專利名稱：用wnt抑制因子－1(wif1)治療和診斷癌癥的方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2004年5月21日提交的臨時申請序列號60/573,197和2005年3月21日提交的臨時申請序列號60/664,241的優(yōu)先權(quán)，將其公開內(nèi)容全文納入本文作參考。
背景技術(shù)：
癌癥是全世界的主要殺手，肺癌是大多數(shù)國家中癌癥死亡的主要原因，世界范圍內(nèi)每年引起超過一百萬人死亡。而且，美國每年報道的新診斷肺癌病例超過170,000(Fong等，Thorax58892-900(2003)；Minna等，Cancer Cell 149-52(2002))。
在過去二十幾年中，許多不同類型的腫瘤發(fā)病率升高。近年來，人們對癌癥的分子遺傳學(xué)的了解獲得顯著進(jìn)展。例如、原癌基因和腫瘤抑制基因是調(diào)節(jié)參與控制正常細(xì)胞生長和分化的其它基因的細(xì)胞基因。這些基因編碼生長因子、生長因子受體、磷酸化各種細(xì)胞物質(zhì)的激酶和調(diào)節(jié)多種細(xì)胞基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。癌癥可能通過以下方式發(fā)生活化顯性生長促進(jìn)性原癌基因，此種基因的突變(如ras)和產(chǎn)物或過表達(dá)(如Her-2/neu和c-myc)可誘導(dǎo)惡變；使抑制腫瘤生長的抑制基因(如p53和Rb)失活，缺這些抑制基因的表達(dá)或功能將導(dǎo)致惡變。這些癌癥的遺傳基礎(chǔ)在于導(dǎo)致癌癥的改變是個體的一個或多個基因的核苷酸序列水平上的改變。
除上述遺傳改變外，也可通過外遺機(jī)制產(chǎn)生癌癥。一種外遺機(jī)制涉及由于基因序列，特別是富CpG區(qū)(CpG島)的基因序列的甲基化而使基因表達(dá)沉默。正常情況下未甲基化的CpG島的異常甲基化與人癌中已明確的腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。外遺機(jī)制如基因轉(zhuǎn)錄的甲基化沉默提供了可用于確定細(xì)胞是否易于失去正常生長控制，因此可能變成癌細(xì)胞的標(biāo)記。癌癥常常是一種潛在疾病，直到疾病晚期才產(chǎn)生臨床體征或癥狀。因此，如采用能鑒定懷疑個體所患癌癥的標(biāo)記或者甚至能夠檢測早期癌癥的標(biāo)記是很有好處的。
不幸的是，大多數(shù)癌癥沒有這種標(biāo)記。例如，常規(guī)切除早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)后患者的存活率為35-85％，這取決于腫瘤發(fā)展階段。不幸的是，檢測到的大多數(shù)肺癌已是晚期，以致NSCLC的五年總存活率僅為15％。肺癌患者死亡率高的主要原因是診斷時大約三分之二的患者已存在腫瘤轉(zhuǎn)移。對這些患者早期檢測到癌癥可提高存活率。DNA甲基化的檢測是一種有希望的鑒定肺癌的特異性生物標(biāo)記的方法，也是一種早期檢測生物標(biāo)記的非侵入性方法。
分泌性糖蛋白Wnt家族是廣泛參與發(fā)育過程和癌發(fā)生的一組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(WO04/032838)。二十多年前就已發(fā)現(xiàn)了Wnt的致癌作用。從那以后，許多報道證明，在完全不同的人癌如結(jié)直腸癌、頭頸癌(Rhee等，Oncogene 216598-605(2002))、黑色素瘤(Weeraratna等，Cancer Cell.1279-88(2002))和白血病(Jemal等，Cancer J.Clin.548-29(2004))中Wnt信號傳導(dǎo)途徑被異?；罨?br> 近年來，有報道稱Dvl蛋白在間皮瘤和NSCLC中過表達(dá)(Uestema等，Oncogene227218-7221(2003))。也證明了在肺癌細(xì)胞系中抑制Wnt-1能誘導(dǎo)凋亡和抑制腫瘤生長(Li等，J.Biol Chem.2775877-81(2002))。Wnt拮抗劑可根據(jù)其作用機(jī)制分為兩組第一組包括分泌的Frizzled相關(guān)蛋白(sFRP)家族、WNT-抑制因子-1(WIF-1)和Cerberus。這些拮抗劑通過直接結(jié)合Wnt分子而抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二組包括Dickkopf(DKK)家族，通過結(jié)合Wnt受體復(fù)合物的LRP5/LRP6組分而抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kawano等，J.細(xì)胞Sci.1162627-34(2003))。
WIF-1是天然分泌的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑。WIF-1是379個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。WIF-1具有28個氨基酸殘基的N-末端信號序列、約150個氨基酸殘基的獨特的WIF結(jié)構(gòu)域(WD)、五個表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)序列和45個氨基酸殘基的C末端親水結(jié)構(gòu)域(Hsieh等，Nature 398431-436(1999)；GenBank NP_009122)。WIF-1與Fz或sFRP的CRD(富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)沒有相似性(Bui等，Oncogene14(10)1249-53(1997)；Melkonyan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(25)13636-41(1997)；Shimizu等，Cell.Growth Differ.8(12)1349-58(1997)；和Todd等，Cancer Res.57(7)1344-52(1997))。WIF-1涉及幾種發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。例如，已證明在爪蟾(Xenopus)胚胎中WIF-1過表達(dá)能阻斷Wnt-8途徑并誘導(dǎo)異常的體節(jié)發(fā)生(Hsieh等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 963546-51(1999))。
盡管在過去的幾十年期間肺癌治療取得了進(jìn)展，但肺癌的5年存活率仍然在15％以下。NSCLC占所有肺癌的75-80％。更好了解肺癌發(fā)病機(jī)理的分子機(jī)制應(yīng)能改善肺癌患者的治療。本發(fā)明提供了用于檢測和治療WIF-1表達(dá)下調(diào)的癌癥如肺癌和誘導(dǎo)WIF-1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞凋亡的組合物、方法和試劑盒。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面基于以下發(fā)現(xiàn)WIF-1啟動子的CpG島中超甲基化(hypermethylate)常與它在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄沉默和WIF-1低表達(dá)相關(guān)。因此，在本發(fā)明的一些方面，提供的組合物可用于各種方式，例如抑制WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞中的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和治療WIF-1低表達(dá)相關(guān)疾病。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，組合物包含能結(jié)合Wnt多肽的Wnt-抑制因子-1(WIF-1)亞域多肽。優(yōu)選能抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WIF-1亞域多肽。在優(yōu)選實施方式中，該WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約1-180的氨基酸序列。其它優(yōu)選的WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-180、SEQ IDNO2的氨基酸殘基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸殘基39-176的氨基酸序列。還優(yōu)選融合于WIF-1多肽的異源氨基酸序列的WIF-1亞域多肽。
本發(fā)明提供了抑制WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞增殖的方法。此方法包括使癌細(xì)胞與有效量的WIF-1多肽接觸的步驟，以抑制癌細(xì)胞增殖。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述癌細(xì)胞包含超甲基化的WIF-1啟動子，接觸癌細(xì)胞的步驟包括通過降低WIF-1啟動子的甲基化來提高癌細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，一定量的WIF-1多肽能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
接觸癌細(xì)胞的步驟可包括在癌細(xì)胞中由包含編碼WIF-1多肽的序列的分離多核苷酸表達(dá)WIF-1多肽。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞凋亡的方法。此方法包括使癌細(xì)胞與有效量的WIF-1活性多肽相接觸的步驟，以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方法是抑制癌細(xì)胞中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，該方法包括使癌細(xì)胞與有效量的WIF-1多肽接觸的步驟，以抑制癌細(xì)胞中的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明也提供了治療WIF-1低表達(dá)相關(guān)疾病的方法。此方法包括給予需要這種治療的對象有效量的WIF-1活性多肽，以治療該疾病。優(yōu)選疾病是癌癥。
本發(fā)明也提供了檢測超甲基化WIF-1啟動子的方法。在優(yōu)選實施方式中，此方法包括使超甲基化的WIF-1啟動子與有效量的含有能與超甲基化WIF-1啟動子特異性雜交序列的寡核苷酸相接觸的步驟，以檢測超甲基化的WIF-1啟動子。
可用于本發(fā)明方法的癌細(xì)胞，或可用本發(fā)明的組合物、方法或試劑盒診斷和/或治療的癌癥包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦腫瘤、陰道癌、睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
可用于本發(fā)明方法的優(yōu)選WIF-1多肽是WIF-1亞域多肽。WIF-1亞域多肽可包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約1-180的氨基酸序列，對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-180的氨基酸序列，對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-176的氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約39-176的氨基酸序列。還優(yōu)選融合于WIF-1多肽的異源氨基酸序列的WIF-1亞域多肽。
可在體外和體內(nèi)實施本發(fā)明方法。
本發(fā)明也提供包含WIF-1多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑、運載體和/或稀釋劑的藥物組合物。藥物組合物包含本文所述WIF-1多肽。
附圖簡要說明

圖1顯示人WIF-1啟動子區(qū)中的CpG島。
圖2A顯示人癌細(xì)胞系中的WIF-1表達(dá)。N，正常細(xì)胞系；T，腫瘤細(xì)胞系。圖2B顯示了不同細(xì)胞系中人WIF-1啟動子的甲基化分析(MSP)。U，未甲基化；M，甲基化。
圖3A顯示人WIF-1啟動子的甲基化分析(硫酸氫鹽測序)。圖3B顯示了去甲基化試劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(DAC)處理不同細(xì)胞系對WIF-1表達(dá)的再活化。
圖4A顯示原發(fā)性人肺癌組織樣品中的WIF-1表達(dá)。圖4B顯示了原發(fā)性人肺癌組織樣品中WIF-1啟動子的甲基化分析(MSP)。圖4C顯示了原發(fā)性人肺癌組織樣品中WIF-1啟動子的甲基化分析(硫酸氫鹽測序)。
圖5顯示了多種癌細(xì)胞系中的WIF-1轉(zhuǎn)染。
圖6顯示轉(zhuǎn)染人WIF-1 cDNA能使NSCLC細(xì)胞系凋亡增加并抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。A圖顯示了NSCLC細(xì)胞系H460、A549、H838和H1299中WIF-1表達(dá)的Western分析。在正常人原代支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)和小呼吸道上皮細(xì)胞(SAEC)中觀察到WIF-1表達(dá)，得自293T細(xì)胞的WIF-1 CM用作陽性對照。β-肌動蛋白用作加樣對照。B圖顯示了將WIF-1 cDNA質(zhì)粒(深色柱)轉(zhuǎn)染入NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中顯著引起更多的細(xì)胞群凋亡(轉(zhuǎn)染5天后)?？蛰d體用作轉(zhuǎn)染對照(淺色柱)。C圖顯示了WIF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Western分析(“+”；轉(zhuǎn)染72小時后)；空載體用作對照(“-”)，檢測了β-聯(lián)蛋白和存活蛋白。β-肌動蛋白用作加樣對照。
圖7顯示W(wǎng)IF-1 CM誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系凋亡。A圖顯示了WIF-1 CM處理后(處理約5-7天后)SAEC細(xì)胞和三種NSCLC細(xì)胞系(H460、A549和H838)的0.5％結(jié)晶紫染色結(jié)果。B圖顯示了WIF-1 CM能誘導(dǎo)三種NSCLC細(xì)胞系(H460、A549和H838)凋亡。此圖顯示了用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡分析的例子。用WIF-1 CM處理NSCLC細(xì)胞約5-7天(深色柱)。收集293T細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基用作對照(淺色柱)。C圖顯示了H460細(xì)胞(處理5天后)的流式細(xì)胞術(shù)分析，作為劑量依賴性凋亡誘導(dǎo)的例子。FL1-H代表膜聯(lián)蛋白的V-FITC染色。D圖顯示了WIF-1 CM處理72小時之前(“對照”)和之后(“WIF-1(1/50)”和“WIF-1(1/5)”)的Western分析。此分析顯示人WIF-1能抑制肺癌細(xì)胞系H460中的Wnt信號傳導(dǎo)途徑。分析了β-聯(lián)蛋白、存活蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞色素C的表達(dá)。β-肌動蛋白用作加樣對照。制備胞漿蛋白質(zhì)。采用全細(xì)胞蛋白質(zhì)作細(xì)胞周期蛋白D1分析。
圖8顯示純化的人WIF-1蛋白能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系凋亡。A圖顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析，證明WIF-1蛋白能以劑量依賴方式引起H460細(xì)胞死亡。用WIF-1蛋白處理H460細(xì)胞約7天。下方的圖顯示了H460細(xì)胞的0.5％結(jié)晶紫染色結(jié)果。B圖顯示了WIF-1蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡。FL1-H代表膜聯(lián)蛋白的V-FITC染色。C圖顯示用(“+”)或不用(“-”)WIF-1 CM處理H460細(xì)胞72小時的Western分析。分析了Dv1-3、β-聯(lián)蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。β-肌動蛋白用作加樣對照。制備胞漿蛋白質(zhì)。采用全細(xì)胞蛋白質(zhì)作細(xì)胞周期蛋白D1分析。
圖9顯示W(wǎng)IF-1再表達(dá)能誘導(dǎo)多種人癌細(xì)胞系凋亡。用pcDNA3.1-空(淺色柱)或用pcDNA3.1-WIF-1(深色柱)轉(zhuǎn)染所示細(xì)胞系，測定％凋亡。
圖10顯示無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系H460凋亡。
圖11顯示純化的重組人WIF-1蛋白(Abnova Corp.)能劑量依賴地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系H460凋亡。
圖12顯示無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)427凋亡。
圖13顯示無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX凋亡。
圖14顯示無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系FEMX凋亡。
圖15顯示無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)蛋白能劑量依賴地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX凋亡。
圖16顯示重組WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)蛋白能抑制黑色素瘤細(xì)胞系LOX中的Wnt信號傳導(dǎo)途徑。分析了蓬亂蛋白(dishevelled)-3、β-聯(lián)蛋白、存活蛋白和細(xì)胞色素C的表達(dá)。β-肌動蛋白用作加樣對照。
圖17顯示正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的WIF-1蛋白表達(dá)。WIF-1蛋白在正常的原代培養(yǎng)細(xì)胞、NHBE、SAEC和NHEK中表達(dá)。WIF-1蛋白在人癌細(xì)胞，包括肺癌(H460、A549)、乳腺癌(MCF-7)、結(jié)腸癌(SW480)和間皮瘤(MS-1、H2052)中低表達(dá)。
圖18顯示編碼WIF-1全長(三角形)的DNA和編碼WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD；星號)的DNA能在體內(nèi)減小腫瘤體積。對照組包括無載體對照(菱形)和載體對照(正方形)。每周測定兩次腫瘤大小。
圖19顯示W(wǎng)IF-1結(jié)構(gòu)域(WD；正方形)重組蛋白能在體內(nèi)減小腫瘤體積。對照，菱形。每周測定兩次腫瘤大小。
圖20顯示重組全長人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SNU 398中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞毒作用。將10μl和100μl含重組全長人WIF-1多肽的CM(SEQ ID NO2)加入細(xì)胞中。用膜聯(lián)蛋白V試驗定量測定處理5天后的凋亡細(xì)胞。
圖21顯示重組全長人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)對結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116的細(xì)胞毒作用。加入200μl含重組全長人WIF-1多肽(SEQ ID NO2)的CM4天后，HCT-116細(xì)胞的0.5％結(jié)晶紫染色結(jié)果，觀察到幾乎100％的細(xì)胞殺死?；罴?xì)胞被染色。
圖22顯示重組人WIF-1亞域多肽(SEQ ID NO26)對黑色素瘤細(xì)胞系LOX和肺癌細(xì)胞系H460引起的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞毒作用。
圖23顯示重組人WIF-1亞域多肽(SEQ ID NO27)對黑色素瘤細(xì)胞系LOX引起的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞毒作用。
圖24顯示在黑色素瘤細(xì)胞系LOX上重組成熟人WIF-1多肽(SEQ ID NO30)引起的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞毒作用。
圖25顯示人WIF-1氨基酸序列(hWIF-1；參見SEQ ID NO2和GenBank登錄號NP_009122)與相應(yīng)的小鼠序列(mWIF-1；參見SEQ ID NO22和GenBank登錄號NP_036045)、大鼠序列(rWIF-1；參見SEQ ID NO23和GenBank登錄號Q6IN38)、爪蟾序列(xWIF-1；參見SEQ ID NO24和GenBank登錄號AAD25404)和紋斑魚序列(zWIF-1，參見SEQ ID NO25和GenBank登錄號Q9W6F9)的比對。“*”表示所比對的WIF-1序列中在所示位置上的WIF-1氨基酸殘基相同；“”表示發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸取代位置；“.”表示所發(fā)現(xiàn)的非保守氨基酸取代位置。
發(fā)明詳述I.定義術(shù)語“WIF-1”指核酸、多肽及其多態(tài)性變體、等位基因、突變體和其種間同源物，如本文進(jìn)一步所述，它們(1)所具有的氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、75、100、150、200、250、300、350或379個氨基酸的區(qū)域上，與下述WIF-1序列的氨基酸序列相同性高于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高；(2)能結(jié)合針對包含以下所示氨基酸序列或其保守性修飾的變體的免疫原所產(chǎn)生的抗體，如多克隆抗體；(3)能結(jié)合Wnt蛋白；(4)能干擾Wnt與Wnt結(jié)合分子的結(jié)合；(5)能至少部分抑制Wnt信號傳導(dǎo)途徑；(6)在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下能與以下所示核酸序列或其保守性修飾變體特異性雜交；(7)所具有的核酸序列優(yōu)選在至少約30、50、100、200、500、1000、1,500、2000或更多個核苷酸的區(qū)域上，與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19的核苷酸序列相同性高于約90％，優(yōu)選高于約96％、97％、98％、99％或更高；和/或(8)至少具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ IDNO28、SEQ ID NO29或SEQ ID NO30的25個，常常是50、75、100、150、200、250、300、350或379個毗連氨基酸殘基；或者至少具有SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19的25個，常常是50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1,000、1,200、1,500、2,000或更多個毗連核苷酸。
WIF-1多核苷酸或多肽序列一般是人的，但可能是其它哺乳動物的，包括但不限于非人靈長類，嚙齒類如大鼠、小鼠或倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或其它哺乳動物?！癢IF-1”多肽和多核苷酸包括天然產(chǎn)生的形式或重組形式。因此，在一些實施方式中，本文所述的WIF-1多肽和WIF-1亞域多肽可包含對應(yīng)于人WIF-1序列的序列。因此，本文提供了示范性WIF-1，它們是本領(lǐng)域已知的。例如，人WIF-1多肽的GenBank登錄號是AAD25402、AAQ88710、AAH18037、NP_009122和Q9Y5W5。全長WIF-1的氨基酸殘基178存在有一些氨基酸序列異質(zhì)性。據(jù)報道此位置為亮氨酸和谷氨酰胺氨基酸殘基。小鼠WIF-1多肽的GenBank登錄號是(例如)Q9WUA1、NP_036045和AAD25403；大鼠WIF-1的GenBank登錄號是Q6IN38；牛WIF-1的登錄號是XP_582244；爪蟾WIF-1的登錄號是AAD25404和Q9W6F8，紋斑魚WIF-1的登錄號是Q9W6F9和AAD25405。
術(shù)語“Wnt”、“Wnt多肽”或“Wnt配體”指與無翅型果蠅(Drosophila)節(jié)段極性基因相關(guān)的一個哺乳動物蛋白質(zhì)家族。在人類中，Wnt基因家族一般編碼38-43kDa具有疏水信號序列的富半胱氨酸糖蛋白和保守的天冬酰胺-連接的寡糖共有序列(Shimizu等，Cell Growth Differ8(12)1349-58(1997))。Wnt家族至少包含19個哺乳動物成員。示范性Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。Wnt多肽優(yōu)選哺乳動物Wnt多肽，更優(yōu)選人Wnt多肽。
在涉及WIF-1蛋白的內(nèi)容中，術(shù)語“Wnt結(jié)合亞域蛋白”、“WIF-1結(jié)構(gòu)域蛋白”、“WIF-1亞域多肽”、“WD蛋白”或其語法等效形式，指可結(jié)合Wnt多肽或可干擾Wnt信號傳導(dǎo)途徑的WIF-1蛋白片段。
本文所用“WIF-1相關(guān)”多肽指WIF-1同源物、WIF-1同種型，WIF-1直向同源物、WIF-1融合蛋白或它們的片段或組合。
“WIF-1同源物”指包含與WIF-1相似的氨基酸序列但不一定具有與WIF-1相似或相同功能的多肽。
“WIF-1同種型”指由相同基因編碼，但pI或MW或二者不同的WIF-1變體。這種同種型的氨基酸組成可以不同(如因另路剪接或限制性蛋白水解所致)，另外，或者可由不同的翻譯后修飾產(chǎn)生(如糖基化、?；蛄姿峄?。
本文所用“WIF-1直向同源物”指非人多肽，其(i)包含與人WIF-1相似的氨基酸序列，和(ii)具有與人WIF-1相似或相同的功能。
本文所用“WIF-1融合蛋白”指包含以下氨基酸序列的多肽(i)WIF-1、WIF-1片段、WIF-1亞域多肽、WIF-1相關(guān)多肽或WIF-1相關(guān)多肽的片段的氨基酸序列，和(ii)異源多肽(即非WIF-1、非WIF-1片段或非WIF-1相關(guān)多肽)的氨基酸序列。
“全長”WIF-1多肽或核酸指WIF-1多肽或多核苷酸序列或其變體，它們含有通常在一種或多種天然產(chǎn)生的野生型WIF-1多核苷酸或多肽序列所含的所有元件?！叭L”可以在翻譯后加工或剪接，包括另路剪接和信號肽切割的各個階段之前或之后。
術(shù)語“超甲基化”指在WIF-1基因序列中通常不甲基化的位置，如WIF-1啟動子中的胞嘧啶甲基化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，檢測WIF-1基因區(qū)域如啟動子中的超甲基化不需要分析該啟動子中的每個CpG殘基。甲基化分析的目標(biāo)可以是一個或多個CpG殘基。因此，提到多核苷酸序列時，“超甲基化”一般指與對照(如癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞)相比甲基化堿基的數(shù)量增加?！俺谆币仓概c對照相比含有加入甲基的胞嘧啶殘基的數(shù)量或頻率。
“WIF-1啟動子”指包含控制“WIF-1”轉(zhuǎn)錄的一個或多個調(diào)控區(qū)的序列。在一些實施方式中，WIF-1啟動子是人WIF-1啟動子。示范性人WIF-1啟動子序列包含SEQ ID NO3所列核苷酸序列。
提到多核苷酸序列如WIF-1啟動子時，“減少甲基化”指與對照(如癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞)相比甲基化堿基的數(shù)量減少。該術(shù)語也指與對照相比含有加入甲基的胞嘧啶殘基的數(shù)量或頻率。
本文所用“生物樣品”是含有核酸或多肽的生物組織或液體樣品。這種樣品一般來自人，但包括分離自非人靈長類或嚙齒類如小鼠和大鼠的組織。生物樣品也可包括組織切片如活檢和尸檢樣品、為進(jìn)行組織學(xué)檢驗制備的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、眼淚、粘液、頭發(fā)、皮膚等。生物樣品也包括外植體和獲自患者組織的原代和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。“生物樣品”也指細(xì)胞或細(xì)胞群或動物的一些組織或液體。最常見的是，生物樣品取自動物，但術(shù)語“生物樣品”也可指體內(nèi)分析，即不從動物取出的細(xì)胞或組織?！吧飿悠贰币话愫袆游锏募?xì)胞，但該術(shù)語也指可用于測定癌癥相關(guān)性多核苷酸或多肽水平的無細(xì)胞生物材料，如血液、唾液或尿液的無細(xì)胞組分。許多類型的生物樣品可用于本發(fā)明，包括但不限于組織活檢樣品、血液樣品、口腔刮出物、唾液樣品或乳頭溢液。本文所用“組織活檢樣品”指得自動物，優(yōu)選人的用于診斷分析的一些組織。在癌癥患者中，組織可取自腫瘤，以便分析腫瘤中的細(xì)胞?！敖M織活檢樣品”可指任何類型的活檢樣品，如穿剌活檢樣品、細(xì)針穿剌活檢樣品、手術(shù)活檢樣品等。
“提供生物樣品”指獲得生物樣品，用于本發(fā)明所述方法。最常見的是，通過提取患者的細(xì)胞樣品，但也可采用先前分離的細(xì)胞(如由另一人分離、在另一個時間、和/或用于另一種目的)，或在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明方法提取。具有治療或結(jié)果病史的存檔組織尤其有用。
生物樣品中的“WIF-1 mRNA水平”指轉(zhuǎn)錄自細(xì)胞或生物樣品中存在的WIF-1基因的mRNA量。該mRNA通常編碼有功能的WIF-1蛋白，但可存在改變或消除了該編碼蛋白功能的突變。不需要定量測定“WIF-1 mRNA水平”，但可簡單地檢測，如用人目測，與或不與對照樣品的水平或?qū)φ諛悠返念A(yù)計水平作比較。
生物樣品中的“WIF-1蛋白或多肽水平”指由細(xì)胞或生物樣品中存在的WIF-1mRNA翻譯產(chǎn)生的多肽量。該多肽可以具有或不具有WIF-1蛋白活性。不需要定量測定“WIF-1蛋白水平”，但可簡單地檢測，如用人目測，與或不與對照樣品的水平或?qū)φ諛悠返念A(yù)計水平作比較。
本文所用術(shù)語“治療”包括(1)預(yù)防疾病，如癌癥，即引起可能傾向于發(fā)生該疾病但仍未經(jīng)歷任何疾病癥狀的對象不發(fā)生該疾病的臨床癥狀；(2)抑制疾病，即阻滯或降低疾病或其臨床癥狀的發(fā)展；或(3)緩解疾病，即引起疾病或其臨床癥狀消退。需要這種治療的對象優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選人。
提到兩個或多個核酸或多肽序列時，術(shù)語“相同”或“相同性”百分?jǐn)?shù)指用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法，以下述默認(rèn)參數(shù)或通過手工比對和觀察(參見例如，NCBI網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)測定時，兩個或多個序列或亞序列相同或特定百分?jǐn)?shù)的氨基酸殘基或核苷酸相同(即比較窗或指定區(qū)域上比較和比對最大對應(yīng)性時，特定區(qū)域上相同性約60％，優(yōu)選70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。那么，可稱這些序列“基本相同”。此定義也指，或可用于，受試序列的互補(bǔ)序列(compliment)。此定義也包括具有缺失和/或加入的序列，以及具有取代的序列，以及天然產(chǎn)生的序列如多態(tài)性或等位基因變體和人造變體。如下所述，優(yōu)選的算法可計算缺口等。相同性優(yōu)選存在于長度至少約為25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
為了比較序列，一般將一個序列用作參比序列，將受試序列與其作比較。當(dāng)采用序列比較算法時，將受試序列和參比序列輸入計算機(jī)，(如果需要)指定亞序列坐標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選采用默認(rèn)程序參數(shù)，或可指定另選參數(shù)。然后，用序列比較算法根據(jù)這些程序參數(shù)計算受試序列相對于參比序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。
這里所用的“比對窗口”包括選自通常數(shù)目約20-600、經(jīng)常約50-200、更常見約100-150個毗連位置之一的片段，在將兩段序列最佳排列對齊后，將一段序列與具有相同數(shù)目毗連未知的參照序列作比對。排列序列進(jìn)行比對的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于比對的最佳序列排列對比可以采用，例如Smith&Waterman，Adv.Appl. Math.2482(1981)中報道的局部同源算法、采用Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)中報道的同源排列算法、采用Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988)中報道的相似性搜尋方法、采用計算機(jī)執(zhí)行這些算法(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或通過手工排列對比和目測(參見，例如Ausubel等人主編的《新編分子生物學(xué)實驗指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，1995增刊。
適合于測定序列相同性和序列相似性百分比的優(yōu)選算法的例子包括BLAST和BLAST2.0算法，這些算法在Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中作了描述。BLAST和BLAST2.0使用本文所述的參數(shù)來測定本發(fā)明核酸與蛋白的序列相同性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件公眾可以通過國家生物技術(shù)信息中心獲得。該算法包括鑒定查詢序列中的長度為W的短字段，將該短字段與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字段排列對比，兩者相匹配或滿足一定的正評分閾值T時，先鑒定出高評分的序列對(HSPs)。T值指相鄰字段的評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字段命中時可用作啟動搜尋來發(fā)現(xiàn)包含它們在內(nèi)的更長HSP的種子字段。將命中的字段沿每條序列的兩側(cè)方向延伸，盡可能提高累積的排列對比評分值。例如對于核苷酸序列而言，累積的評分可用參數(shù)M(一對匹配殘基的加分總是大于0)和N(錯配殘基的扣分總是小于0)進(jìn)行計算。對于氨基酸序列來說，可利用評分矩陣計算累計的評分值。命中字段沿兩側(cè)方向延伸在以下情況時中斷累計的排列對比評分值從其達(dá)到的最高值下跌X數(shù)量時；由于一個或多個負(fù)得分殘基對比的累積導(dǎo)致累計分值降至0或更低時；或達(dá)到了序列兩末端之一時。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了該排列對比的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默認(rèn)值是字段長度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，和對雙鏈進(jìn)行比對。對于氨基酸序列來說，BLASTP程序采用的默認(rèn)值是字段長度3、期望值10和BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))排列對比值(B)50、期望值10、M＝5、N＝-4，和對雙鏈進(jìn)行比對。
BLAST算法也進(jìn)行兩條序列間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(例如參見Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一種相似性衡量值是最小秩和概率(P(N))，表示兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然匹配的概率。例如，如果在待測序列與參照序列的比較時最小秩和概率小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，就認(rèn)為該核酸與參照序列相似。對數(shù)值可以是大的負(fù)數(shù)，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等。
兩個核酸序列或多肽基本上相同的一個標(biāo)志是第一條核酸編碼的多肽與用第二條核酸編碼的多肽所產(chǎn)生的抗體可發(fā)生如下所述的免疫交叉反應(yīng)。因而，例如當(dāng)兩段肽只有保守性置換差異時，一條多肽通常與第二條多肽基本相同。兩條核酸序列基本相同的另一個標(biāo)志是這兩種分子或其互補(bǔ)鏈在如下所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能互相雜交。兩條核酸序列基本相同的另一個標(biāo)志是可采用相同的引物來擴(kuò)增此二序列。
“宿主細(xì)胞”是含有表達(dá)載體并能支持該表達(dá)載體復(fù)制或表達(dá)的天然產(chǎn)生的細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體、體內(nèi)細(xì)胞等。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲細(xì)胞、兩棲類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，如CHO、293、3T3、HeLa等(參見例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。
術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學(xué)上純凈的”指該物質(zhì)幾乎或基本沒有其天然狀態(tài)時通常所見的伴隨成分。純度和均一性通常可采用例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC等分析化學(xué)技術(shù)測定。制劑中主要物質(zhì)蛋白或核酸是基本上純化的。具體地說，分離的核酸不含有與所述基因天然側(cè)接的某些開放閱讀框和編碼所述基因編碼蛋白以外的蛋白質(zhì)的開放閱讀框。在一些實施方式中，術(shù)語“純化的”指核酸或蛋白在電泳凝膠上基本上只產(chǎn)生單一條帶。所述核酸或蛋白的純度優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少99％。在其他實施方式中，“純化”指從待純化的組合物中去除至少一種雜質(zhì)。就此含義而言，純化不要求所純化的化合物均一，例如100％純。
術(shù)語“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。此術(shù)語用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸殘基聚合物以及天然氨基酸聚合物、可包含修飾的殘基以及非天然的氨基酸聚合物。
術(shù)語“氨基酸”指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及功能類似于天然氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸指那些由遺傳密碼子編碼的氨基酸以及那些隨后經(jīng)修飾的氨基酸(例如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)?！鞍被犷愃莆铩敝妇哂信c天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，結(jié)合氫原子、羧基、氨基和R基團(tuán)的α碳原子)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、亞砜甲硫氨酸、甲锍甲硫氨酸。這樣的類似物可以具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但保持了天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)?！鞍被崮M物”指其結(jié)構(gòu)不同于氨基酸通常的化學(xué)結(jié)構(gòu)、但其功能類似于天然氨基酸的化合物。
本文中氨基酸用其通用的3字母符號表示或用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸用其通用的單字母碼表示。
“保守性修飾變體”用于指氨基酸和核酸序列。對于具體的核酸序列而言，保守性修飾變體指那些編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或所述核酸不編碼例如與天然鄰接序列基本相同或相關(guān)序列的氨基酸序列。由于遺傳密碼子的簡并性，許多功能上相同的核酸編碼大部分蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由一個密碼子確定丙氨酸的每個位置上，該密碼子可改變?yōu)樗龅牧硪粋€密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守性修飾變異的一種。本文所述編碼多肽的每個核酸序列也包括該核酸的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在某些上下文中可修飾某核酸中的各密碼子(除AUG和TGG外，AUG是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)而產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，就表達(dá)產(chǎn)物而非實際探針序列而言，在所述序列中通常包含編碼多肽的核酸的沉默變異。
關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，對核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行個別的置換、篩除或添加或在編碼序列中進(jìn)行低百分比氨基酸的置換、刪除或添加是一種“保守性修飾變體”，如果所述的改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸置換某氨基酸時。提供功能上相似的氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域所熟知的。這類保守性修飾變體是本發(fā)明多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因的補(bǔ)充而不是排斥。典型的相互保守性置換是1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)和谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton所著《蛋白質(zhì)》(Proteins)，1984)。
大分子結(jié)構(gòu)如多肽結(jié)構(gòu)可用術(shù)語“組成水平不同”來描述。對這種組織水平的總體描述，可參見例如Alberts等所著《細(xì)胞分子生物學(xué)》第3版(Molecular Biology ofthe Cell(1994))以及Cantor&Schimmel所著《生物物理化學(xué)》第一部分《生物大分子構(gòu)象》(Biophysical Chemistry Part IThe Conformation of Biological Macromolecules(1980))?！耙患壗Y(jié)構(gòu)”指具體肽的氨基酸序列?！岸壗Y(jié)構(gòu)”指多肽中局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是通常形成該多肽緊湊單位的一部分，通常長度為25-500個氨基酸。典型的結(jié)構(gòu)域由例如β折疊和α螺旋等更低組成部分的結(jié)構(gòu)構(gòu)成。“三級結(jié)構(gòu)”指多肽單體完整的三維結(jié)構(gòu)?！八募壗Y(jié)構(gòu)”指通常由獨立的三級單位通過非共價締合形成的三維結(jié)構(gòu)。
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或語法等效形式指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。寡核苷酸一般長約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多個核苷酸，可長達(dá)約100個核苷酸。核酸和多核苷酸可以是任何長度的聚合物，包括較長長度，如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。本發(fā)明核酸通常含有磷酸二酯鍵，但在一些情況下，包括可具有另一種主鏈的核酸類似物，包括例如亞氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亞氨基磷酸酯(phophoroamidite)連接(參見Eckstein，《寡核苷酸和類似物實踐方法》(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大學(xué)出版社)；以及肽核酸主鏈和連接。其它核酸類似物包括具有帶正電主鏈、非離子型主鏈和非核糖主鏈的核酸，包括美國專利號5,235,033和5,034,506以及Sanghui和Cook主編《反義研究中的糖修飾》(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)中ASC研討會系列580第6章和第7章所述核酸。核酸的一種定義也包括含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸?？梢蚋鞣N原因而修飾核糖-磷酸主鏈，例如增加所述分子在生理環(huán)境中或作為生物芯片上的探針的穩(wěn)定性和半衰期?？芍苽涮烊划a(chǎn)生的核酸和類似物的混合物；或者，可制備不同核酸類似物的混合物以及天然產(chǎn)生的核酸和類似物的混合物。
各種參考文獻(xiàn)公開了這種核酸類似物，包括例如亞氨基磷酸酯(Beaucage等，Tetrahedron 49(10)1925(1993)和其參考文獻(xiàn)；Letsinger，J.Org. Chem. 353800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biochem. 81579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.143487(1986)；Sawai等，Chem.Lett. 805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem. Soc. 1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta 26141 91986))，硫代磷酸酯(Mag等，NuclearAcids Res.191437(1991)；和美國專利號5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.1112321(1989)，O-甲基亞氨基磷酸酯連接(參見Eckstein，《寡核苷酸和類似物實踐方法》(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大學(xué)出版社)；以及肽核酸主鏈和連接(參見Egholm，J.Am.Chem.Soc.1141895(1992)；Meier等，Chem.Iht.Ed.Engl.311008(1992)；Nielsen，Nature 365566(1993)；Carlsson等，Nature 380207(1996)，將所有這些文獻(xiàn)納入作參考)。其它核酸類似物包括具有帶正電主鏈的核酸(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097(1995)；具有非離子型主鏈的核酸(美國專利號5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；Letsinger等，Nucleoside and Nucleotide 131597(1994)；Y.S.Sanghui和P.Dan Cook主編《反義研究中的糖修飾》(Carbohydrate Modifications inAntisense Research)中ASC研討會系列第2章和第3章；Mesmaeker等，Bioorganic andMedicinal Chem.Lett.4395(1994)；Jeffs等，J. Biomolecular NMR 3417(1994)；Tetrahedron Lett.37743(1996))和非核糖主鏈，包括美國專利號5,235,033和5,034,506以及Y.S.Sanghui和P.Dan Cook主編《反義研究中的糖修飾》(CarbohydrateModifications in Antisense Research)中ASC研討會系列580第6章和第7章所述的核酸。核酸的一種定義也包括含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸(參見Jenkins等，Chem.Soc.Rev.169-176頁(1995))。Rawls，C&E News，1997年6月2日，第35頁描述了幾種核酸類似物。特別將所有這些參考文獻(xiàn)納入本文作參考。
其它類似物包括作為肽核酸類似物的肽核酸(PNA)。與天然產(chǎn)生核酸的高度帶電磷酸二酯主鏈相反，在中性條件下，這些主鏈基本上是非離子型。這產(chǎn)生了兩個優(yōu)點。第一，PNA主鏈具有改進(jìn)的雜交動力學(xué)。PNA的錯配堿基對與完美匹配堿基對相比解鏈溫度(Tm)改變較大。有一個內(nèi)部錯配的DNA和RNA一般Tm降低2-4℃。采用非離子型PNA主鏈時，Tm降低接近7-9℃。類似地，由于它們的非離子特性，連接于這些主鏈的堿基雜交時對鹽濃度相對不敏感。此外，PNA不會被細(xì)胞酶降解，因此可能更穩(wěn)定。
如具體描述的那樣，核酸可以是單鏈或雙鏈，或者含有雙鏈或單鏈序列部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述單鏈的定義也包括互補(bǔ)鏈序列；因此本文所述序列也包括該序列的互補(bǔ)序列。所述核酸可以是DNA(包括基因組DNA和cDNA)、RNA或雜交體，所述核酸可含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及以下堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌啉、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等?！稗D(zhuǎn)錄物”一般指天然產(chǎn)生的RNA，如前mRNA、hnRNA或mRNA。本文所用術(shù)語“核苷”包括核苷酸和核苷以及核苷酸類似物和修飾核苷，如氨基修飾的核苷。此外，“核苷”包括非天然產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似物。因此，例如，本文中將各含有一個堿基的肽核酸的單個單元稱為核苷。
“標(biāo)記”或“可檢測部分”是可用分光光度、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理手段檢測到的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括32p、熒光染料、電子致密試劑、酶(如常用于ELISA中的)、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白質(zhì)或其他能被檢測到的試劑，例如通過將放射性標(biāo)記摻入肽中，或用于檢測與所述肽特異性反應(yīng)的抗體?？蓪?biāo)記摻入乳腺癌核酸、蛋白質(zhì)和抗體的任何位置中?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的抗體和標(biāo)記偶聯(lián)方法，包括Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30407(1982)所述的那些方法。
“標(biāo)記的核酸探針或寡核苷酸”是通過接頭或化學(xué)鍵以共價方式，或通過離子鍵、范德華力、靜電作用或氫鍵以非共價方式結(jié)合有某標(biāo)記物的核酸，可通過檢測結(jié)合于探針的該標(biāo)記物的存在來測定該探針的存在。或者，可采用高親和力相互作用方法獲得相同結(jié)果，其中結(jié)合伴侶之一與另一伴侶(如生物素、鏈霉抗生物素蛋白)結(jié)合。
如本文所用“核酸探針或寡核苷酸”定義為能夠通過一種或多種類型的化學(xué)鍵，通常通過互補(bǔ)堿基配對、通常通過氫鍵形成結(jié)合于互補(bǔ)序列靶核酸的核酸。本文所用探針可包括天然堿基(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥苷、肌苷等)。此外，探針中的堿基可通過除磷酸二酯鍵以外的連接鍵相連接，只要它不干擾雜交功能。因此，例如，探針可以是組成堿基通過肽鍵而非磷酸二酯鍵相連接的肽核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，探針可依據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性結(jié)合與該探針序列不完全互補(bǔ)的靶序列。探針優(yōu)選直接標(biāo)記或間接標(biāo)記，如用同位素、生色團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、色原直接標(biāo)記，或用隨后可結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物的生物素間接標(biāo)記。通過測定是否存在該探針，可以檢測是否存在選擇的序列或亞序列?？筛鶕?jù)基因組水平，或RNA水平或蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行診斷或預(yù)后。
在用于指例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時，術(shù)語“重組”表示所述細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過外源核酸或蛋白質(zhì)的引入或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變進(jìn)行了修飾，或所述細(xì)胞衍生自這種經(jīng)修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞可表達(dá)在該細(xì)胞天然(未重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因或可表達(dá)該細(xì)胞異常時表達(dá)的、低表達(dá)的或完全不表達(dá)的基因。本文所用術(shù)語“重組核酸”指通常最初在體外形成的核酸通過核酸操作，例如用聚合酶和內(nèi)切酶，以通常自然界中不存在的形式存在的核酸。這樣，實現(xiàn)了不同序列的操作性連接。因此認(rèn)為，將分離的線性核酸，或?qū)⑼ǔ２贿B接的DNA分子在體外連接形成表達(dá)載體均是符合本發(fā)明目的的重組核酸。應(yīng)理解，一旦制備了重組核酸并將其重新導(dǎo)入宿主細(xì)胞或有機(jī)體中，該核酸將以非重組方式復(fù)制，即在體內(nèi)能利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)制而不是體外操控而復(fù)制；然而，這樣的核酸一旦以重組方式產(chǎn)生，雖然隨后以非重組方式復(fù)制，仍認(rèn)為是適應(yīng)于本發(fā)明目的的重組核酸。類似地，“重組蛋白”是用重組技術(shù)制造(即通過上述重組核酸的表達(dá))的蛋白質(zhì)。
當(dāng)用于指核酸部分時，術(shù)語“異源”表示所述核酸包含兩個或多個亞序列，這些亞序列通常在自然條件下不存在相同的相互關(guān)系。例如，含有兩個或多個序列的所述核酸通常以重組方式產(chǎn)生，例如從無關(guān)基因制備新的功能性核酸，例如，從一種來源的啟動子和另一來源的編碼區(qū)制備新的核酸。類似地，異源蛋白質(zhì)通常指天然不存在相互關(guān)系的兩個或多個亞序列組成的蛋白質(zhì)(例如融合蛋白)。
“啟動子”定義為指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一列核酸控制序列。本文所用啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列，如聚合酶II型啟動子是TATA元件。啟動子也任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑子元件，它們可以位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點多達(dá)幾千個堿基。
“組成性”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動子。“誘導(dǎo)型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。術(shù)語“操作性連接”指核酸表達(dá)控制序列(如啟動子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點序列)與第二核酸序列之間的功能性連接，此連接中表達(dá)控制序列能指導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
“表達(dá)載體”是通過重組或合成方法產(chǎn)生的核酸構(gòu)建物，它具有能夠在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特定核酸的一系列特定核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)載體包含的待轉(zhuǎn)錄核酸操作性連接于啟動子。
術(shù)語“選擇性(或特異性)雜交”指當(dāng)一序列存在于復(fù)雜混合物(如總細(xì)胞或文庫的DNA或RNA)中時，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下該分子僅與特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。
術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指一般在復(fù)雜的核酸混合物中，探針與其靶亞序列而不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴的，并且在不同情況下不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的廣泛指南可見Tijssen，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)—與核酸探針雜交》(Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes)，“雜交原理和核酸試驗方案概述”(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays)(1993)。通常，選擇比特定序列在確定離子強(qiáng)度pH下熱解鏈點(Tm)低約5-10℃的嚴(yán)謹(jǐn)條件。Tm是與靶序列互補(bǔ)的50％探針與靶序列雜交達(dá)到平衡(由于靶序列過量存在，在Tm下，50％探針平衡時被占據(jù))時的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件是在pH7.0-8.3時鹽濃度低于約1.0M鈉離子，一般約為0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)；對于短探針(如10-50個核苷酸)溫度至少約為30℃，對于長探針(如大于50個核苷酸)溫度至少約為60℃的條件。也可通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的兩倍，優(yōu)選為背景雜交的10倍。示范性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可以如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃孵育，或者5×SSC、1％SDS，65℃孵育，用0.2×SSC洗滌，以及65℃，0.1％SDS。對于PCR，低嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增的溫度一般約為36℃，但是退火溫度可在約32℃～48℃之間變化，這取決于引物長度。對于高嚴(yán)謹(jǐn)PCR擴(kuò)增，溫度一般約為62℃，但高嚴(yán)謹(jǐn)退火溫度可約為50℃-65℃，這取決于引物長度和特異性。高嚴(yán)謹(jǐn)和低嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增的循環(huán)條件包括變性階段90℃-95℃，30秒-2分鐘；退火階段持續(xù)30秒-2分鐘；延伸階段為約72℃1-2分鐘。文獻(xiàn)提供了低嚴(yán)謹(jǐn)和高嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指南，如Innis等，(1990)《PCR方案，方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.紐約)。
如果核酸編碼的多肽基本相同，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不互相雜交的核酸仍然基本相同。例如，當(dāng)利用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時，發(fā)生這種情況。在這種情況下，核酸一般在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。示范性“中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”包括在含40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中37℃雜交，用1×SSC在45℃洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難認(rèn)識到，可采用另一種雜交和洗滌條件來提供嚴(yán)謹(jǐn)性相似的條件。許多參考文獻(xiàn)中提供了確定雜交參數(shù)的其它指南，例如《新編分子生物學(xué)實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等編。
“測定功能性作用”指測定在WIF-1的間接或直接影響下參數(shù)(如功能、酶、物理和化學(xué)作用)增加或降低的化合物?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測定這種功能作用，如蛋白質(zhì)的光譜特征(如熒光、吸光度、折射率)、流體力學(xué)特性(如形狀)、色譜特性或溶解性改變，測定誘導(dǎo)性標(biāo)記或WIF-1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；測定結(jié)合活性如結(jié)合于Frizzled受體，測定細(xì)胞增殖，測定凋亡等。也可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試驗如體外試驗測定某化合物對癌癥的功能性作用，所述體外試驗如軟瓊脂上的細(xì)胞生長；錨定依賴性；接觸抑制和生長密度限制；細(xì)胞增殖；細(xì)胞轉(zhuǎn)化；生長因子或血清依賴性；腫瘤特異性標(biāo)記的水平；侵入基質(zhì)膠(Matrigel)；體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)以及癌細(xì)胞的其它特征。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法評價此功能性作用，如用于定量或定性測定形態(tài)學(xué)特征變化的顯微鏡觀察、WIF-1 RNA或蛋白質(zhì)水平變化的測定、RNA穩(wěn)定性的測定、下游或報道基因表達(dá)(CAT、熒光素酶、β-gal、GFP等)的鑒定，如通過化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)，抗體結(jié)合、可誘導(dǎo)標(biāo)記和配體結(jié)合實驗?！肮δ苄宰饔谩卑w外、體內(nèi)和離體活性。
WIF-1多核苷酸和多肽序列的“激活物”或“調(diào)節(jié)物”表示能活化WIF-1的物質(zhì)。激活物是(例如)誘導(dǎo)或激活本發(fā)明多肽的表達(dá)，或者能結(jié)合、刺激、打開、激活、促進(jìn)、或增強(qiáng)活性、致敏或上調(diào)本發(fā)明多肽活性的物質(zhì)。激活物包括編碼WIF-1的核酸、去甲基化合物、以及天然產(chǎn)生和合成的化合物、小化學(xué)分子等。檢測激活物的試驗包括例如，將候選化合物施加于表達(dá)WIF-1的細(xì)胞，然后測定功能性作用。將用潛在激活物處理的包含WIF-1的樣品或試驗與不含該激活物的對照樣品作比較，以檢測作用程度。將對照樣品(不用候選制劑處理)的相對活性值設(shè)定為100％。當(dāng)與對照相比多肽活性值為110％，任選150％，任選200％、300％、400％、500％或1000-3000％或更高時，即實現(xiàn)了該多肽的活化。
術(shù)語“細(xì)胞生長改變”指體內(nèi)或體外細(xì)胞生長和增殖特征的任何改變，如形成細(xì)胞灶、錨定獨立性、在半固體或軟瓊脂中生長、接觸抑制和生長密度限制的改變、喪失對生長因子或血清的要求、細(xì)胞形態(tài)改變、獲得或丟失永生性、獲得或丟失腫瘤特異性標(biāo)記、注射入合適的動物宿主時能夠形成腫瘤或抑制腫瘤、和/或細(xì)胞的永生化。參見例如，F(xiàn)reshney，《動物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù)手冊》(Culture of Animal Cellsa Manual of Basic Technique)，231-241頁(第3版，1994)。
“腫瘤細(xì)胞”指腫瘤中的癌前細(xì)胞、癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
“癌細(xì)胞”、“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞或組織培養(yǎng)物的“轉(zhuǎn)化”指不一定涉及攝取新的遺傳物質(zhì)而發(fā)生的自發(fā)性或誘導(dǎo)性表型改變。雖然轉(zhuǎn)化可用轉(zhuǎn)化病毒感染和摻入新基因組DNA、或攝入外源性DNA引起，但也可自發(fā)性或在接觸致癌物后使內(nèi)源性基因突變而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化與表型改變有關(guān)，例如細(xì)胞永生化、生長控制異常、非形態(tài)改變和/或惡變(參見，F(xiàn)reshney，《動物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù)手冊》(Culture of Animal Cellsa Manual of Basic Technique)(第3版，1994))。
“抗體”指包含能特異性結(jié)合和識別某抗原的免疫球蛋白基因或其片段的構(gòu)架區(qū)的多肽。被識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及多種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ和λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，進(jìn)而分別確定了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE?？贵w的抗原結(jié)合區(qū)或其功能等效物通常是其結(jié)合特異性和親和力的最重要部分。參見Paul，《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology)。
示范性免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。各四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，各對具有一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)。各鏈的N末端確定了主要負(fù)責(zé)抗原識別的可變區(qū)，其長約100-110或更多個氨基酸。術(shù)語輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體可以(如)完整的免疫球蛋白，或用各種肽酶消化產(chǎn)生的特征已熟知的許多片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體時在絞鏈區(qū)的二硫鍵以下處切斷，產(chǎn)生F(ab)′2，它是Fab的二聚體，F(xiàn)ab本身是通過二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab)′2，切斷絞鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將F(ab)′2二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab′單體。Fab′單體基本上是含有一部分絞鏈區(qū)的Fab(參見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)(Paul編，第三版，1993)。雖然消化完整抗體可產(chǎn)生各種抗體片段，但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道也可用化學(xué)方法或重組DNA方法從頭合成這些片段。因此，本文所用術(shù)語抗體也包括通過修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段或用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(如單鏈Fv)或用噬菌體展示文庫鑒定的抗體(參見例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990))。
為了制備抗體，如重組單克隆抗體或多克隆抗體，可采用本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)(參見例如，Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 472(1983)；Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，77-96頁(1985)；Coligan，《免疫學(xué)當(dāng)前方案》(Current Protocols inImmunology)(1991)；Harlow和Lane，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988)；和Goding，《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)(第2版，1986))?？刹杉{產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)來產(chǎn)生本發(fā)明多肽的抗體。也可采用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物如其它哺乳動物來表達(dá)人源化抗體?；蛘撸捎檬删w展示技術(shù)鑒定能特異性結(jié)合所選抗原的抗體和異聚性Fab片段(參見例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10779-783(1992))。
“嵌合抗體”是(a)恒定區(qū)或其一部分被改變、取代或交換的抗體分子，其抗原結(jié)合位點(可變區(qū))連接于類型不同或改變的恒定區(qū)、效應(yīng)物和/或物質(zhì)，或是能賦予該嵌合抗體新性能的完全不同的分子，如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其一部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、取代或交換的抗體分子。
本文所用術(shù)語“WIF-1表達(dá)下調(diào)”或“WIF-1低表達(dá)”和其語法等效形式指WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸的表達(dá)水平低于確定的參比水平。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明，將鑒定的正?；蚪】祵ο笾蠾IF-1多肽或WIF-1多核苷酸的參比水平作為截取值，低于該截取值表明WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸水平與癌癥之間顯著相關(guān)。癌細(xì)胞中WIF-1水平比相同組織正常細(xì)胞中的WIF-1水平通常低至少約2倍，常低至少約5倍，更常低至少約10倍。本文中，術(shù)語“下調(diào)”和“低表達(dá)”可互換使用。本文所述的測定WIF-1水平的方法，包括但不限于RT-PCR和采用抗WIF-1抗體。
“使含量與...相關(guān)”指將一種樣品中經(jīng)測定的某物質(zhì)、分子或標(biāo)記(如WIF-1)的含量與另一樣品中相同物質(zhì)、分子或標(biāo)記經(jīng)測定的含量作比較。另一樣品中相同物質(zhì)、分子或標(biāo)記經(jīng)測定的含量可以是某給定癌癥特異性的。
術(shù)語“測定含量”的同義詞也認(rèn)為包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，其包括但不限于檢測、測試、測量或測定某分子如WIF-1的存在、不存在、含量或濃度。
II.WIF-1多肽本發(fā)明提供了新型WIF-1多肽。包含信號肽序列的全長WIF-1多肽(參見例如本文所述的SEQ ID NO.2和GenBank登錄號)、不含信號肽的成熟全長WIF-1多肽(如SEQ ID NO14或SEQ ID NO30)可用于實施本發(fā)明方法，并可用作本發(fā)明藥物組合物和試劑盒中的組合物。在優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-379的氨基酸序列。與人Wnt2(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基29-379比較時，此氨基酸序列可具有一個或多個氨基酸不同(加入、取代或缺失氨基酸)。
在本發(fā)明的其它方面，WIF-1多肽包含全長WIF-1多肽的片段，該片段包含WIF-1亞域，該WIF-1亞域多肽能結(jié)合Wnt多肽和/或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，優(yōu)選的WIF-1多肽是能結(jié)合Wnt多肽和/或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WIF-1亞域多肽。在優(yōu)選實施方式中，此亞域包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180。在其它優(yōu)選實施方式中，此結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15的氨基酸序列、SEQ ID NO16的氨基酸序列、SEQ ID NO26的氨基酸序列、SEQ IDNO27的氨基酸序列、SEQ ID NO28的氨基酸序列、SEQ ID NO29的氨基酸序列、或至少與這些序列基本相同能結(jié)合Wnt多肽或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸序列。在其它實施方式中，Wnt結(jié)合域包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180、SEQID NO2的氨基酸殘基29-176、或至少與該序列基本相同能結(jié)合Wnt多肽或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸序列。因此，本發(fā)明WIF-1的亞域多肽可包含約120-180個氨基酸殘基，在一些實施方式中可包含約130-150個氨基酸殘基。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽是由WIF-1的Wnt結(jié)合域組成的WIF-1片段。在優(yōu)選實施方式中，此亞域由SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180組成。在其它優(yōu)選實施方式中，此結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ IDNO15的氨基酸序列、SEQ ID NO16的氨基酸序列、SEQ ID NO26的氨基酸序列、SEQ ID NO27的氨基酸序列、SEQ ID NO28的氨基酸序列、SEQ ID NO29的氨基酸序列或至少與這些序列基本相同能結(jié)合Wnt多肽或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸序列，在其它實施方式中，Wnt-結(jié)合域由SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176或至少與該序列基本相同能結(jié)合Wnt多肽或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸序列組成。因此，本發(fā)明的WIF-1亞域多肽可由約120-180個氨基酸殘基組成，在一些實施方式中由約130-150個氨基酸殘基組成。
WIF-1的優(yōu)選片段包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152，SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的氨基酸序列或至少與這些序列基本相同的氨基酸序列。本發(fā)明也提供了這些亞域多肽的功能性片段。因此，也優(yōu)選SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28或SEQ IDNO29的較短片段，包括例如，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ IDNO29的約70個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO.-26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約80個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約90個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約100個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約110個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約120個氨基酸殘基，SEQ ID NO14的氨基酸殘基1-152、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29的約130個氨基酸殘基，或者至少與這些序列基本相同能結(jié)合Wnt多肽和/或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一實施方式中，能結(jié)合Wnt多肽和/或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WIF-1亞域多肽是包含SEQ ID NO2所示W(wǎng)IF-1前體蛋白的少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％序列的片段。在另一優(yōu)選實施方式中，能結(jié)合Wnt多肽和/或抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WIF-1亞域多肽是包含SEQ ID NO2所示W(wǎng)IF-1前體蛋白的少于或等于99％、95％、90％、85％、80％、75％。70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％序列的片段，WIF-1前體蛋白不含信號肽序列MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEA(SEQ ID NO20)。
在另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約1-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基約29-180或SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176的氨基酸序列。與SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180或SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176比較時，這些氨基酸序列可以有一個或多個氨基酸不同(加入、取代或缺失氨基酸)。
WIF-1亞域多肽片段優(yōu)選包含上述序列的毗連序列。然而，如本文所述，可對氨基酸殘基進(jìn)行一個或多個插入、取代和/或加入。本發(fā)明包括這種多肽，只要它們能結(jié)合Wnt多肽和抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
SEQ ID NO2的178位氨基酸殘基可以是亮氨酸(參見例如，SEQ ID NO2和GenBank登錄號AAD25402和NP_009122)或谷氨酰胺(參見例如，SEQ ID NO14和16以及GenBank登錄號Q9Y5W5、AAH18037、AAQ88710)。
從本文所述內(nèi)容中可明顯看出仍會產(chǎn)生有功能的WIF-1亞域多肽的其它氨基酸取代，例如圖20。雖然對應(yīng)于WIF-1亞域多肽的氨基酸序列在各種動物如人、大鼠、小鼠、爪蟾和紋斑魚中非常保守，但發(fā)現(xiàn)了某些氨基酸取代，包括保守取代和非保守取代(圖25)。這些氨基酸取代似乎不干擾WIF-1活性。因此，人WIF-1亞域多肽可包含一個或多個以下的氨基酸取代H43N、V47I、S59A、S86A、S86H、M87V、A94S、A94T、G95D、L104Q、S 105T、G112D、A115D、V121M、L123R、T126S、S132T、V134I、LI41R、K143N、K143D、D153N、D153T、V154I、I155L、N158D、S159A、E160G、T163P、T163V、T163I、Q166R或Q169H。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽，優(yōu)選WIF-1亞域多肽是糖基化的。N-連接的氨基酸共有序列是Asn-X-Ser或Thr，其中X可以是除脯氨酸(praline)以外的任何氨基酸殘基。大多數(shù)O-連接糖與蛋白質(zhì)的共價連接包括單糖N-乙酰半乳糖胺和氨基酸絲氨酸或蘇氨酸之間的連接。在SEQ ID NO2的88位和SEQ ID NO2的245位分別發(fā)現(xiàn)了N-連接的糖基化位點NFT、NCS。因此，全長WIF-1多肽包含這兩個N-連接的糖基化位點，而WIF-1亞域多肽僅包含NFT糖基化位點。這些糖基化位點在所分析的所有WIF-1種類中保守(參見圖25)，表明它是WIF-1的重要功能特征。由真核細(xì)胞純化的重組全長WIF-1多肽和重組WIF-1亞域多肽是糖基化的，而在細(xì)菌中制備的WIF-1多肽沒有發(fā)現(xiàn)糖基化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，在真核細(xì)胞中產(chǎn)生WIF-1多肽，優(yōu)選WIF-1亞域多肽。本文描述了在真核細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白的方法。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了包含至少兩個N連接糖基化位點的WIF-1多肽。本發(fā)明還提供包含至少一個N連接糖基化位點的WIF-1亞域多肽。如本文所述，在誘導(dǎo)凋亡中糖基化的WIF-1多肽和糖基化的亞域多肽比它們的非糖基化對應(yīng)物更有效。因此，本發(fā)明也提供了包含至少一個額外的N連接糖基化位點的WIF-1多肽和WIF-1亞域多肽?？捎帽绢I(lǐng)域已知的體外誘變方法加入額外的糖基化位點。
III.鑒定WIF-1序列在本發(fā)明的一個方面，測定患者樣品中的WIF-1 mRNA或蛋白水平來提供所需的診斷或預(yù)后信息。即，可鑒別正常組織(如正常肺、乳腺或其它組織)與相同來源的癌組織或轉(zhuǎn)移性癌組織；或者可將癌組織或轉(zhuǎn)移性癌組織與其它患者，如存活的癌癥患者的相似組織樣品作比較。
A.通用重組DNA法本發(fā)明的這個方面依賴重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。刊登了本發(fā)明通用方法的基礎(chǔ)教科書包括Sambrook和Russell，《分子克隆，實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)；Kriegler，《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗室手冊》(GeneTransfer and ExpressionA Laboratory Manual)(1990)；《新編分子生物學(xué)實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等編，1994-1999)。用于產(chǎn)生本發(fā)明所用WIF-1的方法也可用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)配體或調(diào)節(jié)配體與受體結(jié)合的多肽，用于本發(fā)明。
對于核酸，以千堿基(kb)或堿基對(bp)表示大小。這些對大小的估計獲自瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、獲自核酸測序或獲自已發(fā)表的DNA序列。對于蛋白質(zhì)，以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)表示大小?？蓮哪z電泳、蛋白質(zhì)測序、產(chǎn)生的氨基酸序列或已發(fā)表的蛋白質(zhì)序列估計蛋白質(zhì)大小。
可根據(jù)首先由Beaucage和Carathers，Tetrahedron Letts.221859-1862(1981)描述的固相亞磷酰胺三酯法，采用自動化合成儀化學(xué)合成不能購得的寡核苷酸，如VanDevanter等，Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)所述。通過天然丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC純化寡核苷酸，如Pearson和Reanier，J.Chrom.255137-149(1983)所述。
克隆后可用(例如)測序雙鏈模板的鏈末端分析法(Wallace等，Gene1621-26(1981))驗證克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
1.分離核苷酸序列的克隆方法通常，通過與探針雜交從cDNA和基因組DNA文庫克隆，或用寡核苷酸引物擴(kuò)增技術(shù)分離編碼WIF-1的核酸序列和相關(guān)的核酸序列同源物。例如，這些序列一般通過與核酸探針雜交分離自哺乳動物核酸(基因組或cDNA)文庫，其序列可衍生自SEQ ID NO1。
也可用引物擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增和分離DNA或RNA核酸(參見例如，下述“多核苷酸的檢測”章節(jié))?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的原理設(shè)計用于擴(kuò)增特定序列的合適引物(參見例如，Dieffenfach和Dveksler，《PCR引物實驗室手冊》(PCR PrimerA LaboratoryManual)(1995))?？捎眠@些引物(如)擴(kuò)增全長序列或探針，其大小一般是十個至幾百個核苷酸，然后將其用于鑒定WIF-1多核苷酸。
也可用抗體作探針，從表達(dá)文庫中分離編碼WIF-1的核酸。可用SEQ ID NO2的序列產(chǎn)生這種多克隆或單克隆抗體。
也可用合成寡核苷酸構(gòu)建用作探針或表達(dá)蛋白的WIF-1基因。用長度通常為40-120bp、代表該基因的正義和反義鏈的一系列重疊寡核苷酸進(jìn)行此方法。然后退火、連接并克隆這些DNA片段?；蛘?，可用擴(kuò)增技術(shù)以精確引物擴(kuò)增該核酸的特定亞序列。然后將此特定亞序列連接入表達(dá)載體中。
一般將編碼WIF-1的核酸克隆入中間載體中，然后轉(zhuǎn)化入原核或真核細(xì)胞以復(fù)制和/或表達(dá)。這些中間載體一般是原核載體如質(zhì)粒，或穿梭載體。
可任選按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備包含WIF-1或其結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的編碼核酸。例如，可將結(jié)構(gòu)域如配體結(jié)合域共價連接于異源蛋白，如綠色熒光蛋白、熒光素酶或β-半乳糖苷酶。
2.在原核和真核生物中表達(dá)為獲得WIF-1核酸高水平表達(dá)，一般將WIF-1核酸亞克隆入含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)效啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子和(如果是編碼蛋白的核酸)啟動翻譯的核糖體結(jié)合位點的表達(dá)載體中。本領(lǐng)域熟知合適的細(xì)菌啟動子，參見例如Sambrook和Russell，同上，Ausubel等，同上。表達(dá)WIF-1蛋白的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可以獲自(如)大腸桿菌、芽孢桿菌(Bacillus sp.)和沙門菌(Salmonella)(Palva等，Gene 22229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302543-545(1983)。可購得裝有這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒。本領(lǐng)域熟知哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)，也可購得這些表達(dá)系統(tǒng)。在一個實施方式中，真核表達(dá)載體是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動子取決于具體應(yīng)用。啟動子的定位距異源轉(zhuǎn)錄起始位點的距離任選與天然情況下其距轉(zhuǎn)錄起始位點的距離大約相同。然而如本領(lǐng)域所知，可以適當(dāng)?shù)馗淖兇司嚯x，而不會喪失啟動子功能。
除啟動子外，表達(dá)載體一般含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其含有在宿主細(xì)胞中表達(dá)WIF-1編碼核酸所必需的所有其它元件。因此，表達(dá)盒一般含有操作性連接于編碼WIF-1的核酸序列的啟動子以及轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所需的信號。一般可將編碼WIF-1的核酸序列連接于可切割信號肽序列，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌編碼蛋白。這種信號肽可包括組織纖溶酶原激活物、胰島素和神經(jīng)元生長因子的信號肽，以及煙芽夜蛾保幼激素酯酶等。表達(dá)盒的其它元件可包括增強(qiáng)子和(如果基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因時)含有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。
除啟動子序列外，表達(dá)盒也應(yīng)在結(jié)構(gòu)基因下游含有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效終止作用。終止區(qū)可獲自與啟動子序列相同的基因，或可獲自不同基因。
用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運入細(xì)胞中的具體表達(dá)載體并不特別重要?？刹捎糜糜谡婧嘶蛟思?xì)胞中表達(dá)的任何常規(guī)載體。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒如pBR322質(zhì)粒、pSKF、pET23D和融合表達(dá)系統(tǒng)如GST和LacZ。也可將表位尾加入重組蛋白，以提供方便的分離(如)c-myc方法。
真核表達(dá)載體如SV40載體、乳頭瘤病毒載體和衍生自EB病毒的載體中一般采用含有真核病毒調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體。其它示范性真核載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE和能在以下啟動子指導(dǎo)下表達(dá)蛋白的其它載體SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或在真核細(xì)胞中能有效表達(dá)的其它啟動子。
一些表達(dá)系統(tǒng)具有提供基因擴(kuò)增的標(biāo)記，如胸苷激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶和二氫葉酸還原酶?；蛘撸簧婕盎驍U(kuò)增的高產(chǎn)率表達(dá)系統(tǒng)也適用，如昆蟲細(xì)胞中可采用桿狀病毒載體，它含有在多角體蛋白啟動子或其它強(qiáng)效桿狀病毒啟動子指導(dǎo)下的WIF-1編碼序列。
表達(dá)系統(tǒng)一般包含的元件也包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制子、用于選擇含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌的編碼抗生素抗性的基因，和在質(zhì)粒非必需區(qū)中插入真核序列的獨特限制性位點。具體抗生素抗性基因的選擇并不重要，本領(lǐng)域已知的許多抗性基因都合適。任選(如果需要)不干擾真核細(xì)胞中DNA復(fù)制的原核序列。
用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生能表達(dá)大量WIF-1蛋白的細(xì)菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細(xì)胞系，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化該蛋白(參見例如，Colley等，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；蛋白質(zhì)純化指南(Guide to Protein Purification)，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，第182卷(Deutscher編，1990))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化真核和原核細(xì)胞(參見例如，Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)101347-362(Wu等編，1983)。
可采用將外源性核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的任何熟知方法。這些方法包括采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、聚凝胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、胞漿載體(plasma vector)、病毒載體和能將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源性遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞中的任何其它熟知方法(參見例如，Sambrook和Russell，同上)。僅僅需要所用具體遺傳工程方法能夠至少將一個基因成功引入能夠表達(dá)WIF-1的宿主細(xì)胞中。
將表達(dá)載體引入細(xì)胞后，在有利于表達(dá)WIF-1的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收WIF-1(參見例如，Scopes，《蛋白質(zhì)純化原理和實踐》(Protein PurificationPrinciples and Practice)(1982)；美國專利號4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。
IV.檢測WIF-1多核苷酸和多肽A.檢測對象的癌細(xì)胞本發(fā)明的WIF-1多肽可以各種方式應(yīng)用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了檢測對象癌細(xì)胞的方法。此方法包括提供該對象的生物樣品和檢測細(xì)胞中WIF-1表達(dá)水平的步驟，所述生物樣品包含懷疑是癌細(xì)胞的細(xì)胞。此方法任選包括將細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)水平與一個或多個健康對象細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)水平作比較，或與以前確定的WIF-1表達(dá)水平的參比范圍作比較。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過檢測WIF-1 mRNA水平檢測WIF-1表達(dá)水平。在本發(fā)明的另一實施方式中，通過檢測WIF-1多肽水平檢測WIF-1表達(dá)水平。本文公開了此方法所用試劑如抗WIF-1抗體。
可能因各種原因需要檢測WIF-1表達(dá)水平。檢測WIF-1表達(dá)水平可能是(i)對對象進(jìn)行癌癥的篩檢、診斷或預(yù)后的一部分；(ii)確定該對象對癌癥易感性的一部分；(iii)確定該對象癌癥階段或嚴(yán)重性的一部分；(iv)鑒定該對象發(fā)生癌癥風(fēng)險的一部分；或(v)監(jiān)測給予診斷患有癌癥的對象抗癌藥或治療效果的一部分。給予對象抗癌藥或治療可包括給予本發(fā)明的WIF-1多肽，優(yōu)選WIF-1亞域多肽。
B.鑒定處于發(fā)生癌癥風(fēng)險的對象和鑒定對象的癌癥階段或嚴(yán)重性在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，提供了鑒定處于發(fā)生癌癥風(fēng)險的對象或鑒定對象癌癥階段或嚴(yán)重性的方法。如本文所述，在各種癌細(xì)胞中WIF-1表達(dá)下調(diào)(圖2)。如本文進(jìn)一步所述，WIF-1多肽，尤其是重組WIF-1多肽以劑量依賴方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞(凋亡)(圖10-15)。因此，WIF-1含量是各種癌癥風(fēng)險狀態(tài)，如高、中或低風(fēng)險的特征?？赏ㄟ^以下方法確定發(fā)生癌癥的風(fēng)險測定WIF-1，然后將測定結(jié)果提交給分類算法或?qū)⑵渑cWIF-1的參比含量和/或模式(與具體風(fēng)險水平或癌癥的具體階段或嚴(yán)重性相關(guān))作比較。
可采用本發(fā)明方法測定發(fā)生癌癥風(fēng)險對象的待測生物樣品中的WIF-1水平。測定發(fā)生前列腺癌風(fēng)險對象待測生物樣品中的WIF-1水平低于正?；蚪】祵ο笸壬飿悠分袡z測到的WIF-1水平，或低于預(yù)先確定的基線水平時，表明待測的發(fā)生癌癥風(fēng)險的對象具有發(fā)生癌癥的風(fēng)險。
C.對象癌癥的篩檢、診斷或預(yù)后在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，作為某對象癌癥的篩檢、診斷或預(yù)后的一部分，測定該對象是否有癌癥。采用本發(fā)明方法，測定待篩檢癌癥對象生物樣品中的WIF-1水平。待篩檢癌癥對象生物樣品中檢測到的WIF-1水平低于正?；蚪】祵ο笸壬飿悠分袡z測到的WIF-1水平，或低于預(yù)先確定的基線水平時，表明該篩檢癌癥對象患有或可能患有癌癥。
D.檢測超甲基化的序列在一個方面，本發(fā)明提供了檢測癌細(xì)胞的方法。優(yōu)選檢測對象，更優(yōu)選檢測哺乳動物，最優(yōu)選檢測人的癌癥。采用本文所述組合物和方法，可以各種方式檢測癌癥。在一個實施方式中，采用檢測超甲基化的WIF-1啟動子的方法檢測癌癥。
在一個實施方式中，通過檢測超甲基化的WIF-1調(diào)節(jié)元件，如WIF-1啟動子的存在來檢測癌細(xì)胞，如肺癌或乳腺癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面，檢測WIF-1調(diào)節(jié)元件中所含超甲基化的多核苷酸序列。WIF-1調(diào)節(jié)元件中所含的多核苷酸序列優(yōu)選包含CpG島。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了檢測超甲基化的WIF-1啟動子的方法。可用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，如硫酸氫鹽測序、甲基化-特異性PCR或采用甲基化敏感型限制性酶檢測超甲基化的WIF-1啟動子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，該方法包括將超甲基化的WIF-1啟動子與一種寡核苷酸相接觸的步驟，所述寡核苷酸包含能特異性雜交超甲基化的WIF-1啟動子的序列，其用量能有效檢測超甲基化的WIF-1啟動子。本文描述了用于實施本發(fā)明的寡核苷酸。此方法任選地包括測定WIF-1啟動子的甲基化量并將其與正常樣品相比較的步驟。
可檢測某對象如患者的生物樣品中超甲基化的WIF-1啟動子。檢測到樣品中甲基化量比正常樣品增加表明該患者患有癌癥。
如上所述，該啟動子區(qū)中半胱氨酸殘基的超甲基化是WIF-1低表達(dá)指標(biāo)?？捎酶鞣N方法檢測甲基化程度。例如，可用Southern雜交進(jìn)行甲基化分析，此法能評價WIF-1啟動子CpG島中甲基化敏感型限制性位點。含CG作為其識別位點的一部分并且在C甲基化時受到抑制的任何限制性核酸內(nèi)切酶可用于此分析。甲基化敏感型限制性核酸內(nèi)切酶包括AciI、BsiEI、BssHII、BstUI、EagI、FauI、HaeII、HpaI、HpaII、MspI、NarI、NotI、SacII或SmaI。這些酶可單獨使用或聯(lián)用。
也可采用更靈敏的試驗，對DNA甲基化模式作圖。這些試驗包括硫酸氫鹽DNA測序和甲基化特異性PCR。這些技術(shù)能夠分析跨越感興趣的單CpG島的多個CpG二核苷酸。硫酸氫鹽DNA測序依據(jù)在未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ臈l件下硫酸氫鹽能誘導(dǎo)基因組DNA修飾。然后，用PCR以兩組鏈特異性引物擴(kuò)增硫酸氫鹽修飾的序列，產(chǎn)生一對片段，各自來自一條鏈，其中所有尿嘧啶和胸腺嘧啶殘基都擴(kuò)增為胸腺嘧啶，僅有5-甲基胞嘧啶殘基擴(kuò)增為胞嘧啶。PCR產(chǎn)物可直接測序或可克隆后測序，以提供單個DNA分子的甲基化圖譜(參見例如，F(xiàn)rommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.891827-1831(1992))。
也可不依賴采用甲基化敏感型限制性酶用甲基化特異性PCR評價CpG島內(nèi)CpG二核苷酸位點的甲基化狀態(tài)。此試驗包括先用硫酸氫鈉或另一種同等試劑修飾DNA，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。隨后用甲基化DNA或未甲基化DNA的特異性引物擴(kuò)增，導(dǎo)致含甲基化CpG二核苷酸的DNA被擴(kuò)增。所述引物能特異性區(qū)分甲基化和未甲基化的DNA。為達(dá)到此目的，通常所選擇的引物序列為含有高頻率胞嘧啶的區(qū)域(以區(qū)分未修飾的DNA與修飾的DNA)和所述引物的3′末端附近有CpG對(以使PCR反應(yīng)中甲基化和未甲基化DNA之間的差異最大化)。由于亞硫酸鹽處理后DNA的兩條鏈不再互補(bǔ)，所以可為這兩條修飾鏈設(shè)計引物。例如，甲基化DNA的特異性引物的3′CG對中一般具有一個T，可使其與甲基化DNA中保留的C相區(qū)別，并為反義引物設(shè)計互補(bǔ)鏈。參見專利號5,786,146；Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939821-9826(1996)。
用于擴(kuò)增WIF-1啟動子區(qū)中甲基化和未甲基化DNA序列的示范性引物組包括例如，甲基化特異性引物5′-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO4)和5′-AAACCAACAATCAACGAAC-3′(反向)(SEQ ID NO5)和未甲基化特異性引物5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO6)和5′-AAACCAACAATCAACAAAAC-3′(反向)(SEQ ID NO7)，它們分別對應(yīng)于WIF-1啟動子區(qū)序列-488～-468和-310～-290(參見實施例)。
一個方面，用質(zhì)譜檢測甲基化WIF-1啟動子序列，如本文進(jìn)一步所述。尤其有用的是Bane等(Nucleic Acids Res.30(14)e69(2002)；以全文納入本文作參考)所述方法。Bane等描述了采用SELDI-TOF質(zhì)譜分析含有甲基化和未甲基化啟動子的DNA片段。
用于本發(fā)明的另一優(yōu)選質(zhì)譜技術(shù)是MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜)。MALDI-TOF MS是質(zhì)譜的最新改進(jìn)。將待分析分子與不電離、但有助于大分子(如DNA分子)電離的基質(zhì)混合。例如，該基質(zhì)可以是與DNA分子混合時能吸收紫外輻射的材料?？捎肕ALDI-TOF MS分析各種大小的DNA分子。飛行時間能夠高通量測定離子。用此方法，可在幾秒內(nèi)分析樣品。示范性MALDI-TOF技術(shù)參見例如，美國專利申請?zhí)?001/0033809、2003/0010908、2003/0164449和2004/0050787，Humeny等，Anal.Biochem.313(1)160-166(2003)，Schatz等，NucleicAcids Res.32(21)e167(2004)和Rakyan等，PLos Biol.2(12)e405(2004)；將其全文納入本文作參考。也可用MALDI-TOF對DNA分子進(jìn)行DNA測序(參見例如，Taranenko等，Nucleic Acids Res.26(10)2488-2490(1998)；Edwards等，Nucleic Acids Res.29(21)e104(2001))。因此，本文也考慮用于質(zhì)譜分析本文所述產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物序列的方法和試劑。
E.檢測WIF-1 mRNA在一個實施方式中，癌癥檢測方法包括測定對象如患者生物樣品中編碼WIF-1的轉(zhuǎn)錄物的水平(參見例如，Genbank登錄號NM 007191和SEQ ID NO1)。檢測到的WIF-1 mRNA水平比正常組織低表明該對象患有癌癥。在一個實施方式中，測定WIF-1 mRNA水平的步驟包括擴(kuò)增反應(yīng)。在另一實施方式中，通過測定細(xì)胞中編碼WIF-1的mRNA表達(dá)水平評價是否存在癌癥。WIF-1 mRNA水平低于相應(yīng)的非癌組織表明存在癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知評價具體基因的RNA表達(dá)的方法，包括基于雜交和擴(kuò)增的試驗等。
1.直接雜交試驗本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用核酸雜交技術(shù)檢測和/或定量WIF-1基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA或由其制備的cDNA)水平的方法。例如，評價WIF-1多核苷酸的存在、不存在或含量的一種方法包括Northern印跡。也可用本領(lǐng)域已知技術(shù)，如斑點印跡、原位雜交、RNA酶保護(hù)、探針DNA微芯片陣列等分析基因表達(dá)水平。
2.擴(kuò)增試驗在另一實施方式中，采用擴(kuò)增試驗測定WIF-1的表達(dá)水平。在這種試驗中，WIF-1核酸序列用作擴(kuò)增反應(yīng)(如聚合酶鏈反應(yīng)或PCR)的模板。在定量擴(kuò)增中，擴(kuò)增產(chǎn)物量與初始樣品中模板量成正比。與合適對照的比較能夠衡量樣品中的WIF-1水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知定量擴(kuò)增的方法。定量PCR的詳細(xì)方案參見例如，Innis等，(1990)《PCR方案，方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.，紐約)。WIF-1的已知核酸序列(參見例如，SEQ ID NO1)足以使技術(shù)人員能夠按常規(guī)方法選擇引物來擴(kuò)增該基因的任何部分。
在一個實施方式中，采用TaqMan試驗定量測定癌癥相關(guān)性多核苷酸。TaqMan試驗采用含有5′熒光染料和3′淬滅劑的熒光寡核苷酸探針。該探針能雜交PCR產(chǎn)物，但由于3′的阻斷劑其本身不可延伸。當(dāng)PCR產(chǎn)物在后續(xù)循環(huán)中擴(kuò)增時，聚合酶如AmpliTaq的5′核酸酶活性將切割TaqMan探針。此切割將5′熒光染料與3′淬滅劑分離，從而導(dǎo)致熒光以擴(kuò)增函數(shù)方式增加(參見例如，Perkin-Elmer提供的文獻(xiàn)，如www2.perkin-elmer.com)。
其它合適的擴(kuò)增方法包括但不限于連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(參見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)；Landegren等，Science 2411077(1988)；Barringer等，Gene89117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 861173(1989))、自身維持的序列復(fù)制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))、斑點PCR和銜接頭PCR等。
F.檢測WIF-1多肽在另一實施方式中，檢測癌癥的方法包括測定對象如患者生物樣品中WIF-1多肽的水平。檢測到WIF-1多肽水平比正常組織低表明該對象患有癌癥。
WIF-1表達(dá)下調(diào)表明存在癌癥和可能與多種癌癥相關(guān)。因此，WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸可用作癌癥診斷中的生物標(biāo)記。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，測定生物樣品中WIF-1的含量。正常、健康或無癌對象提供的生物樣品中WIF-1含量一般與癌癥對象或懷疑患有癌癥對象提供的生物樣品中WIF-1含量有關(guān)。癌癥對象或懷疑患有癌癥對象的生物樣品中檢測到的WIF-1含量可能是某給定癌癥特異性的。
可通過以下特異性檢測方法檢測WIF-1多肽，包括但不限于親和捕獲、質(zhì)譜、傳統(tǒng)的WIF-1免疫試驗、PAGE或HPLC，如本文進(jìn)一步所述或如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
可用于此目的的檢測范例包括光學(xué)方法、電化學(xué)方法(電壓計和電流計技術(shù))、原子力顯微術(shù)和射頻法，如多極共振譜法。除了共聚焦和非共聚焦顯微術(shù)以外，光學(xué)方法的例子是檢測熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、吸光度、光反射、透射和雙折射或折射指數(shù)(如表面等離振子共振、橢圓偏光法、共振鏡(resonant mirror)法、光柵耦合器波導(dǎo)法或干涉測量法)。
1.質(zhì)譜檢測在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，用質(zhì)譜法檢測WIF-1多肽，質(zhì)譜法采用質(zhì)譜儀檢測氣相離子。通常，質(zhì)譜包括電離或汽化分子，在電場中加速離子，使離子通過磁場。當(dāng)離子通過磁場時，離子根據(jù)其質(zhì)量分離，然后進(jìn)入檢測器進(jìn)行鑒定和分析。每個樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集過程不到1分鐘。
用于本發(fā)明的優(yōu)選質(zhì)譜技術(shù)是表面增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)。″SELDI″是一種氣相離子譜的方法，此法中將分析物如WIF-1多肽遞呈給能源的基材表面在解吸和電離過程中起積極作用。SELDI技術(shù)參見例如，美國專利號5,719,060，將其全文納入本文作參考。美國專利號5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,528,320，美國專利申請?zhí)?003/0091976和2002/0060290中描述了適合檢測WIF-1多肽和WIF-1多核苷酸的其它質(zhì)譜方法，將其全文納入本文作參考。
用于檢測WIF-1多肽的另一種優(yōu)選質(zhì)譜技術(shù)是上述MALDI-TOF MS。用于本發(fā)明的其它優(yōu)選質(zhì)譜技術(shù)是LC-ESI MS(液相色譜-電霧化電離串聯(lián)質(zhì)譜法)，如Song等(Anal.Chem.77(2)504-510(2005))所述。
通常使待用質(zhì)譜分析的分析物如WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸(如PCR產(chǎn)物)與探針結(jié)合，將分析物遞呈給電離源。任選使探針(如生物芯片)形成合適的形狀(如正方形、矩形、圓形等)，只要它適合用于氣相離子光譜儀(如可拆卸地插入到氣相離子光譜儀中)。例如，探針可以是在預(yù)先確定的可尋址位置上含有一系列孔或具有其它表面形態(tài)的條形、板形或盤形。也任選探針的形狀，用于氣相離子光譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)和檢測器。例如，可使探針適應(yīng)于安裝在可水平、垂直和/或旋轉(zhuǎn)翻譯的支架(carriage)中，該支架可將探針?biāo)?、垂直?或旋轉(zhuǎn)地移動到連續(xù)位置中，而無需對探針再手工定位。
在某些實施方式中，可使探針基材表面條件化，使其能結(jié)合分析物。例如，可(如用化學(xué)方法或機(jī)械方法如粗糙法)使探針基材表面條件化而能將吸附物加在其表面上。吸附物包含能與分析物如WIF-1多肽結(jié)合的官能團(tuán)。在一些實施方式中，也可使基材本身具有吸附物特性，可被認(rèn)為是吸附物的一部分(參見例如，美國專利申請?zhí)?003/0091976)。
可將吸附物以連續(xù)或不連續(xù)的模式加在探針基材上。如果是連續(xù)模式，可將一種或多種吸附物加在基材表面上。如果采用多種類型的吸附物，可涂布該基材表面，從而形成一維或二維梯度不同的一種或多種結(jié)合特征。如果是不連續(xù)模式，可將多種吸附物加在基材表面上預(yù)先確定的可尋址位置或特征表面(如可用質(zhì)譜儀的激光束尋址)中。探針或生物芯片的特征表面包括各種實施方式。例如，生物芯片任選地包括多種特征表面，如排列成直線、正交陣列、圓或n邊多邊形(其中n是三或更大)。多種特征表面一般包括邏輯或空間陣列。多種特征表面各自任選地包含相同或不同的吸附物，或吸附物的一種或多種組合。例如，多種特征表面的至少兩種任選包括相同或不同的吸附物，或吸附物的一種或多種組合。合適的吸附物參見例如，美國專利申請?zhí)?003/0091976所述。
探針基材可用任何合適材料制成。探針基材優(yōu)選用能夠支撐吸附物的材料制成。例如，探針基材可包括但不限于絕緣材料(如塑料、陶瓷、玻璃等)、磁性材料、半導(dǎo)體材料(如硅片)或?qū)щ娦圆牧?如金屬，如鎳、黃銅、鋼、鋁、金、類金屬、合金或?qū)щ娦跃酆衔?、聚合物、有機(jī)聚合物、導(dǎo)電聚合物、生物聚合物、天然生物聚合物、用有機(jī)聚合物涂布的金屬、合成聚合物、復(fù)合材料或它們的任何組合。探針基材也任選為固體或多孔性材料。
根據(jù)基材和/或吸附物的選擇任選用合適方法產(chǎn)生探針。例如，可用能夠衍生金屬表面的材料涂布金屬基材表面。更具體說，可用氧化硅、氧化鈦或金涂布金屬表面。然后，可用雙功能接頭衍生該表面，雙功能接頭的一端可以共價連接于表面上的官能團(tuán)，另一端還可用起吸附物作用的基團(tuán)衍生。在另一例子中，可化學(xué)修飾晶體硅產(chǎn)生的多孔性硅表面，使其包含用于結(jié)合分析物的吸附物。在又一例子中，可通過單體溶液的原位聚合在基材表面上直接形成含水凝膠主鏈的吸附物，所述單體溶液包括例如，包含所選官能團(tuán)作為吸附基團(tuán)的取代的丙烯酰胺單體或其衍生物。例如，美國專利號5,617,060、5,894,063、6,020,208、6,027,942、6,528,320、WO 98/59360以及美國專利申請?zhí)?003/0091976和2002/0060290中描述了適合用于本發(fā)明的探針，將其全文納入本文作參考。
2.WIF-1抗體的產(chǎn)生和免疫學(xué)檢測也可用抗體檢測WIF-1。WIF-1抗體可購得(如Santa Cruz Biotechnology)或可用熟知技術(shù)產(chǎn)生(參見例如，Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》((AntibodiesALaboratory Manual)(1988)和Harlow和Lane，《抗體應(yīng)用》(Using Antibodies)(1999)；Coligan，《免疫學(xué)當(dāng)前方案》(Current Protocols in Immunology)(1991)；Goding，《單克隆抗體原理和實踐》(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice)(第2版，1986)；和Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。這些技術(shù)包括通過選擇噬菌體或相似載體的重組抗體文庫中的抗體制備抗體，以及通過免疫兔或小鼠制備多克隆和單克隆抗體(參見例如，Huse等，Science 2461275-1281(1989)；Ward等，Nature341544-546(1989))。這種抗體一般用于(例如)檢測肺癌或乳腺癌中的診斷或預(yù)后應(yīng)用。
可用WIF-1或其片段產(chǎn)生能與WIF-1特異性反應(yīng)的抗體。例如，如本文所述分離重組WIF-1或其抗原性片段。重組蛋白是產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選免疫原?；蛘?，可采用衍生自本文所述序列并偶聯(lián)有載體蛋白的合成肽作為免疫原。也可采用純化或不純形式的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。然后，將該產(chǎn)物注射入能夠產(chǎn)生抗體的動物體內(nèi)?？僧a(chǎn)生單克隆或多克隆抗體，隨后用于免疫試驗以測定此蛋白質(zhì)。
一般選擇滴度為104或更高的多克隆抗血清，采用競爭性結(jié)合免疫試驗測試它們與非WIF-1蛋白或其它生物的其它相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體的結(jié)合常數(shù)Kd通常至少約為0.1mM，更通常至少約為1μM，任選地至少約為0.1μM或更好，任選0.01μM或更好。在交叉反應(yīng)測定中，競爭性結(jié)合免疫試驗中一般采用經(jīng)過免疫吸附的抗血清來比較第二種蛋白與WIF-1蛋白。為了進(jìn)行此比較，在寬泛的濃度范圍中分別測定這兩種蛋白，分別測定能抑制50％抗血清與固定蛋白質(zhì)結(jié)合所需的兩種蛋白的用量。如果抑制50％結(jié)合所需第二種蛋白的用量比抑制50％結(jié)合所需抗原性WIF-1蛋白的用量小十倍，那么稱第二種蛋白能特異性結(jié)合用WIF-1免疫原所產(chǎn)生的多克隆抗體。
一旦獲得WIF-1特異性抗體后，可用各種免疫試驗方法測定與WIF-1的結(jié)合反應(yīng)。免疫學(xué)和免疫試驗步驟的綜述參見《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》(Basic and ClinicalImmunology)(Stites和Terr編，第7版，1991)。而且，可以幾種形式進(jìn)行本發(fā)明免疫試驗，《酶免疫試驗》(Enzyme Immunoassay)(Maggio編，1980)；和Harlow和Lane，同上)中對其進(jìn)行廣泛綜述。
免疫試驗也常常采用能特異性結(jié)合和標(biāo)記抗體和抗原形成的復(fù)合物的標(biāo)記物。標(biāo)記物本身可以是含抗體/抗原復(fù)合物的部分之一。因此，標(biāo)記物可以是標(biāo)記的WIF-1多肽或標(biāo)記的抗WIF-1抗體?；蛘?，標(biāo)記物可以是第三種分子，如特異性結(jié)合抗體/抗原復(fù)合物的第二抗體(第二抗體一般對產(chǎn)生第一抗體的動物的抗體特異)。能特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白質(zhì)，如蛋白A或蛋白G也可用作標(biāo)記物。這些蛋白對多種動物的免疫球蛋白恒定區(qū)具有強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)性(參見例如，Kronval等，J.Immunol.1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.1352589-2542(1985))。可用可檢測分子如生物素修飾該標(biāo)記物，從而使另一種分子如鏈霉抗生物素蛋白可特異性結(jié)合該檢測分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知各種可檢測分子。
常用試驗包括非競爭性試驗如夾心試驗，和競爭性試驗。在競爭性試驗中，通過測定樣品中存在的未知WIF-1取代(競爭掉)抗WIF-1抗體上加入的(外源性)已知量WIF-1，間接測定樣品中存在的WIF-1量。常用試驗形式包括免疫印跡，可用其檢測和定量樣品中蛋白質(zhì)的存在。其它試驗形式包括脂質(zhì)體免疫試驗(LIA)，該試驗采用的脂質(zhì)體經(jīng)設(shè)計能結(jié)合特定分子(如抗體)并釋放包裹的試劑或標(biāo)記。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測釋放的化學(xué)物質(zhì)(參見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41(1986))。
此試驗中所用的具體標(biāo)記或可檢測基團(tuán)不是本發(fā)明的重要方面，只要其不顯著干擾實驗所用抗體的特異性結(jié)合?？蓹z測基團(tuán)可以是具有可檢測的物理或化學(xué)特性的任何物質(zhì)。免疫試驗領(lǐng)域已開發(fā)出這種可檢測標(biāo)記，通常，用于這種方法的大多數(shù)標(biāo)記可應(yīng)用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記是可用分光光度、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測的任何組合物。可用于本發(fā)明的標(biāo)記物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素黃、得克薩斯紅、羅丹明等)、放射性標(biāo)記、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和常用于ELISA的其它酶)和發(fā)色標(biāo)記物如膠體金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)。
可根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法將標(biāo)記物直接或間接偶聯(lián)于所需試驗組分。如上所述，可采用各種標(biāo)記，根據(jù)所需靈敏度、易于與化合物偶聯(lián)、穩(wěn)定性要求、可用設(shè)備和處理規(guī)定選擇標(biāo)記物。
常用間接方式連接非放射性標(biāo)記。通常，將配體分子(如生物素)共價結(jié)合于該分子。然后，使配體結(jié)合于另一分子(如鏈霉抗生物素蛋白)，該分子本身可被檢測或?qū)⑵涔矁r結(jié)合于信號系統(tǒng)，如可檢測的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物?？膳c能識別WIF-1的抗體或識別抗WIF-1抗體的第二抗體適當(dāng)組合使用所述配體和其靶分子。
也可將所述分子直接偶聯(lián)于能產(chǎn)生信號的化合物，如與酶或熒光團(tuán)偶聯(lián)。用作標(biāo)記物的感興趣酶主要是水解酶，具體是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或者氧化酶，具體是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素黃及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括螢光素和2，3-二氫酞嗪二酮，如魯米諾。可采用的各種標(biāo)記或信號發(fā)生系統(tǒng)的綜述參見美國專利號4,391,904。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知檢測標(biāo)記的方法。因此，例如，當(dāng)標(biāo)記是放射性標(biāo)記時，檢測方法包括閃爍計數(shù)或照相膠片(如放射性自顯影)。當(dāng)標(biāo)記是熒光標(biāo)記時，可通過合適波長的光激發(fā)熒光團(tuán)并檢測闡述的熒光來檢測標(biāo)記。可通過以下方法檢測熒光目測、照相膠片、采用電子檢測器如電荷耦合裝置(CCD)或光電倍增器等。相似地，可通過提供合適的酶底物并檢測得到的反應(yīng)產(chǎn)物檢測酶標(biāo)記。最后，可通過簡單地觀察與標(biāo)記相關(guān)的顏色來檢測簡單的發(fā)色標(biāo)記。因此，在各種沾棒試驗(dipstick assay)中，偶聯(lián)金常呈粉紅色，而各種偶聯(lián)珠呈現(xiàn)珠的顏色。
一些試驗形式不需要采用標(biāo)記組分。例如，可用凝集試驗檢測靶抗體的存在。在這種情況下，抗原包被的顆粒被包含靶抗體的樣品凝集。在這種形式中，不需要標(biāo)記任何組分，可通過簡單的目測檢測靶抗體的存在。
V.鑒定WIF-1的激活物WIF-1激活物，即WIF-1多肽或多核苷酸表達(dá)的激活物可用于治療癌癥，如肺癌或乳腺癌?？捎酶鞣N方法檢測能激活WIF-1的物質(zhì)。能激活WIF-1的物質(zhì)包括能激活增強(qiáng)WIF-1活性的化合物以及能增加WIF-1表達(dá)的物質(zhì)，包括能減少WIF-1啟動子甲基化的去甲基制劑。
經(jīng)測試可作為WIF-1激活物的物質(zhì)可以是小分子化合物或生物分子，如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂質(zhì)。測試化合物一般是小化學(xué)分子和肽。基本上任何化合物都可用作本發(fā)明試驗中的潛在激活物，但采用可溶解于水溶液或有機(jī)溶液(尤其是DMSO有機(jī)溶液)的最常見的化合物。
A.大規(guī)模和高通量篩選設(shè)計了可用自動化試驗步驟和任何方便來源的化合物平行運行的試驗(如在機(jī)器人試驗微量滴定板上進(jìn)行的微量滴定形式試驗)來篩選大化合物文庫。
在一些實施方式中，高通量篩選法包括提供含有大量潛在治療化合物(潛在的調(diào)節(jié)劑化合物)的組合化學(xué)文庫或肽文庫。然后，如本文所述，在一個或多個試驗中篩選這種“組合化學(xué)文庫”或“配體文庫”，以鑒定顯示出所需特征活性的文庫成員(尤其是化學(xué)物質(zhì)或亞類)。這樣鑒定的化合物可用作常規(guī)的“先導(dǎo)化合物”或其本身可用作潛在的或?qū)嶋H的治療劑。
組合化學(xué)文庫是通過化學(xué)合成或生物合成，通過組合許多化合物“建筑塊”如試劑產(chǎn)生的各種化合物的集合。例如，通過以各種可能方式組合給定長度的化合物(即多肽化合物中的氨基酸數(shù)量)的一組化合物建筑塊(氨基酸)形成線性組合化學(xué)文庫如多肽文庫?？赏ㄟ^這種化合物建筑塊的組成性混合合成幾百萬化合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知組合化學(xué)文庫的制備和篩選。這種組合化學(xué)文庫包括但不限于肽文庫(參見例如，美國專利5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等，Nature 35484-88(1991))。也可采用產(chǎn)生化合物多樣性文庫的其它化學(xué)方法。這種化學(xué)方法包括但不限于類肽(如PCT公開號WO 91/19735)，編碼肽(如PCT公開WO 93/20242)，隨機(jī)生物寡聚物(如PCT公開號WO 92/00091)，苯并二氮雜(如美國專利號5,288,514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮雜和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文庫的類似有機(jī)合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 2611303(1993))，和/或肽酰膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))，核酸文庫(參見Ausubel等(1993)；Berger和Sambrook，同上)，肽核酸文庫(參見例如，美國專利5,539,083)，抗體文庫(參見例如，Vaughn等，Nature Biotechnology 14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文庫(參見例如，Liang等，Science 2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)，小有機(jī)分子文庫(參見例如，苯并二氮雜，Baum C&EN，1月18日，33頁(1993)；類異戊二烯，美國專利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinone)和間噻嗪酮(metathiazanone)，美國專利5,549,974；吡咯烷，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯并二氮雜，5,288,514等)。
可購得制備組合文庫的裝置(參見例如，357 MPS，390 MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY；Symphony，Rainin，美國馬薩諸塞州沃本；433 A AppliedBiosystems，加利福尼亞州福斯特城；9050 Plus，Millipore，馬薩諸塞州貝德福德)。此外，可購得許多組合文庫(參見例如，ComGenex，新澤西州普林斯頓；Tripos，Inc.，密蘇里州圣路易斯；3D Pharmaceuticals，Exton，賓夕法尼亞州；Martek Biosciences，馬里蘭州哥倫比亞等)。
1.固相和可溶解性高通量試驗在高通量試驗中，可能在一天內(nèi)篩選多達(dá)幾千種不同的調(diào)節(jié)物或配體。具體說，可用微量滴定板的各孔對所選潛在調(diào)節(jié)物進(jìn)行獨立試驗，或者，如果要觀察濃度或培育時間的作用，可用每5-10孔測試一種調(diào)節(jié)物。因此，一塊標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板可測定約100(如96)種調(diào)節(jié)物。如果采用1536孔板，那么一塊板可容易地測定約100-1500種不同化合物。每天可測定幾塊不同的板；可用本發(fā)明集成系統(tǒng)篩選多達(dá)約6,000-20,000或更多種不同化合物。此外，可采用微流體方法操作試劑。
B.篩選WIF-1激活物的方法1.WIF-1活性WIF-1和其等位基因和多態(tài)性變體具有抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。因此，可用各種終點確定WIF-1活性。它們包括但不限于測定WIF-1與Frizzled受體的結(jié)合。而且，也可用細(xì)胞生長和/或凋亡評價WIF-1活性。本領(lǐng)域熟知進(jìn)行這些試驗的方法(參見例如，Masuhara等，Biochem.Biophys.Res.Commun.239439-446(1997)；Minamoto等，Biochem.Biophys.Res.Commun.23779-83，(1997))。
在一個實施方式中，可通過測定細(xì)胞活力確定WIF-1活性。可通過測定許多不同的終點評價細(xì)胞活力，包括胞質(zhì)酶水平、細(xì)胞對染料的通透性、DNA片段化、釋放放射性同位素標(biāo)記如51Cr或其它形式。一般用適合高通量篩選形式的試驗，如比色或熒光活力試驗測定細(xì)胞活力。例如，在Alamar藍(lán)(AB)試驗中加入了在代謝活性的反應(yīng)中能改變顏色或熒光的氧化還原指示劑。在存在活細(xì)胞而非死細(xì)胞時Alamar藍(lán)發(fā)熒光。可用微孔板或流式細(xì)胞術(shù)方便地讀取這種試驗的結(jié)果。也可方便地以高通量形式應(yīng)用比色試驗如MTT試驗，測定細(xì)胞活力和增殖，MTT試驗測定MTT(3-(4，5-二甲基)噻唑-2-基-2，5-二苯基溴化四唑)還原為甲 也可采用測定細(xì)胞數(shù)量的其它試驗。這些試驗包括測定染料嵌入細(xì)胞DNA中的試驗。嵌入染料的量與細(xì)胞數(shù)量成正比。例如，可用染料如Hoechst 33342染細(xì)胞，該染料能嵌入活細(xì)胞的DNA中，通過測定熒光量確定細(xì)胞數(shù)量。也可直接計細(xì)胞數(shù)。
將可能的WIF-1激活物處理的樣品或試驗結(jié)果與未經(jīng)測試化合物處理的對照樣品作比較，以檢測調(diào)節(jié)程度。將對照樣品(未經(jīng)激活物處理)的相對WIF-1活性值設(shè)定為100。當(dāng)與對照相比WIF-1的活性值為110％，任選150％、200％、300％、400％、500％或1000-2000％時即實現(xiàn)WIF-1的活化。
2.表達(dá)試驗也提供了篩選能提高WIF-1表達(dá)的化合物的試驗。篩選方法通常包括進(jìn)行細(xì)胞試驗，該試驗中使測試化合物與能表達(dá)WIF-1的一種或多種細(xì)胞接觸，然后檢測WIF-1表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物)的增加?？捎帽磉_(dá)WIF-1的任何細(xì)胞進(jìn)行此試驗。
可用多種不同方法檢測WIF-l表達(dá)。如上所述，可用能與WIF-1轉(zhuǎn)錄物(或其衍生的互補(bǔ)核酸)特異性雜交的探針檢測細(xì)胞中表達(dá)的mRNA來測定細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)水平?？赏ㄟ^以下步驟進(jìn)行檢測裂解細(xì)胞和進(jìn)行Northern印跡，或者不裂解細(xì)胞采用原位雜交技術(shù)?；蛘撸捎妹庖叻椒z測WIF-1e蛋白，此法中用特異性結(jié)合于WIF-1的抗體檢測細(xì)胞裂解物。
其它基于細(xì)胞的試驗包括報道物試驗，用標(biāo)準(zhǔn)的報道基因試驗對細(xì)胞進(jìn)行該試驗?？稍诒磉_(dá)或不表達(dá)WIF-1的細(xì)胞中進(jìn)行這些試驗。用異源核酸構(gòu)建物進(jìn)行這些試驗中的一些試驗，所述構(gòu)建物包含操作性連接于編碼可檢測產(chǎn)物的報道基因的WIF-1啟動子?？刹捎迷S多不同的報道基因。一些報道物本身是可檢測的。這種報道物的例子是能發(fā)射可用熒光檢測器檢測的熒光的綠色熒光蛋白。其它報道基因能產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物。這種報道物常常是酶。示范性酶報道物包括但不限于CAT(氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶；Alton和Vapnek，Nature 282864-869(1979))、熒光素酶、 -半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(Toh等，Eur.J.Biochem.182231-238(1980)；和Hall等，J.MoI.Appl.Gen.2101(1983))。
在這些試驗中，使含有報道構(gòu)建物的細(xì)胞與測試化合物接觸。通過檢測可檢測報道物的水平監(jiān)測受調(diào)節(jié)啟動子的表達(dá)。此試驗可鑒定許多不同類型的WIF-1激活物。例如，可通過結(jié)合啟動子而抑制該啟動子、通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或其它調(diào)節(jié)因子而抑制該啟動子、結(jié)合其啟動子或引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生抑制該啟動子的分子來鑒定受試化合物。相似地，也可(如)通過結(jié)合啟動子而激活該啟動子、通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或其它調(diào)節(jié)因子而激活該啟動子、結(jié)合其啟動子或引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生激活該啟動子的分子來鑒定受試化合物。
可將表達(dá)水平或活性水平與基線值相比較。基線值可以是對照樣品的值或代表對照群體(如本文所述貧乏(lean)個體)或細(xì)胞(如未接觸WIF-1調(diào)節(jié)物的組織培養(yǎng)細(xì)胞)WIF-1表達(dá)水平的統(tǒng)計值。也可測定不表達(dá)WIF-1的細(xì)胞(作為陰性對照)的表達(dá)水平。此外，這種細(xì)胞與受試細(xì)胞在遺傳上基本相同。
可進(jìn)行各種對照(測定)以保證觀察到的活性是真實的，包括用缺乏報道構(gòu)建物的細(xì)胞進(jìn)行平行反應(yīng)或不使含有報道構(gòu)建物的細(xì)胞與受試化合物接觸。也可如下所述進(jìn)一步驗證這些化合物。
化合物可通過各種機(jī)制提高WIF-1的表達(dá)。例如，在一個實施方式中，化合物可通過降低WIF-1啟動子的甲基化增加表達(dá)。這種化合物包括可引入細(xì)胞的甲基化抑制劑如5-氮胞苷等。
3.增加WIF-1活性的核酸在本發(fā)明的一個方面，WIF-1激活物也可包含表達(dá)WIF-1或WIF-1多肽的核酸分子，如包含本文鑒定的Wnt-結(jié)合域的核酸分子?？捎贸Ｒ?guī)的基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法將編碼WIF-1的核酸引入哺乳動物細(xì)胞或靶組織中。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸露的核酸和與遞送載體如脂質(zhì)體復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，在遞送給細(xì)胞后它們具有游離的或整合的基因組。基因治療方法的綜述參見Anderson，Science 256808-813(1992)；Nabel和Feigner，TIBTECH 11211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH 11162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11167-175(1993)；Miller，Nature 357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology6(10)1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience835-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)31-44(1995)；Haddada等，《當(dāng)今微生物學(xué)和免疫學(xué)論題》(Current Topics in Microbiology andImmunology)Doerfler和Bhm(編)(1995)；和Yu等，Gene Therapy 113-26(1994)。
a)非病毒遞送方法編碼本發(fā)明工程改造多肽的核酸的非病毒遞送方法包括脂轉(zhuǎn)染(lipofection)、顯微注射、基因槍、病毒顆粒、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì)核酸偶合體、裸DNA、人造病毒粒子以及DNA攝取增強(qiáng)劑。例如，在美國專利5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂轉(zhuǎn)染，并且可購得脂轉(zhuǎn)染試劑(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。適于多核苷酸的有效受體識別脂轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024所述的那些物質(zhì)?？梢韵蚣?xì)胞(離體給藥)或靶組織(體內(nèi)給藥)遞送。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知包含靶向脂質(zhì)體如免疫脂質(zhì)復(fù)合物的脂質(zhì)核酸復(fù)合物的制備方法(參見例如Crystal，Science 270404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.524817-4820(1992)；美國專利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
b)病毒遞送方法使用RNA或DNA病毒系統(tǒng)來遞送WIF-1核酸是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。常規(guī)病毒系統(tǒng)包括用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒以及單純皰疹病毒載體。
在許多基因治療應(yīng)用中，希望基因治療載體以高特異性遞送到特定組織類型(例如肺組織或乳腺組織)中?？筛脑觳《据d體使之表達(dá)的配體成為與病毒外表面上病毒包膜蛋白相融合的蛋白質(zhì)而對給定的細(xì)胞類型具有特異性。選擇與已知存在于感興趣細(xì)胞類型上的受體具有親和力的配體。例如，Han等在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A929747-9751(1995)中報道了可改造莫羅尼小鼠白血病病毒使其表達(dá)與gp70融合的人本調(diào)蛋白(heregulin)，并且重組病毒能感染表達(dá)人表皮生長因子受體的某些人乳腺癌細(xì)胞?？蓪⑦@一原理延伸到其它配對的表達(dá)配體融合蛋白的病毒和表達(dá)受體的靶細(xì)胞。例如，可以改造絲狀噬菌體使其展示對所選細(xì)胞受體具有特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如Fab或Fv)。雖然以上描述主要用于病毒載體，但可將同樣的原理用于非病毒載體?？梢愿脑爝@樣的載體，使其包含認(rèn)為有助于被特定靶細(xì)胞攝取的特定攝取序列。
可以通過給予患者個體、一般通過全身給藥(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部應(yīng)用(如下所述)體內(nèi)遞送基因治療載體。另外，可將載體遞送給離體細(xì)胞，如從患者個體取出的細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于診斷、研究或基因治療的離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(例如，通過將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新輸入宿主生物體)。在一些實施方式中，分離對象生物體的細(xì)胞，用WIF-1核酸轉(zhuǎn)染后再輸回該對象生物體(例如患者)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適于離體轉(zhuǎn)染的多種細(xì)胞類型(參見，例如Freshney等，《動物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊》(Cultureof Animal Cells，A Manual of Basic Technique)，第3版，1994))以及其中說明如何分離并培養(yǎng)患者細(xì)胞所引用的參考文獻(xiàn))。
也可將含治療性核酸的載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)直接給予生物體，用于體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，可以給予裸DNA。通過常用途徑之一給予導(dǎo)入分子使其與血液或組織細(xì)胞最終接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得并且熟知給予這種核酸的適當(dāng)方法，雖然可用一種以上的途徑給予特定組合物，但常常是某特定途徑比其他途徑提供更快捷、更有效的反應(yīng)。
藥學(xué)上可接受的的運載體部分取決于所給予的特定組合物以及用于給予該組合物的特定方法。因此，如下所述，本發(fā)明藥物組合物有多種合適劑型(參見例如，《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1989))。
VI.藥物組合物本發(fā)明提供了用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)癌癥的藥物組合物。這種藥物組合物包含例如WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽；上述物質(zhì)的抗體；編碼WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽的多核苷酸；WIF-1表達(dá)的激活物；或WIF-1活性調(diào)節(jié)物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)的癌癥的藥物組合物包含(i)編碼WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本發(fā)明又一實施方式中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本發(fā)明另一實施方式中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO16的WIF-1多肽。在優(yōu)選實施方式中，該多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)癌癥的藥物組合物包含(i)WIF-1多肽和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO14的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在本發(fā)明又一實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。在優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽是包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
A.給予藥物組合物可將包含WIF-1激活物、WIF-1多肽或WIF-1多核苷酸的藥物組合物給予患者，以治療癌癥，如肺癌或乳腺癌。如下所詳述，激活物可以任何適當(dāng)形式、任選地與藥學(xué)上可接受的運載體一起給予。
可將治療有效劑量的經(jīng)鑒定的激活物給予患者，以預(yù)防、治療或控制癌癥?？蓪⑺龌衔锝o予患者，其用量足以引發(fā)患者的有效治療反應(yīng)。有效治療反應(yīng)是至少部分阻滯或減緩疾病的癥狀或并發(fā)癥的反應(yīng)。將足夠達(dá)到此目的的用量定義為“治療有效劑量”。該劑量取決于所用具體WIF-1激活物的功效和對象的病況，以及待治療患者的體重和體表面積。該劑量的大小也取決于具體對象的具體化合物或載體所伴有的副作用性質(zhì)和程度。
可在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏杏脴?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，例如測定LD50(導(dǎo)致50％群體致死的劑量)和ED50(對50％群體治療有效的劑量)測定所述化合物的毒性和療效。毒性和療效之間的劑量之比是治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值表示。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。雖然可采用具有有毒副作用的化合物，但應(yīng)小心設(shè)計使這種化合物靶向患病組織部位的遞送系統(tǒng)，以最大程度降低對正常細(xì)胞的可能損傷，從而減少副作用。
可利用獲自細(xì)胞培養(yǎng)試驗和動物研究的數(shù)據(jù)制訂用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量的循環(huán)濃度優(yōu)選在包括毒性很小或沒有毒性的ED50范圍內(nèi)。劑量可根據(jù)所用劑型和給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。對用于本發(fā)明方法的化合物而言，一開始時可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗估計治療有效劑量?？稍趧游锬Ｐ椭写_定劑量，以獲得循環(huán)血漿濃度范圍，該范圍包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC50(實現(xiàn)癥狀半數(shù)最大抑制的受試化合物濃度)?？衫眠@些信息更準(zhǔn)確地確定人用劑量。可通過(例如)高效液相色譜(HPLC)測定血漿水平。通常，一般對象的調(diào)節(jié)物劑量相當(dāng)于約1ng/kg-10mg/kg。
可用一種或多種生理學(xué)可接受的運載體或賦形劑，以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)配制本發(fā)明所用藥物組合物。可配制所述化合物及其生理學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物，經(jīng)任何適當(dāng)途徑給藥，包括吸入、局部、經(jīng)鼻、口服、胃腸道外(如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi))或經(jīng)直腸給藥。
對于口服給藥，藥物組合物可采取(例如)用藥學(xué)上可接受的賦形劑以常規(guī)方法制備的片劑或膠囊形式，賦形劑包括粘合劑，例如預(yù)膠凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素；填充劑，例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅；崩解劑，例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉；或濕潤劑，例如十二烷硫酸鈉。片劑可用本領(lǐng)域熟知的方法包衣。用于口服給藥的液體制劑可采取(例如)溶液、糖漿或懸液形式，或者，可以是臨用前用水或其它合適運載體重建的干燥產(chǎn)品?？捎盟帉W(xué)上可接受的添加劑以常規(guī)方法制備這種液體制劑，添加劑例如有懸浮劑，如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪；乳化劑，如卵磷脂或阿拉伯樹膠；非水性運載體，例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾的植物油；和防腐劑，如甲基或丙基-對羥基苯甲酸酯或山梨酸。制劑也可適當(dāng)?shù)睾芯彌_鹽、調(diào)味劑、色素和/或甜味劑。如果需要，可適當(dāng)配制口服給藥制劑，以控制釋放活性化合物。
對于吸入給藥，可由加壓包或噴霧器以氣溶膠噴霧遞呈形式方便地遞送這些化合物，加壓包或噴霧器中采用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體。就加壓氣霧劑而言，可通過提供閥門確定劑量單位，以遞送計量的藥物。用于吸入器或吹藥器的(例如)明膠膠囊或藥筒可含有所述化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可將所述化合物配制成通過注射，如推注或連續(xù)輸注的胃腸道外給藥劑型。注射劑可以是裝在(例如)安瓿或多劑量容器中的添加有防腐劑的單位劑型。所述組合物可采取用油或水運載體配制的懸液、溶液或乳液形式，并可含有配方試劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是粉末形式，臨用前用合適的運載體，如無菌無熱原水重建。
也可將所述化合物配制成直腸給藥組合物，如栓劑或保留灌腸劑，其(例如)含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其它甘油酯。
而且，可將所述化合物配制成長效制劑?？赏ㄟ^植入(如皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射給予這種長效制劑。因此，例如，可用合適的聚合材料或疏水材料(例如作為用可接受油配的乳劑)或離子交換樹脂配制所述化合物，或配制成微溶衍生物如微溶鹽。
如果需要，可在包裝或分配裝置中提供所述組合物，這種包裝或分配裝置可裝入一個或多個含活性成分的單位劑型。所述藥包可(例如)包含金屬或塑料箔片，例如，起泡包裝。所述包裝或分配裝置可附有給藥說明書。
VII.治療癌癥的方法用于治療WIF-1下調(diào)癌癥和誘導(dǎo)WIF-1下調(diào)的細(xì)胞凋亡的本發(fā)明方法部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即正常細(xì)胞表達(dá)的WIF-1在人癌細(xì)胞中低表達(dá)。WIF-1低表達(dá)和可用本發(fā)明方法治療的癌癥包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦腫瘤、陰道或睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。癌癥優(yōu)選是肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌或黑色素瘤。
本發(fā)明提供治療或預(yù)防WIF-1表達(dá)下調(diào)癌癥的方法。此方法包括給予患者藥物組合物的步驟。所述藥物組合物包含例如，WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽；上述物質(zhì)的抗體；編碼WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽的多核苷酸；WIF-1表達(dá)激活物；或WIF-1活性調(diào)節(jié)物。本發(fā)明藥物組合物可單獨給予或與一種或多種其它治療化合物或療法聯(lián)合給予。這種治療化合物或療法的例子包括但不限于泰素、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬、氟尿嘧啶和多柔比星。
治療癌癥的方法可任選地包括一個或多個下述步驟獲得個體的組織或體液生物樣品；篩檢該生物樣品中WIF-1多肽的表達(dá)，例如將該生物樣品與WIF-1抗體接觸；或篩檢該生物樣品中WIF-1多核苷酸的表達(dá)，例如檢測WIF-1 mRNA。
A.抑制細(xì)胞增殖可以各種方式使用本發(fā)明WIF-1多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了抑制WIF-1低表達(dá)細(xì)胞增殖的方法?！霸鲋场敝讣?xì)胞生長、細(xì)胞繁殖或倍增或者病理性囊腫(morbid cyst)。低表達(dá)的WIF-1可以是WIF-1多肽或WIF-1 mRNA。此方法包括使細(xì)胞與WIF-1多肽接觸的步驟，所述多肽的用量能有效抑制細(xì)胞增殖。用WIF-1多肽，優(yōu)選本發(fā)明WIF-1亞域多肽來抑制細(xì)胞，優(yōu)選癌細(xì)胞的增殖。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，在體外實施此方法。如本文進(jìn)一步所述，也可在體內(nèi)實施本發(fā)明方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，與WIF-1多肽接觸的細(xì)胞是選自下組的癌細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦癌、陰道癌、睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞。優(yōu)選的癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，與WIF-1多肽接觸的癌細(xì)胞包含本文所述的超甲基化的WIF-1啟動子。通常用本文所述方法降低WIF-1啟動子的甲基化后，細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)增加。
B.抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以各種方式使用本發(fā)明WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，提供了本文所述抑制細(xì)胞，優(yōu)選癌細(xì)胞中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。此方法包括將WIF-1低表達(dá)細(xì)胞與WIF-1多肽接觸的步驟，所述多肽的用量能有效抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？捎肳IF-1多肽，優(yōu)選本發(fā)明WIF-1亞域多肽抑制細(xì)胞，優(yōu)選癌細(xì)胞中的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
C.治療疾病可以各種方式使用本發(fā)明WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，提供了治療WIF-1低表達(dá)相關(guān)疾病的方法。此方法包括給予對象，優(yōu)選需要治療的對象WIF-1活性多肽的步驟，所述多肽的用量能有效治療該疾病。所述對象優(yōu)選人?？捎肳IF-1多肽，優(yōu)選本發(fā)明WIF-1亞域多肽治療WIF-1低表達(dá)相關(guān)疾病。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，WIF-1低表達(dá)相關(guān)疾病是癌癥?？捎肳IF-1多肽，優(yōu)選本發(fā)明WIF-1亞域多肽治療選自下組的癌癥肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦癌、陰道癌、睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。癌癥優(yōu)選肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌或黑色素瘤。
D.用WIF-1多核苷酸治療癌癥的方法本發(fā)明提供治療或預(yù)防WIF-1表達(dá)下調(diào)的各種癌癥的方法。在本發(fā)明的一些方面，使細(xì)胞與能增加細(xì)胞中WIF-1表達(dá)的組合物相接觸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，組合物包含編碼WIF-1多肽，優(yōu)選WIF-1亞域多肽的核酸。
本發(fā)明提供了編碼以下物質(zhì)的多核苷酸SEQ ID NO2的WIF-1多肽、SEQ IDNO14的WIF-1多肽、SEQ ID NO15的WIF-1多肽、SEQ ID NO16的WIF-1多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180的WIF-1亞域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-180的WIF-1亞域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176的WIF-1亞域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
在本發(fā)明其它優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO17的核苷酸序列、SEQ ID NO18的核苷酸序列或SEQ ID NO19的核苷酸序列?？捎蒘EQ ID NO1推斷出編碼包含下述WIF-1亞域多肽的核苷酸序列SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-180、SEQ ID NO2的氨基酸殘基29-176或SEQ ID NO2的氨基酸殘基39-176。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，治療癌癥的方法包括給予診斷患有癌癥的患者治療有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含(i)編碼WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。
在此方法的優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本發(fā)明又一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO16的WIF-1多肽。其它優(yōu)選的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180的WIF-1亞域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-1 80的WIF-1亞域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176的WIF-1亞域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1。在其它優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列、編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-180的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列、編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列或編碼包含SEQID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列。
給予包含編碼WIF-1多肽的多核苷酸的藥物組合物的方式和時間安排對本發(fā)明不重要?？梢员疚乃龅母鞣N方式將該藥物組合物給予患者。在此方法的優(yōu)選方面，將包含編碼WIF-1多肽的多核苷酸的藥物組合物注射到腫瘤附近。另一方面，將該藥物組合物直接注射入腫瘤中。監(jiān)測癌癥過程(如根據(jù)腫瘤大小確定癌癥是否消退)時，本領(lǐng)域治療醫(yī)師將確定藥物組合物的注射進(jìn)行一次或在適當(dāng)時間后重復(fù)注射?？梢悦咳兆⑸洹?br> E.用WIF-1多肽治療癌癥的方法本發(fā)明提供治療或預(yù)防WIF-1表達(dá)下調(diào)各種癌癥的方法。在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，此方法包括給予診斷患有癌癥的患者治療有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含(i)WIF-1多肽和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。
在此方法的優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO14的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在本發(fā)明的其它實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。其它優(yōu)選WIF-1多肽是包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180、SEQ IDNO2氨基酸殘基29-180、SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176或SEQ ID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
給予包含WIF-1多肽的藥物組合物的方式和時間安排對本發(fā)明不重要?？梢员疚乃龅母鞣N方式將該藥物組合物給予患者。在優(yōu)選方面，將包含WIF-1多肽的藥物組合物注射到腫瘤附近。另一方面，將該藥物組合物直接注射入腫瘤中。監(jiān)測癌癥過程(如根據(jù)腫瘤大小確定癌癥是否消退)時，本領(lǐng)域治療醫(yī)師將確定藥物組合物的注射進(jìn)行一次或在適當(dāng)時間后重復(fù)注射?？梢悦咳兆⑸?。
1.WIF-1模擬物本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道，可采用與WIF-1多肽、WIF-1肽或包含WIF-1的Wnt結(jié)合域的多肽結(jié)構(gòu)相同的肽模擬物實施本發(fā)明方法，并可將它們包括在本發(fā)明試劑盒中。肽模擬物是結(jié)構(gòu)上與某多肽充分相似，從而保留該多肽的所需性能的化合物。模擬物的基本結(jié)構(gòu)常常模擬了該多肽的基本結(jié)構(gòu)和/或具有該多肽的顯著生物學(xué)性能。例如，WO 94/05639中描述了用作蛋白酶抑制劑的肽模擬物。WIF-1肽模擬物指能夠模擬天然產(chǎn)生或重組WIF-1多肽生物作用的任何肽或非肽化合物。模擬物可包括但不限于(i)具有大量修飾以致于(例如)WIF-1多肽和模擬物的側(cè)鏈無相似性或相似性很小(這種修飾(例如)可減少該模擬物降解)的肽；(ii)分離肽的非蛋白部分；或(iii)合成或天然的有機(jī)分子，包括核酸和通過組合化學(xué)鑒定的物質(zhì)。例如，可用本領(lǐng)域已知的各種方法設(shè)計、選擇和/或鑒定這種模擬物，所述方法包括例如，構(gòu)建和篩選大的化學(xué)多樣性分子文庫、合成或天然的化合物文庫，或通過合理、定向或隨機(jī)性設(shè)計。篩選這些文庫的總目的是依次應(yīng)用組合選擇來獲得對感興趣結(jié)合位點具有高親和力的物質(zhì)。對于定向或合理的藥物設(shè)計來說，可利用WIF-1的Wnt結(jié)合域結(jié)構(gòu)作為選擇和設(shè)計肽模擬物的基礎(chǔ)。例如，美國專利號6,514,729、6,627,186、6,682,923和6,746,853中也描述了肽模擬物。
F.測定癌癥過程(進(jìn)展、消退)癌癥的階段或嚴(yán)重性指指腫瘤的不同臨床階段。用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)建立的各種參數(shù)定義腫瘤的臨床階段。一些參數(shù)包括形態(tài)、腫瘤大小、腫瘤在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移的程度等。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，測定癌癥作為確定癌癥過程的一部分。因此，本發(fā)明提供了測定對象癌癥過程的方法。癌癥過程指癌癥狀態(tài)隨時間的改變，包括癌癥進(jìn)展(惡化)和癌癥消退(改善)。消退包括腫瘤緩解、腫瘤大小減小或縮小、癌細(xì)胞數(shù)量減少和前列腺癌相關(guān)的癥狀減輕。
G.監(jiān)測給予患有WIF-1下調(diào)性癌癥對象的手術(shù)或抗癌藥或治療的效果如上所述，包含WIF-1的組合物可用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)的癌癥。然而，其它藥物，如本文所述包含WIF-1激活物的組合物也可用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)癌癥的患者。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，測定癌癥狀態(tài)作為監(jiān)測手術(shù)效果(如切除腫瘤)、給予診斷患有WIF-1表達(dá)下調(diào)癌癥的對象抗癌藥或治療效果的一部分。給予癌癥患者手術(shù)或抗癌藥或治療的效果可以是癌癥復(fù)發(fā)、癌癥進(jìn)展(惡化)和癌癥消退(改善)。
采用本發(fā)明組合物、方法和試劑盒，在手術(shù)后多次或給予抗癌藥或治療后不同時間測定對象生物樣品中的WIF-1水平。第一次(t1；如給予抗癌藥或治療之前)檢測到某對象生物樣品中的WIF-1水平低于第二次(t2；如給予抗癌藥或治療之后)檢測同一對象同等生物樣品中的WIF-1水平時，表明該對象的癌癥正在消退。同樣，與第一次檢測到的WIF-1水平相比，第二次檢測到的WIF-1水平較低，表明該對象的癌癥正在進(jìn)展。類似地，第一次(t1；如剛剛手術(shù)后)檢測到某對象生物樣品中的WIF-1水平低于第二次(t2；如術(shù)后數(shù)周或數(shù)月)檢測同一對象同等生物樣品中的WIF-1水平時，可能表明對象的癌癥沒有復(fù)發(fā)。同樣，與第一次檢測到的Wnt2水平相比，第二次檢測到的Wnt2水平較低可能表明該對象的癌癥正在復(fù)發(fā)。
VIII.凋亡誘導(dǎo)方法凋亡在多細(xì)胞生物的發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到核心作用?？赏ㄟ^多種獨立的信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)凋亡，這些途徑匯合成由幾種死亡受體和其配體(屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體/配體超家族)之間多種相互作用組成的最終效應(yīng)物機(jī)制。表征最好的死亡受體是CD95(“Fas”)、TNFR1(p55)、死亡受體3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最終效應(yīng)物機(jī)制是激活稱為胱冬酶的一系列蛋白酶。這些胱冬酶的活化導(dǎo)致一系列活細(xì)胞蛋白的切割和細(xì)胞死亡。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)WIF-1表達(dá)下調(diào)細(xì)胞凋亡的方法。在一個方面，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法包括使細(xì)胞暴露于一種組合物或使細(xì)胞接觸該組合物的步驟，所述組合物包含(i)編碼WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽、WIF-1表達(dá)激活物或WIF-1活性調(diào)節(jié)物的多核苷酸或(ii)WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽、WIF-1表達(dá)激活物或WIF-1活性調(diào)節(jié)物。通常使細(xì)胞暴露或接觸有效量的所述組合物。
在優(yōu)選實施方式中，使細(xì)胞離體暴露于或離體接觸組合物。在另一優(yōu)選實施方式中，使細(xì)胞在體內(nèi)暴露于或在體內(nèi)接觸所述組合物。
A.用WIF-1多核苷酸誘導(dǎo)凋亡的方法在優(yōu)選實施方式中，誘導(dǎo)WIF-1表達(dá)下調(diào)細(xì)胞凋亡的方法包括使細(xì)胞暴露于一種組合物或使細(xì)胞接觸該組合物的步驟，所述組合物包含WIF-1多核苷酸。在優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO2的WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO14的WIF-1多肽。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO15的WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO16的WIF-1多肽。其它優(yōu)選的多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180的WIF-1亞域多肽、包含SEQ IDNO2氨基酸殘基29-180的WIF-1亞域多肽、包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176的WIF-1亞域多肽或包含SEQ ID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1。在其它優(yōu)選實施方式中，，所述多核苷酸包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18或SEQ ID NO19，編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基1-180的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列、編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-180的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列、編碼包含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-176的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列或編碼包含SEQID NO2氨基酸殘基39-176的WIF-1亞域多肽的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個方面，用WIF-1多核苷酸在體外，如在培養(yǎng)細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。在另一優(yōu)選方面，用WIF-1多核苷酸在體內(nèi)，即在動物(優(yōu)選哺乳動物，包括人)體內(nèi)，優(yōu)選癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
B.用WIF-1多肽誘導(dǎo)凋亡的方法可以各種方式使用本發(fā)明WIF-1多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，提供了誘導(dǎo)WIF-1低表達(dá)細(xì)胞，優(yōu)選癌細(xì)胞凋亡的方法。此方法包括使細(xì)胞與WIF-1活性多肽接觸的步驟，所述多肽的用量能有效誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。
在此方法的優(yōu)選實施方式中，WIF-1活性多肽是包含SEQ ID NO14氨基酸序列的WIF-1多肽。在此方法的另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。在此方法的又一優(yōu)選實施方式中，WIF-1多肽包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO16的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，WIF-1活性多肽是WIF-1亞域多肽，如本文通篇所述。
在本發(fā)明的一個方面，用WIF-1多肽在體外，如在培養(yǎng)細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。在另一優(yōu)選方面，用WIF-1多肽在體內(nèi)，即在動物(優(yōu)選哺乳動物，包括人)體內(nèi)，優(yōu)選癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
IX.基因治療一方面，以基因治療方式給予編碼WIF-1多肽、WIF-1類似物、WIF-1模擬物、WIF-1相關(guān)多肽的多核苷酸；WIF-1表達(dá)激活物或WIF-1活性調(diào)節(jié)物以提高WIF-1功能。基因治療指給予對象表達(dá)或可表達(dá)的核酸。在此實施方式中，核酸產(chǎn)生其編碼的多肽通過提高WIF-1功能而產(chǎn)生療效。
可根據(jù)本發(fā)明采用本領(lǐng)域已有的和本文所述的基因治療方法?；蛑委煼椒ǖ娜婢C述參見Goldspiel等，Clinical Pharmacy 12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；和TIBTECH 11(5)155-215(1993年5月)?？刹捎玫谋绢I(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)方法參見Ausubel等(編)，《新編分子生物學(xué)實驗指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，紐約(1993)；和Kriegler，《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實驗室手冊》(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，紐約(1990)。
在一個優(yōu)選方面，通過基因治療方式提高WIF-1功能的核酸包含編碼WIF-1多肽、其片段或嵌合蛋白的序列，其中所述核苷酸序列是在合適宿主中表達(dá)WIF-1多肽、其片段或嵌合蛋白的表達(dá)載體的一部分。具體說，這種核酸的啟動子操作性連接于WIF-1編碼區(qū)。此啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型(任選為組織特異性)啟動子。在另一具體實施方式
，所用核酸分子中WIF-1編碼序列和其它所需序列側(cè)接能促進(jìn)在基因組所需位點上同源重組的區(qū)域，從而提供WIF-1核酸的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature342435-438(1989))。
可直接將所述核酸遞送給對象，在這種情況下使對象直接暴露于或接觸所述核酸或攜帶核酸的載體；此法稱為體內(nèi)基因治療。或者，可間接將核酸遞送給對象，在這種情況下先用該核酸體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后移植入對象體內(nèi)；此方法稱為離體基因治療。
X.用于診斷和/或預(yù)后應(yīng)用的試劑盒對于上述診斷、研究和治療應(yīng)用而言，本發(fā)明也可提供試劑盒。在診斷和研究應(yīng)用中，所述試劑盒可裝有以下一種或所有成分檢測試劑、緩沖液、WIF-1多肽、WIF-1特異性核酸或抗體、雜交探針和/或引物、WIF-1表達(dá)構(gòu)建物、WIF-1的小分子激活物等。治療產(chǎn)品可包括無菌鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的乳液和懸液基。
此外，試劑盒可裝有說明材料，包括實施本發(fā)明方法的指南(即操作方案)。說明書可以各種形式在試劑盒中提供，試劑盒中可裝有一種或多種形式的說明書。雖然說明材料一般包括書面或打印材料，但不限于此。能夠存放此說明書并將它們傳遞給最終使用者的任何介質(zhì)都包括在本發(fā)明中。這種媒介包括但不限于電子存儲媒體(如磁盤、磁帶、盒式磁帶、芯片)、光學(xué)媒體(如CD ROM)等。這種媒介可包括提供所述說明材料的因特網(wǎng)址。
本發(fā)明也提供了用于篩選WIF-1活性調(diào)節(jié)物的試劑盒。這種試劑盒可以由易于獲得的材料與試劑制備。例如，這樣的試劑盒可裝有一種或多種以下材料WIF-1多肽或多核苷酸、反應(yīng)試管以及檢測WIF-1活性的說明書。該試劑盒任選裝有生物活性WIF-1蛋白。可根據(jù)本發(fā)明制備各種試劑盒和組分，這取決于試劑盒的預(yù)期使用者和使用者的具體需要。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，該試劑盒是一種藥盒，裝有含以下組分的藥物組合物(i)編碼WIF-1多肽的多核苷酸和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，該試劑盒是藥盒，裝有含以下組分的藥物組合物(i)WIF-1多肽，優(yōu)選WIF-1亞域多肽和(ii)藥學(xué)上可接受的運載體。藥盒任選裝有說明該藥物組合物可以或應(yīng)該用于治療WIF-1表達(dá)下調(diào)的癌癥的說明書。
本發(fā)明試劑盒還可裝有進(jìn)行質(zhì)譜所需的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種試劑，包括例如探針或芯片。
本發(fā)明的其它試劑盒實施方式包括能使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實施本文所述方法變型的任選功能組分。
雖然為了闡明和理解以描述和舉例方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容不難明白，可以對其進(jìn)行某些改變、更改、修飾和等價物取代，而這不背離本發(fā)明構(gòu)思和范圍。因此，本文所述實施方式涉及各種修飾、改變等，而本發(fā)明范圍僅由所附權(quán)利要求書決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難認(rèn)識到，可改變、修改或修飾各種非關(guān)鍵性參數(shù)，而能產(chǎn)生基本相似的結(jié)果。
雖然本文所述的本發(fā)明各部分內(nèi)容都含有多種實施方式，但是應(yīng)理解，除非另有說明，本發(fā)明給定部分的各實施方式能夠與本發(fā)明其它部分的各實施方式一起應(yīng)用，這些應(yīng)用各自形成本發(fā)明的獨特實施方式。
將本說明書引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請全文納入本文作參考，就像特別和個別地將各發(fā)表物、專利和專利申請納入作參考那樣。
如從上述公開內(nèi)容所理解的那樣，本發(fā)明有各種應(yīng)用。還通過以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下實施例僅為說明，不旨在以任何方式限制本發(fā)明的定義和范圍。
XI.實施例實施例1總方法A.細(xì)胞系和組織樣品NSCLC細(xì)胞系(NCI-H1703、NCI-H460、NCI-H838和NCI-A549)、黑色素瘤細(xì)胞系LOX、肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SNU398和結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；美國弗吉尼亞州馬納薩斯)，在補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI 1640中培養(yǎng)。正常人小呼吸道上皮細(xì)胞(SAEC)和支氣管上皮細(xì)胞(NHBE，16HBE)(原代培養(yǎng)物)獲自Cambrex Bio ScienceWalkersville，Inc.(Walkersville，馬里蘭州)或Clonetics(Walkersville，馬里蘭州)，用Clonetics SAGMTMBullet試劑盒培養(yǎng)。在37℃、含有5％CO2的濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所有細(xì)胞。
在肺癌切除術(shù)時收集患者的新鮮肺癌組織和鄰近正常肺組織，立即用液氮速凍(IRB批號H8714-15319-040)。將這些組織樣品保存在-170℃的液氮器中，待用。
B.克隆和序列分析為了克隆人WIF-1基因的啟動子區(qū)，采用基于PCR的技術(shù)。用DNA STAT-60TM試劑(TEL-TEST，Inc.，F(xiàn)riendswood，得克薩斯州)根據(jù)生產(chǎn)商方案抽提各細(xì)胞系和新鮮組織樣品的基因組DNA。用甲基化試劑盒(EZ DNA甲基化試劑盒，ZymoResearch，美國加利弗尼亞州奧倫奇)對基因組DNA進(jìn)行硫酸氫鹽修飾。用以下兩對引物擴(kuò)增硫酸氫鹽處理的基因組DNA5′-GAGTGATGTTTTAGGGGTTT-3′(正向)(SEQ ID NO8)和5′-CCTAAATACCAAAAAACCTAC-3′(反向)(SEQ ID NO9)(設(shè)計用于擴(kuò)增WIF-1啟動子區(qū)的nt-555～-140)以及5′-GTAGGTTTTTTGGTATTTAGG-3′(正向)(SEQ ID NO10)和5′-TCCATAAATACAAACTCTCCTC-3′(反向)(SEQ ID NO11)(用于擴(kuò)增nt-161～+118)(WIF-1的起始密碼子ATG定義為+1)。用抽提試劑盒(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，加利弗尼亞州巴倫西亞)提取瓊脂糖凝膠中的PCR產(chǎn)物，然后在UCSF癌癥中心(加利福尼亞州舊金山)的DNA測序中心進(jìn)行測序。
用PCR產(chǎn)生人基因組DNA中WIF-1的5′基因組區(qū)的截短形式，將其亞克隆入pGL3Basic載體中。用凝膠純化消化的插入物和載體，連接產(chǎn)生缺失構(gòu)建物。通過限制性酶消化和測序核查克隆片段。
C.瞬時轉(zhuǎn)染和啟動子活性測定對于瞬時轉(zhuǎn)染實驗，在轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞(2×105)接種于六孔板中。用Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，采用1.0μg pGL3Basic載體中的各啟動子構(gòu)建物，0.5μg pSV-β-半乳糖苷酶來校正轉(zhuǎn)染效率。孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時，然后測定熒光素酶活性。在一些實驗中，用細(xì)胞因子處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞6小時，然后測定熒光素酶活性。將所有熒光素酶活性按β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化，相對于pGL3Basic空載體的基礎(chǔ)活性(設(shè)定為一個單位)給出該活性。在用細(xì)胞因子處理細(xì)胞的實驗中，相對于細(xì)胞因子處理后pGL3Basic空載體的基礎(chǔ)活性給出標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶活性。一式三份進(jìn)行測定，在至少重復(fù)三次獨立實驗。所示數(shù)據(jù)表示平均值(+S.D.)。
D.集落形成試驗在瞬時轉(zhuǎn)染實驗中，在轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞(2×105)接種于六孔板。按照生產(chǎn)商方案用Lipofectamine 2000(Life Technologies)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，采用5.0μg pCDNA3載體中的WIF-1 cDNA構(gòu)建物，以5.0μg pCDNA3空載體作對照。轉(zhuǎn)染48小時后，剝離轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接種于10厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿。然后，用G418(400μg/ml)選擇細(xì)胞。集落用0.5％亞甲藍(lán)染色，轉(zhuǎn)染4周后計數(shù)。
E.條件培養(yǎng)基(CM)、重組蛋白和蛋白孵育用含人WIF-1開放閱讀框的pcDNA3.1表達(dá)載體產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。在一組實驗中，WIF-1開放閱讀框包含全長WIF-1編碼區(qū)，即編碼SEQ ID NO2的WIF-多肽區(qū)域。因此，切去信號肽后，純化含SEQ ID NO2氨基酸殘基29-379的重組成熟WIF-1多肽。在另一組實驗中，WIF-1開放閱讀框包含WIF-1亞域多肽編碼區(qū)，如編碼SEQ ID NO26所示W(wǎng)IF-多肽的區(qū)域。因此，切去信號肽后，純化含SEQ ID NO27氨基酸序列的重組WIF-1亞域多肽。另一WIF-1亞域多肽序列見SEQ ID NO28。切去信號肽后，純化含SEQ ID NO29氨基酸序列的重組WIF-1亞域多肽。
簡要說，根據(jù)生產(chǎn)商方案用Lipofectamine 2000(Life Technologies)介導(dǎo)pcDNA3.1/myc-his中WIF-1 cDNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染之前，用無血清Freestyle 293表達(dá)培養(yǎng)基維持293T細(xì)胞系。制備未轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基(對照CM)。4天和7天后收集條件培養(yǎng)基。離心去除收集的CM中的細(xì)胞碎片，通過離心濃縮10倍，過濾并凍存于-80℃。純化的麥芽產(chǎn)生的重組人WIF-1蛋白購自Abnova Corp.(Taiwan，ROC)。在實驗前一天將NSCLC細(xì)胞接種于6孔板。然后，用含有或不含各種濃度的重組人WIF-1蛋白的CM替換正常培養(yǎng)基，在37℃、含有5％CO2的濕培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞。一般將40μl、100μl和200μl含WIF-1多肽的CM加入細(xì)胞中。根據(jù)SDS-PAGE定量，估計加入細(xì)胞導(dǎo)致WIF-1多肽活性可被檢測的WIF-1多肽濃度范圍約為10ng/ml至500ng/ml。為了檢測細(xì)菌中產(chǎn)生的WIF-1多肽的相似WIF-1多肽活性，將濃度高得多的WIF-1多肽加入細(xì)胞中。在一些實驗中，細(xì)菌表達(dá)的WIF-1量約為500μg/ml。這相當(dāng)于比哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生該蛋白所需的濃度高1000倍以上。
F.凋亡分析轉(zhuǎn)染3天、5天或1周后(如上所述)，用胰酶消化收獲細(xì)胞(如NSCLC細(xì)胞)，加工后，用膜聯(lián)蛋白V FITC凋亡檢測試劑盒(Oncogene，美國馬薩諸塞州劍橋市；Apotarget，BioSource Intemational)根據(jù)生產(chǎn)商方案測定細(xì)胞表面膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙錠(PI)含量。采用膜聯(lián)蛋白-V-PI雙染方案，以雙色流式細(xì)胞術(shù)中區(qū)分三種細(xì)胞群，(a)非凋亡細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白-V和PI陰性；(b)早期凋亡細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸外露但細(xì)胞膜仍然完整，能結(jié)合膜聯(lián)蛋白V-FITC但排斥碘化丙錠；(c)壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞被膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠雙標(biāo)記。立即用流式細(xì)胞術(shù)分析染色細(xì)胞(FACScan；Decton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lake，新澤西州)。
G.半定量RT-PCR用抽提試劑盒(RNeasy小抽試劑盒，Qiagen，美國加利福尼亞州巴倫西亞)分離肺癌細(xì)胞系、新鮮肺癌和配對的相鄰正常組織的總RNA。在GeneAmp PCR系統(tǒng)9700中用Life Technologies Inc.的一步RT-PCR試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商方案進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR引物獲自O(shè)peron Technologies Inc.(美國加利福尼亞州阿拉米達(dá))。人WIF-1cDNA的引物序列是5′-CCGAAATGGAGGCTTTTGTA-3′(正向)(SEQ ID NO12)和5′-TGGTTGAGCAGTTTGCTTTG-3′(反向)(SEQ ID NO13)。GAPDH用作內(nèi)標(biāo)。如以下文獻(xiàn)所述進(jìn)行5-氮雜-2′-脫氧胞苷(DAC)(Sigma，密蘇里州圣路易斯)處理(Altieri，Nat.Rev.Cancer 3(1)46-54(2003)；Blanc-Brude等，Clin.Cancer Res.9(7)2683-92(2003)；Bowen等，J.Invest.Dermatol.120(1)48-55(2003)；Cong等，Mol.Cell.Biol.23(23)8462-70(2003)；Deng等，Cell 115(1)61-70(2003)；He等，Neoplasia，印刷中(2003)；Ishitani等，Mol.Cell Biol.23(1)131-9(2003)；Kawano和Kypta，J. Cell Sci.116(Pt13)2627-34(2003)；Kim等，Lancet 362(9379)205-9(2003)；Krilleke等，Int.J.Cancer 107(4)520-7(2003)；Pham等，Mol.Pathol.56(5)280-5(2003)；Soengas和Lowe，Oncogene 22(20)3138-51(2003)；Topol等，J.Cell.Biol.162(5)899-908(2003)；Uematsu等，Oncogene 22(46)7218-21(2003)；Uematsu等，Cancer Res.63(15)4547-51(2003)；Usami等，Oncogene 22(39)5978-86(2003)；Veeman等，Dev.Cell.5(3)367-77(2003)；Westfall等，J.Cell Biol.162(5)889-98；和Wong等，Mol.Cell.12(5)1251-60(2003))。
H.Western印跡采用Western印跡的標(biāo)準(zhǔn)方案。WIF-1兔多克隆抗體獲自Santa CruzBiotechnology，Inc.(Santa Cruz，加利福尼亞州)?？筗IF-1、抗Dv13和抗存活蛋白抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，加利福尼亞州)?？?人WIF-1單克隆抗體購自R&D Systems(美國明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)。抗-細(xì)胞周期蛋白D1抗體獲自O(shè)ncogene(美國馬薩諸塞州劍橋市)?？?β-肌動蛋白單克隆抗體獲自Cell SignalingTechnology，Inc.(美國馬薩諸塞州貝弗利)?？?β-聯(lián)蛋白抗體購自TransductionLaboratories(美國肯塔基州萊克星頓)。抗-細(xì)胞色素c抗體獲自BD Biosciences(加利福尼亞州圣地亞哥)。制備胞漿蛋白質(zhì)。
I.甲基化特異性PCR用甲基化-特異性引物組或非甲基化-特異性引物組擴(kuò)增硫酸氫鹽處理的基因組DNA。實驗中采用熱啟動Taq DNA聚合酶(Qiagen Inc.)。甲基化-特異性引物的序列是5′-GGGCGTTTTATTGGGCGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO4)和5′-AAACCAACAATCAACGAAC-3′(反向)(SEQ ID NO5)。非甲基化-特異性引物的序列是5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTAT-3′(正向)(SEQ ID NO6)和5′-AAACCAACAATCAACAAAAC-3′(反向)(SEQ ID NO7)，它們分別對應(yīng)于WIF-1啟動子區(qū)序列-488～-468和-310～-290。
J.WIF-1表達(dá)載體構(gòu)建了幾種表達(dá)載體在真核和原核細(xì)胞中表達(dá)WIF-1多肽和WIF-1亞域多肽。用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(如Sambrook和Russell，《分子克隆，實驗室手冊》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)(第3版，2001)；Kriegler，《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗室手冊》(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)(1990)；和《新編分子生物學(xué)實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等編，1994-1999)構(gòu)建以下表達(dá)載體在真核細(xì)胞中表達(dá)WIF-1(1)pcDNA3.1-myc-his1-379，包含編碼SEQ ID NO2所示W(wǎng)IF-1多肽的核酸；(2)pcDNA3.11-379，包含編碼SEQ IDNO2所示W(wǎng)IF-1多肽和表達(dá)SEQ ID NO30所示W(wǎng)IF-1多肽(切去信號肽后)的核酸；(3)pcDNA3.11-180，包含編碼SEQ ID NO26所示W(wǎng)IF-1多肽和表達(dá)SEQ ID NO27所示W(wǎng)IF-1多肽(切去信號肽后)的核酸；(4)pcDNA3.11-176，包含編碼SEQ IDNO28所示W(wǎng)IF-1多肽和表達(dá)SEQ ID NO29所示W(wǎng)IF-1多肽(切去信號肽后)的核酸；和(5)腺病毒載體1-379，包含編碼SEQ ID NO2所示W(wǎng)IF-1多肽和表達(dá)SEQID NO30所示W(wǎng)IF-1多肽(切去信號肽后)的核酸。對于原核細(xì)胞表達(dá)，(1)pColdI29-379，編碼和表達(dá)包含序列SEQ ID NO30的His加尾WIF-1多肽和(2)pColdI29-180，編碼和表達(dá)包含序列SEQ ID NO27的His加尾WIF-1多肽。
K.在細(xì)菌中表達(dá)WIF-1多肽在大腸桿菌中產(chǎn)生SEQ ID NO27所示W(wǎng)IF亞域多肽和SEQ ID NO30所示全長WIF-1多肽。將各編碼區(qū)插入pColdI載體中，使WIF-1多肽與N-末端His尾一起表達(dá)，并在大腸桿菌(菌株BL21 DE3)中表達(dá)。由細(xì)菌裂解物抽提這兩種蛋白，并用鎳NTA柱純化。用抗-WIF-1和抗-His抗體(R&D，Santa Cruz Biotechnology)以Western印跡證實WIF-1多肽。用SDS-PAGE凝膠(考馬斯試驗)和BCA蛋白質(zhì)定量實驗進(jìn)行WIF-1多肽的定量。
L.用腺病毒載體表達(dá)WIF-1多肽將WIF-1全長多肽的編碼區(qū)(SEQ ID NO2氨基酸殘基1-379)克隆入腺病毒載體。用該重組腺病毒載體感染HEK-293細(xì)胞。濃縮上清(10X)，然后用抗-人WIF-1單克隆抗體(R&D)以Western印跡確認(rèn)。在黑色素瘤細(xì)胞系LOX以及肺癌細(xì)胞系H460和A427(數(shù)據(jù)未顯示)中觀察到劑量-(200μl、100μl、40μl)和時間依賴性凋亡。通過Western分析該通路中的幾種關(guān)鍵蛋白，如DVL-3、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1等證實阻斷了Wnt信號傳導(dǎo)途徑。
M.WIF-1蛋白質(zhì)糖基化分析對WIF-1蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化分析。用GlycoProfile III試劑盒(Sigma Chemical)根據(jù)生產(chǎn)商說明書進(jìn)行糖基化試驗。在細(xì)菌產(chǎn)生和抽提的WIF-1蛋白(全長WIF-1多肽和WIF-1亞域多肽)或購自Abnova Biotech，Inc.的WIF-1蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)上沒有檢測到蛋白質(zhì)糖基化。然而，由轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞純化的全長重組WIF-1多肽和重組WIF-1亞域多肽顯示有糖基化(數(shù)據(jù)未顯示)。
N.統(tǒng)計學(xué)分析采用Excel的非配對t檢驗比較不同構(gòu)建物處理后的活性。
實施例2鑒定WIF-1啟動子區(qū)為了鑒定WIF-1啟動子，用WIF-1的1140-bp編碼序列作為虛擬探針對UCSCr的人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索。用啟動子檢索程序證實該基因的5′區(qū)代表了啟動子區(qū)典型特征。此外，用CpG島檢索程序?qū)IF-1啟動子中的CpG島作圖(圖1)。在此啟動子區(qū)(WIF-1開放閱讀框ATG之前的1.2kb)中鑒定到105個CpG。
實施例3含有缺失突變的人WIF-1啟動子的功能分析為了研究該啟動子活性，將完整1kb片段(ATG之前)以及五個截短片段克隆入無啟動子的熒光素酶(LUC)表達(dá)載體pGL3Basic中。用這些構(gòu)建物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測LUC活性。完整的野生型構(gòu)建物(構(gòu)建物1)顯示出非常高的基礎(chǔ)活性(與設(shè)定為一個單位活性的空載體相比，LUC活性增加約200倍)。
實施例4癌細(xì)胞中該啟動子超甲基化下調(diào)了WIF-1表達(dá)用半定量RT-PCR檢測幾種正常和腫瘤細(xì)胞系中的WIF-1表達(dá)(圖2A)。發(fā)現(xiàn)所有三種正常原代細(xì)胞培養(yǎng)物NHBE、16HBE和SAEC中都表達(dá)WIF-1。相反，在四株NSCLC細(xì)胞系的三株中WIF-1轉(zhuǎn)錄物消失或顯著低表達(dá)。然后分析了這些細(xì)胞系中CpG島的甲基化狀態(tài)。用甲基化-特異性PCR(MSP)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)測定缺乏WIF-1表達(dá)的所有癌細(xì)胞系都是超甲基化的(圖2B)。相反，在表達(dá)WIF-1的所有正常對照中沒有觀察到超甲基化。WIF-1在H1703細(xì)胞系中低表達(dá)程度較低，此細(xì)胞系中MSP僅部分甲基化。而且，用硫酸氫鹽測序詳細(xì)分析了幾種細(xì)胞系中包含該啟動子的-554～ATG和ATG～+118的第一外顯子一部分的WIF-1的672bp片段中有60個CpG位點處于甲基化狀態(tài)(圖3A)。與MSP結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)在所測試的所有NSCLC細(xì)胞系中這些CpG島被密集地甲基化。此外，發(fā)現(xiàn)用去甲基化試劑DAC處理缺乏WIF-1表達(dá)的這些細(xì)胞系后恢復(fù)了WIF-1表達(dá)(圖3B)。正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中WIF-1 mRNA水平下調(diào)與這些細(xì)胞中的WIF-1蛋白水平有關(guān)。發(fā)現(xiàn)正常原代培養(yǎng)細(xì)胞(NHBE、SAEC和NHEK)表達(dá)了WIF-1蛋白(圖17)。然而，在人癌細(xì)胞，包括肺癌(H460、A549)、乳腺癌(MCF-7)、結(jié)腸癌(SW480)和間皮瘤(MS-I、H2052)中WIF-1蛋白低表達(dá)(圖17)。這些結(jié)果證明，NSCLC細(xì)胞系中WIF-1的表達(dá)狀態(tài)與WIF-1啟動子區(qū)的密集CpG甲基化有關(guān)。
實施例5新鮮的人NSCLC組織樣品中該啟動子超甲基化導(dǎo)致WIF-1表達(dá)下調(diào)分析了原代NSCLC組織樣品中WIF-1的表達(dá)和甲基化狀態(tài)。在十八個手術(shù)切除的早期肺癌的匹配對中，發(fā)現(xiàn)與他們的自體正常樣品相比，十五個癌癥樣品(83％)沒有或只有少量WIF-1 mRNA(圖4A)。采用MSP，在缺乏WIF-1表達(dá)的所有腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)異常甲基化，但在其匹配的正常樣品中沒有發(fā)現(xiàn)異常甲基化(圖4B)。在可獲得RNA和硫酸氫鹽-處理的基因組DNA的8個病例(患者6、7、9、10、11、12、15、18)中證明了這種相關(guān)性。此外，在8個其它匹配樣品(患者19～26)中進(jìn)行MSP，其中7個樣品發(fā)現(xiàn)了甲基化證據(jù)。可能由于非癌樣品中不可避免的癌細(xì)胞污染或腫瘤周圍正常組織的惡變前改變，在幾個病例中，分別在正常和腫瘤組織中觀察到輕微甲基化條帶和未甲基化的條帶。這些數(shù)據(jù)證明，WIF-1的沉默與原代NSCLC組織樣品中該啟動子的超甲基化有關(guān)。此外，分析了許多樣品經(jīng)硫酸氫鹽處理后WIF-1啟動子區(qū)的序列。在這些CpG位點中檢測到密集甲基化(圖4C)。總之，WIF-1在NSCLC中常常下調(diào)，此下調(diào)與該啟動子超甲基化有關(guān)。
實施例6恢復(fù)WIF-1誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡證明了恢復(fù)WIF-1可引起因啟動子超甲基化造成WIF-1基因下調(diào)肺癌細(xì)胞系的生長抑制。轉(zhuǎn)染和隨后的藥物選擇一周后，發(fā)現(xiàn)與空載體轉(zhuǎn)染的對照轉(zhuǎn)染物相比，WIF-1轉(zhuǎn)染的H460、A549 MS1、SW480、H28和MCF7細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.005)(圖5)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，WIF-1甲基化-沉默的WIF-1轉(zhuǎn)染的H460、A549和H28細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)水平(轉(zhuǎn)染1周后約57-70％)顯著高于空載體轉(zhuǎn)染的H460、A549和H28細(xì)胞(轉(zhuǎn)染1周后約12-26％)(P＜0.005)(圖5)。此結(jié)果證明，在H460、A549和H28細(xì)胞中恢復(fù)WIF-1表達(dá)能通過誘導(dǎo)凋亡抑制細(xì)胞生長。選擇藥物抗性集落4周后，發(fā)現(xiàn)與空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，WIF-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的集落數(shù)量減少(P＜0.005)。
已知WIF-1能結(jié)合Wnt蛋白抑制其活性(Hsieh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(7)3546-51(1999))。近年來，Wissman等報道了用微陣列分析幾種人癌中WIF-1的下調(diào)，后來用免疫組化在60％乳腺癌和75％肺癌中證實此下調(diào)。在本申請中，報道了在NSCLC細(xì)胞系中WIF-1轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。而且已發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，WIF-1在83％新鮮NSCLC手術(shù)樣品中也下調(diào)。WIF-1沉默與癌細(xì)胞系和人NSCLC原代組織中其啟動子超甲基化有關(guān)。
我們提出，NSCLC中是通過外遺調(diào)節(jié)使WIF-1下調(diào)，類似于先前對結(jié)直腸癌中sFRP的報道。值得注意的是，WIF-1與Fz或sFRP的CRD結(jié)構(gòu)域沒有任何序列相似性(Bui等，Oncogene 14(10)1249-53(1997)；Melkonyan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(25)13636-41(1997)；Shimizu等，Cell Growth Differ.8(12)1349-58(1997)；Todd等，Cancer Res.57(7)1344-52(1997))。WIF-1含有Wnt結(jié)合域和五個表皮生長因子樣重復(fù)序列。它可在胞外空間結(jié)合于XWnt-8和果蠅Wg，并且抑制XWnt-8-Dfz相互作用(Hsieh等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 96(7)3546-51(1999))。對WIF與Wnt的作用機(jī)制仍然是部分了解。鑒定了WIF-1啟動子中的Tcf效應(yīng)元件(數(shù)據(jù)未顯示)，提示W(wǎng)IF-1的作用是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物。
已認(rèn)識到導(dǎo)致下調(diào)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)異常甲基化是一種使人癌腫瘤抑制基因失活的機(jī)制。在肺癌中，首先報道p16是甲基化的。目前，在各種類型的肺癌中發(fā)現(xiàn)，許多其它基因如APC、H-鈣粘著蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、視黃酸受體β-2、E-鈣粘著蛋白、RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族IA是甲基化的，近年來報道，NSCLC細(xì)胞中人SOCS-3啟動子超甲基化(Altieri，Nat.Rev.Cancer 3(1)46-54(2003)；Blanc-Brude等，Clin.Cancer Res.9(7)2683-92(2003)；Bowen等，J.Invest.Dermatol.120(1)48-55(2003)；Cong等，Mol.Cell.Biol.23(23)8462-70(2003)；Deng等，Cell 115(1)61-70(2003)；He等，Neoplasia，印刷中(2003)；Ishitani等，Mol.Cell.Biol.23(1)131-9(2003)；Kawano和Kypta，J.Cell.Sci.116(Pt13)2627-34(2003)；Kim等，Lancet362(9379)205-9(2003)；Krilleke等，Int.J.Cancer 107(4)520-7(2003)；Pham等，Mol Pathol.56(5)280-5(2003)；Soengas和Lowe，Oncogene 22(20)3138-51(2003)；Topol等，J.Cell Biol 162(5)899-908(2003)；Uematsu等，Oncogene 22(46)7218-21(2003)；Uematsu等，Cancer Res.63(15)4547-51(2003)；Usami等，Oncogene22(39)5978-86(2003)；Veeman等，Dev.Cell.5(3)367-77(2003)；Westfall等，J.CellBiol 162(5)889-98；和Wong等，Mol Cell.12(5)1251-60(2003))。發(fā)現(xiàn)啟動子甲基化使WIF-1沉默(如本文所述)揭示是NSCLC發(fā)育期間的重要外遺事件，提示W(wǎng)IF-1可能是肺癌Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵拮抗劑。
也發(fā)現(xiàn)，WIF-1表達(dá)能誘導(dǎo)各種人癌細(xì)胞系凋亡，這些細(xì)胞系包括肺癌細(xì)胞系A(chǔ)427、A549和H460，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480以及間皮瘤細(xì)胞系MS-I和H28。而且，WIF結(jié)構(gòu)域(WD)多肽是WIF的功能性Wnt結(jié)合亞域，包含如SEQ ID NO2所示W(wǎng)IF-1多肽的氨基酸39-176，能劑量依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)427凋亡。WIF-1多肽能劑量依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系H460凋亡；純化的重組人WIF-1蛋白能劑量依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系H460凋亡；WIF-1多肽能劑量依賴性地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX(圖24)和FEMX凋亡；WD多肽能劑量依賴性地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX和H460凋亡(圖22和23)。而且，重組的人WIF-1蛋白能抑制肺癌細(xì)胞系H460的Wnt信號傳導(dǎo)途徑。
總之，本文所述的發(fā)現(xiàn)顯示，WIF-1沉默是啟動子超甲基化的結(jié)果，可能是癌癥中，尤其是肺癌中Wnt通路組成性活化的重要原因。這些發(fā)現(xiàn)提高了用例如抗體阻斷等方法抑制Wnt信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行治療的可能性，產(chǎn)生了用去甲基化試劑逆轉(zhuǎn)WIF-1失活的興趣。這些方法在NSCLC中尤其引人關(guān)注，因為Wnt通路似乎極為重要，目前的治療仍然令人失望。
實施例7轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1 cDNA誘導(dǎo)癌細(xì)胞系凋亡和抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為了證明WIF-1可誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系凋亡和阻斷Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，將WIF-1多肽編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系H460和A549中。將人WIF-1開放閱讀框克隆入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1在NSCLC細(xì)胞中重表達(dá)WIF-1蛋白。此項研究所用表達(dá)載體包含編碼SEQ ID NO2全長WIF-1多肽或SEQ ID NO26所示W(wǎng)IF-1亞域多肽的核酸。首先，證實與SAEC細(xì)胞、NHBC細(xì)胞和293T細(xì)胞的WIF-1無血清CM(對照；圖6A)相比時，WIF-1蛋白水平低表達(dá)。轉(zhuǎn)染5天后，觀察到這兩種細(xì)胞系的凋亡性細(xì)胞死亡顯著增加(圖6B)。而且，Wnt經(jīng)典信號通路的關(guān)鍵介導(dǎo)物—胞漿β-聯(lián)蛋白下調(diào)(圖6C)。此外，WIF-1轉(zhuǎn)染后A549和H460細(xì)胞中的凋亡抑制蛋白—存活蛋白也下調(diào)。存活蛋白是Wnt信號傳導(dǎo)途徑中的重要下游基因(He等，Neoplasia 67-14(2004)；You等，Oncogene 236170-6174(2004))。這些結(jié)果證明，WIF-1蛋白的重表達(dá)通過抑制Wnt信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系H460和A549的程序性細(xì)胞死亡。此外，WIF-1重表達(dá)誘導(dǎo)間皮瘤細(xì)胞系MS1和H28、結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7凋亡(圖9)。
實施例8WIF-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)癌細(xì)胞系凋亡為了進(jìn)一步證實WIF-1在NSCLC細(xì)胞中具有誘導(dǎo)凋亡作用，用WIF-1無血清CM處理細(xì)胞系H460、A549和H838。通過瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組的人全長WIF-1 CM。用Western印跡分析確認(rèn)無血清CM中含有WIF-1蛋白(圖6A)。孵育5天后，觀察到NSCLC細(xì)胞系H460、A549和H838細(xì)胞死亡顯著增加(圖7A)。流式細(xì)胞術(shù)實驗表明，細(xì)胞死亡主要由于凋亡誘導(dǎo)作用(孵育5-7天后＞80％是凋亡細(xì)胞)(圖7B)。而且，所測試的所有三株NSCLC細(xì)胞系中凋亡誘導(dǎo)作用都是劑量依賴性的，例如，H460細(xì)胞中WIF-1和凋亡誘導(dǎo)是劑量反應(yīng)關(guān)系，見圖7C和圖10。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的劑量反應(yīng)性抑制與WIF-1 CM誘導(dǎo)的凋亡水平有關(guān)(圖7D)。胞漿β-聯(lián)蛋白和存活蛋白都下調(diào)(圖7D)。而且，WIF-1 CM處理后Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵下游基因，細(xì)胞周期蛋白D1下調(diào)(圖7D)。細(xì)胞色素C的過表達(dá)可用作WIF-1 CM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的額外證據(jù)。這些數(shù)據(jù)證明，WIF-1 CM抑制Wnt信號傳導(dǎo)途徑并以劑量依賴方式誘導(dǎo)凋亡。重組的全長人WIF-1多肽也以劑量依賴方式誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞系SNU398和結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116凋亡(圖20和21)。
實施例9WIF-I(WD)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)凋亡為了證明WIF-1的凋亡作用不限于全長WIF-1，采用WIF-1(WD)表達(dá)質(zhì)粒(如本文所述地制備)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基孵育肺癌細(xì)胞系A(chǔ)427。此表達(dá)質(zhì)粒編碼包含氨基酸殘基1-180的功能性WIF-1亞域多肽，切除信號肽后它包含SEQ IDNO27所示氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)此WIF-1(WD)多肽也能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)427凋亡(圖12)。
當(dāng)加入黑色素瘤癌細(xì)胞系LOX和肺癌細(xì)胞系H460時，SEQ ID NO27的重組WIF-1亞域多肽也顯示出顯著的細(xì)胞毒作用(圖22和23)。
實施例10WIF-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)非肺癌細(xì)胞系凋亡為了證明WIF-1的凋亡作用不限于NSCLC細(xì)胞，我們用WIF-1表達(dá)質(zhì)粒(如上所述產(chǎn)生的)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基處理其它癌細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)WIF-1介導(dǎo)和NSCLC細(xì)胞中觀察到的凋亡作用不僅限于NSCCLC細(xì)胞。無血清條件培養(yǎng)基中的重組WIF-1蛋白能劑量依賴性地誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX(圖13)和黑色素瘤細(xì)胞系FEMX(圖14)凋亡。如在NSCLC細(xì)胞中所觀察到的那樣，WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)也足以誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞系LOX凋亡(圖15)。除誘導(dǎo)凋亡外，WIF-1(WD)也抑制黑色素瘤細(xì)胞系LOX的Wnt信號傳導(dǎo)途徑，如蓬亂蛋白-3表達(dá)降低所證明的那樣(圖16)。
實施例11純化的人WIF-1能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系凋亡用純化的重組人WIF-1驗證WIF-1在NSCLC細(xì)胞中的作用。用純化的rhWIF-1蛋白處理NSCLC細(xì)胞系H460。孵育7天后，用細(xì)胞病理效應(yīng)試驗測定死H460細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。觀察到大量細(xì)胞死亡(圖8A)。細(xì)胞殺傷作用主要由于誘導(dǎo)了凋亡(孵育7天后40.1-62.8％是凋亡細(xì)胞)(圖8B)。Uematsu等曾證明Dv1-3在NSCLC細(xì)胞中過表達(dá)(Uematsu等，Oncogene 227218-7221(2003))。而且，He等和You等證明，抑制Wnt信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致Dv1-3下調(diào)，并誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡(He等，Neoplasia 67-14(2004)；You等，Oncogene 236170-6174(2004))。本文證明，NSCLC細(xì)胞系H4600與純化WIF-1接觸后胞漿β-聯(lián)蛋白和Dv1-3都下調(diào)(圖8C)。還發(fā)現(xiàn)將rhWIF-1加入H460細(xì)胞后，β-聯(lián)蛋白-TCF關(guān)鍵靶向基因之一的細(xì)胞周期蛋白D1也下調(diào)(圖8C)。與WIF-1 CM數(shù)據(jù)一致(參見上述內(nèi)容和圖7)，純化的人WIF-1能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡和抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而且，純化的重組人WIF-1蛋白能劑量依賴性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞系H460凋亡(圖11)。
實施例12編碼WIF-1全長的DNA和編碼WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)的DNA能減小體內(nèi)腫瘤大小為了證明WIF-1可減小哺乳動物的腫瘤大小，用pcDNA3.1全長WIF-1(氨基酸1-379；SEQ ID NO2)和pcDNA3.1 WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD；氨基酸1-180；SEQ ID NO16)進(jìn)行體內(nèi)測試。將3×106LOX細(xì)胞皮下注射入無胸腺裸小鼠中。三天后(第3天)，將表達(dá)載體注射到腫瘤(5mm)附近。第10天重復(fù)注射表達(dá)載體。采用以下表達(dá)載體和對照(圖18)(i)對照，50μl PBS；載體對照，用50μl lipofectamine配的200μgpcDNA3.1；用50μl lipofectamine配的200μg pcDNA3.1全長WIF-1；用50μllipofectamine配的200μg pcDNA3.1 WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，每周兩次，用公式x2y(x＜y)計算腫瘤體積。WIF-1(全長WIF-1和WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD))治療的動物和對照組(即無載體和載體對照)之間的腫瘤體積差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.01，斯氏t檢驗)。當(dāng)對照動物體內(nèi)的腫瘤進(jìn)展時，觀察到WIF-1治療動物的腫瘤生長顯著減慢(圖18)。在無載體對照和載體對照動物中腫瘤生長進(jìn)展相似。全長WIF-1和WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)的腫瘤生長抑制作用也相似。
實施例13重組WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)蛋白能減小體內(nèi)腫瘤大小為了證明WIF-1結(jié)構(gòu)域蛋白(WD；SEQ ID NO16的氨基酸29-180)可減小哺乳動物的腫瘤大小，進(jìn)行體內(nèi)測試。將3×106LOX細(xì)胞皮下注射入無胸腺裸小鼠中。三天后(第3天)，將重組WIF-1結(jié)構(gòu)域蛋白注射到腫瘤上。每天重復(fù)注射，共14天。如本文所述，用pcDNA3.1 WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)表達(dá)載體包含SEQ ID NO18序列轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞產(chǎn)生了重組WIF-1結(jié)構(gòu)域蛋白。用pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的上清注射對照動物。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，每周兩次，在第18天測量最后一次。用公式x2y(x＜y)計算腫瘤體積。第18天WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)治療的動物和對照動物之間的腫瘤體積差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.02，斯氏t檢驗，n＝3)。當(dāng)對照動物體內(nèi)的腫瘤進(jìn)展時，觀察到WIF-1結(jié)構(gòu)域(WD)蛋白治療的動物腫瘤生長顯著減慢(圖19)。
序列表NM_007191.智人(Homo sapiens)WNT...[gi18379354]位置NM_007191 2020bp mRNA線性PRI 20-DEC-2003定義智人WNT抑制因子(WIF1)，mRNA.
登錄號 NM_007191版本NM_007191.2 GI18379354關(guān)鍵字 .
來源智人(人)生物體 智人真核生物域后生動物亞域；脊索動物門；有頭動物亞門；脊椎動物亞門；硬骨脊椎動物；哺乳動物綱；真獸亞綱；靈長目；狹鼻亞目；人科；人屬。
參考號 1(堿基1-2020)作者Clark，H.F.，Gurney，A.L.，Abaya，E.，Baker，K.，Baldwin，D.，Brush，J.，Chen，J.，Chow，B.，Chui，C.，Crowley，C.，Currell，B.，Deuel，B.，Dowd，P.，Eaton，D.，F(xiàn)oster，J.，Grimaldi，C.，Gu，Q.，Hass，P.E.，Heldens，S.，Huang，A.，Kim，H.S.，Klimowski，L.，Jin，Y.，Johnson，S.，Lee，J.，Lewis，L.，Liao，D.，Mark，M.，Robbie，E.，Sanchez，C.，Schoenfeld，J.，Seshagiri，S.，Simmons，L.，Singh，J.，Smith，V.，Stinson，J.，Vagts，A.，Vandlen，R.，Watanabe，C.，Wieand，D.，Woods，K.，Xie，M.H.，Yansura，D.，Yi，S.，Yu，G.，Yuan，J.，Zhang，M.，Zhang，Z.，Goddard，A.，Wood，W.I.and Godowski，P.
題目分泌蛋白發(fā)現(xiàn)起始物(SPDI)，進(jìn)行大規(guī)模努力以鑒定新型人分泌型跨膜蛋白生物信息學(xué)評估。
雜志Genome Res.13(10)，2265-2270(2003)PUBMED 12975309參考號 2(堿基1-2020)作者Hsieh，J.c.，Kodjabachian，L.，Rebbert，M.L.，Rattner，A.，Smallwood，P.M.，Samos，C.H.，Nusse，R.，Dawid，I.B.and Nathans，J.
題目結(jié)合Wnt蛋白抑制其活性的新分泌蛋白雜志Nature 398(6726)，431-436(1999)PUBMED 10201374注釋REVIEWED REFSEQNCBI員工管理此記錄。參比序列來自AF122922.1和BC018037.1.2002年1月28日此序列版本被替換gi6005949.
摘要WNT蛋白是參與胚胎發(fā)育控制的胞外信號分子。此基因編碼結(jié)合WNT蛋白抑制其活性的分泌蛋白。此蛋白含有WNT抑制因子(WIF)結(jié)構(gòu)域和5個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域。它可能參與中胚層分段。發(fā)現(xiàn)此蛋白存在于魚類、兩棲類和哺乳類中。
完整性3′端完整特征位置/限定詞來源1..2020/生物體＝“智人”/mol-類型＝“mRNA”/db_xref＝″taxon9606″/染色體＝“12”/圖＝“12q14.1”基因1..2020/基因＝“WIF1”/注釋＝“同義詞WIF-1”/注釋＝“基因ID11197”/注釋＝“基因座ID11197”/注釋＝“MIM605186”CDS 119..1258/基因＝″WIF1″/注釋＝“Wnt抑制因子-1”go-功能蛋白酪氨酸激酶活性[goid 0004713][證據(jù)IEA]go-功能結(jié)構(gòu)分子活性[goid 0005198][證據(jù)IEA]
go_過程信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[goid 0007165][證據(jù)][pmid 10201374]；go_過程細(xì)胞-細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[goid 0007267][證據(jù)]；go_過程發(fā)育[goid 0007275][證據(jù)IEA]/密碼子-起始＝1/產(chǎn)物＝“Wnt抑制因子-1前體”/蛋白_id＝“NP_009122.1”/db xref＝″GI6005950”/注釋＝“基因ID11197”/注釋＝“基因座ID11197”/db_xref＝″MIM605186”信號肽 119..202/基因＝″WIF1″misc_feature 203..＞1255/基因＝″WIF1″/注釋＝“KOG1225；區(qū)域Teneur in-1和相關(guān)的胞外基質(zhì)蛋白，含EGF樣重復(fù)序列[信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，胞外結(jié)構(gòu)]/db_xref＝″CDD19014″成熟肽 203..1255/基因＝″WIF1″/產(chǎn)物＝“Wnt抑制因子-1”misc_feature 221..655/基因＝″WIF1″/注釋＝“WIF，區(qū)域Wnt-抑制因子-1樣結(jié)構(gòu)域”/db_xref＝″CDD423″misc_feature 647..742/基因＝″WIF1″/note＝“區(qū)域EGF樣結(jié)構(gòu)域”misc_feature 743..8381/基因＝″WIF1″/note＝“區(qū)域EGF樣結(jié)構(gòu)域”misc_feature 839..934/基因＝″WIF1″/note＝“區(qū)域EGF樣結(jié)構(gòu)域”misc_feature 935..1030/基因＝″WIF1″/note＝“區(qū)域EGF樣結(jié)構(gòu)域”misc_feature 1031..1126/基因＝″WIF1″/note＝“區(qū)域EGF樣結(jié)構(gòu)域”聚腺苷酸信號 1925..1930/基因＝″WIF1″聚腺苷酸位點 1953/基因＝″WIF1″/證據(jù)＝實驗聚腺苷酸信號 1956..1961/基因＝″WIF1″聚腺苷酸位點 1979/基因＝″WIF1″來源SEQ ID NO11 gtctaaacgg gaacagccct ggctgaggga gctgcagcgc agcagagtat ctgacggcgc61 caggttgcgt aggtgcggca cgaggagttt tcccggcagc gaggaggtcc tgagcagcat121 ggcccggagg agcgccttcc ctgccgccgc gctctggctc tggagcatcc tcctgtgcct181 gctggcactg cgggcggagg ccgggccgcc gcaggaggag agcctgtacc tatggatcga241 tgctcaccag gcaagagtac tcataggatt tgaagaagat atcctgattg tttcagaggg301 gaaaatggca ccttttacac atgatttcag aaaagcgcaa cagagaatgc cagctattcc361 tgtcaatatc cattccatga attttacctg gcaagctgca gggcaggcag aatacttcta421 tgaattcctg tccttgcgct ccctggataa aggcatcatg gcagatccaa ccgtcaatgt481 ccctctgctg ggaacagtgc ctcacaaggc atcagttgtt caagttggtt tcccatgtct541 tggaaaacag gatggggtgg cagcatttga agtggatgtg attgttatga attctgaagg601 caacaccatt ctccaaacac ctcaaaatgc tatcttcttt aaaacatgtc tacaagctga
661 gtgcccaggc gggtgccgaa atggaggctt ttgtaatgaa agacgcatct gcgagtgtcc721 tgatgggttc cacggacctc actgtgagaa agccctttgt accccacgat gtatgaatgg781 tggactttgt gtgactcctg gtttctgcat ctgcccacct ggattctatg gagtgaactg841 tgacaaagca aactgctcaa ccacctgctt taatggaggg acctgtttct accctggaaa901 atgtatttgc cctccaggac tagagggaga gcagtgtgaa atcagcaaat gcccacaacc961 ctgtcgaaat ggaggtaaat gcattggtaa aagcaaatgt aagtgttcca aaggttacca1021 gggagacctc tgttcaaagc ctgtctgcga gcctggctgt ggtgcacatg gaacctgcca1081 tgaacccaac aaatgccaat gtcaagaagg ttggcatgga agacactgca ataaaaggta1141 cgaagccagc ctcatacatg ccctgaggcc agcaggcgcc cagctcaggc agcacacgcc1201 ttcacttaaa aaggccgagg agcggcggga tccacctgaa tccaattaca tctggtgaac1261 tccgacatct gaaacgtttt aagttacacc aagttcatag cctttgttaa cctttcatgt1321 gttgaatgtt caaataatgt tcattacact taagaatact ggcctgaatt ttattagctt1381 cattataaat cactgagctg atatttactc ttccttttaa gttttctaag tacgtctgta1441 gcatgatggt atagattttc ttgtttcagt gctttgggac agattttata ttatgtcaat1501 tgatcaggtt aaaattttca gtgtgtagtt ggcagatatt ttcaaaatta caatgcattt1561 atggtgtctg ggggcagggg aacatcagaa aggttaaatt gggcaaaaat gcgtaagtca1621 caagaatttg gatggtgcag ttaatgttga agttacagca tttcagattt tattgtcaga1681 tatttagatg tttgttacat ttttaaaaat tgctcttaat ttttaaactc tcaatacaat1741 atattttgac cttaccatta ttccagagat tcagtattaa aaaaaaaaaa aattacactg1801 tggtagtggc atttaaacaa tataatatat tctaaacaca atgaaatagg gaatataatg1861 tatgaacttt ttgcattggc ttgaagcaat ataatatatt gtaaacaaaa cacagctctt1921 acctaataaa cattttatac tgtttgtatg tataaaataa aggtgctgct ttagttttca1981 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa//SEQ ID NO2包含信號肽序列的全長WIF-1MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAFGTCHEPNKCQCQEGWHGRHCNKRYEASLIHALRPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIWSEQ ID NO3 WIF-1啟動子序列AATTCGGCAACTTTTAAAAAATTATTTTATTTATTTATTTATATATTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTATCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGCCACGATCTTGGCTTAATGCAACCTCCGCCTCCCGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGGGTAGCTAGGACTACAGGCCCCCGCCACCATGCCCAGCTAATTTTTGCATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCACGCTGGCCAAGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCAGGGATTACAGGCGTGAGCCATCGCGCCCGGCCGAATTCAGCAACTTTTAAAAAATATCAGCAAACGTGAAGATATCCACGATGTTAGAGGAGCCCTACCCCGGAGGGTCAGGTACAGCTATCGTCCAGGGCCCAGGGCACTCTTCCGGGCACTGCCGGGTTATCAGGGAGACAGACGGGAATCCCCAAATGCTGGGTGTCGGGCAAGTACCAGCTGGACGCCCTGCGCCTCGAGCCAAGGCCAGCGCCTGCCATCGGCACCATCGGACAGTCGAGCCTCGAGTTTTAACTGCTTGGGAGCGCGCAAAGTGCCAGCCTATCGCAGAACGGAGCGCATAGGGTTGGCGGAGAGAGGAATCCTACTGGCTGAAAGGGAGACGAAGGGCAATTTGCGCCTTCAGTGAGCGCCGGAGGAGGAACAGGAGTCATCACCTCATCATCATCATCATCATCATCATCACCATCACCATCACCATCATCAGCACTCAGTCAAGCCCAGCGTTGTCTGCTCTCCCCATTTCCCTCCCCCGAAGCCTCCCTTGGCCCGAGGAGGTGGCGAGTGATGTCCCAGGGGTCTCTGAGTGCCCTTCTCCGGGTCCGCCAGCCCTACACGCCCACTTCGCGGGCGCTCCACTGGGCGCACCGCACTGTGAATGCAGCCTCGGGGGTCCCTCGCGGCCCCGCCCCCGGGGGGGCCCCACAGCGCCCCCAAGTGGCGGCCGCCCAGGCCTCGCGGGCCCCACTCCTCGCTCGCACCTCGCTCGCGCCAGCCCTTCCCGCTCTTCTGTTCTCGCTCTATTTGCCCCGCTGACTGCTGGCCTCGCCAGCTTTGCCAGTCTTACGTCTCTGCCGCCCCCACTCCCGCCCGCGCCCCATCTTCTTGCGCGACTCGCGCCCGCTGGTCCCCCCCTCCTCCTCCCGCGTCCTGCCTGCCCCCTCCTCCTGCTCTCGCAGGCTCCTTGGCACCCAGGCCGGGAGGCGACGCGCCCAGCCGTCTAAACGGGAACAGCCCTGGCTGAGGGAGCTGCAGCGCAGCAGAGTATCTGACGGCGCCAGGTTGCGTAGGTGCGGCACGAGGAGTTTTCCCGGCAGCGAGGAGGTCCTGAGCAGCATGGCCCGGAGGAGCGCCTTCCCTGCCGCCGCGCTCTGGCTCTGGAGCATCCTCCTGTGCCTGCTGGCACTGCGGGCGGAGGCCGGGCCGCCGCAGGAGGAGAGCCTGTACCTATGGATCGATGCTCACCAGGCAAGAGTACTCATAGGATTTGAAGAAGATATCCTGATTGTTTCAGAGGGGAAAATGGCACCTTTTACACATGATTTCAGAAAAGCGCAACAGAGAATGCCAGCTATTCCTGTCAATATCSEQ ID NO4GGGCGTTTTATTGGGCGTATSEQ ID NO5AAACCAACAATCAACGAAC
SEQ ID NO6GGGTGTTTTATTGGGTGTATSEQ ID NO7AAACCAACAATCAACAAAACSEQ ID NO8GAGTGATGTTTTAGGGGTTTSEQ ID NO9CCTAAATACCAAAAAACCTACSEQ ID NO10GTAGGTTTTTTGGTATTTAGGSEQ ID NO11TCCATAAATACAAACTCTCCTCSEQ ID NO12CCGAAATGGAGGCTTTTGTASEQ ID NO13TGGTTGAGCAGTTTGCTTTGSEQ ID NO14人WIF-1蛋白序列(無信號肽)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCQQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCQEGWHGRHCNKRYEASLIHALRPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIWSEQ ID NO15人WIF1的WIF結(jié)構(gòu)域蛋白序列WIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCSEQ ID NO16截短的人WIF-1蛋白序列(氨基酸1-180)MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCQQASEQ ID NO人全長WIF-1cDNA序列NM_007191.2；GI183793541 atggcccgga ggagcgcctt ccctgccgcc gcgctctggc tctggagcat cctcctgtgc61 ctgctggcac tgcgggcgga ggccgggccg ccgcaggagg agagcctgta cctatggatc121 gatgctcacc aggcaagagt actcatagga tttgaagaag atatcctgat tgtttcagag181 gggaaaatgg caccttttac acatgatttc agaaaagcgc aacagagaat gccagctatt241 cctgtcaata tccattccat gaattttacc tggcaagctg cagggcaggc agaatacttc301 tatgaattcc tgtccttgcg ctccctggat aaaggcatca tggcagatcc aaccgtcaat361 gtccctctgc tgggaacagt gcctcacaag gcatcagttg ttcaagttgg tttcccatgt421 cttggaaaac aggatggggt ggcagcattt gaagtggatg tgattgttat gaattctgaa481 ggcaacacca ttctccaaac acctcaaaat gctatcttct ttaaaacatg tctacaagct541 gagtgcccag gcgggtgccg aaatggaggc ttttgtaatg aaagacgcat ctgcgagtgt601 cctgatgggt tccacggacc tcactgtgag aaagcccttt gtaccccacg atgtatgaat661 ggtggacttt gtgtgactcc tggtttctgc atctgcccac ctggattcta tggagtgaac721 tgtgacaaag caaactgctc aaccacctgc tttaatggag ggacctgttt ctaccctgga
781 aaatgtattt gccctccagg actagaggga gagcagtgtg aaatcagcaa atgcccacaa841 ccctgtcgaa atggaggtaa atgcattggt aaaagcaaat gtaagtgttc caaaggttac901 cagggagacc tctgttcaaa gcctgtctgc gagcctggct gtggtgcaca tggaacctgc961 catgaaccca acaaatgcca atgtcaagaa ggttggcatg gaagacactg caataaaagg1021 tacgaagcca gcctcataca tgccctgagg ccagcaggcg cccagctcag gcagcacacg1081 ccttcactta aaaaggccga ggagcggcgg gatccacctg aatccaatta catctggtgaSEQ ID NO18人WIF-1亞域(WD)cDNA序列1 atggcccgga ggagcgcctt ccctgccgcc gcgctctggc tctggagcat cctcctgtgc61 ctgctggcac tgcgggcgga ggccgggccg ccgcaggagg agagcctgta cctatggatc121 gatgctcacc aggcaagagt actcatagga tttgaagaag atatcctgat tgtttcagag181 gggaaaatgg caccttttac acatgatttc agaaaagcgc aacagagaat gccagctatt241 cctgtcaata tccattccat gaattttacc tggcaagctg cagggcaggc agaatacttc301 tatgaattcc tgtccttgcg ctccctggat aaaggcatca tggcagatcc aaccgtcaat361 gtccctctgc tgggaacagt gcctcacaag gcatcagttg ttcaagttgg tttcccatgt421 cttggaaaac aggatggggt ggcagcattt gaagtggatg tgattgttat gaattctgaa481 ggcaacacca ttctccaaac acctcaaaat gctatcttct ttaaaacatg tctacaagctSEQ ID NO19編碼WIF結(jié)構(gòu)域蛋白序列(氨基酸殘基39-177)的人WIF-1亞域(WD)cDNA序列1 tggatcgatg ctcaccaggc aagagtactc ataggatttg aagaagatat cctgattgtt60 tcagagggga aaatggcacc ttttacacat gatttcagaa aagcgcaaca gagaatgcca121 gctattcctg tcaatatcca ttccatgaat tttacctggc aagctgcagg gcaggcagaa181 tacttctatg aattcctgtc cttgcgctcc ctggataaag gcatcatggc agatccaacc241 gtcaatgtcc ctctgctggg aacagtgcct cacaaggcat cagttgttca agttggtttc301 ccatgtcttg gaaaacagga tggggtggca gcatttgaag tggatgtgat tgttatgaat361 tctgaaggca acaccattct ccaaacacct caaaatgcta tcttctttaa aacatgtSEQ ID NO20人WIF-1的信號肽序列MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEASEQ ID NO21編碼WIF結(jié)構(gòu)域蛋白序列(氨基酸殘基39-176)的人WIF-1亞域(WD)cDNA序列1 tggatcgatg ctcaccaggc aagagtactc ataggatttg aagaagatat cctgattgtt60 tcagagggga aaatggcacc ttttacacat gatttcagaa aagcgcaaca gagaatgcca121 gctattcctg tcaatatcca ttccatgaat tttacctggc aagctgcagg gcaggcagaa181 tacttctatg aattcctgtc cttgcgctcc ctggataaag gcatcatggc agatccaacc241 gtcaatgtcc ctctgctggg aacagtgcct cacaaggcat cagttgttca agttggtttc301 ccatgtcttg gaaaacagga tggggtggca gcatttgaag tggatgtgat tgttatgaat361 tctgaaggca acaccattct ccaaacacct caaaatgcta tcttctttaa aacaSEQ ID NO22 小鼠WIF-1多肽序列(Gen Bank登錄號NP_036045)mWIF-1MARRRAFPAFALRLWSILPCLLLLRADAGQPPEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSE 60mWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 120mWIF-1VPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVNVIVMNSEGNTILRTPQNAIFFKTCQQA 180mWIF-1ECPGGCRNGGFCNERRVCECPDGFYGPHCEKALCIPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVN 240mWIF-1CDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCELSKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCPKGY 300mWIF-1QGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCREGWHGRHCNKRYGASLMHAPRPAGAGLERHT 360mWIF-1PSLKKAEDRRDPPESNYIW 379SEQ ID NO23大鼠WIF-1多肽序列(Gen Bank登錄號NP_036045)rWIF-1MARRRAFPAFVLRLWSILPCLLLLRADAGQPPEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSE 60rWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQASGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 120rWIF-1VPRLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVNVIVMNSEGNPILRTPQNAIFFKTCQQA 180rWIF-1ECPGGCRNGGFCNERRVCECPDGFYGPHCEKALCIPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVN 240rWIF-1CDKANCSATCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCELSKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCPKGY 300rWIF-1QGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCREGWHGRHCNKRYGASLMHAPRPAGAGLERHT 360rWIF-1PSLKKAEGRRDPPESNYIW 379
SEQ ID NO24爪蟾WIF-1多肽序列(GenBank登錄號AAD25404)xWIF-1MSLTGYFAAPLCSIFLFILAH-ADAGQ-QEDSLYMWIDAHQARVLIGFEEDILIVAE55xWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHAMNFTWQATGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVN 115xWIF-1MPLLGTVPHKATVIQVGFPCLGNQDGVAAFEVNVIVMNSEGNVILQTPQNAIFFKTCQQA 175xWIF-1KCTGGCRNGGFCNDRHVCECPDGFYGPHCEKALCMPRCMNGGLCVTPGLCICPPGYYGIN 235xWIF-1CDKVNCTTHCLNGGTCFYPGKCICPSGYEGEQCETSKCQQPCRNGGKCSGKNKCKCSKGY 295xWIF-1QGDLCSKPVCEPSCGAHGTCIEPNKCQCKEGWNGRYCNKKYGSNLMNALRPTGSRNRQH 354xWIF-1TPSPKRTEDRQALPESNYIW 374SEQ ID NO25紋斑魚WIF-1多肽序列(GenBank登錄號Q9W6F9)Q9W6F9)zWIF-1MAFRTPAVQLHLKACVLLLLGGLLEAAYQERGTMYMWIDANQARILIGFEEDILIVSE 58zWIF-1GKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHHVNFTWQATDQAEYFYEFQTLRSLDKDIMDDPTVN 118zWIF-1VPLLGSVPHKASVVQVGFPCRGDQDGVAAFEVTILVMDAGGNIILRTPHNAIFFKTCQRA 178zWIF-1KCPGGCRNGGYCNERQVCECQDGFYGVHCEKALCSPRCLNGGLCMSPGVCICPPGYFGSS 238zWIF-1CERANCSTTCLNGGTCFHPGKCICAVSFEGVRCELSKCRQPCRNGGKCTGRNKCKCSKGY 298zWIF-1HGDLCSKAVCEPSCGAHGTCVEPNRCQCREGWHGRHCNKRFRGGVSNSQRVSPSKHKSPS 358zWIF-1VAAAKEAPETSQPSETNYVV 378SEQ ID NO26人WIF-1亞域多肽序列(1-180)MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYILWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQASEQ ID NO27人WIF-1亞域多肽序列(29-180)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQASEQ ID NO28人WIF-1亞域多肽序列(1-176)ARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTSEQ ID NO29人WIF-1亞域多肽序列(29-176)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTSEQ ID NO30人WIF-1亞域多肽序列(29-379)GPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILQTPQNAIFFKTCLQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCQEGWHGPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIW60497789v權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含能結(jié)合于Wnt多肽的Wnt抑制因子-1(WIF-1)亞域多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽能抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約1-180的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-180的氨基酸序列
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-176的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約39-176的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述WIF-1亞域多肽融合于WIF-1多肽的異源氨基酸序列。
8.一種抑制WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括以下步驟使癌細(xì)胞與WIF-1多肽接觸，該多肽的用量能有效抑制癌細(xì)胞的增殖。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞含有過度甲基化的WIF-1啟動子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述接觸癌細(xì)胞的步驟包括通過降低WIF-1啟動子的甲基化而增加癌細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，WIF-1多肽的用量能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述接觸癌細(xì)胞的步驟包括分離的多核苷酸在癌細(xì)胞中表達(dá)WIF-1多肽的步驟，所述多核苷酸包含編碼WIF-1多肽的序列。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亞域多肽。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ IDNO2氨基酸殘基約1-180的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ IDNO2氨基酸殘基約29-180的氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ IDNO2氨基酸殘基約29-176的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ IDNO2氨基酸殘基約39-176的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述亞域多肽融合于WIF-1多肽的異源氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在體外實施所述方法。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在體內(nèi)實施所述方法。
21.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞選自肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦癌、陰道癌、睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。
22.一種誘導(dǎo)WIF-1低表達(dá)癌細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括以下步驟使癌細(xì)胞與WIF-1活性多肽接觸，該活性多肽的用量能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
23.一種抑制細(xì)胞中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，所述方法包括以下步驟使細(xì)胞與WIF-1亞域多肽接觸，所述亞域多肽能有效抑制細(xì)胞中的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
24.一種治療WIF-1低表達(dá)相關(guān)性疾病的方法，所述方法包括以下步驟給予需要治療的對象WIF-1活性多肽，該活性多肽的用量能有效治療所述疾病。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亞域多肽。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌癥。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、間皮瘤、卵巢癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、腦癌、陰道癌、睪丸癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
28.一種藥物組合物，其包含WIF-1多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑、運載體和/或稀釋劑。
29.如權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其特征在于，所述WIF-1多肽是WIF-1亞域多肽。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約1-180的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-180的氨基酸序列。
32.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約29-176的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其特征在于，所述亞域多肽包含對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基約39-176的氨基酸序列。
34.一種檢測過度甲基化的WIF-1啟動子的方法，所述方法包括以下步驟使過度甲基化的WIF-1啟動子與一種寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸包含能特異性雜交過度甲基化WIF-1啟動子的序列，其用量能有效檢測過度甲基化的WIF-1啟動子。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于診斷和治療Wnt抑制因子－1(WIF－1)低表達(dá)癌癥的組合物、方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK1984923SQ200580023718
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者尤亮, 何飚, 徐志東, D·M·雅布隆斯 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會