一種靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種短肽介導(dǎo)的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)。所述基因遞釋系統(tǒng)包括靶向功能基、基因藥物和載體。所述的靶向功能基為短肽，載體為聚β-氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯，短肽與聚乙二醇共價(jià)連接，基因藥物通過包載或吸附的方式與載體形成納米級基因遞釋系統(tǒng)。該基因遞釋系統(tǒng)通過將基因主動靶向遞送至腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)所需要的分泌型藥物蛋白，并進(jìn)一步將其分泌遞送至腦內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)腦部神經(jīng)退行性疾病的治療。
【專利說明】一種靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)，具體涉及一種短肽介導(dǎo)的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類社會的老齡化，腦神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率正呈逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為危害人類生命和健康的重大疾病之一。由于血腦屏障(BBB)的存在阻礙了化學(xué)藥物、蛋白多肽和基因藥物的腦內(nèi)遞送，嚴(yán)重影響了腦部疾病的治療效果，目前，臨床對于神經(jīng)退行性疾病尚無有效的治療措施和藥物。本領(lǐng)域研究者關(guān)注于基因治療可能是攻克和治愈神經(jīng)退行性疾病最具希望和挑戰(zhàn)的研究課題。
[0003]腦靶向納米遞藥系統(tǒng)的研究為腦部疾病的治療帶來新的希望。目前，腦靶向的策略主要是通過受體介導(dǎo)或吸附介導(dǎo)的機(jī)制增加納米遞藥系統(tǒng)透過血腦屏障，從而提高腦內(nèi)的藥物濃度，如專利“一種腦靶向遞藥系統(tǒng)”(專利申請?zhí)?00910051970.3)，“腦血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性聚乳酸納米粒載體及其制法和應(yīng)用”(專利申請?zhí)?00610125443.9)，“一種腦靶向基因傳釋系統(tǒng)及其制備方法”(專利申請?zhí)?00610116486.0)，“腦靶向脂質(zhì)體藥物制劑的制備方法”(專利申請?zhí)?00310105969.7)，“一種99mTc腫瘤顯像藥物腦靶向脂質(zhì)體制劑及其應(yīng)用”(專利申請?zhí)?00910141973.6)，“一種乙酰膽堿受體介導(dǎo)跨越血腦屏障的主動靶向遞藥系統(tǒng)”(專利申請?zhí)?01010110665.X)，“苯甲酰胺類似物介導(dǎo)的腦靶向遞藥系統(tǒng)”(專利申請?zhí)?01010111960.7)，“具有腦靶向遞藥特性的多肽及其制備方法”，(專利申請?zhí)?01110029806.X)，“有機(jī)胺衍生物作為小分子藥物腦靶向修飾基團(tuán)的用途”(專利申請?zhí)?01010144446.3)等。采用受體介導(dǎo)或吸附介導(dǎo)的機(jī)制使納米遞藥系統(tǒng)透過血腦屏障，雖然一定程度上可以提高腦內(nèi)的藥物濃度，但仍然存在以下缺點(diǎn)，尤其是對于基因藥物:①腦靶向的效率不高，通常僅能提高2~3倍；②組織選擇性較差，通常在增加藥物腦內(nèi)遞送的同時(shí)，可能更大程度地提高其它組織器官的藥物濃度；③由于基因必須進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白才能發(fā)揮治療作用，故納米基因遞藥系統(tǒng)必須克服BBB和神經(jīng)細(xì)胞兩種細(xì)胞屏障，因此進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞核的基因量和基因轉(zhuǎn)染效率就更低，往往難以達(dá)到治療要求；④納米載體進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)后，由于腦內(nèi)的滯留和蓄積而存在很大的安全性問題。鑒于此，亟需研究更為安全、有效的腦神經(jīng)退行性疾病的基因治療系統(tǒng)。
[0004]血腦屏障(BBB)是由極化的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和膠質(zhì)細(xì)胞足突所構(gòu)成，其中腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起主要屏障作用。由于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與大部分神經(jīng)細(xì)胞緊密相鄰，因此腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的分泌型蛋白可分泌進(jìn)入腦內(nèi)，直接為神經(jīng)細(xì)胞所攝取利用。鑒于此，通過靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的新策略將可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)產(chǎn)物的腦內(nèi)遞送，有利于腦內(nèi)疾病的治療。如:構(gòu)建一種靶向性的非病毒基因載體，將基因主動靶向遞送至腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)所需要的分泌型藥物蛋白，并進(jìn)一步將其分泌遞送至腦內(nèi)，進(jìn)而與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮藥理作用。由于非病毒基因載體只需克服腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一種細(xì)胞屏障，而且不需進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞，因此該靶向策略既可顯著提高腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核基因攝取量，提高基因的轉(zhuǎn)染效率，又可避免納米載體進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)而引發(fā)的安全性問題。
[0005]TBl 肽(序列 TFFYGGCRGKRNNFKTKRY，編號 Angiop印78)是 AngioChem 公司通過生物信息學(xué)方法篩選獲得的一條短肽。該短肽具有很強(qiáng)的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性，腦動脈灌注試驗(yàn)顯示其腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分布容積(Vd)值是腦實(shí)質(zhì)的12倍，全腦分布容積是Angiop印I的5倍，顯示其可作為靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能分子。但是，由于TBl序列中間存在一個(gè)半胱氨酸(Cys)，既影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，也不利于Cys修飾后保持肽的活性。
[0006]聚β -氨基酯(poly ( β-amino esters)，PAE)是一種新型的非病毒基因載體，是由二丙烯酸酯和含伯氨基化合物通過Michael加成反應(yīng)聚合而成的一類陽離子聚酯。研究表明，PAE具有體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、可生物降解的優(yōu)勢。
[0007]目前國內(nèi)外未見采用TB短肽修飾PAE-C32靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的旨在針對現(xiàn)有腦靶向基因遞釋系統(tǒng)的不足，提供一種新的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)，具體涉及一種短肽介導(dǎo)的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)。該基因遞釋系統(tǒng)通過將基因主動靶向遞送至腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)所需要的分泌型藥物蛋白，并進(jìn)一步將其分泌遞送至腦內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)腦部神經(jīng)退行性疾病的治療。
[0009]本發(fā)明的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)，包括靶向功能基、藥物和載體；所述的靶向功能基為短肽，載體為聚氨基酯和聚乙二醇-聚氨基酯，短肽與聚乙二醇共價(jià)連接，基因藥物通過包載或吸附的方式與載體形成納米級基因遞釋系統(tǒng)。
[0010]所述的基因遞釋系統(tǒng)粒徑為10-300nm。
[0011]本發(fā)明中，靶向功能基是介導(dǎo)靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的短肽，選自序列I的TBl肽、序列2的TB2肽或序列3的TB3肽。優(yōu)選TB2或TB3肽。
[0012]本發(fā)明中，將TBl肽的氨基酸序列進(jìn)行了突變，突變后獲得短肽TB2 (序列CTFFYGGSRGKRNNFKTKRY)和短肽 TB3 (序列 cTFFYGGSRGKRNNFKTKRY，c 為 D 型 Cys)，可明顯改善TBl肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高可修飾性，并保持TBl肽對腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向性。
[0013]本發(fā)明中，基因載體為聚β_氨基酯(PAE)和聚乙二醇(PEG)-聚β-氨基酯(PEG-PAE)，其中:ΡΑΕ為線性或枝狀，優(yōu)選線性，分子量為5000-20000Da，優(yōu)選8000-12000Da ；PEG 分子量為 1000_20000Da，優(yōu)選 2000_5000Da ;上述 PEG-PAE 的聚乙二醇部分可以是單甲氧基聚乙二醇，也可以是含其它活性基團(tuán)的聚乙二醇；PAE和PEG-PAE可以以任意比例混合使用；上述活性基團(tuán)是馬亞酰亞胺基、巰基、胺基、羧基、生物素或親和素中的一種；
[0014]其中的聚β -氨基酯(poly (β-amino esters)，PAE)是一種新型的非病毒基因載體，是由二丙烯酸酯和含伯氨基化合物通過Michael加成反應(yīng)聚合而成的一類陽離子聚酯；與陽離子脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)、樹狀高分子PAMAM等非病毒載體相比，所述PAE具有體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、可生物降解的優(yōu)勢；[0015]本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選的，以PAE為基因載體，以多肽TB2或TB3為靶向功能基，獲得高轉(zhuǎn)染效率和高安全性的靶向性非病毒基因載體(TB-NP)，通過靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)產(chǎn)物的腦內(nèi)遞送，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腦部神經(jīng)退行性疾病的治療。
[0016]本發(fā)明中，基因藥物通過包載或吸附的方式載入基因遞釋系統(tǒng)內(nèi)。
[0017]所述的基因藥物是指含有治療基因的質(zhì)粒DNA，所述治療基因?yàn)樯窠?jīng)營養(yǎng)因子基因。除治療基因外，質(zhì)粒DNA還包括治療基因前后的序列，可以是啟動子、增強(qiáng)子，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，能夠使質(zhì)粒DNA在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制的序列。所述神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5 (NT-4/5)神經(jīng)營養(yǎng)因子6 (NT-6)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I (IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF^ )、表皮生長因子(EGF)或血小板源性生長因子(PDGF)中的一種。
[0018]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0019]1、TB肽與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)
[0020]采用5-羧基熒光素(5-FAM，綠熒光)標(biāo)記短肽ΤΒ1、ΤΒ2、ΤΒ3，與BCEC共孵育6小時(shí)，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞法測定短肽ΤΒ1、ΤΒ2、ΤΒ3與BCEC的結(jié)合情況，證實(shí)ΤΒ2肽和ΤΒ3肽具有與TBl類似的靶向BCEC特性。
[0021]2、ΤΒ1，ΤΒ2肽的細(xì)胞結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)
[0022]采用Na125I碘化TBl、ΤΒ2肽，經(jīng)G25凝膠色譜柱分離除去游離125I。將不同濃度1251-TB的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，ρΗ7.4)與BCEC在4°C條件下共培養(yǎng)，將細(xì)胞裂解后測定125I放射性強(qiáng)度和細(xì)胞蛋白含量，進(jìn)行結(jié)合`飽和分析，求算TBl、TB2肽與BCEC細(xì)胞表面受體復(fù)合物的解離常數(shù)Kd，證實(shí)TB2保持了 TBl與BCEC的親和性。
[0023]3、TBl，TB2肽的藥動學(xué)與組織分布
[0024]采用Na125I碘化TB1、TB2肽，SD大鼠靜脈注射1251-TB的PBS溶液，定時(shí)采血和組織樣品，測定TB1，TB2肽的藥動學(xué)與組織分布，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TB2保持了 TBl對BCEC較強(qiáng)的靶向性。
[0025]4、載基因納米粒的制備與表征
[0026]將TB2肽與馬亞酰亞胺基-PEG-PAE共價(jià)相連得到TB2-PEG-PAE，將PAE與TB2-PEG-PAE按9:1比例混和溶解后，與等體積的質(zhì)粒DNA溶液中混合，即得到載基因的PAE納米粒(TB-NP)，通過凝膠色譜柱分離純化TB-NP。Zeta/激光粒度儀測定TB-NP的平均粒徑和電位，透射電鏡觀察TB-NP的形態(tài)。
[0027]5、體外轉(zhuǎn)染
[0028]通過納米粒包載綠熒光蛋白報(bào)告基因(pEGFP)，定性檢測綠熒光蛋白和定量測定綠熒光細(xì)胞陽性率，考察NP表面修飾TB2后對BCEC的轉(zhuǎn)染效率。證實(shí)NP表面修飾TB2后可顯著增加對BCEC細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0029]6、TB-NP靶向BCEC實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物腦內(nèi)遞送的體外評價(jià)
[0030]通過納米粒包載人源腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子治療基因(TB-NP-hBDNF)，采用TB-NP-hBDNF轉(zhuǎn)染BCEC細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染后的BCEC細(xì)胞接種于transwell插件(24孔)中，建立體外BBB連接模型。測定已建立的BBB模型中供體池、接收池中分泌出的hBDNF蛋白量隨時(shí)間變化的動力學(xué)，評價(jià)基因產(chǎn)物hBDNF的腦內(nèi)遞送特征和效率。[0031 ] 7、TB-NP靶向BCEC的活體成像評價(jià)
[0032]通過納米粒包載溴乙錠單疊氮鹽(EMA)標(biāo)記的hBDNF質(zhì)粒DNA,活體成像法評價(jià)TB-NP對腦部BCEC的靶向性。
[0033]8、TB-NP-hBDNF治療AD模型鼠的效果評價(jià)
[0034]采用大鼠雙側(cè)海馬(CA1-CA3)區(qū)注射Amyloid- β 25_35建立AD模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)TB-NP-hBDNF治療對模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶障礙的改善作用。
[0035]9、基因遞釋系統(tǒng)對BCEC的毒性評價(jià)
[0036]采用3- (4，5- 二甲基噻唑-2) _2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽(MTT法)評價(jià)TB-NP對BCEC的毒性。
[0037]結(jié)果顯示，TB2肽和TB3肽具有與TBl類似的靶向BCEC特性；TB1、TB2與BCEC細(xì)胞表面受體復(fù)合物的解離常數(shù)Kd分別為261.1nM,206.nM，表明TB2保持了 TBl與BCEC的親和性及較強(qiáng)的靶向性；當(dāng)PAE與DNA的質(zhì)量比為100:1時(shí)PAE可完全包封DNA，包封率為99.3% ；NP表面修飾TB2后可顯著增加對BCEC細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率；TB_NP靶向BCEC實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物腦內(nèi)遞送的體外評價(jià)結(jié)果顯示，基因產(chǎn)物具有很高的腦內(nèi)分泌效率；活體成像評價(jià)結(jié)果顯示TB修飾NP后對腦部BCEC有良好的靶向性。本發(fā)明經(jīng)動物試驗(yàn)結(jié)果表明TB-NP-hBDNF對Amyloid- β 25_35誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙具有明顯的改善作用。
[0038]本發(fā)明的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有:`[0039]通過靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，能實(shí)現(xiàn)腦部神經(jīng)退行性疾病的治療，既可明顯提高腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核基因攝取量，提高基因的轉(zhuǎn)染效率，又避免了納米載體進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)而引發(fā)的安全性問題。
[0040]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0041]圖1，TB肽與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合圖，
[0042]其中，上一行為熒光顯微鏡觀察結(jié)果:(A) TBl肽、(B) TBl肽、(C) ΤΒ2肽(放大倍數(shù)200倍)；下一行為流式細(xì)胞檢測結(jié)果:(D)陽性率、(E)熒光強(qiáng)度。
[0043]圖2，TBl，ΤΒ2肽的細(xì)胞結(jié)合飽和曲線圖。
[0044]圖3，TBl, ΤΒ2肽的藥動學(xué)與組織分布，
[0045]其中，(A)藥動學(xué)，(B)腦部分布容積，(C)器官組織分布。
[0046]圖4，TB-NP 的表征，
[0047]其中，(A)粒徑分布圖，(B)透射電鏡圖。
[0048]圖5，TB-NP-EGFP的體外BCEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染，
[0049]其中，A:熒光顯微鏡結(jié)果；B:48h流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。
[0050]圖6，體外BBB模型中基因產(chǎn)物hBDNF的腦內(nèi)遞送，
[0051]其中，(A)體外BBB模型的跨細(xì)胞電阻，(B)體外BBB模型中基因產(chǎn)物hBDNF的腦內(nèi)遞送情況。[0052]圖7，TB-NP靶向BCEC的活體成像，
[0053]其中，(A) 2小時(shí)，(B) 8小時(shí)，(C) 24小時(shí)，左側(cè)為TB-NP組，右側(cè)為NP組。
[0054]圖8，TB-NP-hBDNF基因治療對AD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的影響。
[0055]圖9，基因遞釋系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。
【具體實(shí)施方式】:
[0056]實(shí)施例1、TB肽與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)
[0057]合成5-羧基熒光素(5-FAM，綠熒光)標(biāo)記的短肽TB1、TB2、TB3，每個(gè)短肽分子標(biāo)記一個(gè)5-FAM。BCEC細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中培養(yǎng)2天，顯微鏡觀察匯合度80%左右用于細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)。移除培養(yǎng)液，加入300 μ L濃度為48nmol/mL的TB短肽溶液(含10%胎牛血清)，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，冰冷PBS洗3次，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞法測定短肽TBl、TB2、TB3與BCEC的結(jié)合情況。結(jié)果如圖1顯示，TBl、TB2、TB3短肽均能與BCEC很好的結(jié)合，而且結(jié)合陽性率和熒光強(qiáng)度均無顯著性差異，表明TB2肽和TB3肽具有與TBl類似的靶向BCEC特性。
[0058]實(shí)施例2、TBl，TB2肽的細(xì)胞結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)
[0059]采用Na125I碘化TBl、TB2肽，經(jīng)G25凝膠色譜柱分離除去游離125I。BCEC細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中培養(yǎng)2天，顯微鏡觀察匯合度80%左右用于結(jié)合飽和試驗(yàn)。移除培養(yǎng)液，加入300 μ L含有不同濃度1251-TB的PBS溶液(ρΗ7.4)，使1251-TB終濃度分別為 0.1,0.2,0.5，1,2,5,10，50，100，500，1000nM，4°C培養(yǎng) 120min，冰冷 PBS 洗 3次，每孔200 μ LlN NaOH裂 解，然后100 μ L2N HCL中和，測定125I放射性強(qiáng)度，同時(shí)采用BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行結(jié)合飽和分析，求出TB肽與BCEC細(xì)胞表面受體復(fù)合物的解離常數(shù)Kd。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示:TB2、TBl與BCEC細(xì)胞的結(jié)合飽和曲線相似；TB1、TB2與BCEC細(xì)胞表面受體復(fù)合物的解離常數(shù)Kd分別為261.1nM,206.nM，上述結(jié)果表明TB2保持了 TBl與BCEC的親和性。
[0060]實(shí)施例3、TB I，TB2肽的藥動學(xué)與組織分布
[0061]藥動學(xué):采用Na125I碘化TBl、TB2肽，SD大鼠靜脈注射含有80 μ Ci1251-TB的PBS溶液(0.4mL/大鼠)，定時(shí)(5分鐘，10分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘)采血0.2mL。組織分布:給藥方法同上，定時(shí)(5分鐘,60分鐘)處死大鼠，4°C Hepes-Ringer緩沖液灌注，迅速取大腦、小腦、心、肝、脾、肺、腎稱重，分離大腦毛細(xì)血管和腦實(shí)質(zhì)。Y計(jì)數(shù)儀測定各血樣及組織中放射性強(qiáng)度，計(jì)算TB肽的藥動學(xué)參數(shù)及組織分布，各器官攝取TB肽的量以每克組織中占注射劑量的百分比表示(％ID/g tissue)。
[0062]如圖3A所示，TB2與TBl的動力學(xué)曲線相似。計(jì)算其藥動學(xué)參數(shù)，TB2、TBl在血中的 AUCchoo 分別為 3.00%ID.h/mL, 3.01%ID.h/mL, MRT 分別為 3.16h, 3.10h。TB2 的AUCO-⑴、MRT與TBl相比均無顯著性差異，表明TBl經(jīng)氨基酸突變到TB2后，其藥動學(xué)行為未發(fā)生顯著性改變。此外，TB2與TBl相比，其組織分布也沒有顯著性差異(圖3B，3C)。尾靜脈注射1251-TB260分鐘后，TB2在大腦和小腦中的分布量分別為0.062±0.002%ID/g,
0.058±0.003%ID/g (圖3B)，TB2在腦毛細(xì)血管部位的分布容積為80.7± 11.1 μ L，遠(yuǎn)高于其在腦實(shí)質(zhì)部位的分布容積6.6±5.3 μ L，表明ΤΒ2保持了 TBl對BCEC較強(qiáng)的靶向性。
[0063]實(shí)施例4、TB-NP的制備與表征[0064]采用5-氨基-1-戊醇和I，4- 丁二醇二丙烯酸酯合成分子量為1000ODa的PAE及馬亞酰亞胺基-PEG-PAE (PEG分子量為3400Da)，將TB2肽與馬亞酰亞胺基-PEG-PAE共價(jià)相連得到TB2-PEG-PAE。將PAE與Maleimide-PEG-PAE按9:1比例混和溶解后，加入到等體積的質(zhì)粒DNA溶液中混合，即得到載基因的PAE納米粒(TB-NP)，通過凝膠色譜柱分離純化TB-NP。Zeta/激光粒度儀測定TB-NP的平均粒徑和電位，透射電鏡觀察TB-NP的形態(tài)。
[0065]結(jié)果顯示，當(dāng)PAE與DNA的質(zhì)量比為100:1時(shí)PAE可完全包封DNA，采用PicoGreen試劑盒定量測定DNA包封率為99.3%。Zeta/激光粒度儀測定TB-NP的平均粒徑35.4nm(圖4A)，平均Zeta電位約+25mV，透射電鏡顯示粒子形態(tài)呈圓形，粒徑在50nm以下(圖4B)。
[0066]實(shí)施例5、TB-NP的體外轉(zhuǎn)染
[0067]將BCEC細(xì)胞種于24孔板，接種密度為I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔，觀察豐度達(dá)到70%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過納米粒包載報(bào)告基因PEGFP對BCEC轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒DNA (EGFP)的濃度為2.5 μ g/孔，48h后觀察EGFP的表達(dá)情況，定性檢測綠熒光蛋白和定量測定綠熒光細(xì)胞陽性率，考察NP表面修飾TB2后對BCEC的轉(zhuǎn)染效率。
[0068]由圖5A可知，NP表面連接TB2后，BCEC中綠熒光蛋白的表達(dá)顯著增加；流式細(xì)胞儀測定結(jié)果(圖5B)也顯示TB-NP組綠熒光細(xì)胞陽性率高達(dá)86%，顯著高于NP組，并且與商用試劑盒Lipo-Plus相當(dāng)(80%)。上述結(jié)果表明，NP表面修飾TB2后可顯著增加對BCEC細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0069]實(shí)施例6、TB-NP靶向BCEC實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物腦內(nèi)遞送的體外評價(jià)
[0070]將BCEC細(xì)胞種于24孔板，接種密度為I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔，觀察豐度達(dá)到70%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過納米粒包載報(bào)告治療基因(TB-NP-hBDNF)對BCEC轉(zhuǎn)染。將已轉(zhuǎn)染的BCEC細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于transwell插件(24孔)中，建立體外BBB連接模型。插件供體池中加培養(yǎng)液100 μ L，接受池加培養(yǎng)液細(xì)胞液600 μ L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)基，采用細(xì)胞電阻儀測定BBB模型的跨細(xì)胞電阻，考察緊密連接的形成。緊密連接的形成后每天抽取插件供體池中細(xì)胞液IOOyL以及接受池中的細(xì)胞液600 μ L，酶聯(lián)免疫法測定已建立的BBB模型中供體池、接收池中分泌出的hBDNF蛋白量隨時(shí)間變化的動力學(xué)，計(jì)算評價(jià)基因產(chǎn)物hBDNF的腦內(nèi)遞送特征和效率。
[0071]如圖6A所示，體外BBB模型中BCEC跨細(xì)胞電阻從第四天開始即保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，只在140 Ω左右范圍上下波動，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)基本一致，表明體外BBB模型構(gòu)建成功，已經(jīng)形成緊密連接。從圖6B可以看出，在形成緊密連接以后，BCEC細(xì)胞往細(xì)胞兩側(cè)分泌的蛋白基本保持同樣的量，表明所構(gòu)建的載體系統(tǒng)靶向BCEC后基因產(chǎn)物的遞送并無明顯極性；另一方面，在構(gòu)建BBB模型后直到第八天BCEC細(xì)胞仍保持高水平的hBDNF分泌量，表明基因產(chǎn)物具有很高的腦內(nèi)分泌效率。
[0072]實(shí)施例7、TB-NP靶向BCEC的活體成像評價(jià)
[0073]采用光解反應(yīng)將質(zhì)粒標(biāo)記溴乙錠單疊氮鹽(EMA):將200 μ ghBDNF質(zhì)粒DNA加入至5μ gEMA水溶液中，冰浴中放置15min，采用薄層層析紫外燈(254nm)直接照射30分鐘，加入乙醇使終濃度為70%，HOOOrpm離心30min，即得EMA標(biāo)記的質(zhì)粒DNA。將EMA標(biāo)記的質(zhì)粒DNA按實(shí)施例4載入TB-NP中，尾靜脈注射入20克裸鼠體內(nèi)，劑量為50 μ g/裸鼠。給藥后分別于2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)乙醚麻醉，放入活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察。如圖7所示，2小時(shí)、8小時(shí)TB-NP組裸鼠腦部的熒光顯著高于未修飾NP組，表明TB修飾NP后對腦部BCEC有良好的靶向性。
[0074]實(shí)施例8、TB-NP-hBDNF治療AD模型鼠的初步效果
[0075]采用大鼠雙側(cè)CA1-CA3區(qū)注射Amyloid-β 25_35建立AD模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)TB-NP-hBDNF治療對模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶障礙的改善作用。
[0076]AD模型鼠的制備:將Amyloid-β25_35溶于注射用水(2g/L)，密封37°C振搖76h使其成凝聚態(tài)，_20°C凍存?zhèn)溆?。SD大鼠采用10%水合氯醛麻醉后固定于腦立體定位儀上，于兩側(cè)海馬(CA1-CA3)區(qū)各緩慢(I μ L/min)注入凝聚態(tài)Amyloid-β 25_355 μ L，留針5分鐘后緩慢撤針，縫合切口，陰性對照組(Sham control)注射等量生理鹽水,動物蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。
[0077]分組與給藥:動物手術(shù)后隨機(jī)分成3組，每組8只，與陰性對照組共4組，手術(shù)后尾靜脈注射(表2)，隔天給藥，連續(xù)給藥7次(14天)后開始水迷宮實(shí)驗(yàn)。
[0078]水迷宮試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前5天為學(xué)習(xí)階段。每只大鼠每天接受4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練90s，兩次訓(xùn)練間隔時(shí)間為30s。每次訓(xùn)練的大鼠入水點(diǎn)為隨機(jī)順序排列的4個(gè)象限，每相鄰兩天的入水順序不同。攝像頭記錄大鼠在水池中的游泳軌跡及大鼠到達(dá)平臺的潛伏期。若大鼠在90s內(nèi)上臺，允許其在平臺上停留20s ;若908內(nèi)大鼠不能發(fā)現(xiàn)并爬上平臺，則將其導(dǎo)引至平臺并使之在平臺上停留20s，其潛伏期定為90s。實(shí)驗(yàn)第六天進(jìn)行探索試驗(yàn)。每只大鼠試驗(yàn)兩次，分別將大鼠從第三象限的起點(diǎn)和終點(diǎn)放入水中，記錄并分析90s內(nèi)大鼠跨越平臺的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,AD模型組的潛伏期(Day4, Day5)均顯著高于假手術(shù)組(Sham control),表明大鼠雙側(cè)CA1-CA3區(qū)注射Amyloid-β 25_35可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙，模型建立成功(圖8Α)。而TB-NP-hBDNF組的潛伏期(Day4，Day5)均顯著低于AD模型組，表明TB-NP-hBDNF可明顯改善Amyloid-β 25_35所致的大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙(圖8Α)。NP-hBDNF組的潛伏期(Dayl至Day5)與AD模型組無顯著性差異，表明NP-hBDNF對Amyloid- β 25_35所致的大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙(圖8Α)無明顯改善作用。跨臺試驗(yàn)結(jié)果也顯示TB-NP-hBDNF組的跨臺次顯著高于AD模型組，與Sham control組相比無顯著性差異。上述結(jié)果表明TB-NP-hBDNF對Amyloid-β 25_35誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙具有明顯的改善作用。
[0079]表1分組與給藥
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，其包括靶向功能基、基因藥物和載體； 所述的靶向功能基為短肽，所述的載體為聚β-氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯，所述短肽與聚乙二醇共價(jià)連接，基因藥物通過包載或吸附的方式與所述載體制成納米級基因遞釋系統(tǒng)。
2.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的靶向功能基是介導(dǎo)靶向腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的短肽，選自序列I的TBl肽、序列2的ΤΒ2肽或序列3的ΤΒ3肽。
3.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚β_氨基酯為線性或枝狀，分子量為5000~20000道爾頓。
4.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯以任意比例混合。
5.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚氨基酯的聚乙二醇部分是單甲氧基聚乙二醇，或是含其它活性基團(tuán)的聚乙二醇。
6.按權(quán)利要求5所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的活性基團(tuán)是馬亞酰亞胺基、巰基、胺基、羧基、生物素或親和素中的一種。
7.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的納米級基因遞釋系統(tǒng)粒徑為10-300納米。
8.按權(quán)利要求1所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于所述的基因藥物是含有治療基因的質(zhì)粒DNA。`
9.按權(quán)利要求8所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于所述的治療基因?yàn)樯窠?jīng)營養(yǎng)因子基因。
10.按權(quán)利要求9所述的基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、神經(jīng)營養(yǎng)因子4/5、神經(jīng)營養(yǎng)因子6、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1、轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子或血小板源性生長因子。
【文檔編號】A61P25/28GK103505744SQ201210225177
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月30日
【發(fā)明者】龐志清, 蔣新國, 高會樂, 蘇婧晗, 錢勇, 魏彥 申請人:復(fù)旦大學(xué)