治療肺癌和前列腺癌的抗-cd22抗原結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了，通過使肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞與結(jié)合表達(dá)于所述癌細(xì)胞表面上的CD22的抗原結(jié)合分子接觸，預(yù)防、減少、延緩或抑制表達(dá)或過度表達(dá)CD22的肺癌和前列腺癌的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法。
【專利說明】治療肺癌和前列腺癌的抗-CD22抗原結(jié)合分子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求于2011年6月8日遞交的第61/494，758號美國臨時申請的權(quán)益，為所有目的其在此通過引用全文并入本文中。
[0002]【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及，通過使癌細(xì)胞接觸結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子，例如肽、非抗體結(jié)合分子、抗體或抗體片段，預(yù)防、減少、延緩和抑制肺癌和/或前列腺癌細(xì)胞的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]在美國，無論在男性還是女性中，肺癌都是癌癥死亡的最常見原因(MinnaJD.“Neoplasms of the Lung, ’Kasper DL, editor.Harrison’s Principles of InternalMedicine.16th ed;2005.p.506-515)。盡管存在鉬基化療的改良品和幾種新批準(zhǔn)的靶標(biāo)藥劑，患有晚期的、不可切除的NSCLC患者的中位總存活期僅為8- 11個月(Detterbeck，et a
1.，Chest (2009) 136(1): 260-71; Wang, et al.，Cancer (2010) 116(6):1518-25)。抑制來自表皮生長因子受體(EGFR)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MAbs和酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)為一些NSCLC患者提供了臨床受益。盡管如此，EGFR抑制劑或埃羅替尼(erlotinib)僅在小部分的患者中有效，并且它們不可避免地發(fā)展出抗性；靶向VEGF的mAb貝伐單抗(bevacizumab)僅漸增性地增加無進展存活(Sun, et al., J Clin Invest (2007) 117(10):2740-50;Stinchcombe, et al., Proc Am Thorac Soc (2009)6 (2):233-41;和Katzel, et al., J Hematol Oncol (2009) 2:2)。如果要在NSCLC的治療中取得顯著進展，則新的治療方法是必需的。本發(fā)明部分地基于⑶22作為NSCLC的靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種抗-⑶22單克隆抗體(mAb)結(jié)合肺癌和前列腺癌，包括那些被開發(fā)用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)的單克隆抗體。一旦抗_CD22mAb，HB22.7，有效地結(jié)合NSCLC并介導(dǎo)特定的體外和體內(nèi)殺傷。`
[0006]⑶22作為藥物開發(fā)的靶標(biāo)。⑶22為影響B(tài)細(xì)胞存活的140kDa單次跨膜唾液酸粘附蛋白(Tedder, et al., Annu Rev Immunol (1997) 15:481-504;和 Tedder, etal.,Adv Immunol (2005)88:1-50) ο與大多數(shù)的NHL—樣，幾乎所有成熟的B細(xì)胞都表達(dá) CD22 (Crocker, et al., Nat Rev Immunol(2007)7(4):255-66;Collins, et al., J Immunol(2006) 177(5):2994-3003;Haas,et al., J Immunol(2006) 177 (5):3063-73;和Engel, et al., J Exp Med (1995) 181 (4): 1581-6)。CD22 是免疫球蛋白(Ig)超家族的成員并具有7個胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域。CD22的2個氨基端Ig結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)細(xì)胞粘附至廣泛分布的具有α (2,6)唾液酸的配體上，以及B細(xì)胞歸巢至內(nèi)皮細(xì)胞中(Crocker, et al., Nat RevImmunol(2007)7(4):255-66)。
[0007]B細(xì)胞中⑶22的重要功能是調(diào)節(jié)B細(xì)胞抗原受體(BCR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在⑶22的胞質(zhì)尾部內(nèi)為免疫受體酪氨酸活化基序(ITAMs)和酪氨酸抑制性基序(ITIMs) (Tedder, etal.,Annu Rev Tmmunol (1997) 15:481-504;Tedder, et al., Adv Immunol(2005)88:1-50)。CD22ITAMs在通過src樣激酶BCR活化后成為磷酸化的，促進了補充蛋白酪氨酸磷酸酶至⑶22。由于BCR的緊密接近性，這些⑶22相關(guān)的磷酸酶隨后將BCR組分去磷酸化，導(dǎo)致BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的衰減。僅在最近才探測到CD22對B細(xì)胞功能的不依賴BCR的參與結(jié)果以及通過⑶22引發(fā)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。已經(jīng)證明，通過配體結(jié)合和交聯(lián)進行的⑶22的有效和直接活化對B細(xì)胞NHL具有細(xì)胞毒性(Tedder, et al.，Annu Rev Immunol (1997) 15:481-504;Tedder, et al., Adv Immunol (2005)88:1-50;Tuscano, et al., Blood(1999)94 (4):1382-92;Tuscano, et al., Eur J Immunol (1996)26(6):1246-52;Tuscano, etal.，Blood(1996)87:4723-4730)。
[0008]迄今為止，人們認(rèn)為⑶22僅表達(dá)于B細(xì)胞上。觀察到⑶22表達(dá)于NSCLC上，確定了 NSCLC腫瘤發(fā)生的未被探索的機制，此外還提供了用于NSCLC的CD22抗原靶向療法的方法，如果有的話，NSCLC中存在很少的腫瘤特異性靶標(biāo)。
[0009]發(fā)明概述
[0010]在一個方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減少、延緩或抑制肺癌細(xì)胞的增殖和/或生長的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使肺癌細(xì)胞與結(jié)合表達(dá)于肺癌細(xì)胞表面上的⑶22的抗原結(jié)合分子接觸。
[0011]在另一個方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減少、延緩或抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和/或生長的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使前列腺癌細(xì)胞與結(jié)合表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞表面上的CD22的抗原結(jié)合分子接觸。
[0012]在一個 進一步的方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減少、延緩或抑制有需要的個體內(nèi)肺癌的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法。在一些實施方案中，所述方法包括將結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子給予至個體，其中所述抗原結(jié)合分子結(jié)合表達(dá)于肺癌上的CD22，從而預(yù)防、減少、延緩或抑制個體內(nèi)肺癌的生長或轉(zhuǎn)移。
[0013]在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、減少、延緩或抑制有需要的個體內(nèi)前列腺癌的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法。在一些實施方案中，所述方法包括將結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子給予至個體，其中所述抗原結(jié)合分子結(jié)合表達(dá)于前列腺癌上的CD22，從而預(yù)防、減少、延緩或抑制個體內(nèi)前列腺癌的生長或轉(zhuǎn)移。
[0014]關(guān)于實施方案，在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子為結(jié)合⑶22的肽。在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子為非抗體結(jié)合蛋白。在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子為結(jié)合CD22的抗體或抗體片段。在一些實施方案中，結(jié)合CD22的抗體或抗體片段為單克隆的。在一些實施方案中，抗-⑶22抗體或抗體片段為HB22.7 ( 即，包含HB22.7的最小結(jié)合決定區(qū)，例如，包含HB22.7的重鏈和輕鏈互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3)。在一些實施方案中，抗-⑶22抗體或抗體片段為hHB22.7(即，包含HB22.7的最小結(jié)合決定子，例如，包含HB22.7的重鏈和輕鏈互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3)。在一些實施方案中，抗-⑶22抗體或抗體片段為人嵌合體。在一些實施方案中，抗-CD22抗體或抗體片段為人源化的。在一些實施方案中，抗-CD22抗體或抗體片段為人抗體或抗體片段。在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子為IgG抗體。在一些實施方案中，IgG抗體為人IgGl同種型或人IgG3同種型。
[0015]在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段綴合至治療劑上。在一些實施方案中，治療劑選自細(xì)胞毒素、放射性核素、抑制性核酸、化療劑和抗腫瘤劑。在一些實施方案中，治療劑封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或納米顆粒內(nèi)。在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段可以綴合或整合到脂質(zhì)體或納米顆粒。[0016]在癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞的實施方案中，在一些實施方案中，肺癌細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。在一些實施方案中，肺癌細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)或過度表達(dá)⑶22。
[0017]在癌細(xì)胞為前列腺癌細(xì)胞的實施方案中，在一些實施方案中，前列腺癌細(xì)胞為激素敏感性的。在一些實施方案中，前列腺癌細(xì)胞為激素耐受性的(hormone refractory)。在一些實施方案中，前列腺癌細(xì)胞表達(dá)或過度表達(dá)CD22于細(xì)胞表面上。
[0018]在癌癥為肺癌的實施方案中，在一些實施方案中，肺癌為非小細(xì)胞肺癌。在一些實施方案中，非小細(xì)胞肺癌為選自以下的亞型:鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、良性腫瘤和支氣管上皮起源的混合腫瘤。在一些實施方案中，肺癌在細(xì)胞表面上表達(dá)或過度表達(dá)⑶22。
[0019]在癌癥為前列腺癌的實施方案中，在一些實施方案中，前列腺癌為激素敏感性的。在一些實施方案中，前列腺癌為激素耐受性的。任何患有局部或轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者都可以為使用⑶22抗原結(jié)合性分子、靶向表達(dá)于前列腺組織上的⑶22的個體。在一些實施方案中，前列腺癌在細(xì)胞表面上表達(dá)或過度表達(dá)CD22。
[0020]在一些實施方案中，肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞位于體外。在一些實施方案中，肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞位于體內(nèi)。在一些實施方案中，肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞為人細(xì)胞。
[0021]在一些實施方案中，個體為人。
[0022]在一些實施方案中，個體不患有血液癌癥。在一些實施方案中，個體不患有B細(xì)胞惡性腫瘤。在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段不與化療劑或抗腫瘤劑共給予。在一些實施方案中，個體不患有除肺癌外的任何疾病病癥或任何癌癥。在一些實施方案中，個體不患有除前列腺癌外的任何其他疾病病癥或任何癌癥。
[0023]在一些實施方案中，抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給予。
[0024]定義
`[0025]“⑶22”是指譜系受限的B細(xì)胞抗原，其屬于Ig超家族。其在60-70%的B細(xì)胞淋巴瘤和白血病中表達(dá)，并且在B細(xì)胞發(fā)展早期階段不存在于細(xì)胞表面上或干細(xì)胞上。參見，例如 Vaickus et al., Crit.Rev.0ncol/Hematol.11:267-297 (1991)。人 CD22 的核酸序列和編碼的氨基酸序列被分配了 GenBank登錄號NM_001771.3 — NP_001762.2(同種型I)；NM_001185099.1 — NP_001172028.1(同種型 2) ；ΝΜ_001185100.1 — NP_001172029.1(同種型 3);和 NM_001185101.1 — NP_001172030.1(同種型 4)。
[0026]如本文中所使用，術(shù)語“抗-⑶22”關(guān)于抗體，是指特異性結(jié)合⑶22的抗體，并且包括關(guān)于針對⑶22生成的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，CD22為靈長類⑶22如人⑶22。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗體在編碼人CD22的cDNA被引入至非靈長類哺乳動物后由該動物針對人⑶22合成產(chǎn)生。
[0027]術(shù)語“全身給予”和“經(jīng)全身給予”是指通過循環(huán)系統(tǒng)將結(jié)合⑶22的抗原結(jié)合分子給予到身體內(nèi)的位點，包括藥物作用的靶向位點的方法。全身給予包括但不限于，經(jīng)口、鼻內(nèi)、直腸和腸胃外(即，不通過消化道，諸如肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)皮和皮下)給予。
[0028]術(shù)語“共給予(co-administer) ”和“共給予(co-administering) ”和它們的變型是指兩種或更多種活性劑在個體血液中同時存在。共給予的活性劑可以被同時或順序遞送。在肺癌和/或前列腺癌的治療和預(yù)防中，結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子可以與在治療或預(yù)防癌癥中有效的另一活性劑(例如，化療劑、抗腫瘤劑、抑制性核酸、細(xì)胞毒素等)共給予。[0029]短語“導(dǎo)致被給予”是指由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員(例如，醫(yī)師)或管理個體的醫(yī)療護理的人員采取的管理和/或允許將待確定的(at issue)試劑/化合物給予到個體的行為。導(dǎo)致被給予可以包括診斷和/或為個體確定合適的治療或預(yù)防方案，和/或為個體開特定試劑/化合物的處方。此類開處方可以包括，例如，撰寫處方表、解釋病歷等。
[0030]術(shù)語“基本上由…組成”及其變型是指方法或組合物中明確確定的活性劑的大類或種類，以及用于所述方法或組合物的預(yù)期目的的任何無活性的賦形劑。
[0031]術(shù)語“治療(treating) ”和“治療(treatment) ”及其變型是指對該術(shù)語適用的疾病或病癥或者此類疾病或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)作延緩，阻滯或逆轉(zhuǎn)其進展，對其的緩解或預(yù)防。治療包括治療性和預(yù)防性治療方案。
[0032]術(shù)語“抑制”、“降低”、“減少”關(guān)于腫瘤或癌癥生長或進展是指利用本領(lǐng)域已知的任何方法通過可測量的量來抑制個體內(nèi)腫瘤或癌癥的生長、擴散、轉(zhuǎn)移。相比給予結(jié)合⑶22的抗原結(jié)合分子前的腫瘤負(fù)荷，如果腫瘤負(fù)荷降低了至少約10%、20%、30%、50%、80%或100%，則腫瘤或癌癥的生長、進展或擴散得到抑制、降低或減少。在一些實施方案中，相比給予結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子前的腫瘤負(fù)荷，腫瘤或癌癥的生長、進展或擴散被抑制、降低或減少了至少約I倍、2倍、3倍、4倍或更多。
[0033]術(shù)語“對象”、“患者”或“個體”可互換地指任何哺乳動物，例如:人、非人靈長類(例如，黑猩猩或獼猴)、馴養(yǎng)的哺乳動物(例如，犬類、貓科動物)、農(nóng)業(yè)哺乳動物(例如，牛、馬、綿羊、豬)和實驗室哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠)。
[0034]如本文中所使用，“哺乳動物細(xì)胞”包括關(guān)于來源于哺乳動物的細(xì)胞，所述哺乳動物包括人和非人靈長類(例如，黑猩猩或獼猴)、馴養(yǎng)的哺乳動物(例如、犬類、貓科動物)、農(nóng)業(yè)哺乳動物(例如，牛、馬、綿羊、豬)和實驗室哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠)。所述細(xì)胞可以在體內(nèi)或體外培養(yǎng)。
[0035]如本文中所使用，“抗原結(jié)合分子”為任何可以特異性或選擇性結(jié)合抗原的分子。結(jié)合分子可以包括抗體或其片段?？?CD22結(jié)合分子為結(jié)合CD22抗原的分子，如抗-CD22抗體或其片段。其他抗-CD22結(jié)合分子還可以包括多價分子、多特異性分子(例如，雙抗體)、融合分子、適體、高親合性多聚體(avimer)或其他天然存在的或重組制備的分子。可用于本發(fā)明方法的示例性抗原結(jié)合分子包括抗體樣分子。抗體樣分子為可以通過結(jié)合祀標(biāo)分子展示功能的分子(參見，例如，Current Opinion in Biotechnology〗006,17:653-658;Current Opinion in Biotechnology2007, 18:1-10;Current Opinionin Structural Biologyl997, 7:463-469; Protein Science2006, 15:14-27),并且包括,例如 DARPins (W02002/020565)、親和體(Affibody) (W0 1995/001937)、高親合性多聚體(Avimer) (W02004/044011 ;W0 2005/040229)和類抗體蛋白(Adnectin) (W02002/032925)。
[0036]“抗體”是指免疫球蛋白家族的多肽，或包含能非共價地、可逆地和以特定方式結(jié)合對應(yīng)抗原的免疫球蛋白片段的多肽。示例性抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚物。每個四聚物由兩對完全相同的多肽鏈組成，每對具有通過二硫鍵連接的一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50_70kD)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，它們反過來定義了免疫球蛋白 類，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每條鏈的N末端限定了主要負(fù)責(zé)抗原識別的約100至110個或更多個氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。如本申請中所使用，“抗體”包括抗體及其片段的所有變體，其具有特定的結(jié)合特異性，例如，對腫瘤相關(guān)抗原的特異性。因此，全長抗體、嵌合抗體、人源化的抗體、人抗體、單抗體(unibodies)、單結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab’和具有相同結(jié)合特異性的這些片段的多聚體類型(例如，F(xiàn)(ab’)2)都位于該概念的范圍內(nèi)。
[0037]通常，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)(這些區(qū)域也稱為“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有由3個高變區(qū)打斷的“骨架”區(qū)，也稱為“互補決定區(qū)”或“⑶R”。骨架區(qū)和⑶R的范圍已經(jīng)確定。參見，Kabat and ffu, SEQUENCESOF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S.Government Printing Office, NIHPublication N0.91-3242(1991);Kabat and ffu, J Immunol.(1991) 147(5):1709-19;和Wuand Kabat, Mol Immunol.(1992) 29 (9): 1141-6。物種內(nèi)不同輕鏈或重鏈的骨架區(qū)序列相對保守?？贵w的骨架區(qū)是組成性輕鏈和重鏈的組合骨架區(qū)，其用來在三維空間中放置和排列CDRs。
[0038]⑶Rs主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。每條鏈的⑶Rs通常稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N末端開始順序編號，并且通常還由特定⑶R所在的鏈確定。因此，VH⑶R3位于發(fā)現(xiàn)其的抗體的重鏈可變域，而VL CDRl為來自發(fā)現(xiàn)其的抗體的輕鏈可變域的CDRl。
[0039]提及“VH”是指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFV、dsFV或Fab。提及“VL”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括其Fv、scFv、dsFv或Fab。
[0040]短語“單鏈Fv”或“ scFv”是指常規(guī)雙鏈抗體的重鏈可變域和輕鏈可變域已連接成一條鏈的抗體。通常，連接肽插入在兩條鏈之間，以允許合適折疊并制備活性結(jié)合位點。 [0041]術(shù)語“連接肽”包括關(guān)于抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)v片段)內(nèi)的肽，其用來將重鏈可變域間接結(jié)合至輕鏈可變域。
[0042]術(shù)語“親本抗體”指待突變或變異以得到結(jié)合與親本抗體相同表位的抗體或其片段的任何目標(biāo)抗體，優(yōu)選所述親本抗體對靶標(biāo)抗原具有相等或更高的親和力。
[0043]術(shù)語“特異性結(jié)合”在本文中被定義為結(jié)合伴侶優(yōu)先在特定位點結(jié)合另一物質(zhì)(例如，多肽和配體(分析物)、兩條多肽、多肽和核酸分子或兩個核酸分子)。術(shù)語“特異性結(jié)合”指相對于非特異性靶標(biāo)分子(例如，隨機生成的缺少特異性識別位點的分子；或缺少靶標(biāo)分子或抗原的對照樣品)，對靶標(biāo)分子/序列的結(jié)合偏好(例如，親和力)為至少2倍，更優(yōu)選為至少5倍，且最優(yōu)選為至少10倍或20倍。
[0044]關(guān)于本發(fā)明的抗體，術(shù)語“免疫特異性”、“特異性結(jié)合”是指結(jié)合至目標(biāo)蛋白(例如，CD22)的一個或多個表位的抗體和非抗體抗原結(jié)合分子，但其不大量識別和結(jié)合含有混合種類抗原生物分子的樣品中的其他分子。
[0045]術(shù)語“選擇性反應(yīng)”關(guān)于抗原，是指抗體的整體或部分與具有該抗原的細(xì)胞或組織優(yōu)先結(jié)合，而不與缺少該抗原的細(xì)胞或組織結(jié)合。當(dāng)然，已知分子和非靶標(biāo)細(xì)胞或組織之間可發(fā)生一定程度的非特異性相互作用。然而，可以將選擇性反應(yīng)區(qū)別為通過特異性識別抗原來介導(dǎo)。盡管選擇性反應(yīng)抗體結(jié)合了抗原，它們可能以低親和性進行結(jié)合。另一方面，相比抗體和缺少抗原的細(xì)胞間的結(jié)合，特異性結(jié)合導(dǎo)致所述抗體和具有抗原的細(xì)胞間更強的結(jié)合。相比缺少CD22的細(xì)胞或組織，特異性結(jié)合通常導(dǎo)致到具有CD22的細(xì)胞或組織結(jié)合抗體的量(每單位時間)的增加大于2倍，優(yōu)選大于5倍，更優(yōu)選大于10倍或20倍，且最優(yōu)選大于100倍。
[0046]術(shù)語“免疫反應(yīng)性條件”包括關(guān)于這樣的條件，其允許生成的抗體至特定表位來以可檢測程度大于和/或基本上排除與基本上所有其他表位結(jié)合的程度結(jié)合該表位。免疫反應(yīng)性條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的形式，并且通常為免疫測定方案中利用的那些或體內(nèi)遭遇的那些條件。參見，例如，Harlow&Lane, Using Antibodies, A LaboratoryManual (1998), for a description of immunoassay formats and conditions。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中采用的免疫反應(yīng)性條件為“生理條件”，其包括關(guān)于通常位于活的哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)部的條件(例如，溫度、滲透壓、pH)。雖然已知一些器官遭受極端條件，有機體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境通常位于約pH7(即，pH6.0至pH8.0，更通常pH6.5至7.5)，含有水作為主要溶劑，并且存在于超過O °C且低于50 V的溫度下。滲透壓位于支持細(xì)胞生存和增殖的范圍內(nèi)。
[0047]“靶向部分”為試圖將免疫綴合物靶向目標(biāo)細(xì)胞的免疫綴合物的部分。通常，靶向部分為抗體、scFv、dsFv、Fab 或 F (ab，)2。
[0048]“毒性部分”為賦予對目標(biāo)細(xì)胞具有免疫毒素細(xì)胞毒性的免疫毒素的部分。
[0049]“治療部分”為試圖用作治療劑的免疫綴合物的部分。
[0050]術(shù)語“治療劑”包括被給予用來在患者體內(nèi)誘導(dǎo)期望的治療效應(yīng)的、當(dāng)前已知的或以后開發(fā)的用作抗腫瘤劑、抗炎劑、細(xì)胞因子、抗感染劑、酶活化劑或抑制劑、變構(gòu)改性劑、抗生素、抑制性核酸或其他試劑的任何數(shù)目的化合物。治療劑還可以為化療劑、抗腫瘤劑、細(xì)胞毒素或放射性核素，其中所述期望的治療效應(yīng)為，例如，殺傷癌細(xì)胞。
[0051]“可檢測標(biāo)記”關(guān)于免疫綴合物，指具有使得其存在可被檢測的特性的免疫綴合物部分。例如，可以用放射性同位素標(biāo)記免疫綴合物，所述放射性同位素允許存在免疫綴合物的細(xì)胞在免疫組織化學(xué)測定中被檢測到。
`[0052]術(shù)語“效應(yīng)部分”指試圖對靶向部分所靶向的細(xì)胞具有效應(yīng)或試圖確定免疫綴合物的存在的免疫綴合物部分。因此，效應(yīng)部分可以為，例如，治療部分、毒素、放射性標(biāo)記或突光標(biāo)記。
[0053]術(shù)語“免疫綴合物”包括關(guān)于效應(yīng)分子與抗體、抗體片段或抗原結(jié)合分子的共價連接。效應(yīng)分子可以為免疫毒素。
[0054]術(shù)語“有效量”或“對…有效的量”或“治療有效量”包括關(guān)于足以產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的治療劑劑量，例如，減少或消除腫瘤負(fù)荷、抑制至少50%的細(xì)胞蛋白合成或殺傷細(xì)胞。
[0055]術(shù)語“毒素”或“細(xì)胞毒素”包括關(guān)于相思豆毒素、蓖麻毒素、白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒菌毒素、澳瑞他汀(auristatin)E、澳瑞他汀F、單甲基澳瑞他汀E(MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)或它們的修飾的毒素。例如，PE和DT為通常通過肝毒性致死的高毒性化合物。然而，對于PE和DT，可以通過去除該毒素的天然尋靶組分(例如，PE的結(jié)構(gòu)域Ia或DT的B鏈)并用不同的尋靶部分如抗體將其取代，將其改性為用作免疫毒素的形式。
[0056]術(shù)語“接觸”包括關(guān)于以直接物理結(jié)合放置。
[0057]術(shù)語“綴合”、“連接(joining) ”、“結(jié)合”或“連接(linking) ”是指使兩個多肽成為一個連續(xù)的多肽分子。在本發(fā)明上下文中，這些術(shù)語包括關(guān)于將抗體部分連接至效應(yīng)分子(EM)上。連接可以通過化學(xué)或重組方式進行?；瘜W(xué)方式是指抗體部分和效應(yīng)分子之間的反應(yīng)，以便在兩個分子間形成共價鍵以形成一個分子。還預(yù)期了可生物降解的連接臂。參見，例如，Meng, et al., Biomaterials.(2009) 30 (12): 2180-98; Duncan, Biochem Soc Trans.(2007)35 (Ptl):56-60;Kim, et al., Biomaterials.(2011)32(22):5158-66;和 Chen, etal.,Bioconjug Chem.(2011) 22 (4): 617-24。
[0058]術(shù)語“體內(nèi)”包括提及細(xì)胞所來自的有機體體內(nèi)。“離體(Ex vivo)”和“體外(invitro) ”指細(xì)胞所來自的有機體體外。
[0059]詞語“惡性細(xì)胞”或“惡性腫瘤”是指具有侵入性和/或能經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的腫瘤或腫瘤細(xì)胞，即癌細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1A-G顯示了 NSCLC中的CD22表達(dá)。⑷用FITC標(biāo)記的HB22.7探測了幾種NSCLC細(xì)胞系。Ramos和Jurkat細(xì)胞分別用作⑶22陽性和陰性對照。(B)從指定的 cDNA(泳道 1-Ramos、2-A549、3-H1650、4-H727、5-A427、6-CD22 質(zhì)粒、7_BEC)PCR 擴增CD22。(C)分別來自B和T細(xì)胞、培養(yǎng)基、A549、Calul和Calu6NSCLC細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物的抗-⑶22免疫印跡。(D)泳道1-5分別為提取自Ramos B細(xì)胞、A549、H1650、H727和A427的總RNA的人CD22Northern印跡。用DIG_dUTP標(biāo)記的DNA探針完成檢測。(E)用抗-⑶22mAb(A254BioteX)染色、用免疫過氧物酶檢測和H&E復(fù)染的肺癌患者活檢樣本的IHC(60X) ; (F)來自Ramos、H1650、A549、H727、293T和Calul細(xì)胞的細(xì)胞膜部分的抗-CD22Western 印跡；(G)來自 Ramos、H1650、A549、H727、Raj1、A427 和 293T 細(xì)胞的胞質(zhì)部分的抗-⑶22Western印跡。
[0061]圖2A-C顯示了抗-⑶22介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和⑶22內(nèi)化。(A)⑶22的連接介導(dǎo)NSCLC和NHL B細(xì)胞的細(xì)胞毒 性。用抗-⑶22或抗-⑶20mAbs(分別為HB22.7或利妥昔單抗(rituximab)) (50ug/ml)處理細(xì)胞48hr，然后用MTT測定評估。(B)在NSCLC細(xì)胞系上評估⑶22的內(nèi)化。通過相比無細(xì)胞毒對照(SAP)，評估連接至抗小鼠mAb (ZAP)的載體蛋白的細(xì)胞毒性，確定內(nèi)化程度。在Ramos B細(xì)胞(上圖)和兩個NSCLC細(xì)胞系——A549和H727 (下圖)中評估HB22.7-ZAP和HB22.7-SAP。這還證明了靶向⑶22的抗體藥物綴合物(ADC)用于治療NSCLC的有效性。(C)進行了使用A549細(xì)胞的ADCC和CDC測定來確定huHB22.7對人PBMC或CDC介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的效應(yīng)。+/_補體(1:10稀釋)，或+/-1111耶22.7(5(^8/(^)孵育PBMCs (10:1PBMC:A549比)。用DELFIA EuTDA細(xì)胞毒性測定評估了 A549特異性細(xì)胞毒性，并報道為％對照。
[0062]圖3闡明了 HB22.7可有效靶向體內(nèi)的人A549異種移植物。荷載A549或Raji NHL側(cè)面異種移植物(箭頭)的小鼠接受了 64Cu-D0TA-HB22.7 (50 μ Ci)，用于使用微型-PET掃描儀的Ι-ΡΕΤ。上圖:荷載Α549異種移植物小鼠的橫斷面視圖。下圖:荷載人NHL(Raji)異種移植物小鼠的橫斷面視圖。
[0063]圖4A-D闡明了 ΗΒ22.7抗-⑶22阻斷性mAb在體內(nèi)具有針對NSCLC的活性:(A)用以下物質(zhì)經(jīng)靜脈內(nèi)(iv)注射(箭頭)荷載人BAC/H1650異種移植物的裸鼠:(IgG對照，上曲線)或ΗΒ22.7(下曲線)(1.4mg)。(B)用以下物質(zhì)在腫瘤發(fā)展前(預(yù)處理的)或在腫瘤生長后已建立的)iv注射(箭頭)荷載A549異種移植物的裸鼠:PBS (未處理的)、HB22.7 (1.4mg)或利妥昔單抗。(C) A549 (NSCLC)和PC-3 (前列腺癌)異種移植物的生長。在腫瘤發(fā)展前(&，預(yù)處理的)用PBS (未處理的)、HB22.7(1.4mg)經(jīng)靜脈內(nèi)(iv)注射(箭頭)裸鼠，或者在腫瘤生長后T，以建立的)用HB22.7(1.4mg)經(jīng)靜脈內(nèi)(iv)注射(箭頭)裸鼠。(D)荷載A549異種移植物的小鼠在未輻射裸鼠體內(nèi)建立，并按(B)中所述用HB22.7處理。
[0064]圖5A-B闡明了抗-⑶22mAb HB22.7在NSCLC的原位模型中阻止肺轉(zhuǎn)移的發(fā)展并改善存活。(A)經(jīng)(左圖)或不經(jīng)(右圖)HB22.7(1.4mg)預(yù)處理，IV注射A549細(xì)胞。在注射后64天，檢測存活小鼠的肺。(B)荷載原位/iv A549NSCLC異種移植物的小鼠的Kaplan-Meier存活曲線；用HB22.7(1.4)處理小鼠，并與未處理的對照小鼠比較。
[0065]圖6顯示了用阿霉素(多柔比星(doxorubicin), 50 μ g/ml)或包覆有HB22.7 (IL-阿霉素)(50 μ g/ml)的PEG化脂質(zhì)體阿霉素處理A549細(xì)胞進行MTT測定。將細(xì)胞處理lhr，洗滌，然后在24hr后分析。(+)對照用阿霉素連續(xù)處理。
[0066]圖7顯示了相比用阿霉素(10mg/kg)處理的小鼠或不經(jīng)過任何處理的小鼠，用靶向⑶22的IL-阿霉素(10mg/kg)處理的荷載A549的小鼠體內(nèi)腫瘤生長得到極大抑制。
[0067]圖8顯示了用阿霉素或IL-阿霉素處理的H1650細(xì)胞的MTT測定。將細(xì)胞僅處理lhr，洗滌并在24hr后分析。報道為％未處理對照。誤差條:來自3個實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0068]圖9A-B闡明了通過流式細(xì)胞術(shù)評估，前列腺癌細(xì)胞系LnCAP (激素敏感性的)、PC3(激素耐受性的)和DU145(激素耐受性的)也被發(fā)現(xiàn)具有顯著的⑶22表達(dá)。B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Ramos被用作⑶22染色的陽性對照。
[0069]圖10闡明了使用⑶22特異性引物，通過PCR在mRNA水平上確認(rèn)了肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和前列腺癌細(xì)胞系DU14`5中的⑶22表達(dá)。B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Ramos被用作陽性對照。
[0070]圖11顯示了利用補體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)測定和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)分析抗-CD22抗體在體外殺傷前列腺癌細(xì)胞的能力。這在前列腺癌細(xì)胞系DU145、LnCaP和PC3上進行。抗體僅有效殺傷DU145和PC3細(xì)胞，而對LnCaP具有很少影響。PC3和Dul45代表耐受性前列腺癌，其更難治療并在人群中占多數(shù)。當(dāng)抗體、補體和效應(yīng)細(xì)胞存在時，所有3種前列腺細(xì)胞系都得到有效殺傷。
[0071]發(fā)明詳述
[0072]1.引言
[0073]⑶22是140kDa單次跨膜的唾液酸粘附蛋白，其影響B(tài)細(xì)胞存活。幾乎所有成熟的B細(xì)胞都表達(dá)⑶22，這與大多數(shù)非霍奇金淋巴瘤(NHL) —樣。⑶22被認(rèn)為僅在B-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和表面上表達(dá)。本發(fā)明部分地基于⑶22表面表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞，特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞上這一發(fā)現(xiàn)。NSCLC細(xì)胞表面上的⑶22表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)使用人NSCLC細(xì)胞系組以及通過幾個患者樣品的免疫組織化學(xué)(IHC)確定。表達(dá)通過直接核酸測序、RT-PCR、免疫印跡和Northern印跡證實。分別在體外和體內(nèi)證實了抗-⑶22單克隆抗體(mAb)、HB22.7對人NSCLC細(xì)胞系和異種移植物的細(xì)胞毒性。通過利用體內(nèi)原位NSCLC模型，證實HB22.7大幅抑制肺轉(zhuǎn)移的發(fā)展并顯著延長整體存活。
[0074]觀察到CD22表達(dá)于肺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞上，分別揭示了肺癌和前列腺癌腫瘤發(fā)生迄今為止未被探索的機制。此外，該發(fā)現(xiàn)提供了肺癌和前列腺癌的新的靶向療法，它們?yōu)榫哂泻苌倌[瘤特異性靶標(biāo)的惡性腫瘤。[0075]2.可以從本發(fā)明方法獲益的個體[0076]易于治療或預(yù)防的患者包括存在肺癌和/或前列腺癌風(fēng)險但不顯示癥狀的個體，以及當(dāng)前顯示癥狀的患者。在一些實施方案中，個體展現(xiàn)疾病癥狀并被診斷為患有肺癌和/或前列腺癌。個體可以處于疾病早期或晚期。個體可以具有或沒有可檢測的轉(zhuǎn)移。在一些實施方案中，個體處于緩解期或出現(xiàn)緩解。
[0077]在一些實施方案中，個體展現(xiàn)肺癌癥狀。例如，個體可能經(jīng)歷或展現(xiàn)呼吸困難(呼吸短促)、咳血(咳出血)、慢性咳嗽或常規(guī)咳嗽方式發(fā)生改變、哮喘、胸痛或腹部疼痛、惡病質(zhì)(體重減輕)、疲乏和食欲不振、發(fā)聲困難(聲音撕啞)、鼓槌指、吞咽困難(難以吞咽)、易患肺炎。個體還可能經(jīng)歷或展現(xiàn)副腫瘤綜合癥，包括，例如蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合征(自身抗體引起的肌無力)、血鈣過多、抗利尿激素分泌異常綜合癥(SIADH)、出汗方式改變、眼肌問題和/或臂神經(jīng)叢侵入引起的手肌無力?；加型砥诜伟┑膫€體還可以經(jīng)歷骨痛。
[0078]在一些實施方案中，個體展現(xiàn)前列腺癌癥狀。例如，個體可能具有增加的前列腺特異性抗原(PSA)水平，例如，血液中檢測到的。個體還可以經(jīng)歷或展現(xiàn)尿頻、夜尿(晚間排尿增加)、形成和維持穩(wěn)定尿流困難、血尿(尿中有血)和排尿困難(尿痛)、勃起困難和/或射精疼痛?；加型砥谇傲邢侔┑膫€體還可以經(jīng)歷骨痛、尿失禁和/或大便失禁。
[0079]通常，個體不患有和/或診斷未患有任何血液惡性腫瘤，特別是與⑶22的表達(dá)或過表達(dá)相關(guān)的或由CD22的表達(dá)或過表達(dá)介導(dǎo)的血液惡性腫瘤。在一些實施方案中，個體不患有和/或診斷未患有任何B細(xì)胞疾病病癥或疾病，包括，例如，任何B細(xì)胞惡性腫瘤、自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHD)、體液排斥和/或器官移植物受體體內(nèi)的移植后淋巴組織增生性疾病病癥。在不同的實施方案中，個體不患有和/或診斷未患有淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤，包括Burkitt’s淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T-細(xì)胞白血病淋巴瘤或與以上每種相關(guān)的任何亞型)、白血病(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、成人白血病)、多發(fā)性骨髓瘤和/或漿細(xì)胞瘤。
[0080]3.接受預(yù)防和治療的病癥
[0081]⑶22抗原結(jié)合性分子(抗體和非抗體)可用于治療在細(xì)胞表面上表達(dá)或過表達(dá)CD22的肺癌和前列腺癌?？梢詫D22抗原結(jié)合性分子給予患者以達(dá)到抑制、減少、收縮或預(yù)防肺和/或前列腺腫瘤和/或肺和/或癌細(xì)胞的增殖或生長的作用。在進行治療的情形下，患者具有癌癥或腫瘤負(fù)荷，并且給予CD22抗原結(jié)合性分子可以逆轉(zhuǎn)、延緩或抑制疾病進展。在進行預(yù)防的情形下，患者可能處于緩解期，或可能經(jīng)歷了初始腫瘤的去除，并且給予CD22結(jié)合性分子可以減少、抑制或消除轉(zhuǎn)移增殖和/或生長。
[0082]通過與CD22抗原結(jié)合性分子接觸可以治療或預(yù)防的示例性肺癌包括但不限于，耐受常規(guī)化療的腺癌、鱗狀癌、支氣管癌、支氣管肺泡癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移性肺癌。
[0083]通過與CD22抗原結(jié)合性分子接觸可以治療或預(yù)防示例性前列腺癌包括但不限于，激素敏感性的和激素耐受性的前列腺癌。例如，所述前列腺癌可以為雄激素依賴性的前列腺癌或雄激素非依賴性的前列腺癌。所述前列腺癌可以為腺癌或小細(xì)胞癌。
[0084]4.結(jié)合⑶22的抗原結(jié)合分子[0085]a.非抗體抗原結(jié)合分子
[0086]在不同的實施方案中，抗原結(jié)合分子為非抗體結(jié)合蛋白。開發(fā)了以類似于抗體的方式靶向并結(jié)合靶標(biāo)的蛋白分子。這些“抗體模擬物”中的某些使用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區(qū)的替代性蛋白骨架。
[0087]例如，Ladner et al.(第5，260，203號美國專利)描述了單個多肽鏈結(jié)合分子，其具有類似于聚集的但分子上分離的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的結(jié)合特異性。該單鏈結(jié)合分子含有由肽連接臂連接的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合位點，并將折疊成類似于所述兩個肽抗體的結(jié)構(gòu)。該單鏈結(jié)合分子展現(xiàn)超過常規(guī)抗體的幾種優(yōu)勢，包括更小的尺寸、更大的穩(wěn)定性和更容易被修飾。
[0088]Ku et al.(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.92(14):6552-6556(1995))公開了基于細(xì)胞色素b562的抗體替代物。Ku et al.(1995)生成了文庫，其中細(xì)胞色素b562的兩個環(huán)被隨機排列并被挑選用于針對牛血清白蛋白的結(jié)合。個體突變體被發(fā)現(xiàn)選擇性結(jié)合類似于抗BSA抗體的BSA。
[0089]Lipovsek el al.(第6，818，418號和第7，115，396號美國專利)公開了一種抗體模擬物，其特征為具有纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白支架和至少一個可變環(huán)。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物被稱為類抗體蛋白(Adnectin)，其展現(xiàn)許多與天然或改造的抗體相同的特征，包括對任何靶向配體的高親和性和特異性。任何用于發(fā)展新的或改善的結(jié)合蛋白的技術(shù)都可以與這些抗體模擬物一起使用。 [0090]這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)類似于IgG重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)。因此，這些模擬物展現(xiàn)與天然抗體在性質(zhì)和親和力方面類似的抗原結(jié)合特性。另外，相對于抗體和抗體片段，這些基 于纖連蛋白的抗體模擬物展現(xiàn)某些益處。例如，對于天然折疊穩(wěn)定性這些抗體模擬物不依賴二硫鍵，并且因此，在通常會毀壞抗體的條件下仍然穩(wěn)定。另外，由于這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)類似于IgG重鏈的結(jié)構(gòu)，可以在體外進行環(huán)隨機化和改組過程,其類似于體內(nèi)的抗體親和性成熟過程。
[0091]Beste et al.(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.96 (5): 1898-1903 (1999))公開了基于脂質(zhì)運載蛋白支架的抗體模擬物(Anticalin?)。脂質(zhì)運載蛋白在該蛋白末端由具有4個高變環(huán)的β-桶組成。Beste (1999)使這些環(huán)經(jīng)歷隨機誘變并挑選用于與例如，熒光素的結(jié)合。3個變體展現(xiàn)與熒光素的特異性結(jié)合，其中一個變體顯示類似于抗熒光素抗體的結(jié)合。進一步分析揭示出所有隨機化位置都是可變的，表明Amicalin?適合用作抗體替代物。Anticalins?為小的、單鏈肽，通常為160至180個殘基，相對于抗體其提供了幾種優(yōu)勢，包括減少的生產(chǎn)成本、增加的儲存穩(wěn)定性和減少的免疫反應(yīng)。
[0092]Hamilton et al.(第5，770, 380號美國專利)公開了合成抗體模擬物，其利用剛性的、非肽的杯芳烴有機支架，并連接有多個可變肽環(huán)用作結(jié)合位點。這些肽環(huán)都相對于彼此從杯芳烴幾何上的同側(cè)伸出。由于該幾何確認(rèn)，所有環(huán)都可用于結(jié)合，增加了對配體的結(jié)合親和力。然而，相比其他抗體模擬物，基于杯芳烴的抗體模擬物并非僅由肽組成，并且因此其較不易于受到蛋白酶的攻擊。該支架不單純由肽、DNA或RNA組成，意味著該抗體模擬物在極端環(huán)境條件下相對穩(wěn)定，并具有長使用期限。另外，由于基于杯芳烴的抗體模擬物相對較小，其較不可能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
[0093]Murali et al.(Cell.Mo1.Biol.49 (2): 209-216 (2003))論述了將抗體減小為較小的模擬肽的方法，它們稱為“抗體樣結(jié)合模擬肽”(ABiP)，其還可以用作抗體替代物。
[0094]Silverman el al.(Nat.Biotechnol.(2005), 23:1556-1561)公開了一種稱為“Avimer (高親合性多聚體)”的融合蛋白，其為包含多個結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽。Avimer通過體外外顯子改組和噬菌體展示由人胞外受體結(jié)構(gòu)域發(fā)展而來，其為在針對不同靶標(biāo)分子的親和性和特異性上有些類似于抗體的一種結(jié)合蛋白。產(chǎn)生的多結(jié)構(gòu)域蛋白可以包含多個獨立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，相比單表位結(jié)合蛋白，它們可以展現(xiàn)增加的親和力(在一些情形下為亞納摩爾)和特異性。關(guān)于構(gòu)建和使用Avimer的方法的其他細(xì)節(jié)公開在，例如第20040175756號、第 20050048512 號、第 20050053973 號、第 20050089932 號和第 20050221384 號美國專利申請公開中。
[0095]除了非免疫球蛋白骨架，抗體性質(zhì)還在包含RNA分子的化合物和非天然寡聚物(例如，蛋白酶抑制劑、苯二氮卓類、嘌呤衍生物和β轉(zhuǎn)角模擬物)中被模擬，所有這些物質(zhì)都適用于本發(fā)明。
[0096]b.抗-CD22 抗體
[0097]在不同的實施方案中，抗原結(jié)合分子為結(jié)合CD22的所有或任何胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域的抗體或抗體片段。此類抗-CD22抗體可用于治療和預(yù)防肺癌、前列腺癌以及肺癌和前列腺癌的轉(zhuǎn)移。
[0098]適用于治療和/或預(yù)防肺和/或前列腺癌的抗體對CD22多肽的胞外區(qū)域的至少一部分具有特異性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用來源于CD22的胞外結(jié)構(gòu)域的肽來產(chǎn)生適用于本發(fā)明的合適抗體。適用于挑選用作抗原的肽的示例性和非限制性的氨基序列公開 為GenBank登錄號NP_001762.2(同種型I) ;NP_001172028.1 (同種型2)；NP_001172029.1 (同種型 3);和 NP_001172030.1 (同種型 4)。
[0099]靶標(biāo)細(xì)胞包括任何表達(dá)或過度表達(dá)CD22的肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的抗-CD22抗體包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化的抗體、人抗體和它們的片段。
[0100]多克隆抗體的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。參見，例如，Green et al., Productionof Polyclonal Anti sera, IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS(Manson, ed)，1-5 頁(HumanaPressl992), Coligan et al, Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats.Miceand Hamsters, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, section241 (1992)，其在此通過引用并入本文。
[0101]單克隆抗體的制備同樣也是常規(guī)的。參見，例如，Kohler&Milstem, Nature256495(1975).Coligan et al., sections2.5.1-2.6.7, Harlow et al., ANTIBODIES ALABORATORY MANUAL, 726頁(Cold Spring Harbor Publ988,和Harlow, USING ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998),其在此通過引用并入本文。簡單地說，可以通過用包含抗原的組合物注射小鼠得到單克隆抗體，通過去除血清樣品證實抗體產(chǎn)品的存在，去除脾臟得到B淋巴細(xì)胞，將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來制備雜交瘤，克隆雜交瘤并挑選產(chǎn)生抗原的抗體的陽性克隆，以及從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體?？梢酝ㄟ^多種完善的現(xiàn)有技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。此類分離技術(shù)包括使用蛋白-A瓊脂糖的親和層析、尺寸排阻色譜和離子交換層析。參見，例如，Coliganet al.sections2.7.1-2.7.12 和 sections2.9.1-2.9.3，Barnes et al., Purificationof Immunoglobulin G(IgG)，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, V0L10, 79-104 頁(HumanaPressl992)。
[0102]單克隆抗體的體外和體內(nèi)增殖方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。體外增殖可以在合適的培養(yǎng)基如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)或RPMI1640培養(yǎng)基中進行，任選地補充有哺乳動物血清如胎牛血清或微量元素和生長維持補充物如正常小鼠腹膜滲出液細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞。體外制備提供了相對純的抗體制劑，并允許擴大規(guī)模來產(chǎn)生大量期望的抗體。大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)可以通過氣升式反應(yīng)器、連續(xù)攪拌器反應(yīng)器或固定的或包埋的細(xì)胞培養(yǎng)物中均質(zhì)懸浮培養(yǎng)來進行。體內(nèi)增殖可以通過將細(xì)胞克隆注射到與親本細(xì)胞組織相容的哺乳動物，例如，同基因小鼠體內(nèi)進行，以引起產(chǎn)生抗體的腫瘤的生長。任選地，在注射前用碳?xì)浠衔?，尤其是油如姥鮫烷(四甲基十五烷)誘導(dǎo)動物。I至3周后，從動物的體液中回收期望的單克隆抗體。
[0103]可以修改或制備抗-CD22抗體用于治療應(yīng)用。例如，本發(fā)明的抗體還可以來源于類人靈長類抗體。用于在狒狒體內(nèi)產(chǎn)生用于治療的抗體的通用技術(shù)可參見，例如，Goldenberg et al.,國際專利公開 W091/11465 (1991)和 Losman et al., Int.J.Cancer46:310(1990)，其在此通過引用并入本文。
[0104]可選地，用于治療的抗-⑶22抗體可以來源于“人源化的”單克隆抗體。通過將小鼠互補決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變鏈轉(zhuǎn)移到人可變域中，然后在鼠的對應(yīng)物骨架區(qū)域中用人殘基取代，制備人源化的單克隆抗體。使用來源于人源化單克隆抗體的抗體組分避免了與鼠恒定區(qū)的免疫原性相關(guān)的潛在問題。例如，Orlandi, et al.，Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA86:3833 (1989)描述了克隆鼠免疫球蛋白可變域的一般技術(shù)，其在此通過引用整體并入本文。例如，Jones et al., Nature321:522 (1986) ; Riechmann et al.,Nature332:323(1988);Verhoeyen et al.,Science239:1534(1988);Carter et al.Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA89:4285(1992);Sandhu, Crit.Rev.Biotech.12:437(1992);和Singeret al., J.1mmunol.150:2844 (1993)描述了制備人源化的單克隆抗體的技術(shù),其在此通過引用并入本文。
[0105]用于本發(fā)明方法的抗-⑶22抗體還可以來源于從組合免疫球蛋白文庫分離的人抗體片段。參見，例如，Barbas, et al., METHODS: A COMPANION TO METHODS INENZYM0L0GY，VOL.2，119 頁(1991) ;ffinter et al.，Ann.Rev.1mmunol.12:433 (1994)，其在此通過引用并入本文。可用于制備人免疫球蛋白噬菌體文庫的克隆和表達(dá)載體可以例如，從 STRATAGENE 克隆系統(tǒng)(現(xiàn)在為 Agilent Technologies)得到。
[0106]另外，用于治療和/或預(yù)防肺癌和/或前列腺癌的抗-CD22抗體可以來源于人單克隆抗體。此類抗體從被“改造”以便響應(yīng)抗原攻擊而制備特異性人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得。在該技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座元件被引入到小鼠品系中，其來源于含有內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座的靶向斷裂的胚胎干細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成人抗原特異性的人抗體，并且所述小鼠可以用來制備人抗體分泌性雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法，描述于 Green et al., Nature Genet.7:13(1994);Lonberg et al.Nature368:856(1994);和Taylor et al., Int.1mmunol.6:579 (1994),其在此通過引用并入本文。
[0107]在不同的實施方案中，抗體為人IgG免疫球蛋白。如合適或需要，IgG可以為同種型以提升抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDCC)，例如，人IgGl或人IgG3。
[0108]可以通過蛋白水解抗體或通過在大腸桿菌(E.coli)內(nèi)表達(dá)編碼該片段的DNA，制備用于本發(fā)明方法的抗體片段。可以通過常規(guī)方法利用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體得到抗體片段。例如，可以通過用胃蛋白酶酶切抗體制備抗體片段，以提供表示為F(ab’)2的片段——該片段可以利用硫醇還原劑，以及任選地切割二硫鍵產(chǎn)生的巰基的保護基進一步切割，以制備Fab’單價片段?？蛇x地，使用胃蛋白酶進行酶切直接制備兩個單價Fab’片段和一個Fe片段。例如，Goldenberg,第4，036，945號和第4，331，647號美國專利以及其中含有的參考文獻描述了這些方法。這些專利在此通過引用整體并入本文。也參見，Nisonhoff, et al., Arch.Biochem.Biophys.89:230 (1960) ; Porter, Biochem.J.73:119(1959):Edelman et al.,METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.1, 422 頁(AcademicPressl967);和 Coligan et al.sections2.8.1-2.8.10 和 2.10.1-2.10.4。
[0109]還可以使用切割抗體的其他方法，諸如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段、進一步切割片段，或其他酶法、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要該片段結(jié)合至完整抗體識別的抗原。
[0110]例如，F(xiàn)v片段包含結(jié)合的VH和VL鏈。該結(jié)合可以為非共價的，如Inbaret al., Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA69:2659 (1972)中所描述?？蛇x地，可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接或通過化學(xué)物如戍二醒交聯(lián)。參見，例如Sandhu, Crit RevBiotechnol.1992; 12 (5-6): 437-62。在一些實施方案中，F(xiàn)v片段包含通過肽連接臂連接的VH和VL鏈。通過構(gòu)建包含編碼通過寡核苷酸連接的VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因，制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)。將所述結(jié)構(gòu)基因插入到表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載 體引入到宿主細(xì)胞如大腸桿菌中。重組宿主細(xì)胞合成帶有橋聯(lián)兩個V結(jié)構(gòu)域的連接肽的單條多肽鏈。制備sFv的方法，描述于例如，Whitlow et al, MET0H0DS:A COMPANION TOMETHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.2，97 頁(1991) ; Bird et al, Science242:423-426 (1988) ; Ladner, et al,美國專利第 4，946，778 號;Pack, et al, BioTechnologyll: 127177 (1993);和Sandhu,同上。
[0111]適用于本發(fā)明方法的另一形式的抗體片段為編碼單一互補決定區(qū)(CDR)的肽?？梢酝ㄟ^構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體的CDR基因得到CDR肽(“最小識別單元”)。例如，通過利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，制備此類基因。參見，例如，Larricket al, METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.2，106頁(1991)，iv.SmallOrganic Compounds。
[0112]在一些實施方案中，抗-CD22抗體為單一結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)或納米抗體。單一結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體為缺少輕鏈的完整功能抗體；它們?yōu)楹幸粋€可變域(VHH)和兩個恒定域(CH2和CH3)的重鏈抗體。類似完整抗體，單一結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體能選擇性結(jié)合特定抗原。單一結(jié)構(gòu)域抗體分子量僅為12 - 15kDa，其比由兩條重蛋白鏈和兩條輕鏈組成的常見抗體(150 - 160kDa)小得多，并且甚至比Fab片段(~50kDa，一條輕鏈和半條重鏈)和單鏈可變片段(~25kDa，兩個可變域，一個來自輕鏈，且另一個來自重鏈)還小。納米抗體比常規(guī)4鏈抗體更有效和更穩(wěn)定，其產(chǎn)生(I)較低的劑量形式、較不頻繁的劑量引起較少的副作用；和(2)增加的穩(wěn)定性，導(dǎo)致給予途徑的更廣泛選擇，除包括靜脈內(nèi)途徑外，還有經(jīng)口或皮下途徑以及緩釋制劑。具有穩(wěn)定的抗-CD22納米抗體的緩釋制劑可用于治療和預(yù)防前列腺和肺癌，避免了對反復(fù)注射的需要和與其相關(guān)的副作用。由于它們的小尺寸，納米抗體能夠穿過膜和滲透入其他較大多肽和蛋白不能接近的生理區(qū)室、組織和器官。
[0113]結(jié)合⑶22的眾多抗體為本領(lǐng)域已知。此類抗-⑶22抗體及其片段可用于治療和預(yù)防前列腺和肺癌中。用于本發(fā)明方法的示例性抗-CD2抗體包括，例如，依帕珠單抗(Epratuzumab)(人源化的 LL2)(Furman, et al., Curr Treat Options Oncol.(2004)5(4):283-8) ;CAT_8015(Mussai, et al., Br J Haematol.(2010) 150(3):352-8 ;伊珠單抗-奧加米星(inotuzumab ozogamicin) (CMC-544) (Wong, et al., Expert Opin BiolTher.(2010) 10(8):1251-8) ;RFB4 和 BL22(CAT-3888)(Wayne, et al., Clin Cancer Res.(2010) 16 (6): 1894-903;和第 7，777，019 號、第 7，541，034 號和第 7，355，012 號美國專利)；以及 HB22.7 (第 2007/0264260 號美國專利公開；O’Donnell, et al., Cancer ImmunolImmunother.(2009) 58 (10): 1715-22)。優(yōu)選地，抗體被人源化以用于治療或預(yù)防人肺癌和/或前列腺癌。
[0114]c.包含效應(yīng)部分或治療部分的綴合物
[0115]在一些實施方案中，將CD22抗原結(jié)合性分子作為與效應(yīng)部分或治療部分的綴合物給予到個體或與肺癌和/或前列腺癌細(xì)胞接觸。免疫綴合物包含綴合至細(xì)胞毒性試劑如化療劑、抗腫瘤劑、細(xì)胞毒素或放射性核素的CD22抗原結(jié)合分子(抗體和非抗體)。
[0116]可以通過綴合至細(xì)胞毒放射性核素進一步提高本文的抗-⑶22抗體的功效，以允許對靶標(biāo)位點具有特異性的靶向放射治療(放射免疫療法)。合適的放射性核素包括，例如，I131和Y9°，兩者都被用于臨床實踐。其他合適的放射性核素包括但不限于，In111、Cu67、Cu64、I131、As211、Bi212、Bi213 和 Re1860 [0117]可用于產(chǎn)生⑶22結(jié)合性免疫綴合物的化療劑包括但不限于，例如，埃羅替尼、阿霉素(adriamycin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、5_氟尿嘧唳(5-FU)、阿糖胞苷("Ara-C")、吉西他濱(gemcitabine)、環(huán)磷酰胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、環(huán)磷酰胺、紫杉燒類，例如紫杉醇(泰素(Taxol), Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, N.J.)和多西他賽(docetaxel)(泰素帝(Taxotere), Rhone-PoulencRorer, Antony, Rnace)、氨甲喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、順鉬、美法侖(melphalan)、長春花堿、博來霉素、依托泊苷(etoposide)、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、長春新堿、長春瑞濱(vinorelbine)、卡鉬、替尼泊苷(teniposide)、道諾霉素(daunomycin)、洋紅霉素(carminomycin)、氨蝶呤、放線菌素 D (dactinomycin)、絲裂霉素、埃斯培拉霉素(esperamicins)(見第4，675, 187號美國專利)、6_硫代鳥嘌呤、6-巰嘌呤、放線菌素(actinomycin)D、VP-16 (依托泊苷)、瘤可寧(chlorambucil)、美法侖，以及其他相關(guān)的氮芥類、澳瑞他汀類(auristatins)包括單甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin Ε, MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)。可使用其他化療劑。
[0118]可用于本文的CD22結(jié)合性免疫綴合物的細(xì)胞毒素包括，例如，白喉A鏈、假單胞菌外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、伊諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)。具體包括抗體-美登木素生物堿(maytansinoid)和抗體-卡里奇霉素(calicheamicin)綴合物。含有美登木素生物堿的免疫綴合物公開于，例如，第5，208，020號、第5，416，020號美國專利和歐洲專利EP0425235中。還見Liu et al.，Proc.Natl.Acad Sc1.USA93:8618-8623 (1996)?？贵w-卡里奇霉素綴合物公開于，例如第5,712, 374號、第5，714，586 號、第 5，739，116 號、第 5，767，285 號、第 5，770，701 號、第 5，770，710 號、第5，773，OOl號和第5，877，296號美國專利中。其他已知的細(xì)胞毒素及其變體也可用于⑶22
結(jié)合性免疫綴合物。
[0119]在一些實施方案中，治療劑為抑制性核酸。抑制性核酸可被遞送至肺癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞，以特異性抑制靶基因的表達(dá)，例如，介導(dǎo)癌癥進展的基因的表達(dá)。示例性抑制性核酸包括反義RNA(asRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、小RNA(miRNA)和核酶。
[0120]在不同的實施方案中，治療劑被封裝在脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、膠團、不溶性單分子層、液晶、磷脂分散劑、層狀層等。在這些制劑中，待遞送的本發(fā)明組合物，單獨或聯(lián)合結(jié)合至期望的靶標(biāo)如抗體的分子或聯(lián)合其他治療性或免疫原性組合物，作為脂質(zhì)體的部分而摻入。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體由標(biāo)準(zhǔn)成泡脂質(zhì)形成，所述成泡脂質(zhì)通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和留醇如膽固醇。通常通過考慮例如，脂質(zhì)體大小、血流中脂質(zhì)體的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性來指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。多種方法可用于制備脂質(zhì)體，其描述于例如，Szoka, et al., Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467 (1980),第 4，235，871 號、第 4，501，728 號、第4，837，028號和第5，019，369號美國專利中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，將⑶22結(jié)合性抗原結(jié)合分子(抗體和非抗體)整合、連接或直接綴合至脂質(zhì)體。已在體內(nèi)動物模型中測試了綴合至脂質(zhì)體封裝的多柔比星的抗-⑶22抗體。參見,例如,O’Donnell, et al.，InvestNew Drugs.(2010)28(3):260-7;0’ Donnel1，et al., Cancer Tmmunol Immunother.(2009)58(12):2051-8 和 Tuscano, et al., Clin Cancer Res.(2010) 16 (10): 2760-8。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解，可以用另一目標(biāo)治療劑替換多柔比星。
[0121]在一些實施方案中， 治療劑被封裝在納米顆粒內(nèi)。抗體-納米顆粒綴合物為本領(lǐng)域已知且被描述于，例如，Musacchio, et al., Front Biosc1.(2011) 16:1388-412;Cuong, eta 1., Curr Cancer Drug Targets.(20 1 1) 1 1 (2): 147-55;Jain, BMC Med.(2010)8:83;Sunderland,et al., Drug Development Research(2006)67 (I): 70-93;Gu, et al.,Nanotoday(2007) 2(3):14-21;Alexis, et al.,ChemMedChem.(2008)3(12):1839-43;Fay, et al., Immunotherapy.(2011)3(3):381-394;Minko, etal.,Methods Mol Biol.(2010)624:281-94;和第 W02011/046842 號、第 WO 2010/040062號、第WO 2010/047765號和第W02010/120385號PCT公開中，為所有目的這些公開在此通過引用整體并入本文。已知的納米顆粒核心可用于封裝治療劑(例如，化療劑或抗腫瘤劑)以遞送至肺癌細(xì)胞和/或前列腺癌細(xì)胞中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將CD22抗原結(jié)合性分子(抗體或非抗體)整合、連接或直接綴合至納米顆粒核心。
[0122]在一些實施方案中，封裝性納米顆粒為圓柱形PRINT納米顆粒，其描述于例如，Gratton, et al., Proc Natl Acad Sci USA.(2008) 105 (33): 11613-8。如合適或需要，納米顆粒可以為可生物降解的或不可生物降解的。聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、可生物降解的聚(L-乳酸)(PLLA)和基于PEG的水凝膠可作為基質(zhì)用于顆粒藥物遞送系統(tǒng)中，因為它們?yōu)樯锵嗳?、生物可吸收的，并且已?jīng)在醫(yī)療應(yīng)用中顯示前景?？梢匀菀椎乜刂凭酆衔锏姆肿恿亢腿樗崤c乙醇酸的比率來確定合適的釋放速率和降解特性。PEG水凝膠顆粒易于共價結(jié)合靶向配體，因其提供有氨基柄。使用此類基質(zhì)，可制備含有大量化療劑的PRINT顆粒，例如，5至40wt%的化療劑(例如，多西他賽、紫杉醇、順鉬、吉西他濱、培美曲塞和/或埃羅替尼)。
[0123]可以使用以下物質(zhì)制備抗體和細(xì)胞毒性試劑的綴合物:各種雙官能團蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(STOP)、亞胺基硫烷(iminothiolane，IT)、亞胺酸酯(imidoesters)的雙官能團衍生物(如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyladipimidate HCl))、活性酯(如二琥拍酰亞胺辛二酸酯)、醒類(如戍二醒(glutareldehyde))、二疊氮化合物(如二(對疊氮苯甲酰)己二胺)、二重氮衍生物(如二(對重氮苯甲酰)_乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以按 Vitetta et al.，Science, 238:1098 (1987)中所述制備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酰芐基-3-甲基二乙烯三胺戊乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核素綴合至抗體的示例性螯合劑。參見，W094/11026。[0124]抗-⑶22抗體的共價修飾也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果適用，它們可以通過化學(xué)合成或通過抗體的酶促或化學(xué)切割進行制備。通過使抗體的靶向氨基酸殘基與有機衍生劑反應(yīng)將抗體的其他類型共價修飾引入到分子中，所述衍生劑能與選定側(cè)鏈或N末端或C末端殘基反應(yīng)。優(yōu)選的抗體共價修飾類型包括以本領(lǐng)域熟知的方式，將抗體連接至多種非蛋白聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
[0125]5.配制和給予
[0126]a.配制
[0127]可以將CD22結(jié)合性抗原結(jié)合分子(抗體和非抗體)配制成用于給予患者的藥物制劑?？梢酝ㄟ^多種方法給予所述藥物制劑。方法可以包括全身給予，其中抗原結(jié)合分子通過循環(huán)系統(tǒng)被遞送至身體內(nèi)的位點，包括藥物作用的靶向位點。全身給予包括但不限于，經(jīng)口、鼻內(nèi)、吸入、直腸和腸胃外(即，不通過消化道，諸如肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)皮和皮下)給予。在其它實施方案中，給予CD22結(jié)合性抗原結(jié)合分子為局部性給予，例如，局部或瘤內(nèi)給予。
[0128]b.劑量
[0129]可以給予CD22抗原結(jié)合性分子(抗體和非抗體)，用于預(yù)防性和/或治療性治療。在治療應(yīng)用中，以足以減輕、減少、延遲或抑制疾病及其并發(fā)癥的量將包含CD22結(jié)合性分子的組合物給予到患有疾病或惡性病癥如肺癌或前列腺癌的患者。足夠?qū)崿F(xiàn)這一目的的量被定義為“治療有效劑量”。對該用途有效的量取決于疾病嚴(yán)重性和患者總體健康狀況，并且常常進行臨床研究來確定給定癌癥類型的最佳劑量?；衔锏挠行Я繛?，提供癥狀的主觀緩解或如臨床醫(yī)師或其他合格觀察人員注意到客觀可辨認(rèn)的改善的劑量。
[0130]在預(yù)防應(yīng)用中，將含有CD22抗原結(jié)合性分子的組合物給予到還未進入疾病狀態(tài)或處于緩解狀態(tài)的患者，以阻止疾病發(fā)作。此種量被定義為“預(yù)防有效劑量”。在該用途中，精確劑量也取決于患者健康狀態(tài)。
[0131]有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開。通常，通過以下方式確定CD22抗原結(jié)合性分子的有效的或有效量:首先給予低劑量或小量的多肽或組合物，然后漸增性地增加給予的劑量或用量，根據(jù)需要加入第二或第三藥物，直到在治療個體內(nèi)觀察到期望效應(yīng)以及最小的或沒有毒副作用。確定合適的用于給予本發(fā)明組合物的劑量和劑量方案的適用方法描述于，例如，Goodman和Gilman’ s ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ilth Edition, 2006,同上！Physicians’DeskReference (PDR), 64th Edition, 2010;Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 21st Ed., 2006,同上；和 Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005，London:Pharmaceutical Press.,以及 Martindale, Martindale:The ExtraPharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn 中，其各自通過引用全部并入本文。
[0132]本文描述的藥物制劑的示例性劑量包括毫克、微克或納克量的CD22抗原結(jié)合性分子/千克個體或樣品重量(例如，約0.5微克/千克至約100微克/千克，或約I微克/千克至約50微克/千克)。此外還應(yīng)當(dāng)理解，CD22抗原結(jié)合性分子的合適劑量取決于組合物相對于要達(dá)到的期望效果的功效。當(dāng)將CD22抗原結(jié)合性分子給予到哺乳動物時，醫(yī)師、獸醫(yī)或研究人員最初可以，例如，開出相對低的劑量處方，然后增加劑量直至得到合適的響應(yīng)。另外，應(yīng)當(dāng)理解，對任何特定哺乳動物個體的特定劑量水平取決于多種因素，包括采用的特定組合物的活性、個體的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食、給予時間、給予途徑、排泄速率、組合物劑型、患者響應(yīng)、病癥嚴(yán)重性、任意藥物組合和處方醫(yī)師的判斷?？梢园凑諅€別患者要求隨時間增加或減少劑量。通常，最初給予患者低劑量，然后增加劑量至患者可耐受的有效劑量。
[0133]給予的CD22抗原結(jié)合性分子劑量取決于哺乳動物的種類、體重、年齡、個體條件、待治療區(qū)域表面積和給予形式。劑量大小還由在特定個體內(nèi)伴隨特定化合物的給予的任何不利影響的存在、性質(zhì)和程度決定。給予至約50至70kg哺乳動物的單位劑量可以含有約IOmg至2500mg的活性成分,例如，約20mg至2400mg活性成分。通常，0)22抗原結(jié)合性分子的劑量為足以達(dá)到預(yù)期效果的劑量。
[0134]組合物的最佳劑量、毒性和療效還可以根據(jù)個別組合物的相對功效發(fā)生變化，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方案在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏屑右詼y定，例如，通過測定LD50 (50%群體致死的劑量)和ED50 (50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效應(yīng)之間的劑量比為治療指數(shù)，并且可以表示為LD50/ED50比率。展現(xiàn)大治療指數(shù)的組合物是優(yōu)選的。雖然可以使用展現(xiàn)毒副作用的組合物，應(yīng)當(dāng)小心設(shè)計將此類組合物靶向受影響組織位點的遞送系統(tǒng)，以將對正常細(xì)胞的潛在損害減少最小，從而減少副作用。
[0135]可以將從例如，動物研究(例如，嚙齒類和猴)獲得的數(shù)據(jù)用來制定用于人的劑量范圍。本發(fā)明多肽的劑量優(yōu)選位于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，其包括ED50并且具有很少或沒有毒性。劑量可以根據(jù)采用的劑量形式和給予途徑在該范圍內(nèi)發(fā)生變化。對于任何用于本發(fā)明方法的組合物，最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)試驗中評估治療有效劑量?？梢栽趧游锬Ｐ椭兄贫▌┝浚赃_(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中所測定IC50(達(dá)到癥狀的半最大抑制的測試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。可以將此類信息用來更精確地確定用來開始人臨床試驗的劑量范圍。可以例如，通過高效液相色譜(HPLC)測量血漿水平。通常，典型個體的多肽或組合物等價劑量為約lng/kg至100mg/kg。
[0136]本發(fā)明的用于靜脈內(nèi)給予的典型抗原結(jié)合分子組合物為，每名患者每次給予約0.lmg/kg至100mg/kg?？墒褂玫膭┝繛椋棵颊呙看谓o予0.lmg/kg至約IOOmg/kg。制備可給予組合物的實際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，并且被更詳細(xì)地描述于諸如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21stEd., 2006, Lippincott ffilliams&ffilkins 的出版物中。
[0137]在本發(fā)明的一個實施方案中，例如，以約Ing化合物/kg個體重量(lng/kg)至約100mg/kg的劑量給予本發(fā)明的藥物制劑。在另一個實施方案中，劑量為約5mg/kg至約lOOmg/kg的劑量范圍。在又一實施方案中，劑量為約10mg/kg至約250mg/kg。在另一實施方案中，劑量為約25mg/kg至約150mg/kg。優(yōu)選劑量為約10mg/kg。
[0138]在不同的實施方案中，在一定期間內(nèi)通過推注或連續(xù)輸注給予CD22抗原結(jié)合性分子(抗體和非抗體)，諸如連續(xù)或推注輸注每周一次或兩次。另一途徑為皮下注射。劑量取決于靶向的惡性腫瘤的性質(zhì)、形式和階段，患者的性別、年齡、狀況、治療前史、使用過的其他抗癌癥治療(包括，例如輻射、化療、免疫療法等)和熟練醫(yī)師通?？紤]的其他因素。例如，肺癌或前列腺癌患者可以接受約50至約1500mg/m2/周，特別是約100至約1000mg/m2/周，更特別是約150至約500mg/m2/周的如本文描述的抗-⑶22抗原結(jié)合分子。
[0139]成功治療后，可取的是使個體經(jīng)歷維持治療以阻止治療的疾病或惡性病癥復(fù)發(fā)。
[0140]c.方案
[0141]可以從個體體內(nèi)抗原結(jié)合分子的測量值計算最佳劑量方案。通常，劑量為Ing至l，000mg/kg體重，并且如需要或合適，可每天、每半周、每周、每兩周、每半月、每月、每兩月或每年給予一次或多次。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最佳劑量、劑量方法和重復(fù)率。本領(lǐng)域技術(shù)人員能按照本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有方案和本文的公開確定給予人的本發(fā)明多肽或多肽組合物的最佳劑量。
[0142]可以單獨給予或與其他抗腫瘤劑或化療劑組合共給予CD22結(jié)合性分子。當(dāng)作為組合的部分給予時，CD22結(jié)合性分子可以與其他活性劑一起或分開給予，例如，作為混合物或以單獨制劑形式。CD22抗原結(jié)合性分子可以通過相同或不同給予途徑給予。CD22抗原結(jié)合性分子可以同時或順序給予。 [0143]可以根據(jù)患者所需的和耐受的劑量和頻率一次或多次給予所述藥物制劑。無論如何，組合物應(yīng)當(dāng)提供足夠量的本發(fā)明的CD22抗原結(jié)合性分子，以有效治療患者。優(yōu)選地，一次給予劑量，但可以定期給予直到達(dá)到治療結(jié)果或直到副作用使得需要終止治療。在一些實施方案中，在患者的余生中都給予CD22抗原結(jié)合性分子。通常，所述劑量足以治療或改善癥狀或疾病病征，而不會對患者產(chǎn)生不可接受的毒性。
[0144]所述劑量可以每周給予一次或分成亞劑量并以多個劑量給予，例如，每周兩次或三次。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本文描述的組合物能以不同量和不同次數(shù)給予。技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，某些因素可以影響有效治療個體所需的劑量和時間安排，包括但不限于疾病嚴(yán)重性或惡性病癥、先前的治療、總體健康狀況和/或個體年齡以及其他存在的疾病。此外，以治療有效量的組合物治療個體可以包括單次治療，或優(yōu)選地，可以包括一系列治療。
[0145]為了達(dá)到期望的治療效果，可以以治療有效的每天或每周劑量給予藥物制劑多日。因此，治療有效地給予組合物來治療本文描述的個體內(nèi)的疾病或惡性病癥可能需要周期性(例如，每天或每周)給予，其持續(xù)3天至兩周或更長的時間段。雖然連續(xù)的每天劑量是優(yōu)選的途徑，或每周劑量可能達(dá)到治療有效劑量，只要給予的重復(fù)頻率足以在個體內(nèi)維持組合物的治療有效濃度，即使化合物或組合物不是每天給予仍可能得到治療的有益效果。例如，可以每隔一天、每三天給予組合物，或者，如果采用較高的劑量范圍并且為個體所耐受，則每周給予一次。
[0146]在一些實施方案中，⑶22抗原結(jié)合分子在2至12周的過程中每周給予。
[0147]d.組合療法[0148]1.化療
[0149]可以將CD22抗原結(jié)合性分子與其他化療劑共給予，作為組合療法。CD22抗原結(jié)合性分子和化療劑可以一起給予(例如，作為綴合部分或作為納米顆粒組分)，或單獨給予?？梢耘cCD22抗原結(jié)合性分子共給予的化療劑的實例包括但不限于:表皮生長因子受體(EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑(埃羅替尼)、葉酸抗代謝物(培美曲塞)、烷化劑(順鉬、卡鉬和奧沙利鉬(oxaliplatin));抗代謝物(嘌呤或嘌呤模擬物，包括例如，硫唑嘌呤和巰嘌呤)；核苷類似物(吉西他濱、5-氟尿嘧啶)、植物生物堿和萜類(長春花生物堿和紫杉烷類)；長春花生物堿(長春新堿、長春花堿、長春瑞濱和長春地辛(vindesine));足葉草毒素(podophyllotoxin)(包括依托泊苷和替尼泊苷)；紫杉烷類(紫杉醇和多西他賽)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(I型抑制劑:喜樹堿(camptothecins)、伊立替康(irinotecan)和拓?fù)涮婵?topotecan) ;11型抑制劑:安吖唳(amsacrine)、依托泊苷、依托泊苷磷酸鹽和替尼泊苷)；抗腫瘤藥(放線菌素D、多柔比星、表柔比星、氟達(dá)拉濱(fludarabine)和博來霉素)；以及澳瑞他汀類，包括單甲基澳瑞他汀E (MMAE)、單甲基澳瑞他汀F (MMAF)。
[0150]任何用來治療目標(biāo)癌癥的化療劑都可以在組合療法方案中與CD22抗原結(jié)合性分子的肽和多肽共給予。
[0151]i1.輻射
[0152]CD22抗原結(jié)合性分子可以結(jié)合輻射方案(放射療法、輻射療法)給予。多種放射方案可用于疾病治療。技術(shù)人員已知的任何方案都可以與本發(fā)明的多肽組合用于治療患者。放射方案包括利用放射療法破壞細(xì)胞DNA進行的治療。細(xì)胞DNA的破壞可以由光子、電子、質(zhì)子、中子或離子束直接或間接離子化組成DNA鏈的原子引起。間接離子化的發(fā)生是由于水的離子化形成自由基，尤其羥基自由基，其隨后破壞DNA。在輻射療法的最常見形式中，大多數(shù)的輻射效應(yīng)通過自由基`來實現(xiàn)。由于細(xì)胞DNA修復(fù)機制，利用誘導(dǎo)雙鏈DNA破裂的試劑如輻射療法，被證明為非常有效的癌癥治療技術(shù)。癌細(xì)胞常常為未分化的和干細(xì)胞樣，此類細(xì)胞相比健康和分化更高的細(xì)胞，復(fù)制更快并具有減小的修復(fù)亞致死損傷的能力。另外，DNA損傷通過細(xì)胞分裂得到遺傳，引起癌細(xì)胞損傷的積累，誘導(dǎo)較慢的繁殖并且通常死亡。
[0153]輻射療法過程中使用的輻射量以戈瑞(Gy)度量，并且根據(jù)治療的癌癥類型和階段以及患者的總體健康狀況發(fā)生變化。劑量范圍還可受到癌癥類型的影響，例如，實體性上皮腫瘤的典型有療效劑量為60至80Gy，而淋巴瘤的劑量為20至40Gy。
[0154]還可以采用預(yù)防性(佐劑)劑量，并且其通常為45至60Gy，以1.8至2.0Gy分割給予(對于肺癌和前列腺癌)。許多其他因素是公知的，并且技術(shù)人員在選擇劑量時會加以考慮，包括患者是否接受其他治療(例如，但不限于給予CD22抗原結(jié)合性分子、給予化療等)、患者副發(fā)病變、輻射療法時間安排(例如，在手術(shù)之前還是之后給予輻射療法)以及任何手術(shù)方案的成功程度。
[0155]開出的輻射劑量處方的遞送參數(shù)可以由技術(shù)人員在治療計劃期間確定?？梢栽趯Ｓ糜嬎銠C上利用專門的治療規(guī)劃軟件完成治療計劃。根據(jù)輻射遞送方法，可以將幾種角度或來源用來總計總共所需的劑量。通常，設(shè)計的計劃遞送一致的處方劑量至腫瘤，并將遞送至周圍健康組織的劑量減至最小。
[0156]ii1.手術(shù)[0157]CD22抗原結(jié)合性分子可結(jié)合手術(shù)去除或腫瘤減滅給予。多種手術(shù)方案可用于疾病治療。可以將技術(shù)人員已知的任何方案與本發(fā)明的多肽組合用于治療患者。通常通過緊迫性、方案類型、涉及的身體系統(tǒng)、侵入程度和專用設(shè)備歸類手術(shù)方案。
[0158]手術(shù)方案的實例可以包括緊急情況以及預(yù)定方案。急診手術(shù)為必須快速進行以挽救生命、肢體或功能能力的手術(shù)。手續(xù)方案的其他實例可以包括探索性手術(shù)、治療性手術(shù)截肢、再植、重建、整容、切除、移植或摘除器官或身體部分，以及本領(lǐng)域已知的其他手術(shù)?？梢赃M行探索性手術(shù)來幫助或確認(rèn)診斷。治療性手術(shù)治療先前診斷的病癥。截肢包括切除身體部分，通常為肢體或手指或足趾。再植包括重新接上斷裂的身體部位。重建手術(shù)包括重建受傷的、殘缺的或畸形的身體部位?？梢赃M行整容手術(shù)來改善其他方面正常的結(jié)構(gòu)的外觀，或用于修復(fù)由于疾病損壞的或丟失的結(jié)構(gòu)。切除是從患者切掉器官、組織或其他身體部位。移植手術(shù)為通過將來自不同人(或動物)的另一器官或身體部位插入到患者體內(nèi)進行的器官或身體部位更換。從活人或動物摘除器官或身體部位用于移植也是一種類型的手術(shù)。
[0159]除了采用大切口來接近目標(biāo)區(qū)域的常規(guī)開放性手續(xù)方案，手術(shù)方案還包括微創(chuàng)手術(shù)。微創(chuàng)手術(shù)通常包括較小的外部切口，其被用于插入小型儀器到體腔或結(jié)構(gòu)內(nèi)，如在腹腔鏡手術(shù)或血管成形術(shù)中。激光手術(shù)包括利用激光取代手術(shù)刀或類似的手術(shù)器械切割組織。顯微手術(shù)包括利用操作性顯微鏡，以便外科醫(yī)生能看見微小結(jié)構(gòu)。機器人手術(shù)利用手術(shù)機器人(諸如，例如Da Vinci (Intuit Surgical, Sunnyvale, California))，以在技術(shù)人員，例如，熟練外科醫(yī)生指導(dǎo)下控制儀器。
[0160]6.監(jiān)測方法
[0161]多種方法可用于確定本發(fā)明多肽的治療性和預(yù)防性治療功效。通常，功效是在沒有顯著毒性的情況下產(chǎn)生效應(yīng)的能力。功效指所述治療為給定介入(介入的實例可以包括但不限于給予藥物制劑、采用醫(yī)療設(shè)備或采用手術(shù)方案)提供了治療或預(yù)防效果?？梢酝ㄟ^比較治療與未治療個體或通過比較治療之前和之后的相同個體來測量功效?？梢允褂枚喾N方法確定治療功效，包括藥理學(xué)研究、診斷研究、預(yù)測研究和預(yù)后研究。功效的指標(biāo)實例包括但不限于，腫瘤細(xì)胞增殖的`抑制和/或生長以及腫瘤細(xì)胞死亡的促進。
[0162]可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法評估抗癌治療的功效?？梢栽趧游锬Ｐ椭信c未治療或空白對照比較來篩選CD22抗原結(jié)合性分子的預(yù)防或治療功效。隨后可以分析通過此類篩選確定的CD22抗原結(jié)合性分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡或提高免疫系統(tǒng)活化的能力。例如，可以針對培養(yǎng)物中的腫瘤細(xì)胞系測試血清的多個稀釋液，并且可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測細(xì)胞死亡或抑制細(xì)胞增殖和/或生長。(參見，例如，Maniatis, et al., MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982;Ausubel, etal.Editor, Current Protocols in Molecular Biology, USA, 1984-2008;和 Ausubel, etal.Editor, Current Protocols in Molecular Biology, USA, 1984-2008;Bonifacino, etal., Editor, Current Protocols in Cell Biology, USA, 2010;所有這些都通過引用整體并入本文)。
[0163]本發(fā)明方法提供了檢測在患有或易患多種癌癥的患者體內(nèi)抑制疾病的方法?？梢詫⒍喾N方法用來監(jiān)測有癥狀患者的治療性治療和無癥狀患者的預(yù)防性治療。
[0164]檢測方法分別需要確定給予CD22抗原結(jié)合性分子劑量前患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的基線值，以及將該值與治療后腫瘤負(fù)荷的值比較。[0165]關(guān)于使用CD22抗原結(jié)合性分子的治療，腫瘤負(fù)荷值的顯著減小(即，大于相同樣品重復(fù)測量的典型實驗誤差容限，表示為與此類測量均值的一個標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示陽性治療結(jié)果(即，給予CD22抗原結(jié)合性分子阻止或抑制或減少了腫瘤增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的進展)。
[0166]在其他方法中，從接受了 CD22抗原結(jié)合性分子治療個體的對照群體確定腫瘤負(fù)荷的對照值(例如，均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差)。將患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的測量值與對照值(其實例為隨機的、安慰劑對照的臨床試驗)比較。如果患者體內(nèi)測得的水平?jīng)]有與對照值顯著不同(例如，大于一個標(biāo)準(zhǔn)偏差)，則可以停止治療。如果患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷水平顯著超過對照值，則確保繼續(xù)給予藥劑。
[0167]在其他方法中，監(jiān)測了當(dāng)前未接受治療但經(jīng)歷了先前的治療過程的患者的腫瘤負(fù)荷來確定否是需要恢復(fù)治療?？梢詫y得的患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷值與在先前的治療過程后獲得的患者體內(nèi)此前腫瘤負(fù)荷值比較。相對于此前測量的腫瘤負(fù)荷值顯著減小(即，大于相同樣品重復(fù)測量的典型誤差容限)指示可以恢復(fù)治療?？蛇x地，可以將患者體內(nèi)測得的值與測得的經(jīng)歷治療過程后患者群體的對照值(均值加標(biāo)準(zhǔn)偏差)比較。可選地，可以將患者體內(nèi)測得的值與保持無疾病癥狀的預(yù)防性治療患者群體或顯示疾病特征改善的治療性治療患者群體的對照值比較。在所有這些情形下，腫瘤負(fù)荷相對于對照水平(即，大于標(biāo)準(zhǔn)偏差)的顯著增加指示應(yīng)當(dāng)在患者體內(nèi)恢復(fù)治療。
[0168]用于分析的組織樣品通常為來自患者的血液、血漿、血清、粘液、組織活檢、腫瘤、腹水或腦脊液?？梢苑治鰳悠芬杂糜谥甘玖鲂纬??？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測瘤形成或腫瘤負(fù)荷，例如，由合格的病理學(xué)家目測觀察組織活檢或其他成像技術(shù)，例如，射線照相術(shù)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、計算機斷層攝影術(shù)(CT)、超聲、磁共振成像(MRI)。
實施例
[0169]提供以下實施例以闡述但不限制要求保護的發(fā)明。
[0170]實施例1
[0171 ] ⑶22抗原廣泛表達(dá)于肺癌細(xì)胞上
[0172]材料和方法
[0173]試劑:考馬斯亮藍(lán)R、蛋白酶抑制劑混合物片劑和乙二胺四乙酸(EDTA) (SigmaChemical C0., St.Louis, MO)、山羊抗-小鼠免疫球蛋白突光素綴合物(山羊抗_小鼠 Ig-FITC) (Biosource, Camarillo, CA)、小鼠抗-人 IgG(H+L)德克薩斯紅綴合物(Rockland Immunochemicals;Gilbertsville,PA)、抗-小鼠 HRP 抗體(Dako NorthAmerica, Inc, Carpentaria, CA)。BCA? 蛋白分析試劑盒、RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素和胎牛血清(FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA)、利妥昔單抗(Rituxan) (Genentech (South San Francisco, CA)。兔抗-CD22 抗血清(SantaCruz Biotec)。用于 IHC 的抗-CD22, NCLCD22-2, (Leice Biosystems, Newcastle UK)?？?⑶22mAb、HB22.7從腹水純化而來并且在先前已有表征(Engel, et al.，J ExpMed(1995) 181 (4): 1581-6)。所有化學(xué)制品均為分析級純度。
[0174]細(xì)胞系:CD22陽性的人Burkitt’ s B細(xì)胞淋巴瘤系、Ramos (ATCC CRL-1596)和肺癌細(xì)胞系(A549、H1355、H1975、H460、CaluU H1650、H727)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection) (Rockville, MD)。肺癌細(xì)胞系HCC827和A427 由 PhilMack 博士(UC Davis Dept, of Internal Medicine)惠贈，并且在先前已有表征(Li, etal., Cancer Res(2010)70:5942-52;和 Huang, et al., Cancer Res(1995)55:3847-53)。所有細(xì)胞均解凍并培養(yǎng)在RPM1-1640(Ramos)或DMEM(肺癌細(xì)胞系)中，其補充有10%FBS、50單位/ml青霉素G和50 μ g/ml硫酸鏈霉素。細(xì)胞于37°C、5%C02和90%濕度下培養(yǎng)在組織培養(yǎng)瓶中。傳代兩代后，將多個小瓶重新冷凍并儲存在液氮中備用。將細(xì)胞的新鮮小瓶定期解凍并用于體外實驗，以確保細(xì)胞不隨培養(yǎng)時間/傳代發(fā)生變化。對于異種移植研究，在腫瘤細(xì)胞移植前7-10天將A549或H1650細(xì)胞的新鮮小瓶解凍。[0175]流式細(xì)胞術(shù)(FACS) =FACS被用來評估⑶22表面表達(dá)和HB22.7結(jié)合。以1/50稀釋加入一抗，隨后在冰上孵育45分鐘；加入冷的PBS/FBS (Iml)，1300x g下微型離心機離心5秒,然后再次洗漆。加入山羊抗—小鼠-FITC(3 μ I) (Biosource, Camarillo, CA)并于黑暗下在冰上孵育30分鐘。加入冰凍PBS/FBS(lml)并在黑暗下孵育5分鐘。將細(xì)胞洗滌兩次，然后懸浮在200 μ I冷的PBS/FBS中；隨后加入溶于PBSGOOyl)的2%甲醛。然后利用Becton-Dickinson FACSCalibur細(xì)胞計數(shù)器、采用気離子激光器于488nm激發(fā)分析細(xì)胞。沿完整細(xì)胞周圍利用前向和側(cè)向散射繪制活門(live gate)以消除細(xì)胞碎屑；然后確定FLl(530nm)檢測器范圍內(nèi)的熒光。在活門中收集到一萬個事件(events)。利用界定區(qū)域確定每個熒光峰的平均熒光強度(MFI)。
[0176]體外細(xì)胞毒性測定:以每孔10(^1^的體積將1^11108、4549或!11650細(xì)胞(每樣品2-2.5xl04個)接種在96孔圓底平板中，每樣品3個重復(fù)。用25 μ g/mL終濃度的HB22.7或利妥昔單抗將細(xì)胞處理I小時。對照細(xì)胞僅接收培養(yǎng)基。處理后，在培養(yǎng)基中將平板洗滌3次，然后在37°C、5%C02和90%濕度下孵育5天。通過臺盼藍(lán)排除法評估生活力；實驗以一式三份進行，并且結(jié)果表示為％對照(未處理細(xì)胞)，其中誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0177]免疫印跡、Northern印跡和RT-PCR:按先前所述進行CD22免疫印跡(Tuscano，etal.，Blood(1999)94(4):1382-92;Tuscano, et al., Eur J Immunol (1996)26(6):1246-52)。簡單地說，在125 μ L補充有蛋白酶抑制劑混合物片劑、原釩酸鈉和2-甘油磷酸鹽的CellLytic M裂解緩沖液中裂解指示的細(xì)胞。細(xì)胞于冰上在間歇渦流下裂解30分鐘。將裂解產(chǎn)物(每泳道50 μ g蛋白)在10%SDS-PAGE凝膠上電泳，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜用溶于含有Tween-20 (TBS-T)的Tris緩沖鹽水的5%BSA封閉，沖洗，然后4°C下在以1:1000稀釋于含5%BSA的TBS-T的一抗(抗-⑶22)中孵育過夜。將洗過的膜在室溫下用以1:10，000稀釋于含5%BSA的TBS-T的抗小鼠HRP綴合物孵育I小時。將膜在TBS-T中洗滌4次，然后用增強的ECL檢測試劑(Advanced ECL detection reagent)探測。
[0178]按先前所述進行RT-PCR(Tuscano, et al.，Blood (1999) 94 (4): 1382-92)。簡單地說，通過利用RNeasy小型試劑盒(Qiagen, Valencia, Ca)遵循廠商說明書從細(xì)胞中抽提總RNA進行半定量PCR。利用用于RT-PCR的SuperScript? III第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)
從500ng總RNA合成cDNA。PCR條件包括⑶22引物選擇、濃度和退火溫度在先前已得到優(yōu)化。GAPDH被用作參照基因。
[0179]分析按之前所述進行CD22的Northern印跡(Wilson, et al., J ExpMed (1991) 173 (I):137-146)。簡單地說，通過瓊脂糖-甲醛PAGE大小分離總樣品并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。用利用⑶22特異性PCR引物生成的DIG-dUTP標(biāo)記的DNA探針并遵循廠商建議(Roche)檢測CD22特異性RNA。
[0180]內(nèi)化測定:內(nèi)化測定購自 Advanced Targeting Systems 公司(San Diego, CA),并按包裝說明書中所述進行。簡單地說，提供了綴合有皂素的山羊抗-人IgG(Hum-ZAP)和山羊IgG同種型對照(山羊IgG-SAP) 二抗，且其在先前已有描述(Kohls和Lappi (2000)BioTechniques28 (I): 162-165)。將A549和H727細(xì)胞加入到96孔微板中的90 μ L培養(yǎng)基中，并允許過夜粘附。實驗當(dāng)天將2xl04RamoS細(xì)胞接種在90 μ L培養(yǎng)基中。室溫下用10 μ g/mL第二綴合物Hum-ZAP將HB22.7的系列稀釋液孵育15分鐘。將10 μ L的ΗΒ22.7-Hum-ZAP綴合物加入到每個孔中，給出I μ g/mL終濃度的Hum-ZAP。山羊IgG-SAP被用作Hum-ZAP的非靶向性皂素對照。孵育72小時后，利用CellTiter96Aque0us單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒根據(jù)廠商說明書評估細(xì)胞生活力。在酶標(biāo)儀中于490nm處讀取平板。通過以下方程式確定百分比細(xì)胞生活力:(處理的OD/對照的0D)*100，其中所述對照表示為單獨用培養(yǎng)基處理的細(xì)胞，并且先前證明與內(nèi)化程度相關(guān)。
[0181]ADCC/⑶C測定:對于ADCC測定，PBMCs為采用標(biāo)準(zhǔn)方案從自健康志愿者采集到檸檬酸鹽處理的(citrated)真空管中的全血分離的細(xì)胞。分離后,將PBMCs放置于RPMI加10%FCS 的培養(yǎng)物中。37°C下利用 1000 單位/ml 的人 IL-2(Proleukin, Chiron Inc.)過夜活化細(xì)胞。在測定前12-24小時，將活化的PBMCs與以一式三份培養(yǎng)在96孔板中的A549肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)。作為補體來源，以1/10稀釋加入人血清。以靶標(biāo)細(xì)胞數(shù)目的IOx加入活化的PBMC。在37°C和5%C02下，將細(xì)胞在潮濕的隔室(chamber)中孵育兩天。通過臺盼藍(lán)排除法利用顯微鏡在高倍(40X)下以及平均10個視野確定活細(xì)胞數(shù)目。人血清補體購自Quidel, San Diego, CA，并以小份凍存在_80°C下備用，使用時可容易地解凍小份，并在培養(yǎng)基中以不同的稀釋度用于CDC分析。
[0182]異種移植研究:6_8周大Balb/c雌裸鼠從Harlan SpragueDawley (Indianapolis, IN)獲得,并于無病原體條件下養(yǎng)育在加州大學(xué)戴維斯分校動物設(shè)施(UC Davis animal facility)的微型隔離籠內(nèi)。全身福射(400rads)后3天,將IxlO6的A549、PC-3或H1650細(xì)胞經(jīng)皮下植入左側(cè)。在腫瘤植入后一天(優(yōu)先)，或一旦建立起約IOOmm3腫瘤(~14d)，將小鼠隨機分成治療組(n=8_10只/組):1.4mg的HB22.7、利妥昔單抗或IgG (對照)。在腫瘤植入后第I天、第7天、第14天和第21天給予小鼠治療(優(yōu)先)或在腫瘤建立后每周給予治療達(dá)4周。所有治療都通過尾靜脈給予。利用卡尺每周測量腫瘤兩次，并使用以下方程式計算腫瘤體積:(長度X寬度X深度)x0.52。當(dāng)腫瘤在任何維度上達(dá)到15mm時、如果它們成為垂死的或在84天研究結(jié)束時將小鼠安樂死。
[0183]原位異種移植模型先前已有描述(Hatakeyama, Methods in Enzymology.(2010)479:397-411;和 Guilbaud, et al., Ant1-Cancer Drugs, (1997)8 (3):276-82)。簡單地說，將IO6個A549細(xì)胞重懸在100 μ I培養(yǎng)基中，并經(jīng)尾靜脈注射。在第I天、第7天、第14天和第21天用HB22.7(1.4mg)或Ig對照處理動物。在動物成為垂死的(盡管多數(shù)未處理動物到第14天死亡)時將它們安樂死，并采集肺進行組織學(xué)檢查。為了便于比較肺轉(zhuǎn)移發(fā)展，一組處理動物也在第14天時被安樂死。為了便于比較整體存活，一組處理動物(5)未執(zhí)行安樂死并且再檢測60天。
[0184]通過在起初28天每周兩次測量它們的體重、活動和血液計數(shù),然后在84天的剩余研究時間內(nèi)每周測量一次，評估小鼠毒性(通過加州大學(xué)戴維斯分校的獸醫(yī)實驗動物診所(Veterinary Medicine Lab Animal Clinic)進行毒性的標(biāo)準(zhǔn)評估)。
[0185]1-PET:將銅-64標(biāo)記的HB22.7用于確定HB22.7在體內(nèi)特異性靶向A549的能力，按先前所述進行(Martin, et al.,Mol Imaging Biol.(2009) 11 (2): 79-87)。64Cu (正電子發(fā)射器)整合了所有3種衰減模式:電子捕獲(41%)、β-(40%)和β+(19%)，使得其為成可用于成像和治療的放射性核素。64Cu在華盛頓大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)回旋加速器上制得，并提供為64CuCl2 (0.1M HCl)。雙官能團螯合劑 DOTA (1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷 N，N，，N，，，N，，，-四乙酸(DOTA)含有形成共價連接到蛋白的反應(yīng)功能性和螯合放射金屬的強金屬結(jié)合基團。通過在ΡΗ5.5下與DOTA-NHS酯孵育制備D0TA-HB22.7。用溶于ρΗ5.5的0.1M乙酸銨的乙酸-64Cu標(biāo)記D0TA-HB22.7。孵育后，用ImM EDTA終止反應(yīng)。然后進行HPLC純化，以純化64Cu-D0TA-HB22.7。
[0186]統(tǒng)計分析:通過雙尾非配對學(xué)生T檢驗(Student’ s t test)分析體外細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)和細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)。利用Kaplan-Meier曲線分析腫瘤體積數(shù)據(jù)。對于該分析事件(event)”定義為腫瘤體積達(dá)到400mm3或更大。每只個體小鼠歸類為I (事件發(fā)生)或0(事件未發(fā)生)，并且確定了事件時間(表示為天數(shù))。當(dāng)個體歸類為O (事件未發(fā)生)時，記錄了 88天的事件時間(12.5周研究中的天數(shù))。通過對數(shù)秩檢驗確定了卡方值和P值。所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism軟件(San Diego, CA)進行。p值〈0.05被認(rèn)為顯著。
[0187]結(jié)果
[0188]肺癌中CD22的表達(dá)。HB22.7抗_CD22mAb識別A549NSCLC細(xì)胞表面上的表位。該發(fā)現(xiàn)促使我們通過流式細(xì)胞術(shù)在代表以下主要肺癌亞型的NSCLC細(xì)胞系組中檢測了⑶22表達(dá):腺癌(A549、H1355、H1975、HC827、H460)、鱗狀細(xì)胞癌(Calul)、支氣管肺泡癌(BAC)(H1650)、表皮樣癌(A427)和良性腫瘤(H727)。HB22.7結(jié)合除A427和HC827外的所有細(xì)胞系，在一些情形下結(jié)合水平幾乎(例如H727)與Ramos B-細(xì)胞NHL細(xì)胞上的一樣高，(圖1A)。表面表達(dá)還與其它抗_CD22mAbs —致，包括HB22.2712和HD617。
[0189]為了證實⑶22被表達(dá)于通過流式細(xì)胞術(shù)為陽性的NSCLC系中，從選定的NSCLC細(xì)胞系和正常支氣管上皮細(xì)胞(BEC)中分離了 mRNA，并利用人CD22-特異性寡核苷酸進行了定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，(圖1B)。從Ramos B細(xì)胞、A549、H727、H1650和含CD22質(zhì)粒擴增了預(yù)測長度的cDNA片段，但未從與流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)一致的BEC和A427細(xì)胞分離的mRNA擴增。接下來，進行了抗-CD22免疫印跡(IB)分析，來看人CD22的預(yù)期分子量范圍內(nèi)的蛋白條帶是否能在來自流式細(xì)胞術(shù)-陽性NSCLC的蛋白溶解產(chǎn)物中(但并非在來自Jurkat T細(xì)胞(陰性對照)的溶解產(chǎn)物中)檢測到，(圖1C)。在初始B細(xì)胞(陽性對照)，但并未在初始T細(xì)胞(陰性對照)中，檢測到合適大小范圍內(nèi)的清晰條帶。在CD22PCR陽性細(xì)胞系Calul和A549的泳道中檢測到類似大小范圍內(nèi)的條帶，但在抗-CD22-流式細(xì)胞術(shù)陰性NSCLC系Calu6的樣品泳道中未檢測到。為了證實表達(dá)和轉(zhuǎn)錄本大小，利用來自Ramos B 細(xì)胞、A549、H1650、H727 和 A427 的總 RNA 進行了 Northern 印跡，(圖 1D)。這揭示出mRNA表達(dá)在A549和H727細(xì)胞明顯，在H1650中低水平表達(dá)，并且未在A427中檢測到表達(dá)。
[0190]為了確定⑶22序列是否與B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的相同，對來自A549細(xì)胞的⑶22cDNA的所有2541個堿基對進行測序，A549的序列與公開的分離自B細(xì)胞的⑶22序列(Wilson，etal., J Exp Med(1991) 173(1):137-146)相同。為了證明 CD22 并非異常表達(dá)于這些 NSCLC細(xì)胞系中，獲得了從患有NSCLC患者和正常肺組織得到的組織塊，并在石蠟包埋的切片材料上進行了 CD22表達(dá)的免疫過氧物酶(IP)染色。因為CD22得到巨大的翻譯后修飾(唾液酸化作用)(Crocker, et al., Nat Rev Tmmunol (2007) 7 (4): 255-66; Shan, et al., JImmunol (1995) 154(9):4466-75)?？偹苤狢D22難以通過IHC來檢測，然而，利用與過氧物酶綴合的抗-⑶22mAb，在3種不同的NSCLC腫瘤類型中檢測到了顯著程度的⑶22染色，(圖1E)。部分腫瘤中的抗-CD22IP信號常常較強，但周圍正常肺組織中卻較弱或檢測不到。幾種其他的NSCLC患者樣本也被IHC染色為⑶22-陽性，但從支氣管鏡檢獲得的正常人肺細(xì)胞的細(xì)胞涂片(cytopr印)為CD22陰性。
[0191]⑶22介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞殺傷和受體內(nèi)化:⑶22與配體阻斷性抗-⑶22mAbs的交聯(lián)誘導(dǎo) B 細(xì)胞 NHL 中的細(xì)胞死亡(Tuscano, et al., Blood (1999) 94 (4): 1382-92;和 Tuscano, etal.，Blood (2003) 101 (9):3641-7)，因此評估了是否對于表達(dá)CD22的NSCLC也是如此。測試了 3種NSCLC系以及Ramos NHL細(xì)胞對HB22.7介導(dǎo)的⑶22交聯(lián)的響應(yīng)性。正如期望的，48小時后，在Ramos細(xì)胞中觀察到了 HB22.7和利妥昔單抗(抗-CD20對照mAb)的細(xì)胞毒效應(yīng)。然而，用HB22.7處理的H1650和Calu-1的生活力得到極大減少；正如所期望的，在用利妥昔單抗處理的NSCLC系中未誘導(dǎo)細(xì)胞毒響應(yīng)(圖2A)。
[0192]雖然已知mAb結(jié)合的CD22在B細(xì)胞中介導(dǎo)CD22內(nèi)化(Engel et al., J ExpMed(1995) 181 (4): 1581-6)，但在NSCLC中，從未探索過受體內(nèi)化問題。在具有中間和高水平⑶22表面表達(dá)的A549和H727NSCLC細(xì)胞系中檢測了⑶22內(nèi)化，隨后將其與Ramos B細(xì)胞比較(圖2B)。利用內(nèi)化程度與細(xì)胞毒性程度成比例的新型毒素綴合方法，該研究證明HB22.7介導(dǎo)了 B-NHL細(xì)胞中超過80%的⑶22內(nèi)化，并揭示出A549和H727細(xì)胞中分別存在20%和 10%的內(nèi)化。該大小差異可能是由于NHL中相對于NSCLC細(xì)胞不同的⑶22表達(dá)水平。在初始B細(xì)胞和B NHL細(xì)胞中，⑶22在被配體結(jié)合后被內(nèi)化(Crocker, et al.，NatRev Immunol(2007)7(4):255-66;Shan, et al., J Immunol(1995) 154(9):4466-75)。
[0193]還不知道抗-CD22介導(dǎo)的腫瘤抑制是否通過宿主免疫效應(yīng)物機制如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或直接細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。通過受體內(nèi)化可改變抗體介導(dǎo)的宿主免疫效應(yīng)物的補充機制(Weiner和Carter, Nature (2005) 23 (5):556-7)。利用A549細(xì)胞研究了人源化的HB22.7 (hHB22.7)可介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞內(nèi)的ADCC和/或CDC的可能性(圖2C)。當(dāng)將補體加入到huHB22.7中時，發(fā)生了其他的A549殺傷(約2%殺傷僅由補體產(chǎn)生；約40%殺傷由補體加huHB22.7產(chǎn)生)。由外周血單核細(xì)胞(PBMC)加入至huHB22.7引起的效應(yīng)超過僅PBMCs所見的效應(yīng)很少，(圖2C)。
[0194]HB22.7在體內(nèi)有效靶向NSCLC/A549異種移植物:先前證實可以利用64CU-D0TA-HB22.722，用免疫正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(i_PET)有效監(jiān)測NHL異種移植物的體內(nèi)靶向性。利用相同的抗-⑶221-PET方法，表明HB22.7的生物分布和對NSCLC異種移植物的特異性靶向類似于用HB22.7處理的Raj1-NHL異種移植物中所見的生物分布和特異性靶向，(圖3)。在48小時，大多數(shù)的免疫綴合物被從血池清除，并且在此時存在特異性NSCLC攝取，其它器官包括正常肺中的攝取非常低。
[0195]抗-⑶22阻斷性mAb HB22.7在體內(nèi)針對NSCLC的活性:基于我們的發(fā)現(xiàn)，即⑶22表達(dá)于NSCLC細(xì)胞上和HB22.7結(jié)合大多數(shù)NSCLC細(xì)胞系，開始了異種移植試驗來評估HB22.7的臨床前功效，(圖4A-D)。由于H1650 (BAC)細(xì)胞在體外對HB22.7的細(xì)胞毒效應(yīng)敏感，測試了 HB22.7抑制裸鼠體內(nèi)的H1650腫瘤生長的能力(圖4A)。這表明HB22.7具有顯著的針對裸鼠體內(nèi)H1650腫瘤的功效，在研究結(jié)束時腫瘤體積的減少大于50%(p〈0.001)。
[0196]因為A549NSCLC細(xì)胞在體外耐受HB22.7誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，在⑶22陽性但耐受的細(xì)胞系中評估HB22.7的臨床前功效(圖4B)。相比未處理的和抗-CD20 (利妥昔單抗)的對照，HB22.7確實顯著地延遲了荷載A549小鼠體內(nèi)的腫瘤生長，(p〈0.05)。在利用荷載A459或PC-3(前列腺癌)異種移植物的小鼠進行的重復(fù)研究中，證實了該效應(yīng)的腫瘤特異性，(圖4C)。HB22.7未顯著延遲PC-3異種移植物的生長，但再次證實了 A549細(xì)胞生長的一致減少。考慮到HB22.7在體外針對A549細(xì)胞具有很少的細(xì)胞毒性，該針對A549異種移植物的功效是讓人吃驚的。然而，4個獨立試驗證實了 HB22.7針對人NSCLC異種移植物的功效。還不清楚為何HB22.7在體內(nèi)展現(xiàn)針對A549異種移植物的功效，A549異種移植物在體外展示出對HB22.7的耐受性，但是先前的體外研究證實宿主免疫效應(yīng)物機制可能有幫助(圖2C)。異種移植小鼠的預(yù)輻照通過抑制殘余免疫增加了異種移植吸收率(take-rate)。裸鼠具有能產(chǎn)生ADCC以及補體的殘余NK細(xì)胞活性。因為HB22.7在體外A549細(xì)胞中具有很少的細(xì)胞毒活性，但在異種移植模型中展示活性，該殘余免疫功能可以有助于HB22.7介導(dǎo)的功效。進行了在腫瘤移植前不經(jīng)輻照的A549異種移植試驗來研究HB22.7的作用機制(圖4D)。該試驗證實了 HB22.7針對NSCLC A549異種移植物的活性，并且該活性似乎得到增加，表明ADCC和/或⑶C有幫助。
[0197]肺癌轉(zhuǎn)移的原位模型:⑶22介導(dǎo)B細(xì)胞歸巢至內(nèi)皮細(xì)胞23、24。為了證實⑶22提升或促進肺癌轉(zhuǎn)移，將抗_CD22mAb HB22.7用于肺癌的原位模型，以試圖在靜脈內(nèi)注射NSCLC細(xì)胞后阻止肺轉(zhuǎn)移。將A549腫瘤帶有或沒有HB22.7注射后40天的小鼠安樂死，收獲肺并進行轉(zhuǎn)移的組織學(xué)檢查(圖5A)。差異是巨大的——多數(shù)來自未處理小鼠的肺具有巨大的腫瘤負(fù)荷，并且一個幾乎被腫瘤取代(右上黑色箭頭)；在耶22.7處理的小鼠中，除一個小轉(zhuǎn)移(左下紅色箭頭)外，肺幾乎沒有腫瘤。這證明⑶22對肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)展具有顯著影響。該模型還被用來評估 HB22.7處理對存活的影響。未安樂死的動物繼續(xù)每周注射HB22.7或觀察。這證實了存活的顯著改善，其中超過90%的處理小鼠在84天試驗結(jié)束時仍存活；100%的未處理小鼠到第14天時死亡(p〈0.0001)(圖5B)。
[0198]討論
[0199]分析HB22.7對NHL的效應(yīng)揭示了意想不到的發(fā)現(xiàn)一抗_CD22mAb識別A549NSCLC細(xì)胞表面上的表位。該發(fā)現(xiàn)促使能通過流式細(xì)胞術(shù)在代表以下主要NSCLC亞型的NSCLC細(xì)胞系組中檢查CD22表達(dá):腺癌(A549、H1355、H1975、HC827、H460)、鱗狀細(xì)胞癌(Calul)、支氣管肺泡癌(BAC) (H1650)、表皮樣癌(A427)和良性腫瘤(H727)。HB22.7結(jié)合除A427和HC827外的所有細(xì)胞系，在一些情形下，結(jié)合水平幾乎與Ramos B-細(xì)胞NHL細(xì)胞上的一樣高(例如 H727)(圖1)。本文中和其他地方(Martin, et al., Mol Imaging Biol.(2009) 11(2):79-87;ffilson, et al., J Exp Med(1991) 173(I):137-46;和 Postema, etal.,Clin Cancer Res (2003) 9 (10Pt2): 3995S-4002S)提供的所有可得到的證據(jù)都表明⑶22不在正常肺上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且⑶22表達(dá)為惡性肺細(xì)胞共同但獨特的特征。可公開獲取的cDNA微陣列數(shù)據(jù)庫(NCBI GE0)的詳細(xì)審查表明⑶22在幾種未被測試過的肺癌細(xì)胞系中表達(dá)(一些以相對高水平表達(dá)，例如H1770、EBC-1和LU65);這提供了我們的發(fā)現(xiàn)的獨立證明。這利用患者腫瘤樣本的RT-PCR、1-PET, Northern印跡和IHC得到證實(圖1&3)。通過IHC評估的CD22表達(dá)模式不一致但獨特，其中在腫瘤細(xì)胞的緊密壓緊集群中的表達(dá)顯得更突出(圖1)。這可能是⑶22的粘附性質(zhì)的一個表現(xiàn)，粘附性質(zhì)在某種程度上有助于⑶22介導(dǎo)的肺癌轉(zhuǎn)移。NSCLC中發(fā)現(xiàn)的⑶22的轉(zhuǎn)錄本大小和序列與B細(xì)胞中的相同，因此表面表達(dá)模式為可能介導(dǎo)轉(zhuǎn)移以及可能地生長方面的選擇性優(yōu)勢的僅有異常。CD22在B細(xì)胞中的特定作用仍然存在爭議，但是多數(shù)認(rèn)可其介導(dǎo)粘附和調(diào)節(jié)B細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(Tedder, et al., Annu Rev Tmmunol (1997) 15:481-504; Tedder, et al., AdvImmunol (2005) 88:1-50) ο還有證據(jù)表明⑶22配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)正常以及惡性B細(xì)胞內(nèi)的特定存活信號(Haas, et al., J Immunol (2006) 177 (5): 3063-73)。已經(jīng)證實 CD22 配體阻斷性mAb HB22.7具有顯著的淋巴瘤殺滅性質(zhì)；然而其效能為可變的。
[0200]雖然對機制仍然理解很少，但先前的利用鼠模型的研究表明HB22.7的效應(yīng)通過抑制CD22配體結(jié)合效應(yīng)來特異性介導(dǎo)。NSCLC細(xì)胞在體外和體內(nèi)的選擇性殺傷(圖4)也已得到證實。雖然A549和H1650異種移植物的生長都受到HB22.7的抑制，但僅H1650展現(xiàn)體外細(xì)胞毒性，因此檢測了宿主免疫效應(yīng)物機制產(chǎn)生幫助的可能性(圖2)。ADCC和CDC測定證實補體在體內(nèi)活性一一種在裸鼠異種移植模型中保持完整的系統(tǒng)中起作用。先前利用結(jié)合內(nèi)化性受體的mAb的研究表明，宿主免疫效應(yīng)物機制起較少作用。雖然A549和H727NSCLC細(xì)胞上的⑶22展現(xiàn)了一些內(nèi)化，其比Ramos B細(xì)胞上觀察到的少約50%(圖2)。已表明CD22介導(dǎo)與已知的具有CD22配體的細(xì)胞的同型和異型粘附，包括幾乎所有造血細(xì)胞類型以及內(nèi)皮細(xì)胞(Engel，et al., J Exp Med(1995) 181 (4):1581-6;Wilson, et al., J Exp Med(1991) 173(I):137-146;和 Crocker, et al., Nat RevImmunol (2007) 7 (4): 255-66)。因為⑶22異常表達(dá)于肺癌細(xì)胞上，并且在歸巢中起作用，確定了 CD22是否在肺癌細(xì)胞中介導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移。為了測試該推測，利用了肺癌轉(zhuǎn)移的靜脈內(nèi)原位模型(Hatakeyama, et al., Methods in Enzymology.(2010) 479; 397-411)。HB22.7 處理造成植入肺中的腫瘤數(shù)目和大小的極大減小。在用HB22.7處理的動物的肺中幾乎沒有檢測到腫瘤(圖5)。該模型還提供了研究HB22.7處理對存活影響的機會。盡管一些動物被安樂死用于組織學(xué)檢查，`但在用HB22.7處理，觀察到的那些動物展現(xiàn)整體存活的顯著改善，其中100%的未處理動物到第14天時都死亡，并且超過90%的處理動物在第60天時仍存活(圖5)。
[0201]總之，⑶22對肺癌的識別代表了開發(fā)肺癌特異性療法的里程碑。另外，⑶22作用的檢查為肺癌的發(fā)病機制和侵入性提供了更好的理解。
[0202]實施例2
[0203]包被有抗-CD22抗體的脂質(zhì)體封裝的化療劑抑制肺癌生長
[0204]用攜帶多柔比星的、包被有HB22-7的IL治療NSCLC:脂質(zhì)體為優(yōu)良的化療封裝載體，但可以通過利用mAb對它們進行改進以將它們特異性靶向腫瘤。特異性腫瘤靶向增加了化療功效，因為較高的藥物濃度可定位于腫瘤。腫瘤特異性靶向使正常組織免于遭受與化療相關(guān)的一些毒性。利用包被有HB22.7的PEG化脂質(zhì)體多柔比星(阿霉素)(IL-阿霉素)進行的研究顯示巨大的抗NHL活性(O’Donnell, et al., Invest NewDrugs(2010)28(3):260-7;和Tuscano, et al., Clin Cancer Res.(2010) 16(10):2760-8)。多柔比星對NSCLC具有一些功效，但其他試劑要有效得多。然而，如原理所證明，考慮到包被有阿霉素和HB22.7的IL-阿霉素的有效性，研究了 IL-阿霉素對A549細(xì)胞的體外效應(yīng)(圖 6)。
[0205]比較阿霉素與IL-阿霉素的A549異種移植試驗(圖7)顯示了顯著活性以及非靶向(阿霉素)和靶向(IL-阿霉素)藥物之間的差異。因此進行了其他檢測用于NSCLC治療的⑶22靶向的IL-阿霉素的研究。考慮到阿霉素并非治療NSCLC最有效的試劑，這些數(shù)據(jù)尤其引人注目。利用IL-阿霉素在H1650肺癌細(xì)胞中產(chǎn)生了其他體外數(shù)據(jù)(圖8)。這些數(shù)據(jù)證明⑶22可以用作具有抗-⑶22mAb的有效載荷的靶標(biāo)。
[0206]應(yīng)當(dāng)理解本文中描述的實施例和實施方案僅用于說明性目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)其啟發(fā)進行的各種修飾或更改，并且這些修飾或更改包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。為所有目的，本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此都通過引用 整體并入本文。
【權(quán)利要求】
1.預(yù)防、減少、延緩或抑制肺癌細(xì)胞的增殖和/或生長的方法，包括使所述肺癌細(xì)胞與結(jié)合表達(dá)于所述肺癌細(xì)胞表面上的CD22的抗原結(jié)合分子接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肺癌細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
3.預(yù)防、減少、延緩或抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和/或生長的方法，包括使所述前列腺癌細(xì)胞與結(jié)合表達(dá)于所述前列腺癌細(xì)胞表面上的CD22的抗原結(jié)合分子接觸。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子為結(jié)合CD22的抗體或抗體片段。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為單克隆的。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人嵌合體。
7.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人源化的。
8.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人抗體或抗體片段。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為HB22.7。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段綴合至治療劑上。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中治療劑選自細(xì)胞毒素、放射性核素、抑制性核酸和抗腫瘤劑。
12.如權(quán)利要求10至11中任一項所述的方法，其中所述治療劑封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或脂質(zhì)體上或納米顆粒內(nèi)。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述肺癌細(xì)胞或所述前列腺癌細(xì)胞位于體外。
14.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述肺癌細(xì)胞或所述前列腺癌細(xì)胞位于體內(nèi)。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述肺癌細(xì)胞或所述前列腺癌細(xì)胞為人細(xì)胞。
16.預(yù)防、減少、延緩或抑制有需要的個體內(nèi)肺癌的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括將結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子給予至所述個體，其中所述抗原結(jié)合分子結(jié)合表達(dá)于肺癌上的CD22，從而預(yù)防、減少、延緩或抑制個體內(nèi)肺癌的生長或轉(zhuǎn)移。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。
18.預(yù)防、減少、延緩或抑制有需要的個體內(nèi)前列腺癌的增殖和/或生長和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括將結(jié)合CD22的抗原結(jié)合分子給予至所述個體，其中所述抗原結(jié)合分子結(jié)合表達(dá)于前列腺癌上的CD22，從而預(yù)防、減少、延緩或抑制個體內(nèi)前列腺癌的生長或轉(zhuǎn)移。
19.如權(quán)利要求16至18中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子為結(jié)合CD22的抗體或抗體片段。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子為IgG抗體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述IgG抗體為人IgGl同種型或人IgG3同種型。
22.如權(quán)利要求16至21中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為單克隆的。
23.如權(quán)利要求16至22中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人嵌合體。
24.如權(quán)利要求16至22中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人源化的。
25.如權(quán)利要求16至22中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為人抗體或抗體片段。
26.如權(quán)利要求16至25中任一項所述的方法，其中所述抗-CD22抗體或抗體片段為HB22.7。
27.如權(quán)利要求16至26中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段綴合至治療劑上。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述治療劑選自毒素、放射性核素、抑制性核酸或抗腫瘤劑。
29.如權(quán)利要求27至28中任一項所述的方法，其中所述治療劑封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或納米顆粒內(nèi)。
30.如權(quán)利要求16至29中任一項所述的方法，其中所述個體為人。
31.如權(quán)利要求16至30中任一項所述的方法，其中所述個體不患有血液癌癥。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述個體不患有B細(xì)胞惡性腫瘤。
33.如權(quán)利要求16至32中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段不與抗腫瘤劑共給予。
34.如權(quán)利要求16至33中任一項所述的方法，其中所述抗原結(jié)合分子或抗體或抗體片段經(jīng)靜脈內(nèi)給予。
【文檔編號】A61K39/395GK103717236SQ201280037439
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月8日
【發(fā)明者】約瑟夫·圖斯卡諾, 羅伯特·奧唐奈 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會