專利名稱：一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法，一種免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一種嚴(yán)重危害偶蹄動物的病毒性疫病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的烈性傳染病，中國將其列為一類動物傳染病。該病主要侵染豬、牛、羊等偶蹄動物，傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍發(fā)生大流行。 FMD的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，歸屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)。FMDV有七個血清型，分別為O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3，每個血清型又可產(chǎn)生很多基因亞型，也因流行區(qū)域而分為很多的拓?fù)湫停徊煌逍椭g無交叉保護(hù)反應(yīng)，同一血清型的不同譜系病毒之間的交叉免疫保護(hù)性也有差異，因而經(jīng)常需要根據(jù)流行毒與疫苗毒株的抗原關(guān)系分析，來確定用于預(yù)防流行毒株的適宜的疫苗毒株。FMDV核酸分子為單股正鏈的RNA分子，基因組全長約8500個堿基，只含有一個大的開放閱讀框，表達(dá)產(chǎn)生的聚蛋白逐級裂解產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，結(jié)構(gòu)蛋白組裝產(chǎn)生病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，非結(jié)構(gòu)蛋白則參與病毒與宿主的相互作用、抑制宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機制、參與病毒的復(fù)制過程。病毒衣殼蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，在結(jié)構(gòu)蛋白上存在多個構(gòu)象性的與線性的中和表位。早期通過單克隆抗體與免疫逃逸突變株的序列分析研究表明，在O型FMDV至少存在5個功能獨立的中和性抗原表位，組成抗原位點的區(qū)段主要包括VPl的G-H環(huán)以及其C端氨基酸，VP2的31，70 73，75和77位氨基酸，VPlB-C環(huán)的43和44位點氨基酸；VP3的58位氨基酸，VPl 149位氨基酸等參與構(gòu)成五個中和表位。這5個中和表位除了由VPlG-H環(huán)構(gòu)成的位點I為線性表位外，其余均為構(gòu)象表位。利用合成肽免疫實驗動物和牛的試驗似乎證明位點I是最優(yōu)勢的抗原表位，但是有的試驗結(jié)果顯示疫苗免疫后針對位點2的抗體應(yīng)答水平高于位點I ;其中針對G-H環(huán)位點的免疫顯然是最重要的，因為不同血清型病毒，在G-H環(huán)附近的變異幅度最大，而且G-H環(huán)是病毒結(jié)合細(xì)胞受體的部位。VPlG-H環(huán)也是研制口蹄疫表位肽疫苗的主要基因?qū)ο?，但是單獨合成G-H環(huán)研制表位肽疫苗并不能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，還需要有T細(xì)胞表位的參與才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的保護(hù)性免疫應(yīng)答。T細(xì)胞表位對于誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體、盡早的清除病毒具有重要的作用，有學(xué)者綜合分析了不同血清型病毒抗原位點區(qū)域的差異，結(jié)果顯示B-細(xì)胞與T-細(xì)胞抗原位點區(qū)域顯示出很明顯的血清型特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3A與3D上均存在T-細(xì)胞表位，有些T-細(xì)胞表位在血清型間比較保守，有些在毒株之間差異較大；其中VP4，VPl，3A，3D蛋白中均含有保守的T細(xì)胞表位，這些表位可能更易被宿主細(xì)胞表達(dá)的MHC分子識別，因而在分子疫苗設(shè)計中受到更多的關(guān)注?，F(xiàn)在使用的口蹄疫疫苗主要為全病毒抗原滅活疫苗，在疫苗的制造過程中需要動用活病毒，因而，需要達(dá)到生物安全三級標(biāo)準(zhǔn)的GMP生產(chǎn)車間來防止病毒的擴散。同時、高效疫苗的生產(chǎn)過程中，要對病毒抗原進(jìn)行濃縮，因而疫苗的生產(chǎn)與制備成本較高?；蚬こ桃呙绲难兄婆c應(yīng)用，將為解決這些問題提供方法。目前，已經(jīng)有合成肽疫苗被批準(zhǔn)用于豬口蹄疫的免疫預(yù)防，美國也核準(zhǔn)了口蹄疫病毒基因重組腺病毒活載體疫苗新獸藥注冊申請，說明未來口蹄疫基因工程疫苗替代傳統(tǒng)滅活疫苗將是一種趨勢?；蚬こ桃呙绲膽?yīng)用也有助口蹄疫感染動物與疫苗免疫動物的鑒別診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及 其制備方法，利用該方法制備的BI與TI混合表位疫苗免疫豬，能夠產(chǎn)生同等或優(yōu)于全病毒滅活疫苗的保護(hù)性免疫效果，而且對三個譜系的病毒都具有交叉保護(hù)作用，是一種新型的免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。其技術(shù)方案為一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗，由四部分組成，由中國型(Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯(lián)B細(xì)胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO :1，氨基酸序列為SEQ ID NO :2 ;由通用T細(xì)胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細(xì)胞表位串聯(lián)組成的T細(xì)胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ ID N0:3，氨基酸序列為SEQ ID NO :4 ;添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸〔Polyinosinic :polycytidylic acid, Poly (1: C)〕和 / 或 Toll 樣受體 7/8 劑動劑-R848 為免疫增強劑；201油佐劑。進(jìn)一步，對于免疫豬，所述疫苗的用量為仔豬lmL，成年豬2mL每頭份，耳后部深部肌肉注射。本發(fā)明口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制備方法，重組B與T細(xì)胞表位免疫原均可通過末端融合的6-組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行親合層析純化，純化的B1、TI免疫原與Poly(1:C)分別按終濃度400，300與300 μ g/mL配制于磷酸鹽緩沖液，然后按體積比1:1加入201油佐劑進(jìn)行乳化制備成疫苗。本發(fā)明的有益效果豬體免疫試驗結(jié)果顯示，與口蹄疫O型傳統(tǒng)滅活疫苗相比單獨BI油佐劑疫苗在免疫后產(chǎn)生較高水平的中和抗體，BI免疫原添加Poly(I = C)后中和抗體的水平顯著高于未免疫組與滅活疫苗免疫組(P < 0.01);同時，BI免疫原加入TI與Poly(I = C)后，中和抗體的應(yīng)答水平更加均勻，個體差異縮小，而且對不同譜系病毒的交叉中和作用也有明顯提高((P < 0. 05));再用1000個豬半數(shù)感染量(PID50)的0/Mya/98系豬體適應(yīng)毒攻擊后，BI+Poly(1:C)與BI+TI+Poly(1:C)組豬均可完全抵抗強毒攻擊，攻毒后10天內(nèi)無一頭豬表現(xiàn)出臨床癥狀；而BI單獨免疫組與滅活苗免疫組分別有2頭與3頭豬表現(xiàn)臨床癥狀；對照組五頭豬于攻毒后5天內(nèi)全部發(fā)病。說明BI抗原是一種很好的B細(xì)胞免疫原，添加TI和Poly(1:C)能夠誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答，其對豬的免疫保護(hù)作用優(yōu)于滅活疫苗，因而，是一種新型的免疫增強型口蹄疫混合表位疫苗。


圖1為BI抗原的表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳分析圖.其中，M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，I為誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，2為誘導(dǎo)前對照，3 5顯示在洗脫緩沖液D、E和F中的純化蛋白.；圖2為TI抗原的表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳分析圖，其中M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，I為為誘導(dǎo)前對照，2與3為誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，4與5為在洗脫緩沖液E中的純化蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖具體實施例來詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。材料與方法B細(xì)胞免疫原BI的設(shè)計與表達(dá) 根據(jù)國內(nèi)外O型口蹄疫流行病學(xué)信息，設(shè)計并合成了 B細(xì)胞免疫原基因BI，所含有的O型口蹄疫病毒中和抗原表位序列如下表I所示，將表I中的氨基酸序列按下列順序進(jìn)行排列組合PADRE-GG-(0/HN/CHA/09)VPl 132-160-GG-VP1 193-211-GG-(0/Tibet/99)VPl132-160-GG-(0/IRN/2010) VPl 193-211-GG-VPl 132-160-GG-(0/Mya98)VP1132-160-GG-VP1 193-211-GG-1nvasin_6 XHis，各表位之間以兩個甘氨酸相連，最后加6組氨酸標(biāo)簽序列，有利于表達(dá)蛋白的純化。設(shè)計好的序列交由南京GenScript公司進(jìn)行編碼序列的優(yōu)化與合成，兩端分別加入啟始密碼子與終止密碼子，并加入Nco I與Hind III酶切位點，合成的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其蛋白序列為SEQ ID NO. 2 表1. B細(xì)胞免疫原基因BI中的表位序列組成
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特征在于，由四部分組成，由中國型(Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯(lián)B細(xì)胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO :1，氨基酸序列為SEQ ID NO 2 ;由通用T細(xì)胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細(xì)胞表位串聯(lián)組成的T細(xì)胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ IDNO :3，氨基酸序列為SEQ ID NO 4 ;添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll樣受體7/8劑動劑-R848為免疫增強劑；201油佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特征在于，對于免疫豬，所述疫苗的用量為仔豬lmL，成年豬2mL每頭份，耳后部深部肌肉注射。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制備方法，其特征在于，重組B與T細(xì)胞表位免疫原均可通過末端融合的6-組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行親合層析純化，純化的B1、TI免疫原與Poly (1: C)分別按終濃度400，300與300 μ g/mL配制于磷酸鹽緩沖液，然后按體積比1:1加入201油佐劑進(jìn)行乳化制備成疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口蹄疫病毒混合表位疫苗及其制備方法，該疫苗由四部分組成，由中國型、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯(lián)B細(xì)胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO1，氨基酸序列為SEQ ID NO2；由通用T細(xì)胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細(xì)胞表位串聯(lián)組成的T細(xì)胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ ID NO3，氨基酸序列為SEQID NO4；添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll樣受體7/8劑動劑-R848為免疫增強劑；201油佐劑。利用該方法制備的BI與TI混合表位疫苗免疫豬，能夠產(chǎn)生同等或優(yōu)于全病毒滅活疫苗的保護(hù)性免疫效果，而且對三個譜系的病毒都具有交叉保護(hù)作用，是一種新型的免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。
文檔編號A61P31/14GK103007273SQ201210480120
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者盧曾軍, 劉在新, 曹軼梅, 孫普, 李冬, 包慧芳, 李平花, 付元芳, 陳白興文, 應(yīng)理, 謝寶霞 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所