專利名稱：：一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)學研究及臨床應用領域，具體涉及一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法。
背景技術：
：近年來基因工程技術已經得到快速的發(fā)展，一系列基因工程藥物己經廣泛應用于臨床，其應用范圍主要集中在腫瘤、艾滋病的基因工程藥物和單克隆抗體。目前，全球研制中的生物技術藥物已經超過2200種，其中1700余種己經進入臨床試驗階段。美國有300多種生物藥物處于后期臨床實驗階段。2001年FDA批準了8種生物技術藥物和疫苗及3種藥物新的適應癥；2002年FDA共批準了20個新生物技術藥物和15個生物技術藥物的新適應癥。2003年FDA批準了35個新藥中就包括14個新生物制劑。但是針對真菌的單鏈抗體的研發(fā)，目前還未見報道。由于人源單抗尚存在制備困難、雜交瘤細胞不穩(wěn)定、產量低及親和力弱等問題，目前常用的單抗絕大多數(shù)為鼠源抗體，鼠源單抗在人體重復使用可產生人抗鼠抗體，F(xiàn)c段的存在又可使其與體內具有Fc受體的非特異組織和細胞結合等缺點，因此限制了其在臨床上的應用。隨著基因工程抗體技術日益成熟，利用分子克隆技術制備的基因工程小分子抗體為疾病的免疫診斷和免疫治療提供了新的思路。其中，小分子單鏈抗體(single-chainFvFragment，scFv)因其分子小，實體組織穿透力強，血漿半衰期短，又能保持完整抗體的親和性和特異性，而倍受重視。scFv結構非常簡單，由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一個彈性linker連接而成，是具有完整抗原結合位點的最小抗體片段。能在細菌中表達，易于基因操作和基因工程大量生產，并可用基因工程方法構建與其他效應分子連接的抗腫瘤融合蛋白。因此，scFv成為將藥物、毒素、放射性毒素導向真菌的很有價值的分子，在真菌治療中有很大的臨床應用潛力。通常噬菌體抗體庫技術是建立在噬菌體表面呈現(xiàn)技術和抗體DNA重組技術上，用PCR擴增抗體的全套可變區(qū)基因，特別是在抗體可變區(qū)的輕鏈和重鏈的連接上，采用AmershamBioscieences公司設計的PCR連接方法，已經實現(xiàn)了試劑盒的產品化，但是AmershamBioscieences公司的試劑盒主要是針對小鼠抗體可變區(qū)設計的，盡管scFv已經去除了具有較高抗原性的抗體恒定區(qū)部位，但是由于存在種屬的差異，因此不可避免還是存在一定的免疫原性。這就大大的限制了其在人源性單鏈抗體研究中的應用。經典的噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的原理是以小鼠抗體基因序列為基礎，設計相應引物，通過PCR技術為平臺完成抗體可變區(qū)基因的擴增和連接，最終獲得完整的單鏈抗體基因文庫。其過程分為三個階段既通過RT-PCR分別擴增輕鏈、重鏈可變區(qū)基因；輕鏈和重鏈可變區(qū)的PCR連接；利用PCR填加酶切位點。經典的噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法是首先利用以設計好的小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)兼并引物通過RT-PCR獲得抗體可變區(qū)基因后，用SOE-PCR獲得全長的scFv片段，最后在通過PCR加上酶切位點，PCR產物經酶切后直接連接到表達載體中。經典的噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的缺點是由于SOE-PCR方法的偶然性較大，在連接過程中除了出現(xiàn)5，-VH-Linker-VL(VK)-3'約800bp的片段外，還可能會出現(xiàn)5，-VH-VL(VK)-3，的連接片段，因此會干擾目的片段的獲得。又由于PCR本身也會受到Taq酶擴增效率，Mg2+濃度等多種條件的限制，因此現(xiàn)有技術存在的問題是實驗的穩(wěn)定性較差、效率低、存在較大的突變幾率，影響基因的保真性。
發(fā)明內容本發(fā)明要提供一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法，以克服現(xiàn)有技術存在的穩(wěn)定性較差，效率低，存在較大的突變幾率和低保真性，以及不能直接用于人源性單鏈抗體研究的問題。為克服現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法是同時利用PCR和酶切連接兩種方法，在利用RT-PCR獲得人源性抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因后，通過引物兩端預先設計的酶切位點實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接。上述方案中根據(jù)人類抗體可變區(qū)的特點設計了6條5'端重鏈可變區(qū)引物和7條3'端輕鏈可變區(qū)引物，6條5'端輕鏈可變區(qū)引物和13條3'端輕鏈可變區(qū)引物，共計32條引物，同時設計并合成一對包含有Xhol和Apal兩個酶切位點的Linker(也就是在抗體可變區(qū)的輕鏈和重鏈與Linker的連接部位分別引入了Xhol和Apal兩個酶切位點)；采用酶切連接的方法實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接，所述各引物如下重鏈可變區(qū)上游引物隨機保護序列一Sfil-重鏈可變區(qū)下游引物:輕鏈可變區(qū)上游引物:輕鏈可變區(qū)下游引物:Linker:隨機保護序列一XhoI-隨機保護序列一ApaI-隨機保護序列""NotI-Xhol——(G4S)3——-抗體重鏈可變區(qū)序列一抗體重鏈可變區(qū)序列-抗體輕鏈可變區(qū)序列-抗體輕鏈可變區(qū)序列Apal在實驗中還可以利用同時具有Sfil、Xhol、Apal和Notl酶切位點的pGEM-llZF(+)載體作為克隆載體保存已連接的scFv片段。有利于實驗的重復，保證產物的穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是一、穩(wěn)定性好，突變幾率小，有利于提高基因的保真性在構建基因組工程抗體庫的過程中，由于既要保證抗體可變區(qū)基因的保真性，又要提高scFv的連接效率，所以對于實驗的穩(wěn)定性要求很高，本發(fā)明正是在兼顧這兩者的基礎上提高了實驗的可行性，其對穩(wěn)定性的提高包括以下幾點1、Xhol和Apal兩個酶切位點在人類的抗體可變區(qū)基因上很少存在，在抗體可變區(qū)的輕鏈和重鏈的引物上設計這兩個酶切位點，不會破壞抗體可變區(qū)基因的完整性。2、在經典的(G4S)3Linker的基礎上，引入Xhol和Apal兩個酶切位點后，會在Linker的兩側分別加入亮氨酸、谷氨酸和甘氨酸、脯氨酸，盡管四個氨基酸的加入使Linker的長度有所增加，但是由于這四種氨基酸均不存在較大的支鏈，因此對于Linker的柔韌性不存在明顯的影響，也不能影響輕、重鏈的正確折疊、相互作用以及輕重鏈雜合體的穩(wěn)定性和識別抗原的能力。3、是應用了pGEM-llzf(+)克隆載體上現(xiàn)成的sfil、Sall、Xhol、Notl酶切位點，避免了連接過程中5'-VH-VL(VK)-3'的連接片段片段的出現(xiàn)，進而保證了實驗結果的可靠性，防止無效片段的產生。4、在本方法中由于僅需要一次PCR反應和3次酶切連接反應，因此不但有效的擴增了目的抗體可變區(qū)基因片段，也有力的回避了多次PCR反應所引起的基因突變，同時商業(yè)化的pGEM-llzf(+)克隆載體的應用也大大簡便了實驗操作，保證了實驗的可重復性。二、適用范圍廣利用當前最新的基因工程技術，通過釣取患者血液中B淋巴細胞免疫抗體可變區(qū)基因構建人源性單鏈抗體庫，不但可以用于各種外源感染性疾病的單鏈抗體研究，也可以用于腫瘤等疾病的研究和治療。三、實驗成本低廉，經濟性強。由于利用了基因工程技術擴增人抗體可變區(qū)基因，實驗所需的引物、內切酶、載體等都可以實現(xiàn)反復利用，同時也避免了單克隆抗體制備中需要大量實驗動物的情況，可大大降低研發(fā)成本。具體實施例方式下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細的說明。本發(fā)明的方法原理:是同時利用PCR和酶切連接兩種方法，在利用RT-PCR獲得人源性抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因后，通過引物兩端預先設計的酶切位點實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接。具體說本發(fā)明是根據(jù)人類抗體可變區(qū)的特點設計了6條5'端重鏈可變區(qū)引物和7條3'端輕鏈可變區(qū)引物，6條5'端輕鏈可變區(qū)引物和13條3'端輕鏈可變區(qū)引物，共計32條引物，同時設計并合成一對包含有Xhol和Apal兩個酶切位點的Linker(也就是在抗體可變區(qū)的輕鏈和重鏈與Linker的連接部位分別引入了Xhol和Apal兩個酶切位點)；釆用酶切連接的方法實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接，所述各引物如下-重鏈可變區(qū)上游引物隨機保護序列一SfiI——抗體重鏈可變區(qū)序列重鏈可變區(qū)下游引物隨機保護序列一XhoI——抗體重鏈可變區(qū)序列輕鏈可變區(qū)上游引物隨機保護序列一Apal—一抗體輕鏈可變區(qū)序列輕鏈可變區(qū)下游引物隨機保護序列一NotI——抗體輕鏈可變區(qū)序列Linker:Xhol-(G4S)3-Apal在本發(fā)明的實驗中還可以利用同時具有SfiI、Xhol、ApaI和NotI酶切位點的pGEM-llZF(+)載體作為克隆載體保存已連接的scFv片段。有利于實驗的重復，保證產物的穩(wěn)定性。具體的操作步驟是1、引物設計引物設計參照Daniele方法[3](略有改動)設計重鏈Vh段引物，輕鏈Vl和Vk段引物。重鏈段引物5'端引入Sfil酶切位點，3'端引入XhoI酶切位點。輕鏈段引物5'端引入Apal酶切位點，3'端引入NotI酶切位點。輕鏈和重鏈的保護堿基均為12個，且序列相同。Link鏈5，端引入Xhol酶切位點，3，端引入ApaI酶切位點。2、全血總RNA提取取念珠菌病恢復期患者外周血45例，淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，用試劑盒提取淋巴細胞總RNA。RNA變性電泳鑒定RNA的完整性，核酸蛋白分析儀測定含量。液氮保存?zhèn)溆谩?、RT-PCR擴增VH、Vl和Vk魅按逆轉錄試劑盒說明，以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈，以第一鏈為模板，PCR擴增VH、Vl和Vk魅。PCR反應以反轉錄合成cDNA第一鏈為模板分別擴增VH、Vl和Vk基因，將Vh、VL和VK基因的3'端引物分別混合后與5'段各引物分別進行擴增。反應條件為94。C預變性5min，94。C變性1min，55"退火1min，72。C延伸1min，35個循環(huán)后72"C延伸8min。反應體系在的反應體系中含有cDNA模板lpl，10xPCRbuffer2.0^1，dNTP0.2mmol/L，Mg2+2.5mmol/L，上下游引物各10pmol/L，Taq酶1.0U。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DL2000Marker作對照。觀察370bp處有條帶出現(xiàn)，并切膠回收?；厥债a物克隆到T載體中，并測序鑒定。4、重鏈、Linker鏈與輕鏈的連接將重鏈基因和輕鏈基因分別從T載體上用SfiI、XhoI和ApaI、Notl雙酶切下來，經電泳回收后與Linker鏈分別與載體分步連接，轉化。4.1重鏈基因連入pGEM-llzf(+)載體將重鏈基因從T載體上用SfiI，Xhol雙酶切下來，連入經用同樣酶切過的pegm-llz傲體中，轉化大腸桿菌，提取質粒并經過雙酶切鑒定正確。4.2輕鏈基因連入將輕鏈基因從T載體上用ApaI和NotI雙酶切后，連入經用同樣酶切過的pGEM-llZF(+)載體中，轉化大腸桿菌，提取質粒并經過雙酶切鑒定正確。4.3Linker鏈的接入Linker鏈由合成的兩條寡核苷酸退火而成，其兩端為已經切好的ApaI和XhoI位點。合成的Linker鏈連接進第二步所得的質粒中，獲得完整的抗體基因。通過克隆載體保存所有連接好的克隆，可以為后期的研究奠定基礎。為更清楚地說明本發(fā)明與經典的噬菌體基因工程抗體庫構建的區(qū)別，請參看下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求1.一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法是同時利用PCR和酶切連接兩種方法，在利用RT-PCR獲得人源性抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因后，通過引物兩端預先設計的酶切位點實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接。2、如權利要求1所述的一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法，其特征在于是根據(jù)人類抗體可變區(qū)的特點設計了6條5'端重鏈可變區(qū)引物和7條3'端輕鏈可變區(qū)引物，6條5'端輕鏈可變區(qū)引物和13條3'端輕鏈可變區(qū)引物，共計32條引物，同時設計并合成一對包含有Xhol和Apal兩個酶切位點的Linker(也就是在抗體可變區(qū)的輕鏈和重鏈與Linker的連接部位分別引入了Xhol和Apal兩個酶切位點)；采用酶切連接的方法實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接，所述各引物如下重鏈可變區(qū)上游引物隨機保護序列一SfiI-——抗體重鏈可變區(qū)序列重鏈可變區(qū)下游引物隨機保護序列一XhoI——抗體重鏈可變區(qū)序列輕鏈可變區(qū)上游引物隨機保護序列一ApaI——抗體輕鏈可變區(qū)序列輕鏈可變區(qū)下游引物隨機保護序列""NotI——抗體輕鏈可變區(qū)序列Linker:Xhol——(G4S)3——Apal3、如權利要求1或2所述的一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法，其特征在于利用同時具有SfiI、Xhol、ApaI和NotI酶切位點的pGEM-llZF(+)載體作為克隆載體保存已連接的scFv片段。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)學研究及臨床應用領域，具體涉及一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法。本發(fā)明要提供一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法，以克服現(xiàn)有技術存在的穩(wěn)定性較差，效率低，存在較大的突變幾率和低保真性，以及不能直接用于人源性單鏈抗體研究的問題。為克服現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種噬菌體基因工程抗體庫基因組裝的方法，是同時利用PCR和酶切連接兩種方法，在利用RT-PCR獲得人源性抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因后，通過引物兩端預先設計的酶切位點實現(xiàn)抗體重鏈可變區(qū)、Linker和抗體輕鏈可變區(qū)的拼接。文檔編號C12N15/09GK101210241SQ20061010529公開日2008年7月2日申請日期2006年12月27日優(yōu)先權日2006年12月27日發(fā)明者何文亮,杜孟剛,雪步,趙育英申請人:陜西超英生物科技有限公司