_9.0 ο
本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
O灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:5^10 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min離心l(Tl5 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續(xù)在4。(^下10 000r/min離心15 20 min,取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內(nèi)溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液。2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4 °C以下預(yù)冷0.5 1 h，緩慢加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5 1 h后，于4 V以下10 000 r/min離心15 25 min,取離心上清液加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至丙酮濃度達(dá)60%，靜置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min離心15 25 min，取沉淀置于截留分子量為8kDa的透析袋內(nèi)用雙蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分；
3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、
0.09 0.11 mol/L, 0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為3 5mL/min,每5 mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分；
4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到Sephadex G_75層析柱中，用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脫液收集I試管，并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰，SDS-PAGE測定分子量為11.9 kDa。本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的應(yīng)用，其特征在于BSFN-1對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成具有顯著抑制作用；腹腔注射BSFN-1還可對(duì)荷Lewis肺癌小鼠肺癌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血小板衍生生長因子(TOGF)三種促血管生成因子的表達(dá)有明顯的抑制作用，BSFN-1具有安全無毒副作用和活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:提取、純化工藝較簡單，易于操作，制得的血管生成抑制因子活性顯著，安全無毒，可用于腫瘤疾病的治療。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例用DEAE-52纖維素離子交換層析柱進(jìn)行分離純化時(shí)所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收試管數(shù)，縱向軸是280nm吸光度；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例用Sephadex G_75層析時(shí)所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收試管數(shù)，縱向軸是280nm吸光度；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例用ZORBAX 300SB-C18 HPLC柱進(jìn)行層析時(shí)所獲得的分離峰圖，其中橫軸為洗脫時(shí)間t (min)，縱向軸是280nm吸光度(mAU)；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例用SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示圖，縱軸為分子量(kDa)，其中泳道為I標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)，泳道2為BSFN-1電泳條帶；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例:一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，制備流程如下:灰星鯊軟骨〃組織破碎〃鹽酸胍抽提〃丙酮分級(jí)沉淀分〃離子交換層析純化〃凝膠滲透色譜純化〃血管生成抑制因子BSFN-1。I)灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:8 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提24 h后，抽提溶液于4 °C以下、5 000 r/min離心15 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續(xù)在4。(^下10 000 r/min離心20 min，取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液于4°C以下透析24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內(nèi)溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液。2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4 °C以下預(yù)冷I h，緩慢加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至其濃度為30%，靜置I h后，于4 °C以下10000 r/min離心15 min,取離心上清液加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至丙酮濃度達(dá)60%,靜置Ih后,4 °C以下、9 000 r/min離心15 min,取沉淀置于截留分子量為8 kDa的透析袋內(nèi)用雙蒸水于4 1:以下透析24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分；
3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、0.10 mol/L、0.50 mol/L和1.00 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為3 mL/min，每5 mL洗脫液收集I試管，并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖(圖1)，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分；
4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到S印hadex G-75層析柱中，用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.0 mL/min，每3 mL洗脫液收集I試管，并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖(圖 2)，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1。
所得的BSFN-1經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰(圖3 )，所得的BSFN-1經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示為一條帶，分子量為11.9 kDa(圖4)。將制得的BSFN-1作雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用的測定，測定方法參考賀國安、羅進(jìn)賢、張?zhí)碓取案倪M(jìn)的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)一無氣室孵育法”(記載于《中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》，2003年第2冊(第42卷):第126-128頁)。結(jié)果表明，灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈劑量依賴關(guān)系(表I)
表I灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于該灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的N末端15個(gè)氨基酸殘基的排列順序?yàn)镈PGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO: 1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys,分子量為 11.9 kDa，最適pH 為 7.0-8.5，穩(wěn)定 pH 為 5.0-9.0。
2.—種權(quán)利要求1所述的一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:5^10 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min離心l(Tl5 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續(xù)在4。(^下10 000r/min離心15 20 min,取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內(nèi)溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液； 2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4°C以下預(yù)冷0.5 1 h，緩慢加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5 1 h后，于4 °C以下10 000 r/min離心15 25 min,取離心上清液加入4 °C以下預(yù)冷的丙酮至丙酮濃度達(dá)60%,靜置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min離心15 25 min，取沉淀置于截留分子量為8 kDa的透析袋內(nèi)用雙蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分； 3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-H Cl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為3 5mL/min,每5 mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分； 4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質(zhì)，濾液加入到Sephadex G_75層析柱中,用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脫液收集I試管，并根據(jù)每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對(duì)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰，SDS-PAGE測定分子量為11.9 kDa。
3.權(quán)利要求1所述的一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-I及其制備方法和應(yīng)用，該血管生成抑制因子的N末端15個(gè)氨基酸殘基的排列順序?yàn)镈PGTGDYKGADEFAKSEQIDNO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys，分子量為11.9kDa。制備時(shí)將灰星鯊軟骨勻漿，鹽酸胍抽提，丙酮沉淀分級(jí)、以及離子交換層析和凝膠層析，得一單峰，即為抑制因子BSFN-I?；倚酋徰苌梢种埔蜃覤SFN-I可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103232537SQ20131006168
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者王斌, 羅紅宇, 栗麗, 王玉梅 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院