專利名稱：人源抗Trop-2基因工程抗體IgG及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及人源曬菌體抗體庫及I株抗Trop-2抗體IgG的重、輕鏈基因及其所編碼的蛋白，以及所述蛋白及其衍生物在制備治療胰腺癌等上皮起源腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰腺癌是一種極其兇險(xiǎn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率在全世界范圍內(nèi)均呈明顯的上升趨勢(shì)，2008年胰腺癌分別占男性和女性癌癥死因的第4、第5位，其發(fā)病率和死亡率幾乎 相等。胰腺癌的診治是世界級(jí)的醫(yī)學(xué)難題，惡性程度高、進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后極差，癥狀隱匿，難以早期診斷，其容易發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和胰腺的解剖學(xué)特點(diǎn)決定了外科手術(shù)難以達(dá)到根治性切除。隨著手術(shù)方式的改進(jìn)及放療、化療等綜合措施的引進(jìn)，并發(fā)癥和死亡率有所降低，但五年生存率仍不到5%。胰腺癌作為一種對(duì)現(xiàn)有治療手段無滿意療效的高度惡性腫瘤，尋找新的具有臨床應(yīng)用價(jià)值的胰腺癌治療手段如靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)。隨著對(duì)腫瘤基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究的不斷深入，人們對(duì)腫瘤細(xì)胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它們對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響已經(jīng)越來越清楚，這也使得針對(duì)腫瘤的特異性分子靶點(diǎn)設(shè)計(jì)抗腫瘤治療新方案成為可能。腫瘤的分子靶向治療是一種有異于傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療的新的治療模式，優(yōu)越性在于藥物通常僅與相應(yīng)的靶位結(jié)合，通過直接影響其靶位分子的功能，或本身帶有的物理或化學(xué)效應(yīng)分子來達(dá)到殺傷或抑制目標(biāo)細(xì)胞的作用。由于靶位明確，藥物通常具有很高的選擇性，既可有效殺傷或抑制靶細(xì)胞，又對(duì)正常組織細(xì)胞不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生較小的毒副作用。因此，研制分子靶向藥物成為腫瘤臨床研究的熱點(diǎn)。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2 (human trophoblast cell surface antigen 2，Trop-2)是由TACSTD2基因編碼的細(xì)胞表面糖蛋白。Trop-2由323個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中信號(hào)肽26個(gè)氨基酸，胞外區(qū)248個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)23個(gè)氨基酸，胞質(zhì)區(qū)26個(gè)氨基酸。大量臨床研究和文獻(xiàn)報(bào)道表明，Trop-2在胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、子宮癌和胰腺癌等上皮癌中過表達(dá)，而在成年人正常組織中很少表達(dá)或不表達(dá)；Trop-2在腫瘤組織中的過表達(dá)與患者的預(yù)后不良和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)影響患者的總生存率。因此，Τι·ορ-2已成為腫瘤分子靶向治療中引人注目的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明旨在提供抗Trop-2抗體IgG的重、輕鏈基因及其編碼的多肽，其重組表達(dá)的IgG能夠與Trop-2分子具有特異性結(jié)合能力、對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，所述抗體的Vl鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；
SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；
SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ；
并且所述抗體的Vh鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；
SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ； SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。所述抗體的'鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。所述抗體的八鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。所述抗體的\鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh鏈的氨基酸序列如SEQ IDNO. 13所示。所述抗體的\鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh鏈的核苷酸序列如SEQ IDNO. 14所示。人源抗Trop-2基因工程抗體IgG在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明人從60例胰腺癌患者的全血中分離的B淋巴細(xì)胞中，擴(kuò)增所有的抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，采取基因工程方法，構(gòu)建庫容量為6. 3 X IO9的全人源Fab抗體庫，用重組的Trop-2蛋白和過表達(dá)Trop-2的胰腺癌細(xì)胞BXPC3對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選，分離了 I株抗Trop-2的特異性人源Fab抗體。將Fab的可變區(qū)基因分別與人源抗體IgG的穩(wěn)定區(qū)基因CH和CL融合，制備抗Trop-2抗體IgG分子的重鏈和輕鏈基因，克隆于真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHOdhfr-細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)Protein G柱親和純化后,用于抗體的功能分析。
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，抗Trop-2抗體IgG能夠與Trop-2陽性細(xì)胞BXPC3特異性結(jié)合，但不結(jié)合未表達(dá)Trop-2的NIH3T3細(xì)胞；熒光染色結(jié)果表明，抗Trop-2抗體IgG能夠與陽性細(xì)胞BXPC3的結(jié)合，陽性信號(hào)主要顯示在細(xì)胞膜上，表明抗Trop-2的IgG抗體能夠特異性結(jié)合于BXPC3細(xì)胞表面的天然構(gòu)象Trop-2蛋白；體外試驗(yàn)結(jié)果表明，抗Trop-2抗體IgG對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)84. 15% ;動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗Trop-2抗體IgG對(duì)胰腺癌生長(zhǎng)具有的抑制作用，腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)56. 85%。


圖 I 純化的抗 Trop-2 抗體Fab 的 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測(cè)；A Fab 的 SDS-PAGE檢測(cè)；B Fab 的 Western blot 檢測(cè)；
圖2純化抗體的SDS-PAGE檢測(cè)，M :蛋白Marker ； I :純化后的單抗；
圖3抗Trop-2抗體IgG效價(jià)的檢測(cè)；
圖4 FACS檢測(cè)抗Trop-2抗體IgG分別與NIH3T3細(xì)胞、BxPc3細(xì)胞的結(jié)合；A :抗Trop-2抗體IgG與NIH3T3細(xì)胞結(jié)合的檢測(cè)；B :抗Trop-2抗體IgG與BxPc3細(xì)胞結(jié)合的檢測(cè)圖5抗Trop-2抗體對(duì)BXPC3細(xì)胞系增殖的影響。圖6 抗Trop-2抗體對(duì)胰腺癌增殖的抑制作用；I :陰性對(duì)照；2: O. 4mg/kg組；3 2 mg/kg 組；4: 10 mg/kg 組。
具體實(shí)施方案
以下具體實(shí)施方式
不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例I
全人源Fab曬菌體抗體庫的構(gòu)建
采集胰腺癌患者全血60份,分離淋巴細(xì)胞,采用Invitrogen公司的Trizol抽提總RNA，用0lig0(dT)2(l為引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。然后利用特異性引物PCR分別擴(kuò)增其重、輕鏈可變區(qū)基因。經(jīng)Overlap PCR合成Fab基因，與經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pComb3XSS連接，構(gòu)建Fab的原核重組表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue，構(gòu)建了容量為6. 3 X IO9的全人源Fab抗體庫。所述構(gòu)建的Fab基因與pComb3xSS載體連接是指將純化定量后的Fab基因分別以SfiI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化；純化、定量后與同樣雙酶切pComb3xSS載體連接；所述的轉(zhuǎn)化是指a) O. 2cm電轉(zhuǎn)杯，25 μ F，2. 5 kV，200 Ω的電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue ；b)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)2 h，10倍梯度稀釋將菌液涂布于SOBAG瓊脂板上，30°C過夜培養(yǎng)；c)次日計(jì)算平板上的克隆數(shù)，估算庫容為6. 3 X IO9 ；d)將電轉(zhuǎn)化后菌液加入輔助噬菌體VCSM13超感染，離心沉淀菌體，用LB培養(yǎng)基重懸，37 °C振蕩過夜,離心沉淀菌體,吸取上清即為Fab噬菌體抗體庫。
抗Trop-2特異性抗體的篩選、表達(dá)及純化
用純化的重組人Trop-2蛋白包被固相篩選ELISA板，每孔2 μ g，洗滌，加封閉液，洗滌，加入噬菌體抗體庫抗體，洗滌去除未結(jié)合的噬菌體抗體；加入胰蛋白酶，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，感染增值，輔助噬菌體VCSM13超感染；重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行五輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選；
將最后一輪篩選且增值得到的噬菌體稀釋后鋪于LBA培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜，挑取60個(gè)單菌落于細(xì)胞培養(yǎng)板中，振搖培養(yǎng)過夜；從第一塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移5μ L菌液至第二塊板，振搖培養(yǎng)；加輔助噬菌體VCSM13超感染，振搖培養(yǎng)；離心，培養(yǎng)基重懸沉淀，振搖培養(yǎng)過夜。離心取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm計(jì)算每孔吸光值；iP/N值(Positive/Negative)大于4時(shí),該菌株為陽性單克隆曬菌體菌株；共得到8個(gè)陽性克隆。陽性克隆經(jīng)核酸序列分析后，8個(gè)克隆的基因序列相同，為同一個(gè)Fab。將陽性克隆噬菌體感染疋coli. ToplOF’，含有重組質(zhì)粒pComb3x_Fab的菌株接種IOOOmL的LB液體培養(yǎng)基中(含有100ug/mL的氨芐青霉素)，37°C搖床培養(yǎng)至0D600nm至0. 9，加入終濃度為ImM的IPTG，37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。用SDS-PAGE和ffestern-blot鑒定。結(jié)果顯示，在預(yù)期大小處出現(xiàn)目的條帶，分別為Fab的Fd鏈和L鏈(圖I )。人源抗Trop-2抗體IgG的制備與特性分析
根據(jù)抗體的可變區(qū)基因序列，合成可變區(qū)基因的引物如下
Vh上游引物為
5’ -gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAG-3，
Vh下游引物為
5’ -GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGG-3’ ；
'上游引物為
5’ -GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCCAGATGACCCAG-3，
'下游引物為 5’ -ACGCGTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3>。分別以Fab基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因VH、Vl,同時(shí)擴(kuò)增人IgG的恒定區(qū)基因Ch、(^經(jīng)重疊延伸PCR構(gòu)建IgG抗體的重鏈基因與輕鏈基因，克隆于真核表達(dá)載體中。從液氮罐取出CHOdhfr-細(xì)胞，用含有10% FBS的F-12培養(yǎng)基，空細(xì)胞培養(yǎng)需加HT，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代，鋪到六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%時(shí)，轉(zhuǎn)染IgG重組載體，轉(zhuǎn)染步驟如下
(I)先把六孔板里的培養(yǎng)基換成不含血清的培養(yǎng)基(含HT)，每孔lmL。(2) ΙΟΟμ 無血清培養(yǎng)基里加入IPg質(zhì)粒,輕輕混勻；
(3)以1:1的體積比例，加入轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻；
(4)DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物室溫放置15min ；
(5)把混合物逐滴加入到六孔板中，同時(shí)做空白對(duì)照；
(6 ) 4-6h后，換液(10%血清但不含HT )。24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，可對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞逐漸加壓(MTX 25nM，50nM，100 nM，200nM……)篩選。當(dāng)有克隆形成時(shí)，吸取上清檢測(cè)抗體的表達(dá)量，并進(jìn)一步亞克隆，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。表達(dá)于培養(yǎng)上清中的IgG分子,經(jīng)Protein G柱親和純化后,用于抗體的功能分析。將ProteinL親和層析柱安裝至蛋白質(zhì)純化儀上,用10個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液沖洗酒精。用10個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱床后，上樣品，流速為ImL/分鐘。用結(jié)合緩沖液洗滌柱床至A280nm吸光度到基線，用5_10個(gè)柱床體積的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，純化的蛋白分別為抗體IgG的重鏈和輕鏈(圖2)?？贵w的\鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有以下的⑶R氨基酸序列
SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；
SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；
SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ；
抗體的Vh鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列
SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；
SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ；
SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。所述抗體的'鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。所述抗體的'鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。所述抗體的\鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh鏈的氨基酸序列如SEQ IDNO. 13所示。所述抗體的\鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh鏈的核苷酸序列如SEQ IDNO. 14所示。
具有抗原識(shí)別特異性的全人源抗Trop-2抗體IgG的鑒定
用重組人Trop-2蛋白O. 2 μ g/ mL包被酶聯(lián)板，4 °C過夜，次日封閉液37 °C封閉2 h 后洗板，加入梯度稀釋的Fab抗體，37 °C孵育I h洗板，加入I 1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗人IgG，37 °C孵育I h后洗板，顯色，酶標(biāo)儀測(cè)A450吸光度值。ELISA檢測(cè)分析表明，當(dāng)IgG稀釋滴度從100增加至Ij 6400倍時(shí)，A450 Corr值從I. 462降低到O. 328(Blank O. 132)(圖3);用3%BSA封閉BXPC3細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞30min，洗滌后加入抗Trop-2的Fab，4 V孵育30min，加入FITC標(biāo)記的羊抗人Fab 4 °C孵育30min。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌兩次后，用FACSCalibur cytometer 檢測(cè)，CellQuest 分析軟件分析(Becton Dickinson, Heidelberg,Germany)。FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，IgG能夠與Trop-2陽性細(xì)胞BXPC3特異性結(jié)合，但不結(jié)合未表達(dá)Trop-2的NIH3T3細(xì)胞(圖4)。
抗Trop-2抗體IgG對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC3增殖的影響
以 DMEM 培養(yǎng)液稀釋抗 Trop-2 IgG 抗體，配制 10Pg/mL、20Pg/mL、40Pg/m、80Pg/mL 和16(^g/mL不同濃度的抗體，分別加入培養(yǎng)有BxPC3細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3天，MTS/PMS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。MTS/PMS檢測(cè)結(jié)果顯示，抗Trop-2抗體IgG與BXPC3細(xì)胞共同培養(yǎng)，抗體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)液中的抗體劑量增加時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也明顯增高。當(dāng)IgG為16(^g /mL時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率達(dá)80%以上，而隨著IgG抗體濃度的增加，抗體對(duì)未表達(dá)Trop-2的NIH3T3細(xì)胞增殖的抑制未見顯著的變化(圖5)。
抗Trop-2抗體IgG在動(dòng)物模型中對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制
收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BxPC3細(xì)胞，用PBS洗2次，制成PBS制備成IX 107/mL細(xì)胞懸液，按O. ImL/只的量將細(xì)胞懸液接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，裸小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至50-100mm3后將動(dòng)物隨機(jī)分組，每組8只。分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(抗RV IgG)和實(shí)驗(yàn)組(10mg/kg、2mg/kg和O. 4mg/kg 3個(gè)藥物梯度),每組8只。每2天尾靜脈注射，共注射8次藥物。給藥結(jié)束后，剝離小鼠體內(nèi)的腫瘤，按照公式V=l/2ab2計(jì)算腫瘤體積，分析抗體對(duì)裸鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)的影響。如圖6所示，靜脈給藥結(jié)束后，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間腫瘤大小無顯著差異(P>0. 05)，而實(shí)驗(yàn)組中高濃度組(10mg/kg)的腫瘤的體積顯著小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P〈0. 01)，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用顯著增加，抑制率達(dá)56. 85%。
權(quán)利要求
1.人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的'鏈的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. I 所示的 L-CDRl ；SEQ ID NO. 2 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID NO. 3 所示的 L-CDR3 ； 并且所述抗體的Vh鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. 8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID NO. 9 所示的 H-CDR2 ； SEQ ID NO. 10 所示的 H-CDR3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的Vl鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，Vh鏈的可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的Vl鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，Vh鏈的可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的Vl鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，Vh鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的Vl鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，Vh鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
6.權(quán)利要求I 5任一人源抗Trop-2基因工程抗體IgG在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
人源抗Trop-2基因工程抗體IgG及其應(yīng)用，人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，其特征在于，所述抗體的VL鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQIDNO.1所示的L-CDR1；SEQIDNO.2所示的L-CDR2；SEQIDNO.3所示的L-CDR3；并且所述抗體的VH鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，抗Trop-2抗體IgG對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102827282SQ20121032172
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者林紅, 馮振卿, 朱進(jìn) 申請(qǐng)人:林紅