專利名稱：一種小分子超抗原改造體蛋白及其編碼基因與制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體說是ー種小分子超抗原改造體蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen, SAg)是ー組由細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子，以極低濃度(I 10ng/mL)刺激大部分T細(xì)胞増殖，具有超強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)功能和一定的抗腫瘤活性。因此，超抗原是ー種極好的免疫調(diào)節(jié)劑和增效劑，可望被開發(fā)成潛在的新型抗腫瘤藥物，用于腫瘤治療。金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一類具有代表性的微生物外毒素。由于其極強(qiáng)的T細(xì)胞激活功能，成為ー類典型微生物超抗原，受到人們的·廣泛重視。近年來，人們在對金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)功能及其抗腫瘤等·進(jìn)行了大量研究工作，其中主要集中在對TSSTl、SEA、SEB等的研究方面。腸毒素C2(SEC2)作為金黃色葡萄球菌腸毒素家族中的ー員，國內(nèi)外對其結(jié)構(gòu)與功能方面的研究至今不多，且已有的研究結(jié)論尚不明確。我所首次對SEC2的基因進(jìn)行了克隆、測序并在靶向融合蛋白研究方面取得了開創(chuàng)性成果，為進(jìn)ー步開展SEC2分子改造及其靶向融合蛋白的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。因此，為了進(jìn)ー步提高腸毒素C2在未來抗腫瘤方面的開發(fā)潛力，很有必要對其進(jìn)行進(jìn)ー步的深入研究。為此，我們在前期結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行小型化改造，去除非活性區(qū)域，保留免疫刺激功能區(qū)域。小分子的改造體蛋白較改造前將具有更好的生理屏障穿透性和更小的血清學(xué)反應(yīng)特性，毒性更低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種小分子超抗原改造體蛋白及其編碼基因與制備和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述的小分子超抗原改造體蛋白具有序列表SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4或SEQID NO 6的氨基酸序列。所述的小分子超抗原改造體蛋白的編碼基因具有序列表SEQ ID NO USEQ IDNO 3或SEQ ID NO 5的喊基序列。所述的小分子超抗原改造體蛋白的制備方法為(I)以具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對 Fl :5，-GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG -3，和 Rl :5，-CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’，PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列的sagl突變基因；以具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對F2 :5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 Rl :5’ -CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’，PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 3中堿基序列的sag2突變基因；以具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對Fl :5’ -GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG-3’ 和 R2 :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’，PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 5中堿基序列的sag3突變基因；(2)將以上突變基因sagl、sag2或sag3克隆入表達(dá)載體pET_28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，構(gòu)建成基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后得到小分子超抗原改造體蛋白。步驟2)中所述的誘導(dǎo)是以終濃度為lmmol/L異 丙基-β-D-硫代卩比喃半乳糖苷(IPTG)為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。步驟2)中所述的蛋白分離純化采用Ni親和層析法，層析時所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠樹脂，洗脫液成分為IOmM Tirs-HCl，O. 5Μ NaCl,250mM咪唑，pH = 7. 9。所述的小分子超抗原改造體蛋白可作為抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)類的前體藥物的活性成分。本發(fā)明所具有如下優(yōu)點I.本發(fā)明為人工構(gòu)建的系列編碼小分子超抗原改造體蛋白的核苷酸序列，獲知其基因全序列的組成。2.本發(fā)明利用PCR技術(shù)，克隆編碼小分子超抗原改造體蛋白的核苷酸基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的小分子超抗原改造體蛋白經(jīng)檢驗具有超抗原的生物學(xué)活性；應(yīng)用本發(fā)明，可提供直接用于生產(chǎn)該超抗原突變蛋白的基因工程菌株。3.本發(fā)明構(gòu)建并獲得的小分子超抗原改造體蛋白分子量較改造前顯著降低，具有更好的生理屏障穿透能力，更低的血清反應(yīng)性，更小的毒副作用，并保持了較高的腫瘤抑制活性，因此更具有用于臨床腫瘤治療的前景。4.本發(fā)明提供的小分子超抗原改造體蛋白制備方法，能夠在人工控制的條件下，使該蛋白獲得高效表達(dá)及純化，能滿足エ業(yè)化生產(chǎn)的需要。


圖I為本發(fā)明實施例2中小分子超抗原改造體蛋白基因的PCR產(chǎn)物核酸電泳圖譜。(其中M代表DL2000marker, 1、2、3分別代表具有序列表SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5中核苷酸序列的基因sagl, sag2和sag3的PCR產(chǎn)物。)圖2為本發(fā)明實施例3中小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白純品的電泳圖譜。(其中M代表蛋白marker，1、2、3代表具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :4和SEQ IDNO 6中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl，SAG2和SAG3純品。)圖3為本發(fā)明實施例4小分子超抗原改造體蛋白SAGl的超抗原活性檢測實驗結(jié)果圖。(橫坐標(biāo)為本發(fā)明小分子超抗原改造體蛋白SAGl和陽性對照SEC2，縱坐標(biāo)為增值指數(shù)。)圖4為本發(fā)明實施例5小分子超抗原改造體蛋白SAGl的抑瘤活性檢測結(jié)果圖。(其中橫坐標(biāo)為陰性對照牛血清白蛋白(BSA)、本發(fā)明小分子超抗原改造體蛋白SAGl和陽性對照SEC2 ;縱坐標(biāo)為抑瘤率。)圖5為本發(fā)明實施例6中小分子超抗原改造體蛋白SAGl的熱源檢測結(jié)果圖。(其中橫坐標(biāo)為小分子超抗原改造體蛋白SAGl和陽性對照SEC2作用時間；縱坐標(biāo)為體溫變化情況。)
圖6為本發(fā)明實施例7中小分子超抗原改造體蛋SAGl的三維結(jié)構(gòu)示意圖(蛋白空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊組成，ニ硫環(huán)結(jié)構(gòu)暴露在蛋白分子表面)。圖7為本發(fā)明實施例7中小分子超抗原改造體蛋SAG2的三維結(jié)構(gòu)示意圖(蛋白空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊組成，ニ硫環(huán)結(jié)構(gòu)暴露在蛋白分子表面)。圖8為本發(fā)明實施例7中小分子超抗原改造體蛋SAG3的三維結(jié)構(gòu)示意圖(蛋白空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊組成，ニ硫環(huán)結(jié)構(gòu)暴露在蛋白分子表面)。
具體實施例方式實施例II)具有序列表SEQ ID NO USEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5中堿基序列的 小分子
超抗原改造體蛋白基因
具有序列表SEQ ID NO :1喊基序列的小分子超抗原改造體蛋白基因001 tcaagtgagt ttactggtac gatgggtaat atgaaatatt tatatgatga051 tcattatgta tcagcaacta aagttatgtc tgtagataaa tttttggcac101 atgatttaat ttataacatt agtgataaaa aactaaaaaa ttatgacaaa151 gtgaaaacag agttattaaa tgaagattta gcaaagaagt acaaagatga201 agtagttgat gtgtatggat caaattacta tgtaaactgc tatttttcat251 ccaaagataa tgtaggtaaa gttacaggtg gtaaaacttg tatgtatgga301 ggaataacaa aacatgaagg aaaccacttt gataatggga acttataaSEQ ID NO. I的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度348堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO :3減基序列的小分子超抗原改造體蛋白基因001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt051 tactggtacg atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat101 cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt151 tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg251 tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat301 gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa351 acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttataaSEQ ID NO. 3的信息(參見序列表)
(a)序列特征*長度387堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否

(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO :5減基序列的小分子超抗原改造體蛋白基因001 tcaagtgagt ttactggtac gatgggtaat atgaaatatt tatatgatga051 tcattatgta tcagcaacta aagttatgtc tgtagataaa tttttggcac101 atgatttaat ttataacatt agtgataaaa aactaaaaaa ttatgacaaa151 gtgaaaacag agttattaaa tgaagattta gcaaagaagt acaaagatga201 agtagttgat gtgtatggat caaattacta tgtaaactgc tatttttcat251 ccaaagataa tgtaggtaaa gttacaggtg gtaaaacttg tatgtatgga301 ggaataacaa aacatgaagg aaaccacttt gataatggga acttacaaaa351 tgtacttata agagtttatg aaaataaaag aaacacaatt tcttttgaag401 tgcaaactga taagaaaagt gtaacagctc aagaactaga cataaaagct451 aggaattttt taattaataa aaaaaatttg tatgagttta acagttcacc501 atatgaaaca ggatatataa aatttattga aaataacggc aatacttttt551 ggtatgatat gatgcctgca ccaggcgata agtttgacca atctaaatat601 ttaatgatgt acaacgacaa taaaacggtt gattctaaaa gtgtgaagat651 agaagtccac cttacaacaa agaatggata aSEQ ID NO. 5的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度681堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 7減基序列的SEC2全基因sec2001 gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat041 caagtgagtt tactggtacg atgggtaata tgaaatattt081 atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct121 gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta
161 gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga201 gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa241 gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct281 atttttcatc caaagataat gtaggtaaag ttacaggtgg321 taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga361 aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa401 gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt441 gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac 481 ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt521 atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag gatatataaa561 atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg601 atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt641 taatgatgta caacgacaat aaaacggttg attctaaaag681 tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa(a)序列特征*長度720堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)2)具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO :2氣基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白001 SSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDK051 VKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVGKVTGGKTCMYG101 GITKHEGNHFDNGNLSEQ ID NO. 2的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度115個氨基酸*類型肽鏈*鏈型單鏈(C)假設(shè)否⑷反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO :4氣基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白001 ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLI
051 YNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDN101VGKVTGGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLSEQ ID NO. 4的信息(參見序列表)
(a)序列特征*長度128個氨基酸*類型肽鏈*鏈型單鏈(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO :6氣基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白001 SSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDK051 VKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVGKVTGGKTCMYG101 GITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELDIKA151 RNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFWYDMMPAP⑶KFDQSKY201 LMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNGSEQ ID NO. 6的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度226個氨基酸*類型肽鏈*鏈型單鏈(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)實施例2小分子超抗原改造體蛋白基因的PCR擴(kuò)增I)金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)，取I. 5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA (基因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)。2) PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primerf. O設(shè)計如下所示的端引物及表一中所示的突變引物F2 :5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，R2 :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3’所用引物均由invitrogen生物技術(shù)公司合成。以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物F2和R2擴(kuò)增出具有列表SEQ ID NO. 7堿基序列的SEC2全基因sec2 ；具有序列表SEQ ID NO 1中核苷酸序列的基因sagl，采用Fl :5’-GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG-3’ 和 R I :5’ -CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’ 的引物.通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ IDNO 1序列表中基因片段；具有序列表SEQ ID NO 3中核苷酸序列的基因sag2，采用F2和Rl的引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ ID NO 3序列表中基因片段；具有序列表SEQ ID NO 5中核苷酸序列的基因sag3，采用Fl和R2的引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ ID NO 5序列表中基因片段；基因片斷的PCR反應(yīng)體系為10XPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5 μ l、dNTP4uL、上下游引物各20pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA IOOng, Pfu DNA聚合酶2U，無菌超純水補(bǔ)齊體積至50 μ I?；蚱瑪嗟腜CR反應(yīng)條件為第一階段95°C，5分鐘； 第二階段94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，90 秒；共 30 個循環(huán)；第三階段72 °C，10分鐘；3)小分子超抗原改造體蛋白基因的鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析并分離，，結(jié)果參見附圖1，如圖I所示，通過PCR擴(kuò)增得到了編碼小分子超抗原改造體蛋白的基因產(chǎn)物，大小與理論值相符，切下大小分別為348bp、387bp和681bp的基因片段，按博大泰克生物技術(shù)公司膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；回收產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成編碼小分子超抗原改造體蛋白基因克隆載體pGEM-T-sagl、pGEM_T-sag2和pGEM-T-sag3。連接反應(yīng)根據(jù)Promega公司產(chǎn)品pGEM_T試劑盒使用說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R. E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美國紐約John ffiley&Sons出版社1995年第三版P39-40),篩選陽性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測定DNA序列。實施例3小分子超抗原改造體蛋白的表達(dá)I)小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建分別將基因克隆載體 pET-28a_sagl、pET-28a_sag2 和 pET_28a_sag3 質(zhì)粒 DNA 以 EcoRI、XhoI 雙酶切，分別膠回收試劑盒回收序列表SEQ ID NO USEQ ID NO :3和SEQID NO :5中的小分子超抗原改造體蛋白基因。以T4DNA連接酶分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體 pET-28a-sag I、pET_28a_sag2 和 pET_28a_sag3。轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端終止法測序鑒定正確重組克隆。2)小分子超抗原改造體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化接種轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體質(zhì)粒的BL2KDE3)單菌落于含50 μ g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活化培養(yǎng)，以1% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接下ー級，37°C搖床培養(yǎng)至0D_為O. 6，加入終濃度I. OmmoI/L的IPTG (購自上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，30°C誘導(dǎo)表達(dá)4小吋。分別離心收集菌體，并將各收集的菌體重懸于1/5體積的平衡緩沖液(IOmMTirs-HCl，O. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 9)，分別采用Ni親和層析柱進(jìn)行純化，將逐依洗脫下目的產(chǎn)物既具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白基因編碼蛋白；純化時以O(shè). 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含40mM咪唑(imidazole)的漂洗緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mM Tirs-HCl, O. 5M NaCl，250mM咪唑，pH7. 9)洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白大小及純度，結(jié)果參見附圖2所示，由圖2可知，通過Ni親和層析柱純化，獲得了具有序列表SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO:6中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAG1、SAG2和SAG3純品，能夠滿足后續(xù)生物學(xué)活性實驗要求。實施例4刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞増殖活性檢測取SPF級純系小鼠Balb/c (購自北京華阜康生物科技股份有限公司)，通過頸椎處死后在無菌條件下取其脾臟，輕輕壓碎后過200目篩網(wǎng)。然后將過篩網(wǎng)后的細(xì)胞懸液在1000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min收集細(xì)胞沉淀，用5mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置5min后于1000rpm/min離心5min。再以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)清洗細(xì)胞1-2次，最后用含10% (V/V)胎牛血清FBS(購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以8X IO5Cells/孔加到96孔板中。將經(jīng)純化的具有序列表SEQ ID NO 2中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl分別以1000、100U0ng/ml的終濃度加入各孔。以SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)72h后，加入30ul/孔的MTT液(購自遼寧博奧春天生物科技有限公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1500r/min離心5分鐘后棄上清培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，加入濃度為120ul/well的ニ甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值，結(jié)果參見附圖3，由圖3可知，具有序列表SEQ ID NO :2中気基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl保留了超抗原活性。實施例5小分子超抗原改造體蛋白的抗腫瘤活性檢測將小鼠肝癌細(xì)胞H印al_6(購自ATCC，由本實驗室傳代保存)傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，將消化后的細(xì)胞用含10% (V/V)FBS的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為2X105cellS/mL的單細(xì)胞懸液，然后以I X IO4ceIls/孔培養(yǎng)在96孔板。將按實施例3中方法分離獲得的小鼠脾淋巴細(xì)胞以2X105cells/well加入到上述含有L929細(xì)胞的96孔板中，使效靶比達(dá)到20 I (細(xì)胞數(shù)之比)。然后將純化的具有序列表SEQ ID N0:2中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl分別以終濃度1000、100、10ng/ml加入各孔。以BSA作為陰性對照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，并設(shè)腫瘤細(xì)胞對照孔、淋巴細(xì)胞自然釋放孔及調(diào)零孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。按常規(guī)條件培養(yǎng)72h，加入30ul/well的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1000r/min離心收集細(xì)胞，加入濃度為120ul/well的ニ甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值，結(jié)果參見附圖4，由圖4可知，微量的小分子超抗原改造體蛋白SAGl可有效地抑制小鼠肝癌細(xì)胞的生長，與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比未顯著降低。實施例6小分子超抗原改造體蛋白致熱活性的檢測選擇新西蘭大白兔(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)作為發(fā)熱實驗的動物模型，實驗前連續(xù)測定直腸溫度90min以上，篩選溫度始終保持在38. 6to 39. 5°C之間的、兔子用于進(jìn)一歩實驗。對實驗動物分組，每組三只。通過靜脈注射的方式分別將經(jīng)純化的具有序列表SEQ ID NO 2中氨基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl和SEC2標(biāo)準(zhǔn)品以10 μ g/kg的劑量進(jìn)行注射，以無菌PBS作為陰性對照。通過直腸溫度測量儀對實驗兔子的溫度變化連續(xù)監(jiān)測3h，并記錄每ー時間段的溫度值。最終溫度值以測定溫度減去初始溫度值表示。體溫超過O. 5°C被認(rèn)為有發(fā)燒效應(yīng)。結(jié)果參見圖5，由圖5可知，顯示具有序列表SEQ ID NO 2中基酸序列的小分子超抗原改造體蛋白SAGl的致熱效應(yīng)與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比有顯著降低。實施例7小分子超抗原改造體蛋白的分子三維結(jié)構(gòu)分析分別經(jīng)過Ni親和層析純化的小分子超抗原改造體蛋白純品SAG1、SAG2和SAG3，經(jīng)分子排阻和離子交換法再次純化并超濾濃縮(方法參考分子克隆實驗指南第三版(薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)。在室溫下通過懸滴法獲得小分子超抗原改造體蛋白的晶體。以稀疏矩陣采樣法確定結(jié)晶條件。最終的結(jié)晶條件如下小分子超抗原改造體 蛋白溶液(20mg/ml)和等體積的母液(O. IM Tris-HCl (pH 7. 4)，O. 08M 醋酸鎂，26% (w/v)聚こニ醇6000)混合，約15-18天時出現(xiàn)晶體。用多波長反常散射法(MAD)確定位相，MAD數(shù)據(jù)在ADSC Quantum-4R CXD探測器上收集，所有數(shù)據(jù)用DPS軟件包進(jìn)行統(tǒng)一，用CCP4軟件包進(jìn)行坐標(biāo)修正與處理。模型用XtalView 4. O軟件在SiliconGraphics OCTANE上構(gòu)建和校正，用REFMAC程序進(jìn)行精化。小分子超抗原改造體蛋白SAGl的三維結(jié)構(gòu)參見圖6 ;小分子超抗原改造體蛋白SAG2的三維結(jié)構(gòu)參見圖7 ;小分子超抗原改造體蛋白SAG3的三維結(jié)構(gòu)參見圖8(其結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊組成，ニ硫環(huán)結(jié)構(gòu)暴露在蛋白分子表面)。
權(quán)利要求
1.ー種小分子超抗原改造體蛋白，其特征在于其具有序列表SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
2.—種權(quán)利要求I所述的小分子超抗原改造體蛋白的編碼基因，其特征在于其具有序列表 SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:5 的堿基序列。
3.—種權(quán)利要求I所述的小分子超抗原改造體蛋白的制備方法，其特征在于 (1)以具有序列表SEQID N0:7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對Fl:5’- GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG -3’和 Rl: 5’- CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’，PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO: I中堿基序列的sagl突變基因； 以具有序列表SEQ ID NO:7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對F2:5’_ CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA _3’和 Rl: 5’_ CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG -3'PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO: 3中堿基序列的sag2突變基因； 以具有序列表SEQ ID NO: 7中堿基序列的SEC2全基因sec2為模板，采用引物對Fl:5’- GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG -3’和 R2: 5’- TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG -3’，PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO: 5中堿基序列的sag3突變基因； (2)將以上突變基因sagl、sag2或sag3克隆入表達(dá)載體pET_28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，構(gòu)建成基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后得到小分子超抗原改造體蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子超抗原改造體蛋白的制備方法，其特征在于步驟2)中所述的誘導(dǎo)是以終濃度為lmmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子超抗原改造體蛋白的制備方法，其特征在于步驟2)中所述的蛋白分離純化采用Ni親和層析法，層析時所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠樹脂，洗脫液成分為 IOmM Tirs-HCl, O. 5Μ NaCl，250mM 咪唑，ρΗ=7· 9。
6.一種權(quán)利要求I所述的小分子超抗原改造體蛋白的應(yīng)用，其特征在于其可作為抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)類的前體藥物的活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體地說是涉及一種小分子超抗原改造體蛋白及其編碼基因與制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種小分子超抗原改造體蛋白及其編碼基因與制備和應(yīng)用。所述的小分子超抗原改造體蛋白具有序列表SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列。所述小分子超抗原改造體蛋白的編碼基因具有序列表SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5的堿基序列。
文檔編號C12N15/31GK102718847SQ20111007900
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者周雋逸, 張惠文, 徐明愷, 楊宏麗, 陳艷 申請人:沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司