一種纖維軟骨支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料及其細(xì)胞工程應(yīng)用，具體涉及一種纖維軟骨支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程學(xué)是利用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法研究生物有機(jī)體的組織器官或其功能替代物的新興交叉學(xué)科，它集生物工程、生命科學(xué)、材料科學(xué)與工程及臨床醫(yī)學(xué)于一體。組織工程的基本原理和方法是將體外培養(yǎng)的高濃度細(xì)胞擴(kuò)增后，吸附于一種生物相容性良好，并可被人體逐步降解吸收的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)材料上，形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物，使細(xì)胞按預(yù)制形態(tài)的三維支架生長，然后將這種復(fù)合體植入機(jī)體所需部位。接種的細(xì)胞在生物支架降解吸收過程中，繼續(xù)增生繁殖，形成新的與原功能和形態(tài)相應(yīng)的組織和器官，從而達(dá)到修復(fù)組織外形和功能重建的目的。特定組織的細(xì)胞、支架材料、生長因子為組織工程的三要素，支架材料起中心作用，其不僅為特定的細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，而且還起到模板作用，引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)(Hasler EM Hff, Wu JZ, MullerW，Wyss U.Articular cartiIage b1mechanics: theoretical models,materialproperties, and b1synthetic response.Crit Rev B1med Eng.1999;27:415-88.)。
[0003]軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程種子細(xì)胞的一個(gè)重要來源，應(yīng)用自體軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨可以成功修復(fù)大型哺乳動物關(guān)節(jié)承重面的缺損。自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)作為一種有效和成熟的技術(shù)已開始應(yīng)用于臨床關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)，但軟骨組織中的軟骨細(xì)胞數(shù)量較少，接種支架前需要進(jìn)行足量的擴(kuò)增才能滿足修復(fù)缺損的要求。矛盾的是，隨著傳代次數(shù)增加和培養(yǎng)時(shí)間延長，雖然細(xì)胞數(shù)量有所增加，但軟骨細(xì)胞的形態(tài)逐漸從最初的多角形和圓形變?yōu)轭愃瞥衫w維細(xì)胞樣的扁平、長梭形，同時(shí)特異性的細(xì)胞外基質(zhì)成分也從表達(dá)
II型膠原和蛋白聚糖轉(zhuǎn)交為表達(dá)I型膠原和纖連蛋白，這種現(xiàn)象被稱為軟骨細(xì)胞的去分化(Buckwalter JA MH.Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrixinteract1ns.1nstr Course Lect.1998 ;47:477-86.)。用去分化軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨無論在生化成分還是力學(xué)性能上與關(guān)節(jié)軟骨都有較大差距，因此，人們開始探討如何恢復(fù)去分化軟骨細(xì)胞的軟骨表型，這一過程稱之為再分化。如何避免軟骨細(xì)胞的去分化，并促進(jìn)其再分化是促進(jìn)以軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞的軟骨組織工程發(fā)展的重要問題之一。
[0004]近20年來，納米材料嶄新的興起的一個(gè)領(lǐng)域，它是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(I?100 nm)或由其作為基本單元構(gòu)成的材料，納米材料在結(jié)構(gòu)上具有一些獨(dú)特效應(yīng)如表面效應(yīng)和體積效應(yīng)。近年來，納米材料在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用正成為新的研究熱點(diǎn)，納米技術(shù)在生物材料上的應(yīng)用也愈來愈引人注目。電紡絲是一種利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場作用下形成噴射流進(jìn)行紡絲加工的工藝，是一項(xiàng)制備納米級纖維材料簡便有效的技術(shù)。電紡絲技術(shù)具有快速、高效，設(shè)備簡單的特性，而且易于控制制品的化學(xué)組分和物理性能，由電紡絲纖維制得的無紡布纖維纖度細(xì)、表面積大、孔隙率高，作為細(xì)胞生長的多孔支架，可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖(Kang Sff YS, Kim BS.Effect of chondrocytepassage number on histological aspects of tissue-engineered cartilage.B1medMater Eng 2007 ;17:269_76.)，這些特點(diǎn)賦予電紡絲技術(shù)在生物醫(yī)用領(lǐng)域特別是組織工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。利用納米電紡絲技術(shù)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織工程需要的具有特定功能的種子細(xì)胞，在體外擴(kuò)大培養(yǎng)后，移植體內(nèi)，可以有效的治療軟骨損傷。
[0005]聚乳酸(Polylacticacid,簡稱 PLA)、聚輕基乙酸(Polyglycolic acid,簡稱PGA)以及兩者的共聚物聚乳酸乙醇酸(poly (lactic-co-glycolie acid)),簡稱PLGA,是目前組織工程研究和應(yīng)用最為廣泛的一類材料，這類材料無毒，無抗原性，具有良好的可降解。吸收性、生物安全性和力學(xué)強(qiáng)度，可以通過控制成份含量來調(diào)節(jié)材料的降解速度，使產(chǎn)品性質(zhì)的重復(fù)性和力學(xué)性能達(dá)到較高水平。除了作為手術(shù)縫合線和藥物緩釋載體外，PLGA也用作醫(yī)療縫合補(bǔ)強(qiáng)材料、骨折內(nèi)固定材料和組織工程材料。
[0006]綜上所述，發(fā)明一種簡單、快速、易于操作、可控性強(qiáng)、并且價(jià)格低廉的纖維軟骨支架制作技術(shù)是具有十分重要意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明一種纖維軟骨支架的制備方法，以聚乳酸乙醇酸(poly (lactic-co-glycolie acid), PLGA)電紡絲構(gòu)建了纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的模型培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并讓其向纖維軟骨細(xì)胞分化。建立一種簡易的可控的不同的電紡絲表面的制作策略用于軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并很好的維持了軟骨細(xì)胞的表型。
[0008]本發(fā)明提供了一種纖維軟骨支架的制備方法，按照一下步驟進(jìn)行:
[0009](I)采用三氟乙醇作為溶劑溶解干粉狀PLGA，PLGA的濃度為20% w/v ;利用流體為泵注射PLGA溶液，流體流速為:8μ Ι/min ;利用帶有缺口的平行接收器，獲得平行的PLGA納米電紡絲，紡絲采用的電壓為8kv，在平行接收器上形成平行度好的PLGA電紡絲，2分鐘后用24 X 24mm2的干凈玻璃片收集，過2分鐘再收集，收集3次后就可得到平行取向的PLAG電紡絲；(2)利用上述的平行取向的電紡絲，調(diào)整玻璃片的收集方向，就可得到不同取向的PLGA電紡絲，最終制得纖維軟骨支架。
[0010]本發(fā)明設(shè)計(jì)了平行和垂直取向的納米PLGA電紡絲結(jié)構(gòu)，即在平行結(jié)構(gòu)后，旋轉(zhuǎn)玻璃片的90度繼續(xù)收集PLGA平行的電紡絲可得到。
[0011]本發(fā)明提供了一種以PLGA電紡絲構(gòu)建了纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的模型培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并讓其向纖維軟骨細(xì)胞分化的研究。研究軟骨細(xì)胞與平行及垂直兩個(gè)方向的納米電紡絲上的細(xì)胞生長情況。
[0012]本發(fā)明的創(chuàng)造性在于:利用可溶的PLGA電紡絲制作不同的取向的納米電紡絲表面并且用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1、無需昂貴的刻蝕設(shè)備；2、操作簡單、快速；3、實(shí)驗(yàn)成本低廉；4、不涉及有機(jī)試劑，環(huán)境友好。
【附圖說明】
[0014]圖1制作PLGA電紡絲支架的裝置圖
[0015]圖2制作PLGA電紡絲支架的流程圖。
[0016]圖3 PLGA平行，垂直電紡絲電鏡照片。I為平行PLGA電紡絲的電鏡圖，2為垂直PLGA電紡絲電鏡圖。
[0017]圖4軟骨細(xì)胞生長在不同表面(平面玻璃，平行電紡絲，垂直電紡絲)的細(xì)胞形
O
[0018]圖5軟骨細(xì)胞在生長在不同表面(平面玻璃，平行電紡絲，垂直電紡絲)的II型膠原表達(dá)的突光照片。
[0019]圖6軟骨細(xì)胞在生長在不同表面(平面玻璃，平行電紡絲，垂直電紡絲)的蛋白多糖表達(dá)的熒光照片
[0020]圖7軟骨細(xì)胞在生長在不同表面(平面玻璃，平行電紡絲，垂直電紡絲)的I型膠原表達(dá)的突光照片。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面的實(shí)施實(shí)例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例1:
[0022]PLGA紡絲制備方法與PLGA納米電紡絲結(jié)構(gòu)鑒定。
[0023]PLGA電紡絲技術(shù)裝置如圖1所示，由高壓電壓，PLGA聚合物溶液注射器與接地的平行板收集器組成，2個(gè)平行接受器的距離為10cm，注射器與接受板的距離為30cm。
[0024]具有取向的納米PLGA電紡絲的制作方法見圖2，具體按照以下步驟進(jìn)行:
[0025](I)采用三氟乙醇作為溶劑溶解干粉狀PLGA，PLGA的濃度為20% w/v ;利用流體為泵注射PLGA溶液，流體流速為:8μ Ι/min ;利用帶有缺口的平行接收器，獲得平行的PLGA納米電紡絲，紡絲采用的電壓為8kv，在平行接收器上形成平行度好的PLGA電紡絲，2分鐘后用24 X 24mm2的干凈玻璃片收集，過2分鐘再收集，收集3次后就可得到平行取向的PLAG電紡絲；
[0026](2)利用上述的平行取向的電紡絲，調(diào)整玻璃片的收集方向，就可得到不同取向的PLGA電紡絲，制的所述纖維軟骨支架。
[0027]得到的不同取向的PLGA納米電紡絲后，經(jīng)過電子濺射儀器進(jìn)行表面噴金后，進(jìn)行SEM結(jié)構(gòu)表征，如圖3所示。得到的納米纖維的直徑在200nm左右。實(shí)施例2
[0028]軟骨細(xì)胞在三種不同的表面生長的形態(tài)觀察與增殖。我們采用三種不同的表面結(jié)構(gòu)，即平面的玻璃表面，具有平行的納米的PLGA電紡絲表面和垂直的納米PLGA電紡絲培養(yǎng)第三代的原代軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)24h后明場采集數(shù)據(jù)，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)我們給出了細(xì)胞的生長的示意圖，結(jié)果如圖4所示。
[0029]實(shí)施例3
[0030]三種不同表面對于軟骨細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響。平面的玻璃表面,具有平行的納米的PLGA電紡絲表面和垂直的納米PLGA電紡絲結(jié)構(gòu)對于軟骨細(xì)胞II型膠原，蛋白多糖和I型膠原表達(dá)的影響。軟骨細(xì)胞細(xì)胞在以上3種結(jié)構(gòu)表面生長7天后，細(xì)胞固定后，進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖5，6，7所示。結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞在平行取向的納米電紡絲上能提高II型膠原與蛋白多糖的表達(dá)，同時(shí)也能顯著提高I型膠原的表達(dá)，而垂直方向的納米電紡絲會促進(jìn)II型膠原并沒有對軟骨細(xì)胞蛋白多糖的表達(dá)有促進(jìn)作用。更深層的說明，軟骨細(xì)胞在平行的納米電紡絲上更能維持軟骨表型，并更易于向纖維軟骨分化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種纖維軟骨支架的制備方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行: (1)采用三氟乙醇作為溶劑溶解干粉狀PLGA，PLGA的濃度為20%w/v ;利用流體為泵注射上述PLGA溶液，流體流速為:8μ Ι/min ;利用帶有缺口的平行接收器，獲得平行的PLGA納米電紡絲，紡絲采用的電壓為8kv，在平行接收器上形成平行度好的PLGA電紡絲，2分鐘后用24 X 24mm2的干凈玻璃片收集，過2分鐘再收集，收集3次后就可得到平行取向的PLAG電紡絲； (2)利用上述的平行取向的電紡絲，調(diào)整玻璃片的收集方向，就可得到不同取向的PLGA電紡絲。2.按照權(quán)利要求1所述的一種纖維軟骨支架的制備方法，其特征在于所述纖維軟骨支架利用修飾的基底進(jìn)行細(xì)胞-底面相互作用的研究，對與細(xì)胞在納米絲表面培養(yǎng)的增殖、活力、遷移、取向等行為進(jìn)行考察。3.按照權(quán)利要求1一種纖維軟骨支架的制備方法，其特征在于:用可控表面結(jié)構(gòu)的PLGA電紡絲表面對軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究細(xì)胞與微結(jié)構(gòu)平行及垂直兩個(gè)方向上的遷移情況。
【專利摘要】一種纖維軟骨支架的制備方法，屬納米材料及其細(xì)胞工程領(lǐng)域。按照以下步驟進(jìn)行：(1)采用三氟乙醇作為溶劑溶解干粉狀PLGA利用流體為泵注射上述PLGA溶液，利用帶有缺口的平行接收器，獲得平行的PLGA納米電紡絲，2分鐘后用24×24mm2的干凈玻璃片收集，過2分鐘再收集，收集3次后就可得到平行取向的PLAG電紡絲；(2)利用上述的平行取向的電紡絲，調(diào)整玻璃片的收集方向，就可得到不同取向的PLGA電紡絲。本發(fā)明利用可溶的PLGA電紡絲制作不同的取向的納米電紡絲表面并且用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：無需昂貴的刻蝕設(shè)備；操作簡單、快速；實(shí)驗(yàn)成本低廉；不涉及有機(jī)試劑，環(huán)境友好。
【IPC分類】A61L27/18, A61L27/38
【公開號】CN105497978
【申請?zhí)枴緾N201410484313
【發(fā)明人】秦建華, 石楊, 張旭, 李艷峰
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年9月22日