專利名稱：一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于樹(shù)狀大分子的制備領(lǐng)域，特別涉及一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
alpha-維生素E琥珀酸酯(alpha_T0S)，一種維生素E衍生物，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，在多種類型的腫瘤中引發(fā)癌細(xì)胞的大量凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)循環(huán)，擾亂腫瘤生長(zhǎng)必不可少的自分泌信號(hào)通路。在其特殊的結(jié)構(gòu)中，琥珀?；鶊F(tuán)通過(guò)誘導(dǎo)反應(yīng)活性氧的產(chǎn)生來(lái)引發(fā)癌細(xì)胞凋亡。在傳統(tǒng)藥物治療中往往由于藥物無(wú)特異性，不可避免的會(huì)對(duì)正常細(xì)胞及組 織產(chǎn)生傷害。其次，通過(guò)提高藥物劑量來(lái)提高其藥物毒性，利用藥物直接產(chǎn)生的毒副作用來(lái)摧毀快速分化的細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)這類藥物治療，不僅藥物使用劑量大，而且具有一定的盲目性。為了避免傳統(tǒng)藥物治療中產(chǎn)生的弊端,選擇優(yōu)良的藥物載體十分重要,例如Won, Y. -W.^ (Won, Y. -ff. ; Yoon, S. -M. ; Kim, Y. -H. et al. Adv Funct Mater. 2012, 22, 1199.)利用人類重組明膠和硫辛酸的化合產(chǎn)物作為藥物穩(wěn)定劑和載體，與alpha-TOS自組裝形成了新型藥物復(fù)合體，該納米材料不僅具有良好的穩(wěn)定性、尺寸均一，生物相容性好，該載體材料更有效的防止了 alpha-TOS的水解，提高了抗癌效率。由于alpha-TOS具有疏水性，也可被用于載體材料的疏水性組分，例如Y Tao.等(Y Tao. ; J Han. et al. J MaterChem. 2012，22，8930)利用alpha-TOS共價(jià)修飾的殼聚糖作為兩親性載體，載入抗腫瘤藥物紫杉醇，將alpha-TOS和紫杉醇的藥物特性接合起來(lái)，增強(qiáng)治療效果，結(jié)果表明該納米材料的系統(tǒng)循環(huán)時(shí)間增長(zhǎng)，血液清除速率降低，藥物載入率提高。YF Tan等(YF Tan,；PChandrasekharan, ;D Maity. et al. Biomaterials. 2011，32，2969)利用聚乳酸接枝聚乙二醇化的TOS作為模板包裹氧化鐵和量子點(diǎn)形成腫瘤造影。因此，基于以上載體選擇的特點(diǎn)，我們聯(lián)想到利用樹(shù)狀大分子作為納米載體平臺(tái)用于制備多功能的優(yōu)良分子顯像探針，既能連接靶向試劑形成多功能靶向分子顯像探針復(fù)合體，同時(shí)載入藥物起到臨床治療作用。聚酰胺胺(poly(amidoamine), PAMAM)樹(shù)狀大分子是通過(guò)支化單元逐步重復(fù)反應(yīng)得到的具有樹(shù)狀高度支化結(jié)構(gòu)的大分子。分子結(jié)構(gòu)包括三部分多臂引發(fā)核；由多個(gè)重復(fù)單元組成的支架；表面多功能基團(tuán)。它具有高度支化、高度單分散性，擁有可控的、規(guī)則的結(jié)構(gòu)和組成。它不僅由于表面擁有眾多的功能基團(tuán)而具有獨(dú)特的表面物理、化學(xué)性質(zhì)，而且具有獨(dú)特的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)。表面具有一層官能基團(tuán)，可以通過(guò)鏈-離子間的相互作用，酸-堿相互作用等穩(wěn)定金屬離子，形成復(fù)合材料，十分適合于作為金屬納米顆粒的載體。例如 ShiX. Y.等(Shi, X. Y. ;ffang, S. H. ;Meshinchi, S. ; et al. Small2007, 3, 1245.)利用端基為氨基的第五代PAMAM樹(shù)狀大分子為模板原位還原制備了金納米顆粒，并在包裹納米金的樹(shù)狀大分子外圍修飾靶向分子、染料等，制備得到的金納米顆粒(平均直徑為3. 2nm)具有良好的生物相容性，可對(duì)癌癥細(xì)胞進(jìn)行有效地靶向和成像。另外其內(nèi)部的空腔結(jié)構(gòu)還可以包裹藥物用于癌癥治療。例如Wang，Y.等(Wang, Y. ; R. Guo. ; Shi, X. Y. etal. Biomaterials. 2011，32，3322)利用端基為氨基的第五代PAMAM樹(shù)狀大分子為模板制備了載入抗腫瘤藥物2-甲氧雌二醇的材料，并在樹(shù)狀分子表面修飾靶向分子、染料等，作為多功能的藥物作用平臺(tái)，該體系穩(wěn)定并且實(shí)現(xiàn)了藥物的緩慢釋放。樹(shù)狀大分子還可進(jìn)行表面修飾(如聚乙二醇，PEG)進(jìn)一步提高其生物相容性，沒(méi)有免疫原性，因而作為安全的載體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別為分子影像學(xué)開(kāi)辟了一條新的路線。例如Peng，C.等(Peng, C. , L. Zheng, et al. et al. Biomaterials. 2012, 33, 1107)在端基為氛基的第五代PAMAM樹(shù)狀大分子表面修飾PEG，提高了樹(shù)狀分子包裹金納米粒子的含量，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和生物相容性。樹(shù)狀大分子由于其獨(dú)特的物化性質(zhì)，可作為多功能靶向分子顯像探針的載體，也是藥物的優(yōu)良載體。因此，可以將這些優(yōu)良功能有機(jī)結(jié)合起來(lái)，利用靶向基團(tuán)將顯像探針帶到目標(biāo)部位實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，與此同時(shí)由于該顯像探針復(fù)合體負(fù)載有抗癌藥物，可起到一定的治療作用，有效的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于其它功能化樹(shù)狀大分子的制備，具有很好的使用價(jià)值；所制備的材料有望用于體內(nèi)腫瘤CT診斷，具有良好的診斷應(yīng)用前景；制備得到的用于抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒平臺(tái)具有良好的靶向及藥物療效，為新型納米藥物的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，包括(I)將alpha-維生素E琥珀酸酯alpha-TOS溶于DMSO中，加入EDC活化2_3h后，加入 NH2-PEg-COOH 的 DMSO 溶液，攪拌反應(yīng) 12_24h，得到 T0S-PEG-C00H ；(2)將葉酸FA溶于溶劑中，加入EDC活化2_3h后，加入NH2-PEG-C00H的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)l-2d，得到FA-PEG-C00H ；(3)將第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的DMSO溶液中加入異硫氰酸熒光素FI的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)12-24h，得到G5. NH2-FI ；(4)將T0S-PEG-C00H和FA-PEG-C00H的水溶液經(jīng)過(guò)EDC活化2_3h后，依次加入到G5. NH2-FI的水溶液中，攪拌反應(yīng)2-3d，得到樹(shù)狀大分子G5. NH2-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)溶液；(5)將上述樹(shù)狀大分子G5. NH2-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)溶液中加入氯金酸溶液，攪拌20-40min，然后加入硼氫化鈉溶液攪拌反應(yīng)l_4h，再加入三乙胺N(C2H5)3攪拌20-40min，最后加入乙酸酐Ac2O,攪拌反應(yīng)12_24h，然后進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得包裹金納米粒子的樹(shù)狀大分子{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs。所述步驟(I)中EDC與TOS的摩爾比為I :1，TOS與PEG的摩爾比為I. 5-2:1。所述步驟(2)中的溶劑為DMSO。所述步驟(2)中EDC與FA的摩爾比為I :1，F(xiàn)A與PEG的摩爾比為I. 5-2:1。所述步驟(3)中FI與第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1。
所述步驟(4)中T0S-PEG-C00H 與 G5. NH2-FI 的摩爾比為 34:1，EDC 與T0S-PEG-C00H 的摩爾比為 20:1，F(xiàn)A-PEG-C00H 與 G5. NH2-FI-(PEG-TOs)的摩爾比為 25:1，EDC 與 FA-PEG-C00H 的摩爾比為 20:1。所述步驟(5)中硼氫化鈉溶液的溶劑為水和甲醇的混合溶液，水和甲醇的體積比為 2: I。所述步驟(5)中HAuCl4 *4H20 和樹(shù)狀大分子 G5. NH2-FI-(PEG-TOS) -(PEG-FA)的摩爾比為200:1, NaBH4與HAuCl4 4H20的摩爾比為2-5: 1，三乙胺N(C2H5)3、乙酸酐Ac2O和樹(shù)狀大分子 G5. NH2-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)的摩爾比為 120-660:100-550:1。所述步驟(5)中透析為透析膜為纖維素透析膜MWC0=14000，在磷酸鹽緩沖溶液和蒸懼水中透析3天。本發(fā)明中使用PEG可以增加該材料的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，并增加后續(xù)包裹納米金的、量，達(dá)到更加靈敏的CT造影效果。本發(fā)明中氯金酸溶液加入后，攪拌20_40min，使氯金酸分子與樹(shù)狀大分子充分混合，利用AuC14_與樹(shù)狀大分子氨基的親和力使得其進(jìn)入樹(shù)狀大分子內(nèi)部空腔，再以強(qiáng)還原劑NaBH4快速還原，得到樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒，很好地防止了金納米顆粒的聚集。HAuCl4 4H20 =NaBH4 :樹(shù)狀大分子摩爾比為 200 :600 :1 (NaBH4 與 HAuCl4 4H20 的摩爾比> 3 :1)，既保證納米金的膠體穩(wěn)定性，又有效提高納米金的含量。在加入硼氫化鈉之時(shí)，應(yīng)將NaBH4溶液迅速滴加到AuC14_與樹(shù)狀大分子絡(luò)合物溶液中，快速還原得到終產(chǎn)物{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs。本發(fā)明中將樹(shù)狀大分子表面剩余的氨基乙?；越档推浔砻骐妱?shì)，提高材料的生物相容性。以三乙胺保持溶液的堿性環(huán)境保證乙?；磻?yīng)的順利進(jìn)行。使用1HNMR (氫核磁共振)、UV-Vis (紫外可見(jiàn)光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、MTT測(cè)試、流式細(xì)胞測(cè)試及共聚焦電子顯微鏡測(cè)試表征抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒平臺(tái)的結(jié)果分別如下(I) 1HNMR 測(cè)試結(jié)果1HNMR測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的{(Au°) 2(I(|-G5.NHAc-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)} DENPs 中，一個(gè) G5 接了 5. 4 個(gè) FI、5. 2 個(gè) FA、9. 7 個(gè) T0S，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2。(2) UV-Vis 測(cè)試結(jié)果UV-Vis測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子的表面等離子體共振(SPR)峰位于523nm，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3。這表明本發(fā)明中制備得到了金納米顆粒。(3) TEM測(cè)試結(jié)果TEM測(cè)試結(jié)果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4。金納米顆粒平均直徑約3. 3nm，尺寸分布較窄，具有良好的單分散性。(4)穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子在不同溫度，不同PH中具有良好的穩(wěn)定性，無(wú)沉淀產(chǎn)生，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖5。這表明本發(fā)明中制備的材料穩(wěn)定性好。(5)細(xì)胞形態(tài)結(jié)果
細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表明在純藥濃度為25iiM時(shí)，TOS和{(Au°) 2(I(|-G5.NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs孵化的細(xì)胞其形態(tài)明顯具有凋亡跡象，而不含藥的載體材料{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-FA) - (mPEG)} DENPs孵化的細(xì)胞形態(tài)良好，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖6。說(shuō)明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子具有癌細(xì)胞治療效果。(6) MTT測(cè)試結(jié)果MTT測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子孵化癌細(xì)胞24h后，在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，且較純TOS而言，對(duì)癌細(xì)胞的療效更好，起到藥物治療作用，且不含藥載體材料不存在藥物毒性，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖7。(7)流式細(xì)胞測(cè)試結(jié)果流式細(xì)胞測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子在濃度為IOOnM且孵化癌細(xì)胞lh，對(duì)高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞具有靶向作用，通過(guò)熒光強(qiáng)度的顯著性差異 說(shuō)明制得的材料對(duì)高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞具有特異性，且不會(huì)與L929細(xì)胞(正常細(xì)胞)結(jié)合，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖8，9。(8)激光共聚焦顯微鏡測(cè)試激光共聚焦顯微鏡測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子在濃度為IOOnM且孵化癌細(xì)胞lh，對(duì)高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞具有靶向作用，通過(guò)共聚焦顯微鏡圖片可清晰的看到制備得到的功能化樹(shù)狀大分子進(jìn)入了高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明制得的材料對(duì)高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞具有特異性，且不會(huì)進(jìn)入到L929細(xì)胞(正常細(xì)胞)中，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖10，11。該結(jié)果與流式細(xì)胞測(cè)試結(jié)果相一致，共同說(shuō)明修飾FA的材料對(duì)于癌細(xì)胞的靶向特異性。(9)靶向MTT測(cè)試靶向MTT測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的功能化樹(shù)狀大分子在濃度為12. 5uM且孵化癌細(xì)胞3h，對(duì)高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞具有靶向作用，因此高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞活力低于低葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞活性，且具有顯著性差異，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖12，說(shuō)明葉酸修飾的材料能夠被表面有高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞吞噬，從而實(shí)施對(duì)癌細(xì)胞的特異性治療。本發(fā)明制備的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒材料，其金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的分散性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其對(duì)高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞具有靶向作用且促進(jìn)癌細(xì)胞的特異性凋亡，效果明顯。以表面具有大量氨基，內(nèi)部具有大量空腔和結(jié)構(gòu)精確可控的聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子為模板和穩(wěn)定劑，制備了抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒，本發(fā)明涉及了三個(gè)基本原理(I)充分利用聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的表面大量的可修飾化氨基，在其表面修飾靶向基團(tuán)葉酸(FA)、異硫氰酸熒光素(FI)和抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯(alpha-TOS)，可制備得到新型多功能樹(shù)狀大分子。(2 )由于alpha-TOS具有疏水性，因此通過(guò)NH2-PEG-C00H為中介，將TOS與NH2-PEg-COOH化學(xué)鍵合，再將生成的T0S-PEG-C00H與聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子相連，可提高其水溶性，與此同時(shí)也提高了該納米顆粒的生物相容性和血液循環(huán)時(shí)間。(3)充分利用聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的內(nèi)部空腔包裹穩(wěn)定納米金顆粒。利用AuC14_與樹(shù)狀大分子氨基的親和力使得其進(jìn)入樹(shù)狀大分子內(nèi)部空腔，再以強(qiáng)還原劑NaBH4還原，得到樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒，很好地防止了金納米顆粒的聚集。制備這種抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的關(guān)鍵要素就是找到一個(gè)合適的載體平臺(tái)以負(fù)載不同的功能基團(tuán)，形成多功能納米復(fù)合體。聚酰胺胺(poly (amidoamine)，PAMAM)樹(shù)狀大分子是通過(guò)支化單元逐步重復(fù)反應(yīng)得到的具有樹(shù)狀高度支化結(jié)構(gòu)的大分子。它具有高度支化、高度單分散性，擁有可控的、規(guī)則的結(jié)構(gòu)和組成。它不僅由于表面擁有眾多的功能基團(tuán)而具有獨(dú)特的表面物理、化學(xué)性質(zhì)，而且具有獨(dú)特的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)。表面大量的官能基團(tuán)，可以通過(guò)共價(jià)鍵對(duì)其進(jìn)行修飾與功能化，也可以通過(guò)靜電作用等作用力等穩(wěn)定或鰲合金屬離子，形成復(fù)合材料。所以PAMAM樹(shù)狀大分子可以有效用作一種納米平臺(tái)，修飾或裝載不同的功能基團(tuán)。利用樹(shù)狀大分子所具備的優(yōu)異的單分散性、表面大量官能團(tuán)的可修飾性、內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)所具有的載藥性和經(jīng)修飾后具備的良好的生物相容性，我們通過(guò)樹(shù)狀大分子對(duì)無(wú)機(jī)納米顆粒進(jìn)行修飾、組裝及生物 功能化，以及各種小分子造影劑的接枝，得到穩(wěn)定性、水溶性和生物相容性好的納米探針，實(shí)現(xiàn)在體生物組織的實(shí)時(shí)成像，應(yīng)用于疾病的診斷與治療。本發(fā)明利用樹(shù)狀大分子的特定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，將靶向基團(tuán)葉酸(FA)、熒光分子異硫氰酸熒光素(FI)和抗癌藥物alpha-維生素E琥珀酸酯(alpha-TOS)修飾在樹(shù)狀大分子表面以實(shí)現(xiàn)靶向、熒光示蹤及藥物治療的作用，其中將NH2-PEg-COOH為中介，將TOS和FA分別與NH2-PEg-COOH化學(xué)鍵合，再將生成的T0S-PEG-C00H和FA-PEG-C00H與聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子相連，可提高其水溶性，與此同時(shí)也提高了該功能化樹(shù)狀大分子的生物相容性和血液循環(huán)時(shí)間，最后在樹(shù)狀大分子內(nèi)部包裹納米金顆粒(有望用于CT成像)，并乙酰化樹(shù)狀大分子表面剩余氨基降低表面正電荷性，以降低其毒性，制備出多功能化樹(shù)狀大分子納米顆粒平臺(tái)。我們將納米粒子用于體內(nèi)靶向傳輸，該類具有癌細(xì)胞選擇性的納米粒子傳遞系統(tǒng)的產(chǎn)生可以提高被動(dòng)和主動(dòng)靶向效應(yīng)，提高抗癌效應(yīng)并減少對(duì)于正常細(xì)胞的副作用。通過(guò)與樹(shù)狀大分子的接合，提高了 alpha-TOS水溶性，與此同時(shí)也提高了該藥物的生物相容性和血液循環(huán)時(shí)間，通過(guò)主動(dòng)靶向效應(yīng)可以有效的將藥物帶到目標(biāo)組織區(qū)域，減少藥物與正常細(xì)胞與組織的非特異性結(jié)合。這些具有治療性的納米粒子在不久的將來(lái)被期望在病人體內(nèi)作為藥物進(jìn)行優(yōu)化治療。有益效果(I)本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于其它功能化樹(shù)狀大分子的制備，具有很好的使用價(jià)值；(2)本發(fā)明所制備的材料有望用于體內(nèi)腫瘤CT診斷，具有良好的診斷應(yīng)用前景；(3)本發(fā)明制備得到的用于抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒平臺(tái)具有良好的靶向及藥物療效，為新型納米藥物的開(kāi)發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明反應(yīng)方程式簡(jiǎn)圖；圖2 為本發(fā)明制備的 a) T0S-PEG-C00H, b) FA-PEG-COOH，c)G5. NH2-FI, d)G5. NH2-FI-(PEG-TOs)，e)G5. NH2-FI-(PEG-TOS) -(PEG-FA)的氫核磁共振譜圖；圖3 為本發(fā)明制備的{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs 的紫外吸收光譜圖；圖4 為本發(fā)明制備的{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs 的(a)TEM圖片，(b)選擇區(qū)域的電子衍射圖，(c)高分辨TEM圖片，(d)粒徑分布直方圖；圖5 為本發(fā)明制備的{ (Auq) 2(I(I-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)} DENPs 在(a)4° C，37° C，50° C; (b)pH=5, pH=6, pH=7, pH=8 條件下的紫外吸收光譜圖；圖6為相差顯微鏡下(a)未經(jīng)處理U87MG細(xì)胞和用(b) 0. 5%的乙醇；(C)溶在0. 5%乙醇中的純 TOS (濃度為 25 ii M) ； (d) PBS ； (e) {(Au0) 2。。-G5. NHAc-FI-(PEG-FA) - (mPEG)}DENPs ； (f) {(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs (TOS 濃度的 25 y M)處理的細(xì)胞形態(tài)圖。圖7 為經(jīng)過(guò)不同濃度的{(Au。) 2QQ-G5. NHAc-FI-(PEG-FA)-(mPEG)} DENPs,TOS, {(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs 孵化 24h 的 U87MG 細(xì)胞 MTT 測(cè)試結(jié)果圖；圖8 為(a) U87MG-HFAR 細(xì)胞用 PBS 處理；(b)，(c) U87MG-LFAR 細(xì)胞和 U87MG-HFAR細(xì)胞用 IOOnM {(Au。)200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS)-(mPEG)} DENPs 分別處理 Ih ； (d), (e)U87MG-LFAR 細(xì)胞和 U87MG-HFAR 細(xì)胞用 IOOnM {(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)}DENPs分別處理Ih的流式細(xì)胞分析圖；(f)為U87MG細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分析數(shù)據(jù)圖。 U87MG-HFAR指高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞，U87MG-LFAR指低葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞；圖 9 為 L929 細(xì)胞(a)用 PBS 處理；(b) {(Au0) 200_G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (mPEG)}DENPs (IOOnM) ； (c) {(Au0) 200-G5. NHAc-FI- (PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs (IOOnM)處理 Ih 的流式細(xì)胞分析圖；(d)為L(zhǎng)929細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分析數(shù)據(jù)圖；圖10為分別用濃度為IOOnM的不同材料孵化Ih的U87MG-LFAR細(xì)胞和U87MG-HFAR細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖；圖11為分別用濃度為IOOnM的不同材料孵化Ih的L929細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖；圖12 為 U87MG-HFAR 細(xì)胞和用(I) {(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)}DENPsC 2 ) {(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (mPEG)} DENPsC 12. 5 u M)孵化 3h 的 U87MG-LFAR細(xì)胞MTT測(cè)試結(jié)果圖，未處理的U87MG-HFAR細(xì)胞作為對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例I(I)用5mL的DMSO溶解干重為11. 94mg的alpha-TOS，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為4. 3Img的EDC，攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mLDMS0溶液的干重為30mg的NH2-PEG-C00H，其中TOS與NH2-PEG-C00H的摩爾比為I. 5:1，EDC與TOS的摩爾比為1: 1，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWcO=IOOO在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到TOS-PEG-COOH。(2)用5mL的DMSO溶解干重為11. 37mg的FA，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為4. 94mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mLDMS0溶液的干重為 34. 36mg 的 NH2-PEG-C00H，其中 FA 與 NH2-PEG-C00H 的摩爾比為 I. 5:1，EDC 與 TOS 的摩爾比為I: I，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWcO=IOOO在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到FA-PEG-C00H。(3 )用5mL的DMSO溶解干重為24. 7 Img的G5PAMAM樹(shù)狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為I. 85mg的FI，其中FI與G5PAMAM樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI0(4)用5mL的蒸餾水溶解干重為20mg的T0S-PEG-C00H，邊攪拌邊逐滴滴加溶于 2mL蒸懼水溶液的干重為31. 4mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸餾水的干重為6. 71mg的G5. NH2-FI樹(shù)狀大分子，其中T0S-PEG-C00H與G5PAMAM樹(shù)狀大分子的摩爾比為34:1，EDC與T0S-PEG-C00H的摩爾比為20:1，反應(yīng)3d，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI-(PEG-TOs)。(5)用5mL的蒸餾水溶解干重為15. 57mg的FA-PEG-C00H，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mL蒸懼水溶液的干重為26. 73mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸餾水溶液的干重為15. 18mg的G5. NH2-FI-(PEG-TOS)，其中FA-PEG-C00H與G5. NH2-FI-(PEG-TOS)的摩爾比為 25:1，EDC 與 FA-PEG-C00H 的摩爾比為 20:1，反應(yīng) 3d,將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到 G5. NH2-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)。(6)用 5mL 的蒸餾水溶解干重為 12. 26mg 的 G5. NH2-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)，邊攪拌邊逐滴滴加438. 45 u L氯金酸溶液(30mg/mL)，攪拌30min后，加入3. 625mg的NaBH4溶液(H20:CH30H(體積比)=2:1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)2h ；(7)向步驟(6)的反應(yīng)液中再加入14.821^三乙胺，攪拌反應(yīng)301^11后，向反應(yīng)液中加入8. 39 u L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，將所得的溶液用纖維素透析膜MWCO= 14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒{(Au°)2CICI-G5.NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)}DENPs。合成過(guò)程中對(duì)樹(shù)狀大分子表面修飾用核磁進(jìn)行表征，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹(shù)狀大分子載體表面修飾了 5. 4個(gè)FI、5. 2個(gè)FA、9. 7個(gè)T0S，21. 14個(gè)PEG分子(附圖2)。對(duì)得到的產(chǎn)品{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs進(jìn)行紫外吸收表征如附圖3，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在523nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(附圖4)表明金納米顆粒直徑約3. 3nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進(jìn)一步以電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Au含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹(shù)狀大分子載有200個(gè)金原子，這些測(cè)試結(jié)果表明已成功設(shè)計(jì)合成功能化的樹(shù)狀大分子{(Au°)2CICI-G5.NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)}DENPs。實(shí)施例2
以紫外可見(jiàn)吸收光譜圖對(duì)材料的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，取0. 5mg/mL實(shí)施例I制備的功能化的樹(shù)狀大分子材料，溶劑為蒸餾水，置于4° C，37° C，50° C的溫度條件下和pH=5, 6，7，8的條件下，測(cè)其紫外可見(jiàn)吸收光譜，從譜圖中可見(jiàn)其峰型一致且良好，無(wú)偏移現(xiàn)象，參見(jiàn)圖5，說(shuō)明該材料適應(yīng)不同溫度以及不同pH條件，具有良好的穩(wěn)定性及分散性。實(shí)施例3用細(xì)胞形態(tài)來(lái)分析所制備材料的藥物活性，稱取I. OmgTOS，溶于7535. 8 y L的0. 5%乙醇中配制alpha-TOS濃度為250 y M的溶液；稱取實(shí)施例I中材料4mg，溶于1112. 7 ii L的PBS緩沖液中配制alpha-TOS濃度為250 u M的溶液；稱取對(duì)比例I中材料3. 75mg,溶于1051. 3 y L的PBS緩沖液中配制材料濃度為25 y M的溶液；將U87MG細(xì)胞種于96孔板，IO4個(gè)細(xì)胞/孔，孵化24h后，分別在每孔加10uLPBS,0. 5%乙醇，alpha-TOS(250iiM)，實(shí)施例I材料(25iiM，alpha-TOS濃度為250yM)，對(duì)比例I材料(25yM，不含alpha-TOS)和90 y L培養(yǎng)基，孵化24h后，將材料倒掉，使用相差顯微鏡拍攝細(xì)胞圖像，結(jié)果表明用自由的 alpha-TOS 和{(Au°)200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs 孵化的細(xì)胞其形態(tài)明顯具有凋亡跡象，而對(duì)比例I載體材料{(Au°)2QQ-G5. NHAc-FI-(PEG-FA)-(mPEG)}孵化的細(xì)胞形態(tài)良好，排除了載體材料對(duì)細(xì)胞的毒性影響，參見(jiàn)附圖6。說(shuō)明本發(fā)明中制備得到的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒材料具有癌細(xì)胞治療效果。實(shí)施例4以MTT測(cè)試來(lái)檢測(cè)制備得到的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒材料的藥物活性，稱取實(shí)施例I中材料8mg，溶于1112. 7 ii L的PBS緩沖液中配制alpha-TOS濃度為500 U M的溶液，再分別稀釋到alpha-TOS濃度為250 uM, 125iiM，62. 5iiM 的溶液，稱取 I. 2mg 的自由 alpha-TOS，溶于 4521. 6 u L0. 5% 的乙醇中配制alpha-TOS濃度為500 u M的溶液，再分別稀釋到自由alpha-TOS濃度為250 u M，125 iiM，62. 5 ii M的溶液，稱取對(duì)比例I中材料7. 5mg，溶于1051. 3 y L的PBS緩沖液中配制500 u M的溶液，再分別稀釋到250 u M，125 uM,62.5uM的溶液，該材料的濃度和負(fù)載alpha-TOS濃度為250 u M，125 uM,62. 5uM的實(shí)施例I材料相當(dāng)。將上述不同濃度的材料(其各自的終濃度均為50 PM, 25 u M，12. 5 u M, 6. 25 u M)孵化U87MG細(xì)胞24h后，將材料倒掉，加入180 u L培養(yǎng)基和20 u LMTT,在37°C孵化4h后，將培養(yǎng)液倒掉，加入200 u LDMSO,搖床振搖20min后，用酶標(biāo)儀測(cè)得結(jié)果，得到圖7所示數(shù)據(jù)，結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)實(shí)施例I材料促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，且較純alpha-TOS而言，實(shí)施例I中材料對(duì)癌細(xì)胞的致死效果更為明顯，起到藥物治療作用，且載體材料不存在藥物毒性。實(shí)施例5以流式細(xì)胞測(cè)試來(lái)證明制備得到的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒材料的靶向性。稱取實(shí)施例I材料0. 5mg，溶于4575. 5 ii L的PBS緩沖液中配制濃度為IOOOnM的溶液；稱取對(duì)比例2材料0. 45mg,溶于4013. 06 u L的PBS緩沖液中配制濃度為IOOOnM的溶液；將U87MG細(xì)胞和L929細(xì)胞種于12孔板，2X IO5細(xì)胞/孔，U87MG細(xì)胞分為高葉酸受體表達(dá)和低葉酸受體表達(dá)，使用2. 5 ii M葉酸處理的細(xì)胞為低葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞，未使用葉酸處理的細(xì)胞為高葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞。各細(xì)胞使用等體積的PBS處理，孵化24h后，分別在每孔加100 實(shí)施例1，對(duì)比例2材料和900 u L培養(yǎng)基，各材料的終濃度為IOOnM,孵化Ih后將材料吸出，用PBS洗2-3次，用胰蛋白酶將細(xì)胞懸浮，離心后，溶于ImLPBS中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明用濃度為 IOOnM 的{(Au。)2Q(I-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)}DENPs 孵化癌細(xì)胞lh，對(duì)高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞具有靶向作用，不帶葉酸的對(duì)比例2材料{(Au°)2CICI-G5.NHAc-FI-(PEG-TOS) -mPEG} DENPs對(duì)高低葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞不具靶向作用，通過(guò)熒光強(qiáng)度的顯著性差異說(shuō)明制得的實(shí)施例I材料對(duì)高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞具有特異性，且不會(huì)與L929細(xì)胞(正常細(xì)胞)結(jié)合，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖8，9。實(shí)施例6以共聚焦顯微鏡測(cè)試來(lái)證明制備得到的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的靶向性。稱取實(shí)施例I材料0. 55mg，溶于5032. 8uL的PBS緩沖液中配制濃度為IOOOnM的溶液；稱取對(duì)比例2材料0. 5mg,溶于4458. 95 u L的PBS緩沖液中配制濃度為IOOOnM的溶液；將U87MG細(xì)胞和L929細(xì)胞種于放有蓋玻片的12孔板，5X IO4細(xì)胞/孔，U87MG細(xì)胞分為高葉酸受體表達(dá)和低葉酸受體表達(dá)，使 用2. 5 ii M葉酸處理的細(xì)胞為低葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞，未使用葉酸處理的細(xì)胞為高葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞。各細(xì)胞使用等體積的PBS處理，孵化24h后，分別在每孔加100 u L實(shí)施例1，對(duì)比例2材料和900 u L培養(yǎng)基，各材料的終濃度為IOOnM,孵化Ih后將材料吸出，用PBS洗2-3次，每孔加入2. 5%戊二醛500 ii L固定15min，再用PBS洗2-3次，加liig/mL Hoechst33342500iiL染色20min后，用PBS洗2_3次，將蓋玻片上的細(xì)胞封片至載玻片上，在共聚焦顯微鏡下拍攝，結(jié)果表明用濃度為IOOnM的{(AU°)2CICI-G5.NHAc-FI- (PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs孵化癌細(xì)胞lh，對(duì)高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞具有靶向作用，不帶葉酸的對(duì)比例2材料{(Au°)2QQ-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS)-mPEG}DENPs對(duì)高低葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞不具靶向作用，通過(guò)共聚焦顯微鏡圖片可清晰的看到實(shí)施例I材料進(jìn)入了高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明制得的材料對(duì)高葉酸受體表達(dá)細(xì)胞具有特異性，且不會(huì)進(jìn)入到L929細(xì)胞(正常細(xì)胞)中，參見(jiàn)附圖10，11。該結(jié)果與流式細(xì)胞測(cè)試結(jié)果相一致，共同說(shuō)明實(shí)施例I材料對(duì)于癌細(xì)胞的靶向特異性。實(shí)施例7以MTT測(cè)試實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)得到的抗腫瘤藥物alpha-維生素E琥珀酸酯負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒材料的靶向治療效果，稱取實(shí)施例I中材料4mg，溶于1112. 7 ii L的PBS緩沖液中配制alpha-TOS濃度為250 u M的溶液，再將該溶液稀釋至125 u M ;稱取對(duì)比例2中材料3mg，溶于813. 34 ii L的PBS緩沖液中配制alpha-TOS濃度為250 u M的溶液，再將該溶液稀釋至125 u M ;將U87MG細(xì)胞種于96孔板，I X IO4細(xì)胞/孔，U87MG細(xì)胞分為高葉酸受體表達(dá)和低葉酸受體表達(dá)，使用2. 5 ii M葉酸處理的細(xì)胞為低葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞，未使用葉酸處理的細(xì)胞為高葉酸受體表達(dá)的U87MG細(xì)胞。各細(xì)胞使用等體積的PBS處理，孵化24h后，每孔加10 u L125 u M的實(shí)施例I材料、對(duì)比例2材料和90 y L培養(yǎng)基，各材料的終濃度為12. 5 u M，孵化3h后，將培養(yǎng)液倒掉，換新培養(yǎng)基孵化24h后，加入180 y L培養(yǎng)基和20 u LMTT,在37°C孵化4h后，將MTT倒掉，加入200 u LDMSO,搖床振搖20min后，用酶標(biāo)儀測(cè)得結(jié)果。結(jié)果表明濃度為 12. 5 ii M 的{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)}DENPs孵化癌細(xì)胞3h，高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞活力遠(yuǎn)低于低葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞活力，且具有顯著性差異，說(shuō)明對(duì)高葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞具有靶向作用，參見(jiàn)附圖12，說(shuō)明葉酸修飾的材料能夠被表面有高葉酸受體表達(dá)的癌細(xì)胞吞噬，從而實(shí)施對(duì)癌細(xì)胞的特異性治療。對(duì)比實(shí)施例I(I)用5mL的DMSO溶解干重為14. 2 Img的FA，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為6. 17mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mLDMS0溶液的干重為 42. 92mg 的 NH2-PEG-C00H，其中 FA 與 NH2-PEG-C00H 的摩爾比為 I. 5:1，EDC 與 TOS 的摩爾比為I: I，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWcO=IOOO在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到FA-PEG-C00H。(2)用5mL的DMSO溶解干重為33. 42mg的G5PAMAM樹(shù)狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為2. 50mg的FI，其中FI與G5PAMAM樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI0
(3)用5mL的蒸餾水溶解干重為26. 40mg的FA-PEG-C00H，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mL蒸懼水溶液的干重為45. 32mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸餾水的干重為16. 45mg的G5. NH2-FI,其中FA-PEG-C00H與G5. NH2-FI的摩爾比為20:1，EDC與FA-PEG-C00H的摩爾比為20: 1，反應(yīng)3d，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI-(PEG-FA)。(4)用5mL的蒸餾水溶解干重為11. 32mg的mPEG_C00H，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mL蒸懼水溶液的干重為21. 67mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸餾水溶液的干重為 9. 58mg 的 G5. NH2-FI-(PEG-FA)，其中 mPEG-COOH 與 G5. NH2-FI-(PEG-FA)的摩爾比為30:1，EDC與mPEG-COOH的摩爾比為20:1，反應(yīng)3d，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI-(PEG-FA)-mPEG。(5)用5mL的蒸餾水溶解干重為6. 3Img的G5. NH2-FI-(PEG-FA)-mPEG，邊攪拌邊逐滴滴加250. 92 u L氯金酸溶液(30mg/mL)，攪拌30min后，加入2. 074mg的的NaBH4溶液(H2O:CH3OH(體積比)=2:1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)2h ；(6)向步驟(5)的反應(yīng)液中再加入8. 48iiL三乙胺，攪拌反應(yīng)30min后，向反應(yīng)液中加入4. 80 y L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到不含TOS的對(duì)比材料{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-FA) -mPEG} DENPs。合成過(guò)程中對(duì)該對(duì)比材料用核磁進(jìn)行表征，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹(shù)狀大分子載體表面修飾了 5. 4個(gè)FI、5. 2個(gè)FA、20. I個(gè)PEG分子。以電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Au含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹(shù)狀大分子載有200個(gè)金原子，這些測(cè)試結(jié)果表明已成功設(shè)計(jì)合成不含TOS的對(duì)比材料{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-FA) -mPEG}DENPs。對(duì)比實(shí)施例2(I)用5mL的DMSO溶解干重為10. 5mg的alpha-TOS，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為3. 79mg的EDC，攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mLDMS0溶液的干重為26. 38mg的NH2-PEG-C00H，其中TOS與NH2-PEG-C00H的摩爾比為I. 5:1，EDC與TOS的摩爾比為1: 1，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWcO=IOOO在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到TOS-PEG-COOH。(2)用5mL的DMSO溶解干重為31. 27mg的G5PAMAM樹(shù)狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mLDMS0溶液的干重為2. 34mg的FI，其中FI與G5PAMAM樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1，反應(yīng)ld，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI0(3)用5mL的蒸餾水溶解干重為15mg的T0S-PEG-C00H，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mL蒸懼水溶液的干重為23. 56mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸餾水的干重為5. 032mg的G5. NH2-FI,其中T0S-PEG-C00H與G5. NH2-FI的摩爾比為34:1，EDC與T0S-PEG-C00H的摩爾比為20: 1，反應(yīng)3d，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI-(PEG-TOs)。(4)用5mL的蒸餾水溶解干重為13. Olmg的mPEG-COOH，邊攪拌邊逐滴滴加溶于2mL蒸懼水溶液的干重為25mg的EDC,攪拌反應(yīng)3h后，向該溶液中逐滴滴加溶于5mL蒸懼 水溶液的干重為 9. 72mg 的 G5. NH2-FI-(PEG-TOS)，其中 mPEG-COOH 與 G5. NH2-FI-(PEG-TOS)的摩爾比為35:1，EDC與mPEG-COOH的摩爾比為20:1，反應(yīng)3d，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到G5. NH2-FI-(PEG-TOS)-mPEG。(5)用5mL的蒸餾水溶解干重為5. 57mg的G5. NH2-FI-(PEG-T0S)-mPEG，邊攪拌邊逐滴滴加210. 26 u L氯金酸溶液(30mg/mL)，攪拌30min后，加入I. 738mg的的NaBH4溶液(H2O:CH3OH(體積比)=2:1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)2h ；(6)向步驟(5)的反應(yīng)液中再加入7. 106iiL三乙胺，攪拌反應(yīng)30min后，向反應(yīng)液中加入4. 02 y L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，將所得的溶液用纖維素透析膜MWC0=14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3d，冷凍干燥處理得到不含F(xiàn)A的對(duì)比材料{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) -mPEG} DENPs。合成過(guò)程中對(duì)該對(duì)比材料用核磁進(jìn)行表征，對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹(shù)狀大分子載體表面修飾了 5.4個(gè)？1、9.3個(gè)1'05、20.4個(gè)？￡6分子。以電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Au含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹(shù)狀大分子載有200個(gè)金原子，這些測(cè)試結(jié)果表明已成功設(shè)計(jì)合成不含F(xiàn)A的對(duì)比材料{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) -mPEG}DENPs。
權(quán)利要求
1.一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，包括 (1)將alpha-維生素E琥珀酸酯alpha-TOS溶于二甲基亞砜DMSO中，加入EDC活化2-3h 后，加入 NH2-PEg-COOH 的 DMSO 溶液，攪拌反應(yīng) 12_24h，得到 T0S-PEG-C00H ； (2)將葉酸FA溶于溶劑中，加入EDC活化2-3h后，加入NH2-PEG-C00H的DMSO溶液，攪拌反應(yīng) l-2d，得到 FA-PEG-C00H ； (3)將第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的DMSO溶液中加入異硫氰酸熒光素FI的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)12-24h，得到G5. NH2-FI ； (4)將T0S-PEG-C00H和FA-PEG-C00H的水溶液經(jīng)過(guò)EDC活化2_3h后，依次加入到G5. NH2-FI的水溶液中，攪拌反應(yīng)2-3d，得到樹(shù)狀大分子G5. NH2-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)溶液； (5)將上述樹(shù)狀大分子G5.NH2-FI-(PEG-TOS)-(PEG-FA)溶液中加入氯金酸溶液，攪拌20-40min,然后加入硼氫化鈉溶液攪拌反應(yīng)l_4h，再加入三乙胺N(C2H5) 3攪拌20_40min，最后加入乙酸酐Ac2O,攪拌反應(yīng)12-24h，然后進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得包裹金納米粒子的樹(shù)狀大分子{(Au0) 200-G5. NHAc-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)} DENPs。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中EDC與TOS的摩爾比為I :1，TOS與PEG的摩爾比為I.5-2:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的溶劑為DMS0。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中EDC與FA的摩爾比為I :1，F(xiàn)A與PEG的摩爾比為1.5-2 Io
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中FI與第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中T0S-PEG-C00H與G5. NH2-FI的摩爾比為34:1，EDC與T0S-PEG-C00H 的摩爾比為 20:1，F(xiàn)A-PEG-C00H 與 G5. NH2-FI-(PEG-TOs)的摩爾比為 25:1，EDC 與 FA-PEG-C00H 的摩爾比為 20:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中硼氫化鈉溶液的溶劑為水和甲醇的混合溶液，水和甲醇的體積比為2:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中HAuCl4 · 4H20和樹(shù)狀大分子G5. NH2-FI-(PEG-TOS) - (PEG-FA)的摩爾比為 200:1，NaBH4 與 HAuCl4 · 4H20 的摩爾比為2-5:1，三乙胺 N(C2H5) 3、乙酸酐 Ac2O 和樹(shù)狀大分子 G5. NH2-FI- (PEG-TOS) - (PEG-FA)的摩爾比為 120-660:100-550:10
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中透析為透析膜為纖維素透析膜MWC0=14000，在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種alpha-TOS負(fù)載的樹(shù)狀大分子包裹的納米金顆粒的制備方法，包括(1)alpha-TOS溶液中加EDC，NH2-PEG-COOH溶液，反應(yīng)得TOS-PEG-COOH；(2)葉酸中加入EDC，NH2-PEG-COOH溶液，反應(yīng)得FA-PEG-COOH；(3)將聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子溶液中加入FI溶液，反應(yīng)，得到G5.NH2-FI；(4)將TOS-PEG-COOH和FA-PEG-COOH的溶液加入EDC活化，加入到G5.NH2-FI的水溶液中，反應(yīng)，得到樹(shù)狀大分子溶液；(5)將上述溶液中加入氯金酸、NaBH4、N(C2H5)3、乙酸酐，反應(yīng)，即得。該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)易于操作。
文檔編號(hào)A61K49/04GK102973949SQ201210593688
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者史向陽(yáng), 朱靜怡 申請(qǐng)人:東華大學(xué)