新型wnt組合物和該組合物的治療用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有提高溶解性和改善類生物藥物性能的新型Wnt多肽，以及編碼本發(fā)明的Wnt多肽的多聚核苷酸。本發(fā)明的Wnt多肽在治療方面可用在如例如預(yù)防或治療肌肉損失和/或促進(jìn)肌肉肥大和生長的方法中。
【專利說明】新型WNT組合物和該組合物的治療用途
[0001]關(guān)于序列表的聲明
[0002]提供以文本格式替代紙質(zhì)副本的本申請的序列表，據(jù)此通過引用并入說明書。包含序列表的文本文件的名稱為FATE_095_00W0_ST25.txt。文本文件的大小為124KB，創(chuàng)建于2011年I月11日并通過EFS-Web系統(tǒng)電子提交。
[0003]相關(guān)申請的交叉引用
[0004]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)的規(guī)定，要求2012年I月11日提交的美國臨時(shí)專利申請第61/431，701號的權(quán)益，通過引用將其整體并入本文。
[0005]背景
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0006]本發(fā)明大體涉及新型Wnt組合物及利用所述新型Wnt組合物的治療方法。本發(fā)明的fct多肽及其組合物在治療方面可用于，例如通過促進(jìn)干細(xì)胞擴(kuò)增和肌肉肥大促進(jìn)肌肉再生。
_7] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0008]Wnt基因家族編碼二十多種富含半胱氨酸的分泌型Wnt信號糖蛋白，這些蛋白通過結(jié)合靶細(xì)胞上的佛力子(Fzd)受體而 起作用。佛力子受體是G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白家族。fct家族的不同成員與Fzd家族某些成員的結(jié)合可通過數(shù)條不同通路之一啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在“經(jīng)典通路”中，信號分子散亂蛋白(Disheveled)的激活導(dǎo)致糖原合成酶激酶_3(GSK-3 β )的失活，所述糖原合成酶激酶-3是一種胞質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶。GSK-3 β的革巴標(biāo)β -連環(huán)蛋白進(jìn)而被穩(wěn)定并易位至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中，β -連環(huán)蛋白激活特定啟動(dòng)子的TCF (Τ-細(xì)胞因子)依賴型轉(zhuǎn)錄(Wodarz，1998，Dierick, 1999)?！胺墙?jīng)典”Wnt通路激活包括Wnt和Fzd間的一組相互作用，其可激活Ca2+通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和可能的PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Rho通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及平面細(xì)胞極性(PCP)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0009]Wnt是分泌型糖蛋白，其作為在多種原始細(xì)胞類型中有活性的旁分泌或自分泌信號而起作用。雖然fct蛋白從細(xì)胞中分泌，但是發(fā)現(xiàn)它們是疏水的，并且通過在保守的半胱氨酸殘基和保守的絲氨酸殘基處添加脂質(zhì)部分進(jìn)行翻譯后修飾。這些脂質(zhì)修飾對fct蛋白的生物活性和分泌的重要性被廣泛接受。然而，去垢劑脂化和脂化fct的低溶解性與配制過程中沒有使用去垢劑時(shí)的低產(chǎn)率有關(guān)，從而出現(xiàn)了 Wnt臨床規(guī)模生產(chǎn)的獨(dú)特挑戰(zhàn)。因此，盡管Wnt在多種臨床環(huán)境的治療應(yīng)用中具有巨大潛力，但Wnt的治療潛力由于Wnt的不溶性以及相應(yīng)的不足以作為純化的、生物活性制劑生產(chǎn)而未被充分了解。
[0010]因此，該領(lǐng)域需要保留Wnt生物活性的可溶的、新型Wnt多肽，產(chǎn)生臨床規(guī)模的新型fct的方法以及使用新型Wnt促進(jìn)組織形成、再生、維持和修復(fù)的方法。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本發(fā)明提供修飾的Wnt多肽，其包含降低Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在【具體實(shí)施方式】中，所述Wnt多肽包含降低Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代。[0013]在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽為激活非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Wnt多肽。
[0014]在【具體實(shí)施方式】中，激活非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Wnt多肽選自:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b、和 Wntll。
[0015]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，多肽是Wnt7a或Wnt5a多肽。
[0016]在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了修飾的Wnt7a多肽，其相對于對應(yīng)SEQ ID NO:2和6-11中任一個(gè)的Wnt7a多肽的脂化具有降低的脂化。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的修飾的Wnt7a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:2和6_11中任一個(gè)的第73位的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的fct7a多肽在相應(yīng)于SEQ IDNO:2和6-11中任一個(gè)的第206位的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供的Wnt7a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:2和6_11中任一個(gè)的第73位和第206位的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。
[0017]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的Wnt7a多肽在相應(yīng)于SEQ ID N0:2和6_11中任一個(gè)的第73位或第206位的氨基酸位置處包含丙氨酸。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的Wnt7a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:2和6_11中任一個(gè)的第73位和第206位的氨基酸位置處包含丙氨酸。本發(fā)明還提供了包含本文中任一實(shí)施方式的組合物，其中所述fct7a多肽是人或小鼠fct7a多肽。
[0018]在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了修飾的Wnt5a多肽，其相對于對應(yīng)SEQ ID NO:15和19-23中任一個(gè)的Wnt5a多肽的脂化具有降低的脂化。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的修飾的Wnt5a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:15和19-23中任一個(gè)的第104位的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的fct5a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:15和19-23中任一個(gè)的第244位的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供的Wnt5a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO: 15和19-23中任一個(gè)的位置104和244的氨基酸位置處包含氨基酸缺失、插入、或取代。
[0019]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的Wnt5a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:15和19-23中任一個(gè)的第104位或第244位的氨基酸位置處包含丙氨酸。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的Wnt5a多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO:15和19-23中任一個(gè)的第104位和第244位的氨基酸位置處包含丙氨酸。本發(fā)明還提供了包含本文中任一實(shí)施方式的組合物，其中所述fct5a多肽是人或小鼠fct5a多肽。
[0020]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的Wnt多肽包含SEQ ID NO:3_5、12-13和16-18中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
[0021]在多個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明部分地關(guān)注包含Wnt多肽的融合多肽，所述Wnt多肽包含SEQ ID NO:3-5,12-13和16-18中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方式中，融合多肽包含天然信號肽、異源信號肽、或天然和異源信號肽的雜交體。
[0023]在【具體實(shí)施方式】中，異源信號肽選自:CD33信號肽、免疫球蛋白信號肽、生長激素信號肽、紅細(xì)胞生成素信號肽、白蛋白信號肽、分泌型堿性磷酸酶信號肽、和病毒性信號肽。
[0024]在某些實(shí)施方式中，異源信號肽為⑶33信號肽、IgGK信號肽、或IgGy信號肽。
[0025]在其他實(shí)施方式中，融合多肽包含異源蛋白酶切割位點(diǎn)。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中，異源蛋白酶切割位點(diǎn)選自:煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切割位點(diǎn)、肝素切割位點(diǎn)、凝血酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)和因子Xa切割位點(diǎn)。
[0027]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，融合多肽包含選自以下的表位標(biāo)簽:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位、和HA表位。
[0028]在【具體實(shí)施方式】中，融合多肽包含SEQ ID NO: 3_5和12_13中任一個(gè)所示的氨基酸序列，相較于SEQ ID NO:2和6-11所示的相應(yīng)的天然Wnt多肽，其具有增加的產(chǎn)量、分泌、或溶解性。
[0029]在某些實(shí)施方式中，融合多肽包含SEQ ID NO: 16_18中任一個(gè)所示的氨基酸序列，相較于SEQ ID NO: 15和19-23所示的相應(yīng)的天然Wnt多肽，其具有增加的產(chǎn)量、分泌、或溶解性。
[0030]本發(fā)明還提供編碼Wnt多肽的多聚核苷酸，所述Wnt多肽具有降低Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明的一些實(shí)施方式提供了包含編碼fct多肽的多聚核苷酸的載體，所述fct多肽具有降低Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明還提供了包括此類載體的宿主細(xì)胞,和所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的fct多肽。
[0031]本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的Wnt多肽、多聚核苷酸和載體的組合物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物包含藥學(xué)可接受的鹽、載體、或賦形劑，并且在一些實(shí)施方式中，所述組合物在水溶液中可溶。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述組合物配制為用于注射。在某些實(shí)施方式中，配制所述組合物無需去垢劑。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述組合物的配制基本上不存在去垢劑。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，配制的組合物基本上不含去垢劑。在更具體的實(shí)施方式中，所述組合物配制為用于靜脈注射、心內(nèi)注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射、或肌肉內(nèi)直接注射中的一種或多種。
[0032]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述組合物促進(jìn)組織形成、再生、維持或修復(fù)。在【具體實(shí)施方式】中，所述組織為肌肉，并且在更具體的實(shí)施方式中，所述肌肉為骨骼肌、心肌、或平滑肌。
[0033]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物促進(jìn)干細(xì)胞擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，并且在【具體實(shí)施方式】中，成體干細(xì)胞是衛(wèi)星干細(xì)胞。
[0034]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物促進(jìn)肌肉肥大或防止萎縮。
[0035]本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防肌肉損失的方法，其包括給予個(gè)體具有Wnt多肽的組合物，所述fct多肽包含降低Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述組合物包含藥學(xué)可接受的鹽、載體、或賦形劑，并且在【具體實(shí)施方式】中，所述組合物在水溶液中可溶。在其他【具體實(shí)施方式】中，所述組合物配制為用于注射，并且在更具體的實(shí)施方式中，所述組合物配制為用于靜脈注射、心內(nèi)注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射、或肌肉內(nèi)直接注射中的一種或多種。
[0036]在某些實(shí)施方式中，配制所述組合物無需去垢劑。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述組合物的配制基本上不存在去垢劑。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，配制的組合物基本上不含去垢劑。
[0037]在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方式中，所述個(gè)體患有影響肌肉的疾病或病癥或有患影響肌肉的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。在【具體實(shí)施方式】中，所述疾病是退行性疾病，并且在更具體的實(shí)施方式中，退行性疾病是肌營養(yǎng)不良。在更加具體的實(shí)施方式中，所述肌營養(yǎng)不良選自:杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)、埃默里一德賴富斯肌營養(yǎng)不良、蘭迪二氏肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)、肢帶型肌營養(yǎng)不良、von Graefe-Fuchs型肌營養(yǎng)不良、眼咽型肌營養(yǎng)不良(OPMD)、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(斯太納特病)和先天性肌營養(yǎng)不良。
[0038]在所述方法的其他實(shí)施方式中，所述影響肌肉的疾病或病癥是消耗病、肌肉衰減、肌肉萎縮、ICU誘發(fā)性虛弱、持續(xù)廢用、手術(shù)誘發(fā)性虛弱、或肌肉退行性疾病。在更具體的實(shí)施方式中，所述病癥為便隨肌肉廢用、固定、手術(shù)誘發(fā)性虛弱、或損傷的肌肉萎縮。
[0039]在一些實(shí)施方式中，給予所述組合物促進(jìn)肌肉萎縮。在【具體實(shí)施方式】中，所述肌肉是骨骼肌或心肌。
[0040]在本發(fā)明方法的其他實(shí)施方式中，給予所述組合物促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1顯示的是全部19種人Wnt多肽序列的ClustalW比對。保守的可能的翻譯后脂化位點(diǎn)用灰色陰影標(biāo)出并與人fct7a的半胱氨酸73和絲氨酸206比對。被認(rèn)為是糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺殘基用下劃線示出。
[0042]圖2顯示的是來自多種物種的保守Wnt7a多肽序列的ClustalW比對。
[0043]圖3顯示的是用非經(jīng)典Wnt刺激下的成肌細(xì)胞肥大。圖3a顯示的是非經(jīng)典Wnt處理(Wnt7a)刺激的體外成肌細(xì)胞肥大的代表圖。圖3b顯示的是某些Wnt處理誘發(fā)的體外成肌細(xì)胞纖維肥大的數(shù)據(jù)。每個(gè)處理組的3個(gè)生物重復(fù)中的每個(gè)當(dāng)中計(jì)數(shù)100條纖維并顯示微米下的個(gè)體計(jì)數(shù)和重復(fù)的中位數(shù)。
[0044]圖4顯示的是多種構(gòu)建Wnt7a變體的示意圖。白色顯示的是野生型人Wnt7a序列，如圖所示，導(dǎo)致氨基酸變化的特定點(diǎn)突變的變體用帶有氨基酸變化的白色顯示?；疑幱爸甘镜氖翘烊淮嬖趂ct7a的分泌信號肽用人IgG K鏈信號肽替換。如圖所示，免疫球蛋白Fe區(qū)的氨基或羧基端融合體用接頭區(qū)構(gòu)建成。
[0045]圖5顯示的是哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞表達(dá)和分泌的Wnt7a的SDS-PAGE、Western印跡。具有⑶33或IgG κ鏈的外源分泌信號肽的Wnt多肽增加的表達(dá)和隨后的分泌可清楚地從具有天然信號肽的fct多肽上看出。
[0046]圖6顯示的是高效液相色譜法(HPLC)追蹤檢測溶液中的去垢劑CHAPS。圖6a顯示的是在磷酸鹽緩沖液中校正系統(tǒng)的CHAPS標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6b顯示的是與來自R&D系統(tǒng)的商購蛋白(商業(yè)蛋白包含引起第二大峰的載體蛋白)相比，在1%CHAPS中配制的修飾的Wnt多肽制品。圖6c顯示的是，如圖所示，透析4和20小時(shí)從Wnt多肽制劑中有效去除CHAPS。
[0047]圖7顯示的是成肌細(xì)胞肥大測定，其展示了在存在或不存在去垢劑的情況下配制的Wnt7a變體的活性。Wnt蛋白由IgGK分泌信號肽構(gòu)建而成。蛋白在HEK293哺乳動(dòng)物培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生并親和純化。蛋白在具有1%CHAPS去垢劑的PBS中配制而成。每種蛋白變體的等分試樣通過透析去除去垢劑來重新配制。蛋白具有等摩爾濃度并應(yīng)用于C2C12肥大測定。
[0048]圖8顯示的是測定用編碼本文其他地方所述的修飾的人Wnt7a多肽、野生型人Wnt7a或LacZ對照的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔的小鼠脛骨前肌(TA)肌肉平均纖維直徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0049]圖9顯示的是測定用編碼本文其他地方所述的修飾的人Wnt7a多肽的表達(dá)質(zhì)粒或鹽水對照電穿孔小鼠脛骨前肌(TA)肌肉重量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0050]圖10顯示的是測定用編碼本文其他地方所述的修飾的人Wnt7a多肽、野生型人Wnt7a或LacZ對照的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔小鼠脛骨前肌(TA)肌肉中Pax7+衛(wèi)星干細(xì)胞數(shù)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0051]圖11是免疫球蛋白Fe融合蛋白。圖1Ia顯示用免疫球蛋白κ中的信號肽取代其天然分泌信號肽并構(gòu)建為免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域融合蛋白的Wnt7a蛋白的Western印跡。圖1la中顯示與單獨(dú)的Fe結(jié)構(gòu)域?qū)φ障啾鹊牟溉閯?dòng)物培養(yǎng)系統(tǒng)的分泌。圖1lb顯示利用抗-Wnt7a檢測抗體通過SDS-PAGEWestern印跡得到的Wnt7a和Wnt7a_Fc融合蛋白間的相對分子量差異。
[0052]序列表簡要說明
[0053]SEQ ID NO:1 示出了人 Wnt7a 的 cDNA 序列。
[0054]SEQ ID NO: 2示出了由SEQ ID NO:1編碼的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0055]SEQ ID N0:3示出了 SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第73位具有丙氨酸突變。
[0056]SEQ ID N0:4示出了 SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第206位具有丙氨酸突變。
[0057]SEQ ID N0:5示出了 SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第73位和第206位具有丙氨酸突變。
[0058]SEQ ID NO:6示出了小鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0059]SEQ ID NO: 7示出了大鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0060]SEQ ID N0:8示出了雞Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0061]SEQ ID N0:9示出了斑馬魚Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 10示出了豬Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0063]SEQ ID NO: 11示出了牛Wnt7a多肽的氨基酸 序列。
[0064]SEQ ID NO: 12示出了人免疫球蛋白κ鏈的信號肽取代天然分泌信號肽的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0065]SEQ ID NO: 13示出了在氨基酸第73位和第206位處具有丙氨酸突變的、并用人免疫球蛋白κ鏈的信號肽取代天然分泌信號肽的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO: 14 示出了人 Wnt5a 的 cDNA 序列。
[0067]SEQ ID N0:15示出了由SEQ ID NO: 14編碼的人Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0068]SEQ ID N0:16示出了 SEQ ID NO: 15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第104位具有丙氨酸突變。
[0069]SEQ ID N0:17示出了 SEQ ID NO: 15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第244位具有丙氨酸突變。
[0070]SEQ ID N0:18示出了 SEQ ID NO: 15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第104位和第244位具有丙氨酸突變。
[0071]SEQ ID NO: 19示出了小鼠Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0072]SEQ ID NO: 20示出了大鼠Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0073]SEQ ID NO: 21示出了雞Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0074]SEQ ID NO: 22示出了斑馬魚Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0075]SEQ ID NO:23示出了牛Wnt5a多肽的氨基酸序列。
[0076]SEQ ID NO: 24示出了人Wntl多肽的氨基酸序列。[0077]SEQ ID NO: 25示出了人Wnt2多肽的氨基酸序列。
[0078]SEQ ID NO: 26示出了人Wnt2b多肽的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID NO: 27示出了人Wnt3多肽的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO: 28示出了人Wnt3a多肽的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID NO: 29示出了人Wnt4多肽的氨基酸序列。
[0082]SEQ ID NO: 30示出了人Wnt5b多肽的氨基酸序列。
[0083]SEQ ID NO: 31示出了人Wnt6多肽的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO: 32示出了人Wnt7b多肽的氨基酸序列。
[0085]SEQ ID NO: 33示出了人Wnt8a多肽的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID NO: 34示出了人Wnt8b多肽的氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO: 35示出了人Wnt9a多肽的氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO: 36示出了人Wnt9b多肽的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO: 37示出了人WntlOa多肽的氨基酸序列。
[0090]SEQ ID N0:38示出了 人WntlOb多肽的氨基酸序列。
[0091]SEQ ID N0:39示出了人Wntll多肽的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO:40示出了人Wntl6多肽的氨基酸序列。
[0093]SEQ ID NO: 41-46示出了寡聚核苷酸序列。
[0094]詳細(xì)描述
[0095]A.概述
[0096]雖然Wnt的翻譯后脂化被認(rèn)為是生物活性和蛋白分泌的需要，本發(fā)明提供新型fct多肽，其脂化氨基酸位點(diǎn)被改變使得不發(fā)生翻譯后脂化。本發(fā)明的蛋白保留Wnt生物活性，并且本發(fā)明因此提供了具有改善的類生物藥物性能，如增大的溶解性、產(chǎn)量和配方的修飾的fct組合物，以及該Wnt組合物的治療用途。本發(fā)明提供了對由fct多肽的不溶性引起的問題的新的解決方案，并進(jìn)一步地提供了適用于臨床規(guī)模生產(chǎn)和治療應(yīng)用的包括融合多肽在內(nèi)的創(chuàng)新的fct多肽。本發(fā)明的Wnt組合物的治療用途包括，例如，促進(jìn)組織形成、再生、修復(fù)和維持。
[0097]除非有明確的相反指示，在本發(fā)明的實(shí)施采用化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、DNA重組技術(shù)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)的領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法，為了說明的目的，其中有許多在下面描述。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋。參見，例如，Sambrook，etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989);Maniatis etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008 年 7 月修正)；ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Pub.Associates and ffiley-1nterscience;Glover, DNACloning:A Practical Approach, vol.1 & II (IRL Press, Oxford, 1985) ;Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press,NewYork, 1992);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins, Eds., 1984);Perbal, APractical Guide to Molecular Cloning (1984);和 Harlow and Lane, Antibodies, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998).[0098]在此引用的所有的出版物、專利和專利申請據(jù)此通過引用將其整體并入本文。
[0099]B.定義
[0100]除另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)普通技術(shù)人員所公知的相同含義。
[0101]雖然本發(fā)明的實(shí)施和測試中可使用任何與本文中所描述的相似或等同的方法和材料，但方法和材料的優(yōu)選實(shí)施方式在本文中描述。為了本發(fā)明的目的，下述術(shù)語做出如下定義。
[0102]本文使用的冠詞“一 (a) ”和“一個(gè)(an) ”和“所述(the) ”指該冠詞的語法對象為一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))。例如，“一元件(an element) ”指一個(gè)元件或多個(gè)元件。
[0103]如本文所用，術(shù)語“約”或“大約”指與參考的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長度相差多達(dá)30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長度。在具體實(shí)施方案中，術(shù)語“約”或“大約”在數(shù)值前時(shí)是指該數(shù)值加或減15%、10%、5%或1%的范圍。
[0104]如本文所用，術(shù)語“基本上”是指是參考值95%、96%、97%、98%、99%或100%的量、水平、濃度、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長度。例如，基本上不含一種物質(zhì)(如去垢劑)的組合物是95%、96%、97%、98%、99%或100%不含該指定物質(zhì)，或用常規(guī)方法無法測出該物質(zhì)。類似的含義可應(yīng)用于術(shù)語“不存在”，其指不存在特定物質(zhì)或組合物的組分。
[0105]如本文所用，術(shù)語“干細(xì)胞”是指這樣的細(xì)胞:該細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其能夠(1)長期自我更新，或能夠產(chǎn)生原始細(xì)胞的至少一個(gè)相同的拷貝，(2)在單細(xì)胞水平上分化成多種，并在某些情況下，僅分化成一種特化的細(xì)胞類型，以及(3)在體內(nèi)功能性再生組織。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能被細(xì)分為全能性(totipotent)、多潛能性(pluripotent)、多能性(multipotent)和寡能性 / 單能性(oligo/unipotent)。
[0106]如本文所用，術(shù)語“成體干細(xì)胞”是指在成熟有機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞。成體干細(xì)胞包括，但不限于，外胚層干細(xì)胞、內(nèi)胚層干細(xì)胞、中胚層干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞等。肌肉干細(xì)胞是傳統(tǒng)上被認(rèn)為時(shí)單能性的干細(xì)胞的例子，僅產(chǎn)生肌肉細(xì)胞。
[0107]如本文所用，術(shù)語“衛(wèi)星干細(xì)胞”是指一種產(chǎn)生如成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞的肌原性譜系細(xì)胞的成體干細(xì)胞類型。
[0108]如本文所用，術(shù)語“祖細(xì)胞”是指具有自我更新和分化成更多成熟細(xì)胞的能力、但定向于某個(gè)譜系的細(xì)胞(例如，造血祖細(xì)胞定向于血液譜系)，而干細(xì)胞不必有這樣的限制。成肌細(xì)胞是祖細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例，其可僅分化為一種類型的細(xì)胞，但其本身不是完全成熟或完全分化的。成肌細(xì)胞可分化為肌細(xì)胞。
[0109]如本文所用，術(shù)語“肌細(xì)胞”或“肌纖維”是指肌肉中發(fā)現(xiàn)的一種分化的細(xì)胞類型。每個(gè)肌細(xì)胞包含肌原纖維，所述肌原纖維是長鏈的肌小節(jié)，而肌小節(jié)是肌肉細(xì)胞收縮單位。多種特化型肌細(xì)胞:心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，具有本領(lǐng)域中已知的多種特性。
[0110]如本文所用，術(shù)語“自我更新”是指細(xì)胞具有產(chǎn)生沒有改變的子細(xì)胞并產(chǎn)生特化的細(xì)胞類型的獨(dú)特能力(潛能)。自我更新可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)。非對稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生一個(gè)與親本細(xì)胞相同的子細(xì)胞和一個(gè)不同于親本細(xì)胞并且是祖細(xì)胞或分化的細(xì)胞的子細(xì)胞。因此非對稱細(xì)胞分裂并不增加與親本細(xì)胞相同的子細(xì)胞的數(shù)量，而是維持親本細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量。相比之下，對稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)均與親本細(xì)胞相同的子細(xì)胞。因此對稱細(xì)胞分裂增加與親本細(xì)胞相同的細(xì)胞的數(shù)量，擴(kuò)增親本細(xì)胞群。在【具體實(shí)施方式】中，對稱細(xì)胞分裂與“細(xì)胞擴(kuò)增”互換使用。
[0111]如本文所用，術(shù)語“分化”是指細(xì)胞由此特化為一種特定功能的發(fā)育過程，例如，細(xì)胞獲得不同于原始細(xì)胞類型的一種或多種形態(tài)特征和/或功能。術(shù)語“分化”包括譜系定向和終末分化過程。例如，通過用免疫組織化學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他方法評估或監(jiān)測生物標(biāo)記物的存在與否可評估未分化或分化狀態(tài)。
[0112]如本文所用，術(shù)語“譜系定向”是指干細(xì)胞定向形成特定受限范圍的分化細(xì)胞類型的過程。譜系定向發(fā)生在，例如，干細(xì)胞在非對稱細(xì)胞分裂過程中產(chǎn)生祖細(xì)胞時(shí)。定向祖細(xì)胞通?？勺晕腋禄蚣?xì)胞分裂。
[0113]如本文所用，術(shù)語“終末分化”是指細(xì)胞最終分化成為成熟、完全分化的細(xì)胞。通常地，終末分化伴隨細(xì)胞周期的取消和增值停止。
[0114]如本文所用，術(shù)語“肌肉肥大”是指肌肉尺寸的增加，以及可包括個(gè)體纖維體積的增加和/或肌纖維的橫截面積的增加，而且還可包括每根肌纖維細(xì)胞核數(shù)量的增加。肌肉肥大還可包括整個(gè)肌肉體積和量的增加；然而，肌肉肥大可以與肌肉增生(其是肌纖維數(shù)量的增加)區(qū)別開。在一個(gè)實(shí)施方式中，肌肉肥大是指肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白收縮蛋白數(shù)量的增加。
[0115]如本文所用，術(shù)語“促進(jìn)”、“增強(qiáng)”、“刺激”或“增加”一般是指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的反應(yīng)相比，本發(fā)明的fct組合物產(chǎn)生或引起更強(qiáng)生理反應(yīng)(B卩，可測量的下游效應(yīng))的能力。一種此類可測量的生理反應(yīng)包括，但不限于，與非對稱細(xì)胞分裂相比對稱干細(xì)胞分裂的增加，例如，與正常、未處理的、或?qū)φ仗幚淼募∪饧?xì)胞相比衛(wèi)星干細(xì)胞的增加、和/或增加的肌肉肥大。例 如，生理反應(yīng)可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更高。在另一個(gè)非限制性的例子中，與正常、未處理的、或?qū)φ仗幚淼募∪庀啾龋憫?yīng)給予本發(fā)明的fct組合物的肌肉肥大可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%, 200% 或更高?！霸黾拥摹被颉霸鰪?qiáng)的”反應(yīng)通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”反應(yīng)，并可以包括為由媒介物(不存在試劑)或?qū)φ战M合物所產(chǎn)生反應(yīng)的1.1、1.2,1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(如，500倍、1000倍)(包括兩者之間和大于I的所有整數(shù)和小數(shù)、例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
[0116]如本文所用，術(shù)語“保留(retaining)”或“維持(maintaining)”，或“保留(retain)”或“維持(maintain)”一般是指本發(fā)明的Wnt組合物(即，修飾的Wnt組合物)產(chǎn)生或引起與天然存在fct氨基酸或核酸序列的Wnt組合物引起的反應(yīng)性質(zhì)相似的生理反應(yīng)(即，可測量的下游效應(yīng))的能力。例如，本發(fā)明的fct組合物表現(xiàn)出Wnt生物活性，并因此保留fct活性。本發(fā)明的組合物還產(chǎn)生與天然存在Wnt多肽引起的反應(yīng)性質(zhì)相似的生理反應(yīng)如肌肉肥大。引發(fā)相似生理反應(yīng)的本發(fā)明的fct組合物可以引發(fā)這樣的生理反應(yīng)，該生理反應(yīng)是包含天然存在fct氨基酸和核酸序列的組合物引發(fā)的生理反應(yīng)水平的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或約100%。
[0117]保留“天然存在Wnt7a活性”的修飾或改造的本發(fā)明的Wnt7a多肽是指具有降低蛋白脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、添加、缺失和/或取代的修飾的Wnt7a多肽，其中該多肽產(chǎn)生的生理反應(yīng)是對應(yīng)的天然存在fct7a多肽產(chǎn)生的生理反應(yīng)的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%生
理反應(yīng)。
[0118]保留“天然存在Wnt5a活性”的修飾或改造的本發(fā)明的Wnt5a多肽是指具有降低蛋白脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、添加、缺失、和/或取代的修飾的Wnt5a多肽，其中該多肽產(chǎn)生的生理反應(yīng)是對應(yīng)的天然存在fct5a多肽產(chǎn)生的生理反應(yīng)的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%生理反應(yīng)。
[0119]如本文所用，術(shù)語“減少”或“減低”，或“減輕”或“降低”或“減弱”通常是指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的反應(yīng)相比，本發(fā)明的fct組合物產(chǎn)生或引起更小的生理反應(yīng)(即下游的效應(yīng))的能力，例如減少細(xì)胞凋亡。在一實(shí)施方式中，減少可以是通常與細(xì)胞活力降低相關(guān)的基因表達(dá)的降低或細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的減少?！皽p少的”或“降低的”反應(yīng)通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”反應(yīng)，并可以包括為由媒介物(不存在試劑)或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的反應(yīng)的 1.1、1.2,1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30 倍或更多倍(例如，500 倍，1000 倍)(包括兩者之間和大于I的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的降低。
[0120]C.Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
[0121]Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是古老的、進(jìn)化的保守通路，其在發(fā)育和整個(gè)成年時(shí)期中調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極性、神經(jīng)模式和器官形成的重要方面。已鑒定的Fz受體下游的fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括經(jīng)典通路或Wnt/ β -連環(huán)蛋白依賴型通路以及非經(jīng)典通路或β -連環(huán)蛋白非依賴型通路，并可進(jìn)一步劃分為平面細(xì)胞極性、fct/Ca2+通路和其他通路。
[0122]Wnt蛋白結(jié)合佛力子(Fz)受體家族的細(xì)胞外半胱氨酸富集區(qū)N端，在人類當(dāng)中有十種Fz。Fz蛋白是與G-蛋白偶聯(lián)受體具有拓?fù)渫葱缘钠叽慰缒さ鞍?。此外，對于Wnt和Fz間的相互作用，還需要輔助受體來介導(dǎo)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，需要低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5/6 (LRP5/6)介導(dǎo)經(jīng)典Wnt信號，而可以需要受體酪氨酸激酶RYK介導(dǎo)非經(jīng)典功能。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一調(diào)節(jié)水平出現(xiàn)在存在不同數(shù)量的分泌型Wnt拮抗劑的細(xì)胞外環(huán)境內(nèi)。Wnt結(jié)合受體復(fù)合物之后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)磷蛋白散亂蛋白(Dsh/Dvl)。Dsh可直接與Fz相互作用。在Dsh水平上，Wnt信號分為至少三個(gè)主要級聯(lián)，經(jīng)典(β -連環(huán)蛋白)，平面細(xì)胞極性和Wnt/Ca2+。進(jìn)一步地，G-蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還可刺激生長和存活通路，如PI3K。
[0123]1.經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
[0124]經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最初在果蠅的遺傳篩選中鑒定并描繪出，并且在蒼蠅、蠕蟲、青蛙、魚和小鼠中的深入研究已引起基本分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)框架的鑒定。經(jīng)典fct通路的特點(diǎn)是黏合連接相關(guān)蛋白β_連環(huán)蛋白累積并易位至細(xì)胞核。缺乏fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)β_連環(huán)蛋白被β_連環(huán)蛋白降解復(fù)合物降解，所述復(fù)合物包括Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)、蛋白磷酸酶2A (PP2A)、糖原合成酶激酶3β (GSK3 β )和酪蛋白激酶la (CKl α )。β-連環(huán)蛋白被該復(fù)合物內(nèi)的CKla和GSK30磷酸化，導(dǎo)致其被泛素化以及隨后由蛋白酶體機(jī)制蛋白水解破壞。fct與其由Fz和LRP5/6組成的受體復(fù)合物的結(jié)合誘導(dǎo)CKl和GSK3-0對LRP6的雙重磷酸化，并且這容許包含Axin的蛋白復(fù)合物從細(xì)胞溶質(zhì)易位至質(zhì)膜。Dsh也補(bǔ)充至質(zhì)膜并結(jié)合Fz，并且Axin結(jié)合磷酸化的LPR5/6。在Fz/LRP5/6的質(zhì)膜處形成的該復(fù)合物通過Axin的隔離和/或降解誘導(dǎo)β_連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化。β_連環(huán)蛋白易位至細(xì)胞核，在這里其與Lef/Tcf家族成員復(fù)合以介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。
[0125]經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響前頭結(jié)構(gòu)和神經(jīng)外胚層模式的形成、尾部模式和尾巴形成，還影響多種器官系統(tǒng)包括心臟、肺、腎臟、皮膚以及骨骼的形成。
[0126]可通過經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt包括但不僅限于:Wntl、Wnt2、Wnt2b/13> Wnt3> Wnt3a> Wnt8> Wnt8a> Wnt8b> WntlOa、WntlOb^P Wntl6。
[0127]2.非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
[0128]非經(jīng)典通路通常被稱為β -連環(huán)蛋白非依賴型通路。該通路可進(jìn)一步劃分為至少兩個(gè)不同分支，平面細(xì)胞極性通路(或PCP通路)和Wnt/Ca2+通路，其中本文僅進(jìn)一步詳細(xì)通論P(yáng)CP。PCP通路出自果蠅的遺傳研究，其中包括佛力子和散亂蛋白的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分中的突變被發(fā)現(xiàn)使包括角質(zhì)毛發(fā)(cuticle hair)和感覺鬃的上皮結(jié)構(gòu)的定位隨機(jī)化。已知上皮中的細(xì)胞擁有確定的頂端-基底外側(cè)極性，但是，另外，其還沿著上皮層表面極化。這種嚴(yán)格的組織性支配包括毛囊、感覺鬃和眼睛內(nèi)小眼的六角形排列在內(nèi)的結(jié)構(gòu)的定向。在脊椎動(dòng)物里，這種組織性已被證明引起肌肉細(xì)胞、內(nèi)耳感覺上皮內(nèi)的立體纖毛的組建和定向、毛囊的組建、和經(jīng)歷原腸胚形成的背部中胚層細(xì)胞的形態(tài)和遷移行為。
[0129]Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過不依賴于Fz的LRP5/6轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致Dsh激活。Dsh通過Daaml介導(dǎo)Rho的激活，Rho依次激活Rho激酶(ROCK)。Daaml還通過肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白抑制蛋白(Profilin)介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合。Dsh還介導(dǎo)Rac激活，Rac依次激活JNK。來自Rock、JNK和抑制蛋白中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)整合在一起，用于原腸胚形成過程中細(xì)胞極性和運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞骨架變動(dòng)。
[0130]可通過非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt包括但不僅限于:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b 和 Wntll0
[0131]3.肌肉細(xì)胞發(fā)育中的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0132]衛(wèi)星干細(xì)胞是產(chǎn)生肌肉細(xì)胞的成體干細(xì)胞。成體骨骼肌內(nèi)的衛(wèi)星細(xì)胞位于其宿主肌細(xì)胞的肌纖維膜和基膜間的小凹陷中。損傷，如，物理創(chuàng)傷、重復(fù)鍛煉、或患病時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞變?yōu)榧せ畹?、增殖的并產(chǎn)生表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子(MRF) MyoD和Myf5的成肌前體細(xì)胞(成肌細(xì)胞)群。在再生過程期間，成肌細(xì)胞在定向至終末分化、融合宿主纖維或產(chǎn)生新肌纖維以重建損傷組織前經(jīng)歷多輪分裂(Charge and Rudnicki, 2004)。骨骼肌再生期間，衛(wèi)星細(xì)胞群由干細(xì)胞亞群體維持，由此允許個(gè)體壽命期間的組織平衡和多輪再生(Kuang etal.，2008)。衛(wèi)星干細(xì)胞(Pax7+/Myf5_)占成體衛(wèi)星細(xì)胞庫的約10%，并通過不對稱的頂-底細(xì)胞分裂產(chǎn)生子衛(wèi)星成肌細(xì)胞(Pax7+/Myf5+)。
[0133]Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間的發(fā)育程序、以及調(diào)節(jié)成體組織的干細(xì)胞功能中扮演重要角色(Clevers, 2006)。Wnt在軸旁中胚層的胚胎成肌誘導(dǎo)中是必需的(Borelloet al., 2006; Chen et al., 2005; Tajbakhsh et al.，1998),在肌纖維發(fā)育過程的分化控制中也是必需的(Anakwe et al.，2003)。近年來,Wnt平面細(xì)胞極性(PCP)通路已涉及調(diào)節(jié)發(fā)育肌節(jié)中肌細(xì)胞生長的方向(Gros et al.，2009)。在成人中,Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被認(rèn)為是急性損傷后肌肉組織中的成體干細(xì)胞的成肌定向所必需的(Polesskaya et al., 2003;Torrenteet al., 2004) 0其他的研究表明Wnt/β -連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過儲存成肌細(xì)胞的激活和補(bǔ)充調(diào)節(jié)成肌分化(Rochat et al.，2004)。此外,成體肌肉中衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎通過限制Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并由此促進(jìn)分化來控制成肌譜系的進(jìn)展(Bracket al., 2008)。
[0134]近年來，確定了 Wnt受體Fzd7在休眠衛(wèi)星干細(xì)胞中明顯地上調(diào)。另外，進(jìn)一步的研究顯示出fct7a在肌肉再生中表達(dá)并通過其受體Fzd7和Vangl2 (平面細(xì)胞極性(PCP)通路的組分)起作用，從而誘導(dǎo)對稱衛(wèi)星干細(xì)胞擴(kuò)增并顯著增強(qiáng)細(xì)胞再生。
[0135]PCP通路中受體或效應(yīng)分子，例如Fzd7或Vangl2的抑制，被認(rèn)為是在衛(wèi)星干細(xì)胞上取消fct7a的效應(yīng)(Le Grand et al.，2009)。進(jìn)一步證實(shí)，給予脂化的Wnt7a多肽、或編碼Wnt7a多肽的多聚核苷酸(其隨后通過脂化進(jìn)行翻譯后修飾)，在體外和體內(nèi)顯著增加衛(wèi)星干細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)體內(nèi)組織形成，導(dǎo)致受傷的和患病的肌肉組織中增強(qiáng)的修復(fù)和再生(Le Grand et al., 2009)。
[0136]不希望受任何具體的理論限制，可以考慮到，導(dǎo)致受傷的和患病的肌肉組織中增強(qiáng)的修復(fù)和再生的Wnt7a作用機(jī)制有兩條路:Wnt7a通過PCP通路可以刺激肌肉衛(wèi)星(干)細(xì)胞的對稱擴(kuò)增，導(dǎo)致可隨后分化為成肌細(xì)胞的更大的細(xì)胞庫；以及，第二，經(jīng)G蛋白偶聯(lián)受體(Frizzled)的Wnt7a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可刺激成肌細(xì)胞和肌纖維中磷脂酰肌醇3-激酶/Akt (蛋白激酶B)/哺乳動(dòng)物類雷帕霉素靶標(biāo)(PI3K/Akt/mT0R)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并顯示為刺激肥大(Bodine et al., Nature Cell Biology.2001; vol.3;pp.1014-1017;Glass etal., Nature Cell Biology.2003;vol.5;pp.87-90;Ciciliot and Schiaffino, CurrentPharmaceutical Design.2010; 16(8) ;pp.906-914)。Wnt7a 可通過 G-蛋白偶聯(lián)受體Frizzled7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且該Wnt/Frz相互作用可有助于兩種生物效應(yīng)。
[0137]在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明某種程度上涉及使用包含一種或多種修飾的Wnt的fct組合物來修復(fù)和再生受傷肌肉組織，所述Wnt通過非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的組合物包含選自以下的修飾的、非經(jīng)典fct:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlI。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含修飾的Wnt5a或Wnt7a多肽。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含缺少一個(gè)或多個(gè)脂化位點(diǎn)的修飾的Wnt5a或Wnt7a多肽。
[0138]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包括融合多肽，該融合多肽包含天然的、異源的、或雜合的信號肽和非經(jīng)典fct多肽(任選缺乏一個(gè)或多個(gè)脂化位點(diǎn))。
[0139]雖然已描述了 PI3K/Akt/mT0R通路對肌肉細(xì)胞肥大的重要性，但在肌肉細(xì)胞中特異地刺激該通路的治療挑戰(zhàn)成為在受傷的和患病的肌肉組織中增強(qiáng)修復(fù)和再生的顯著障礙。如IGF-1的有效PI3-激酶激活劑的早期研究產(chǎn)生體外肥大，但存在“脫靶”代謝效應(yīng)的可能(即，IGF-1和PI3K是管家代謝、存活和代謝過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑)。因此，非經(jīng)典Wnt通路的肌肉特異性刺激的潛力，如，PI3K/Akt/mT0R通路的Wnt7a-Fzd7刺激，會(huì)表現(xiàn)出重要且獨(dú)特的治療突破。
[0140]如下進(jìn)一步描述的，本發(fā)明部分涉及創(chuàng)造性的Wnt組合物，其為Wnt組合物增強(qiáng)受傷的和患病的肌肉組織中的修復(fù)和再生的治療用途的這一技術(shù)困難和其它障礙提供意想不到的方案。
[0141]D.多肽
[0142]Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組分。人Wnt基因家族由19個(gè)成員構(gòu)成，編碼具有22或24個(gè)Cys殘基和數(shù)個(gè)保守Asn和Ser殘基的進(jìn)化保守的糖蛋白。示例性人 fct 蛋白包括 Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b> Wnt8> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b、WntlOa、WntIOb> Wntll 和 Wntl6。
[0143]Wnt是分泌型糖蛋白，在轉(zhuǎn)運(yùn)前被高度修飾并釋放如細(xì)胞外環(huán)境。信號序列切割并易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中后，Wnt通過內(nèi)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面并經(jīng)歷多次修飾。Wnt經(jīng)歷 N-連接糖基化(Burrus and McMahon 1995;Kadowaki et al., 1996;Komekado etal., 2007;Kurayoshi et al., 2007;Mason et al., 1992;Smolich et al., 1993;Tanakaet al.2002)。許多Wnt還在第一保守半胱氨酸處棕櫚?；?，Wntl中的C93、Wnt3a中的 C77、和 Wnt5a 中的 C104(Galli et al., 2007;Kadowaki et al., 1996;Komekado etal., 2007;ffillert et al.2003)。此外，Wnt3a在保守絲氨酸處(S209)用棕櫚油酸修飾，這還被Wntl (S224) Wnt5a保留(Takada et al.，2006)。而且,這些保守半胱氨酸和絲氨酸殘基存在于很多 fct *j|^P,Wntl、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt9a、wntl0a 和 Wntll等(Takada et al., 2006;還參見圖1)。
[0144]普遍認(rèn)為Wnt?；斐煞置谛蚖nt的普遍疏水的特性(Willert et al.，2003)。另外，哺乳動(dòng)物類Wnt的翻譯后脂化被認(rèn)為是對功能至關(guān)重要。Wntl、Wnt3a、或Wnt5a的保守N-端半胱氨酸的突變阻止了細(xì)胞培養(yǎng)物中的棕櫚?；＿@些突變Wnt是分泌的但顯不出很少或無信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(Galli et al., 2007;Komekado et al., 2007;Kurayoshiet al.,2007;ffillert et al.，2003)，并且未棕櫚?；腤nt被認(rèn)為不可結(jié)合Fz受體(Komekado et al., 2007;Kurayoshi et al.2007)。突變Wnt3a 中心部分保守的絲氨酸阻止了棕櫚油酸添加并阻塞分泌和因此的活性(Takada et al.，2006)。果蠅Wg的研究確認(rèn)了酸化的重要性(Franch-Marro et al., 2008a;Nusse2003; van den Heuvel et al.，1993)。
[0145]進(jìn)一步地，這些數(shù)據(jù)通過顯示W(wǎng)g信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)損失的果蠅刺猬(pore)表型得以支持(van den Heuvel et al.，1993) aPorc 是Wg掠櫚酸化(Zhai et al.，2004)和 Wg ER輸出(Tanaka et al.，2002)所需的ER-定位的整合膜O-?；D(zhuǎn)移酶(Kadowaki et al.，1996)。脊椎動(dòng)物Porc還提升Wnt脂化并 且是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Wnt生物活性所需的(Galli etal., 2007)。
[0146]這些研究建立了這樣的模型，其中棕櫚油酸修飾是分泌和棕櫚酸酯結(jié)合Fz所需的。因此，缺少一個(gè)或者全部這些脂質(zhì)修飾的fct多肽預(yù)期將缺乏生物活性。
[0147]在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明部分涉及被修飾或改造以降低或移除經(jīng)典脂化位點(diǎn)但出乎意料地保留fct生物活性的Wnt多肽。在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的Wnt多肽促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增和肌肉肥大，并促進(jìn)組織形成、再生、維持和修復(fù)。如本文所用，結(jié)合氨基酸序列使用的術(shù)語“經(jīng)典”是指天然存在多肽中存在的一個(gè)氨基酸或一組氨基酸。在一些情況下，在指示天然存在多肽中存在的氨基酸時(shí)，“經(jīng)典”與“天然”可互換使用。
[0148]在某些實(shí)施方式中，修飾或改造Wnt多肽使之缺少用于Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸。在某些【具體實(shí)施方式】中，修飾或改造fct多肽使之缺少用于Wnt多肽脂化的所有天然氨基酸。在一些實(shí)施方案中，fct多肽是非經(jīng)典Wnt多肽，即一種通過非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt多肽。在【具體實(shí)施方式】中，非經(jīng)典Wnt選自:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wntll。在優(yōu)選實(shí)施方式中，Wnt多肽是本文所述的缺少經(jīng)典或天然脂化位點(diǎn)但保持或具有增加的經(jīng)典和/或非經(jīng)典fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的修飾或改造的Wnt5a 或 Wnt7a 多妝。[0149]如上所述，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明使用本領(lǐng)域已知的和可用的技術(shù)提供組合物，其包含改造的fct多肽或編碼該改造的Wnt多肽的多聚核苷酸。在具體實(shí)施方案中，fct多肽改造為移除一個(gè)或多個(gè)、或所有脂化位點(diǎn)。
[0150]如本文所用，除有相反的說明外，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”可互換使用，并且根據(jù)常規(guī)含義，即為，肽鍵或修飾肽鍵連接的氨基酸的序列。在【具體實(shí)施方式】中，術(shù)語“多肽”包括融合多肽。多肽不限于特定長度，如其可包括全長蛋白序列或全長蛋白的片段，并且可包括多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化、?；⒘姿峄?，也包括本領(lǐng)域公知的、天然存在和非天然存在的其他修飾。本發(fā)明的多肽可通過多種公知的重組和/或合成技術(shù)制備，例證將在下面進(jìn)一步討論。然而，在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的fct多肽被改造，使得它們具有移除或消除fct多肽上的一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)或全部脂化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、插入、或突變。在某些實(shí)施方式中，fct多肽是非經(jīng)典Wnt多肽，即，通過非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的fct多肽。
[0151]在多種實(shí)施方式中，fct多妝選自:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b 和Wntll，其中Wnt多肽通過如氨基酸取代、缺失或突變?nèi)鄙僖粋€(gè)或更多個(gè)或全部脂化位點(diǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，Wnt多肽是通過如氨基酸取代、缺失、或突變?nèi)鄙僖粋€(gè)或更多個(gè)或全部脂化位點(diǎn)的Wnt5a或Wnt7a多肽。
[0152]如本文所用，術(shù)語“非經(jīng)典Wnt多肽”是指通?；蛑饕ㄟ^非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt多肽。示例性非經(jīng)典Wnt多肽包括但不僅限于:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wntll。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“非經(jīng)典Wnt多肽”是指具有這樣序列的修飾或改造的非經(jīng)典Wnt多肽，該序列與天然存在的非經(jīng)典Wnt多肽序列至少約70%、更優(yōu)選約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或約 100% —致?？稍诔^至少約10、25、50、100、200、300或更多個(gè)連續(xù)氨基酸上評估一致性，或者可在序列全長上評估一致性。確定一致性％或同源性％的方法是本領(lǐng)域公知的并可被用于該目的的任何適當(dāng)?shù)姆椒ā７墙?jīng)典fct多肽的示例在SEQ ID Nos:2-13和15-23、29-32和39中示出。
[0153]如本文所用，術(shù)語“Wnt7a多肽”是指具有相應(yīng)于野生型Wnt7a序列的多肽序列的Wnt7a蛋白。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“Wnt7a多肽”是指具有的序列與天然存在的Wnt7a序列至少約 70%、更優(yōu)選約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或約100%—致的修飾或改造的Wnt7a多肽。可在超過至少約10、25、50、100、200、300或更多個(gè)連續(xù)氨基酸上評估一致性，或者可在序列全長上評估一致性。fct7a多肽的示例在SEQ IDNos:2-13中示出。
[0154]如本文所用，術(shù)語“Wnt5a多肽”是指具有相應(yīng)于野生型Wnt5a序列的多肽序列的Wnt5a蛋白。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“Wnt5a多肽”是指具有的序列與天然存在的Wnt5a序列至少約 70%、更優(yōu)選約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或約100%—致的修飾或改造的Wnt5a多肽。可在超過至少約10、25、50、100、200、300或更多個(gè)連續(xù)氨基酸上評估一致性，或者可在序列全長上評估一致性。fct7a多肽的示例在SEQ IDNos: 15-23 中示出。
[0155]如本文所用，術(shù)語“修飾的Wnt多肽”、“修飾或改造的Wnt多肽”和“改造的Wnt多肽”可交換使用，是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失或取代的fct多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，為了防止Wnt多肽脂化但還得到保持Wnt生物活性的Wnt多肽，修飾的Wnt多肽包含保守脂化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代。在【具體實(shí)施方式】中，修飾的fct多肽缺少一個(gè)或多個(gè)或所有脂化位點(diǎn)但保持Wnt活性。優(yōu)選地,本發(fā)明的修飾的Wnt多肽保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt的活性。
[0156]如本文所用，術(shù)語“修飾的非經(jīng)典Wnt多肽”、“修飾或改造的非經(jīng)典Wnt多肽”和“改造的非經(jīng)典fct多肽”可交換使用，是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失或取代的非經(jīng)典fct多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，為了防止非經(jīng)典Wnt多肽脂化但還得到保持非經(jīng)典Wnt生物活性的非經(jīng)典fct多肽，例如通過非經(jīng)典Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，修飾的非經(jīng)典Wnt多肽包含保守脂化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代，。在【具體實(shí)施方式】中，修飾的非經(jīng)典Wnt多肽缺少一個(gè)或多個(gè)或所有脂化位點(diǎn)但保持非經(jīng)典Wnt活性。優(yōu)選地,本發(fā)明的修飾的非經(jīng)典Wnt多肽保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在非經(jīng)典Wnt的活性。
[0157]如本文所用，術(shù)語“修飾的Wnt7a多肽”、“修飾或改造的Wnt7a多肽”和“改造的Wnt7a多肽”可交換使用，是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失或取代的Wnt7a多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，為了防止fct7a多肽脂化但還得到保持或增加Wnt7a生物活性的Wnt7a多肽，修飾的Wnt7a多肽包含保守脂化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代。在【具體實(shí)施方式】中，修飾的Wnt7a多肽缺少一個(gè)或多個(gè)或所有脂化位點(diǎn)但保持Wnt生物活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的fct7a多肽變體保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt7a的活性。修飾的Wnt7a多肽的示例在SEQ ID No:3-5和12-13中示出。
[0158]如本文所用，術(shù)語“修飾的Wnt5a多肽”、“修飾或改造的Wnt5a多肽”和“改造的Wnt5a多肽”可交換使用，是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失或取代的Wnt5a多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在【具體實(shí)施方式】中，為了防止fct5a多肽脂化但還得到保持或增加Wnt5a生物活性的Wnt5a多肽,本發(fā)明的修飾的Wnt5a多肽包含保守脂化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代。在【具體實(shí)施方式】中，修飾的Wnt5a多肽缺少一個(gè)或多個(gè)或所有脂化位點(diǎn)但保持Wnt生物活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的fct5a多肽變體保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt5a的活性。修飾的Wnt5a多肽的示例在SEQ ID No:16_18中示出。
[0159]在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的修飾的Wnt多肽包含減少或阻止多肽脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代，但該多肽具有fct生物活性。在【具體實(shí)施方式】中，Wnt多肽是在表1中確定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的經(jīng)典fct多肽，其中氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代防止確定位置的脂化，并且其中經(jīng)典Wnt多肽保持或增加經(jīng)典Wnt生物活性水平。
[0160]表1
[0161]WntIaa 位置|Ref.SEQ ID

Wntl93;22424

Wnt276;21225

Wnt2b88;22426

Wnt380;21227

Wnt3a77;20928

Wnt8a54;18633

Wnt8b54;18634

Wnt9a93;22135

Wnt9b89;21636

WntlOa96;26837

WntlOb83;25338

Wntl681;22740
[0162]在【具體實(shí)施方式】中，Wnt多肽是在表2中確定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代 的非經(jīng)典Wnt多肽，其中氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代防止確定位置的脂化，并且其中非經(jīng)典fct多肽保持或增加非經(jīng)典Wnt生物活性水平。
[0163]表2
[0164]

WntIAA 位置|Ref.SEQ ID

Wnti78:21229

Wnt5a104;24415

Wnt5b83;22330

Wnt676;228Tl

Wnt7a73;2062

Wnt7b73;20632

Wntll80;21539[0165]在【具體實(shí)施方式】中，Wnt多肽是在氨基酸73和/或206處包含防止在該位置發(fā)生脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的fct7a多肽，其中該Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是在氨基酸第73位包含防止在該位置發(fā)生脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的fct7a多肽，其中該Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的Wnt多肽是在氨基酸第206位包含防止在該位置發(fā)生fct7a脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中該Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一些實(shí)施方式中，多肽是在氨基酸第73位和第206位包含氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中該Wnt7a多肽缺乏翻譯后脂化并具有fct生物活性。
[0166]在某些實(shí)施方式中，Wnt7a多肽的C73和/或S206是Ala或另一氨基酸取代的以防止這些殘基脂化。在其他實(shí)施方式中，突變或缺失C73和/或S206以防止這些殘基的脂化，例如，SEQ ID Nos:3-50在一些實(shí)施方式中，C73和S206被Ala取代，并且本發(fā)明的Wnt7a多肽缺少脂化位點(diǎn)并保持一些Wnt生物活性水平，如，SEQ ID NO: 5。
[0167]在【具體實(shí)施方式】中，Wnt多肽是在氨基酸104和/或244處包含防止在該位置發(fā)生脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的fct5a多肽，其中該Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是在氨基酸第104位包含防止在該位置發(fā)生脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的fct5a多肽，其中該Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的Wnt多肽是在氨基酸第244位包含防止在該位置發(fā)生fct5a脂化的氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中該Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一些實(shí)施方式中，多肽是在氨基酸第104位和第244位包含氨基酸突變、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中該Wnt5a多肽缺乏翻譯后脂化并具有fct生物活性。
[0168]在某些實(shí)施方式中，Wnt5a多肽的C104和/或S244是Ala或另一氨基酸取代的以防止這些殘基脂化。在其他 實(shí)施方式中，突變或缺失C104和/或S244以防止這些殘基的脂化，例如，SEQ ID Nos: 16-18。在一些實(shí)施方式中，C104和S244被Ala取代，并且本發(fā)明的Wnt5a多肽缺少脂化位點(diǎn)并保持一些Wnt生物活性水平，如，SEQ ID NO: 18。
[0169]如本文所用，術(shù)語“天然存在”是指在自然界中可以找到的多肽或多聚核苷酸序列。例如，天然存在多肽或多聚核苷酸序列是有機(jī)體中存在的，并且可以從有機(jī)體中分離的，并且沒有在實(shí)驗(yàn)室中被人為有意修飾的。術(shù)語“野生型”通常與術(shù)語“天然存在”可互換使用。
[0170]在本發(fā)明的上下文中，多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物在表現(xiàn)出約10%、20%、30%、40%或50%的野生型蛋白活性，優(yōu)選至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或至少80%的野生型蛋白活性時(shí)，認(rèn)為其與野生型蛋白具有至少大體上相同的活性。在【具體實(shí)施方式】中，多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物表現(xiàn)出至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的野生型蛋白活性。在某些實(shí)施方式中，可獲得大于野生型活性的活性。如Wnt5a或Wnt7a多肽的非經(jīng)典Wnt多肽、其生物活性片段或變體、或其同源物、旁系同源物或直系同源物的活性，例如，可通過如刺激fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如促進(jìn)對稱干細(xì)胞擴(kuò)增或細(xì)胞生長以測量其模擬野生型fct生物活性的能力，并與野生型蛋白活性的能力對比來確定。測量和表征干細(xì)胞分裂(如衛(wèi)星干細(xì)胞分裂)和細(xì)胞生長(如肌肉肥大)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
[0171]如本文所用，應(yīng)用于參考多聚核苷酸或多肽序列的片段的術(shù)語“生物活性片段”是指具有至少約 5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900、或 1000% 或更多的 Wnt 參考序列的
生物活性(如刺激其fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物活性)的修飾的Wnt多肽的片段。本發(fā)明的某些實(shí)施方式部分涉及長度為至少約20、50、100、150、200、250、或300個(gè)(包括其間所有整數(shù))連續(xù)氨基酸殘基的修飾的fct多肽的生物活性片段或編碼這些片段的多聚核苷酸序列，其包括或編碼具有參考fct多肽(如天然存在的Wnt多肽)的生物活性的多肽。
[0172]修飾的多肽包括多肽變體。本文所用的術(shù)語“變體”是指如本文他處所述和本領(lǐng)域所知的，通過修飾、增加、缺失、或取代至少一個(gè)氨基酸殘基而區(qū)別于參考多肽的多肽。在某些實(shí)施方式中，多肽變體是通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(例如，1、2、3、4、5或更多取代)而區(qū)別于參考多肽，所述取代可以是保守的或非保守的。例如，在多種實(shí)施方式中，可在靶向于天然存在fct多肽脂化的任何氨基酸殘基中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)保守或非保守取代。
[0173]在其他【具體實(shí)施方式】中，與天然存在的Wnt多肽相比，為了防止脂化、增加Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、和/或增加修飾的fct多肽的穩(wěn)定性，Wnt多肽變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加、缺失、或取代。
[0174]在其他【具體實(shí)施方式】中，與天然存在的非經(jīng)典多肽相比，為了防止脂化、增加Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、和/或增加修飾的fct多肽的穩(wěn)定性，非經(jīng)典Wnt多肽變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加、缺失或取代。
[0175]在其他【具體實(shí)施方式】中，與天然存在的Wnt7a多肽相比，為了防止脂化、增加Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、和/或增加修飾的fct多肽的穩(wěn)定性，Wnt7a多肽變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加、缺失或取代。
[0176]在其他【具體實(shí)施方式】中，與天然存在的Wnt5a多肽相比，為了防止脂化、增加Wnt通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、和/或增加修飾的fct多肽的穩(wěn)定性，Wnt5a多肽變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加、缺失或取代。
[0177]為了產(chǎn)生此類變體，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)如表3改變一個(gè)或多個(gè)編碼DNA序列的密碼子。[0178]彪氨基酸密碼子
【權(quán)利要求】
1.修飾的Wnt多肽，其包含降低所述Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
2.Wnt多肽，其包含降低所述Wnt多肽脂化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入或取代。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的Wnt多肽，其中所述Wnt多肽激活非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
4.如權(quán)利要求3所述的Wnt多肽,其中所述Wnt多肽選自:Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b 和 WntlI。
5.如權(quán)利要求3所述的Wnt多肽，其中Wnt多肽是Wnt7a或Wnt5a多肽
6.修飾的Wnt7a多肽，其相對于對應(yīng)SEQID NOs:2和6_11中任一個(gè)Wnt7a多肽的脂化具有降低的脂化。
7.如權(quán)利要求6所述的修飾的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:2和6-11中任一個(gè)的第73位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
8.如權(quán)利要求6所述的修飾的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:2和6-11中任一個(gè)的第206位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
9.如權(quán)利要求6所述的修飾的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:2和6-11中任一個(gè)的第73位和第206位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
10.如權(quán)利要求6所述的修飾的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:2和6-11中任一個(gè)的第73位或第206位的氨基酸位置處包含丙氨酸。
11.如權(quán)利要求6所 述的修飾的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:2和6-11中任一個(gè)的第73位和第206位的氨基酸位置處包含丙氨酸。
12.修飾的Wnt5a多肽，其相對于對應(yīng)SEQID NOs:15和19-23中任一個(gè)的Wnt5a多肽的脂化具有降低的脂化。
13.如權(quán)利要求12所述的修飾的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs:15和19-23中任一個(gè)的第104位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
14.如權(quán)利要求12所述的修飾的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs: 15和19-23中任一個(gè)的第244位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
15.如權(quán)利要求12所述的修飾的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs: 15和19-23中任一個(gè)的第104位和第244位的氨基酸位置處包含氨基酸的缺失、插入或取代。
16.如權(quán)利要求12所述的修飾的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs: 15和19-23中任一個(gè)的第104位或第244位的氨基酸位置處包含丙氨酸。
17.如權(quán)利要求12所述的修飾的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相應(yīng)于SEQID NOs: 15和19-23中任一個(gè)的第104位和第244位的氨基酸位置處包含丙氨酸。
18.Wnt多肽，其包含SEQ ID NOs:3_5、12_13和16-18中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
19.融合多肽，其包含權(quán)利要求18所述的Wnt多肽。
20.如權(quán)利要求19所述的融合多肽，其包含天然信號肽、異源信號肽、或天然和異源信號肽的雜合體。
21.如權(quán)利要求20所述的融合多肽，其中所述異源信號肽選自:CD33信號肽、免疫球蛋白信號肽、生長激素信號肽、紅細(xì)胞生成素信號肽、白蛋白信號肽、分泌型堿性磷酸酶信號肽和病毒性信號肽。
22.如權(quán)利要求20所述的融合多肽，其中所述異源信號肽為CD33信號肽、IgGK信號肽或IgGy信號肽。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其包含異源蛋白酶切割位點(diǎn)。
24.如權(quán)利要求23所述的融合多肽，其中所述異源蛋白酶切割位點(diǎn)選自:煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切割位點(diǎn)、肝素切割位點(diǎn)、凝血酶切割位點(diǎn)、腸激酶切割位點(diǎn)和因子Xa切割位點(diǎn)。
25.如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的融合多肽,其包含選自以下的表位標(biāo)簽:HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。
26.如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQIDN0s:3-5和12-13中任一個(gè)所示的氨基酸序列，相較于SEQ ID N0s:2和6_11中所示的對應(yīng)的天然fct多肽，其具有增加的產(chǎn)量、分泌或溶解性。
27.如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQIDNOs: 16-18中任一個(gè)所示的氨基酸序列，相較于SEQ ID NOs: 15和19-23中所示的對應(yīng)的天然fct多肽，其具有增加的產(chǎn)量、分泌或溶解性。
28.編碼權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的多肽的多聚核苷酸。
29.包含權(quán)利要求28所述的多聚核苷酸的載體。
30.包含權(quán)利要求29所述的載體的宿主細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。
32.組合物，其包 含權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的多肽；編碼權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的多肽的多聚核苷酸；或包含編碼權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的多肽的多聚核苷酸的載體。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其包含藥學(xué)可接受的鹽、載體或賦形劑。
34.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物在水溶液中可溶。
35.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物配制為用于注射。
36.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物無需去垢劑配制。
37.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物配制為用于靜脈注射、心內(nèi)注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射或肌肉內(nèi)直接注射中的一種或多種。
38.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物促進(jìn)組織形成、再生、維持或修復(fù)。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述組織為肌肉。
40.如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述肌肉為骨骼肌、心肌或平滑肌。
41.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物促進(jìn)干細(xì)胞擴(kuò)增。
42.如權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述干細(xì)胞是成體干細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述成體干細(xì)胞是衛(wèi)星干細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物促進(jìn)肌肉肥大或預(yù)防萎縮。
45.治療或預(yù)防肌肉損失的方法，其包括給予個(gè)體權(quán)利要求32所述的組合物。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組合物包含藥學(xué)可接受的鹽、載體、或賦形劑。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組合物在水溶液中可溶。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組合物不在去垢劑中配制。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組合物配制為用于注射。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組合物配制為用于靜脈注射、心內(nèi)注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射或肌肉內(nèi)直接注射中的一種或多種。
51.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述個(gè)體患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有影響肌肉的疾病或病癥。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述疾病是退行性疾病。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述退行性疾病是肌營養(yǎng)不良。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良選自:杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)、埃默里一德賴富斯肌營養(yǎng)不良、蘭迪二氏肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSH)、肢帶型肌營養(yǎng)不良、von Graefe-Fuchs型肌營養(yǎng)不良、眼咽型肌營養(yǎng)不良(OPMD)、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良(斯太納特病)和先天性肌營養(yǎng)不良。
55.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述影響肌肉的疾病或病癥是消耗病、肌肉衰減、肌肉萎縮、ICU誘發(fā)性虛弱、持續(xù)廢用、手術(shù)誘發(fā)性虛弱或肌肉退行性疾病。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述病癥為與肌肉廢用、固定、手術(shù)誘發(fā)性虛弱或損傷相關(guān)的肌肉萎縮。
57.如權(quán)利要求45所述的方法，其中給予所述組合物促進(jìn)肌肉肥大。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。
59.如權(quán)利要求45所述的方法，其中給予所述組合物促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增。
【文檔編號】A61K38/17GK103476791SQ201280009650
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月11日
【發(fā)明者】李彤, 莫妮卡·黑赫斯特·班尼特, 邁克爾·J·菲奇, 彼得·弗林 申請人:菲特治療公司