專利名稱：一種白子菜蛋白提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種白子菜蛋白提取物及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白子菜bicolor DC.)為菊科三七草屬多年生草本植物,主要分布于我國南方各地。白子菜又稱白背三七，近年來我國各地多有引種，主要用于糖尿病的輔助治療，已公開的專利200710084533. 2,200610052502. 4,201110372288. I均指出白子菜具有治療 糖尿病的作用。動物試驗證明，白子菜(白背三七)具有顯著的降血糖作用(胡勇，李維林，林厚文，等，白背三七地上部分降血糖作用研究，西南林學院學報，2007，27 (I) 55-58 ;馬正東，陳磊，宋洪濤，等，白背三七水提取物對2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其機制，中草藥，2010,41 (4)，623-626)，馬正東等認為，白背三七對實驗性2型糖尿病有較明顯的治療作用，其機制可能與增強機體清除活性氧的能力、減輕氧自由基對胰島P細胞的損傷、促進胰島P細胞的修復等作用有關(guān)。姜曼花等(姜曼花，胡劍卓，邱文高，等，白背三七多糖和黃酮降血糖及耐缺氧作用，中國醫(yī)院藥學雜志，2009,29 (13):1074-1076)報道，白背三七多糖和黃酮可使四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平降低，血清胰島素含量升高。對白子菜化學成分的研究結(jié)果顯示，白子菜主要含有黃酮類、生物堿類、萜類及甾體、長鏈脂肪族及煙酸、腺苷、尿苷等其它類型的化合物。白子菜中的黃酮類化合物有槲皮素，3-0-0 -D-吡喃葡萄糖槲皮素，蘆丁，煙花苷，山柰酚，紫云英苷，山柰酚-3-0-(6'丨-0-乙?；?-0-D-吡喃葡萄糖苷，山柰酚-3，7-0-雙-P-D-吡喃葡萄糖苷，均為常見化合物，而這些單體化合物均無特別顯著的降血糖效果。白子菜所含的生物堿類物質(zhì)主要有2-(1'，2'，3' A'-四羥基丁基)-6-(2'，，3'，，4'，-三羥基丁基)-吡嗪，掌葉半夏堿庚，全緣千里光堿，光萼豬屎豆堿，吡咯里西啶，未見其在降血糖作用方面的研究報道。而萜類及留體、長鏈脂肪族物質(zhì)則多不具備明顯的降血糖生物活性。因此仍需對白子菜降血糖活性成分進行更廣泛和深入的研究。a -葡萄糖苷酶專一性地催化含a -葡萄糖苷的蔗糖或麥芽糖水解，a -葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸上段a -葡萄糖苷酶的活性，阻斷碳水化合物分解成單個葡萄糖，從而降低糖尿病病人的餐后血糖。a -葡萄糖苷酶抑制劑作為一種作用獨特的口服降糖藥物，對于采用飲食控制及運動療法效果不滿意的2型糖尿病患者，可改善糖代謝紊亂，延遲或預(yù)防糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生。作為a-葡萄糖苷酶抑制劑,西藥的主要類型有阿卡波糖(Acarbose,卡博平、拜糖平)、伏格列波糖(Voglibose,倍欣)、米格列醇(Miglitol)等，目前以阿卡波糖在臨床上應(yīng)用最為廣泛。本發(fā)明以阿卡波糖為陽性對照藥，研究白子菜中降血糖的活性成分，所得提取物可作為輔助治療糖尿病的保健品或藥物而進一步研究開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種具有顯著抑制a -葡萄糖苷酶活性、從而達到降血糖效果的白子菜蛋白提取物及其制備方法以及在保健品或藥物制備方面的應(yīng)用。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種白子菜蛋白提取物，以白子菜的新鮮葉片為原料，通過蛋白提取方法制備得到。上述蛋白提取方法為采用用TriS-HCl緩沖液勻漿提取、硫酸銨鹽析法沉淀。Tris-HCl提取緩沖液濃度為20-100 mmol/L, pH 7. 50_8. 80 ;緩沖液中含有苯甲基磺酰氟(PMSF )、聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、二硫蘇糖醇(DTT)、維生素C (Vc)和氯化鈉(NaCl) ；PMSF的濃度為0. 01-1 mmol/L, PVP的質(zhì)量百分濃 度為 0. 1-1%, EDTA-Na2 的濃度為 0. 2-2 mmol/L, DTT 的濃度為 2-50 mmol/L, Vc 的濃度為l-10mmol/L, NaCl的質(zhì)量百分濃度為0. 5-1% ;緩沖液的加入量為每克白子菜新鮮葉片加入5-10暈升緩沖液。硫酸銨鹽析法沉淀為依次在硫酸銨的飽和度為20%、50%和80%下進行分級沉淀，分別得到0-20%飽和度的蛋白提取物、20-50%飽和度的蛋白提取物以及50-80%飽和度的蛋白提取物；0-20%飽和度的蛋白提取物或50-80%飽和度的蛋白提取物即為白子菜蛋白提取物。本發(fā)明還提供了該白子菜蛋白提取物的制備方法，包括以下步驟
(1)提取取白子菜的新鮮葉片，加入預(yù)冷的提取緩沖液，勻漿，在4°C提取20min，用
2層紗布過濾，取濾液，離心，所得上清液即為提取液；提取緩沖液是濃度為20-100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 7. 50-8. 80 ;提取緩沖液中含有苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、維生素C和氯化鈉；緩沖液中苯甲基磺酰氟的濃度為0.01-1mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量百分濃度為0. 1-1%,乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0. 2-2mmol/L, 二硫蘇糖醇的濃度為2-50 mmol/L,維生素C的濃度為1_10 mmol/L,氯化鈉的質(zhì)量百分濃度為0. 5-1% ;提取緩沖液的加入量為每克白子菜新鮮葉片加入5-10毫升緩沖液；
(2)鹽析法沉淀將步驟(I)中得到的提取液，加入硫酸銨，使飽和度達到20-80%，在4°C沉淀10-30 min后，離心；
(3)透析取步驟(2)中離心得到的沉淀，加入溶解緩沖液，使沉淀完全溶解，將溶液裝入透析袋進行透析，得到蛋白質(zhì)溶液；溶解緩沖液是濃度為10-50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 7. 50-8. 80 ;溶解緩沖液含有2-50 mmol/L的DTT ；
(4)冷凍干燥將步驟(3)制得的蛋白質(zhì)溶液進行冷凍干燥，所得干燥粉末即為白子菜蛋白提取物。步驟(2)中硫酸銨的飽和度為20%，沉淀lOmin，離心15min，取沉淀，即得0-20%飽和度的蛋白提取物；離心的轉(zhuǎn)速為10,000 rpm，溫度為4°C?；虿襟E(2)中的鹽析法為分級沉淀法，具體步驟如下在提取液中加入硫酸銨使飽和度達20%，4°C放置IOmin后，離心15min ;取上清液，加入硫酸銨使飽和度達50%，4°C放置IOmin后，離心15min，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度達80%，4°C放置IOmin后，離心15min，取沉淀，得到50-80%飽和度的蛋白；離心的速度為10，000 rpm，溫度為4°C。
本發(fā)明還提供了該白子菜蛋白提取物在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑類的保健品或藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點利用Tris-HCl緩沖液提取一硫酸銨鹽析法沉淀，有效地得到具有顯著抑制a-葡萄糖苷酶的蛋白提取物；在提取緩沖液中加入苯甲基磺酰氟抑制蛋白酶活性，防止蛋白質(zhì)降解，利用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合金屬離子，采用聚乙烯吡咯烷酮增加蛋白質(zhì)溶出率并保護蛋白，用二硫蘇糖醇保護蛋白質(zhì)的巰基；本發(fā)明利用分級鹽析法制備的0-20%飽和度以及50-80%飽和度的白子菜蛋白提取物對a -葡萄糖苷酶具有顯著的抑制效果。a-葡萄糖苷酶專一性地催化含a-葡萄糖苷的蔗糖或麥芽糖水解，本發(fā)明白子菜蛋白提取物作為a-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制a-葡萄糖苷酶的活性，阻斷碳水化合物分解成單個葡萄糖，可作為輔助治療糖尿病的藥物或保健品而進一步研究開發(fā)。


圖I為本發(fā)明實施例三中制備的白子菜0-20%飽和度的蛋白提取物對a -葡萄糖 苷酶活性的抑制作用效果 圖2為本發(fā)明實施例三中制備的白子菜20-50%飽和度的蛋白提取物對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果 圖3為本發(fā)明實施例三中制備的白子菜50-80%飽和度的蛋白提取物對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果 圖4為陽性對照藥阿卡波糖對a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明白子菜蛋白提取物進行詳細說明。各實施例中使用的儀器設(shè)備、化學試劑以及檢測方法如下
儀器設(shè)備冷凍離心機(Eppendorf 5804R)，真空冷凍干燥機(西安波意爾精密儀器有限公司 LGJ-12)，酶標儀(TECAN，Infinite F50)；
化學試劑Tris MDBio Inc, Lot 403089 ；DTT MDBio Inc, Lot 527079 ；PVP K-30 Fluca ；PMSF :進口分裝；Vc :國藥集團化學試劑有限公司，批號20080716 ； (NH4)2SO4 :上海久億化學試劑有限公司；NaCl :上海久億化學試劑有限公司；EDTA-Na2 :江蘇昆山金誠試劑廠；透析袋北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司，截留分子量3500 ;陽性對照藥阿卡波糖(拜糖平，拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品)；a-葡萄糖苷酶oriental yeast co. ltd,lot: 22003903 ；4-nitropheny-a -D-glucopyranose (pNPG) sigma, lot BCBB2652 ;服素Amresco 0378 ;硫服BioSharp ；CHAPS Amresco 0465 ;兩性電介質(zhì)載體緩沖液 AmpholinpH 3. 0-9. 5 =BioSharp ;三氯乙酸(TCA) (AR):上海凌峰化學試劑有限公司，批號070423 ；采用凱氏定氮法測定蛋白提取物中的蛋白質(zhì)含量。實施例一
TCA/丙酮法提取白子菜蛋白
稱取白子菜植株倒數(shù)第3-4片鮮葉10 g，先用自來水沖洗2遍，再用蒸餾水沖洗I遍，加液氮研磨成細粉，倒入50 ml離心管中，加30 ml在_20°C冰冷過的丙酮，再加入3ml三氯乙酸(TCA)，旋渦振蕩混勻，混合物在-20 °C放置90分鐘，4 °C離心(10,000 rpmX 20min),棄去上清液,所得沉淀用30 ml冷丙酮洗漆2次,離心,取沉淀物在室溫晾干,加入6ml提取緩沖液(8 mol/L脲素，2 mol/L硫脲，4% (ff/V) CHAPS, 0. 4% (V/V)兩性電介質(zhì)載體緩沖液Ampholin pH 3. 0-9.5,50 mmol/L DTT)，振蕩混勻，放置5分鐘，在18°C離心(10,000 rpmX 20 min)，取上清液，加入8 ml 10% TCA/冷丙酮(含20 mmol/L DTT),-20 °C放置90分鐘，4 °C離心(10，000 rpmX15 min)，棄去上清液，沉淀物用I ml冷丙酮(含20mmol/L DTT)洗2次，沉淀物在空氣中晾干，加入適量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0，含20mmol/L DTT)，待完全溶解后，將蛋白溶液冷凍干燥，制成白子菜蛋白提取物凍干粉。用該法制得白子菜蛋白提取物凍干粉0.48 g，凱氏定氮法測得其中蛋白含量為54. 2%。經(jīng)測定該蛋白提取物對a -葡萄糖苷酶的活性有一定抑制作用，IC50為2. 82 mg/ml o實施例二
Tris-HCl緩沖液提取/(NH4)2SO4沉淀法提取白子菜蛋白
取白子菜植株倒數(shù)第3-4片鮮葉20 g，加預(yù)冷的提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH8. 5,0. I mmol/L PMSF，1% NaCl) 200 ml，勻漿，在 4°C提取 20min，離心(10，000 rpmX15min)，取上清液，加入(NH4)2SO4使飽和度達80%，4 °C放置20 min后，離心(10，000rpmX 15 min),所得沉淀即為白子菜0-80%飽和度的蛋白。在沉淀中加入適量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，待完全溶解后，將蛋白溶液裝入透析袋進行透析，去除殘留的(NH4)2SO4，最后將蛋白溶液冷凍干燥，制成白子菜蛋白提取物凍干粉。用該法得到I. 62 g樣品，凱氏定氮法測得其中蛋白含量為51. 5%。經(jīng)測定該蛋白提取物對a -葡萄糖苷酶的活性有一定的抑制作用，當樣品濃度為8. 63 mg/ml時，抑制百分率為43. 2%。實施例三
Tris-HCl緩沖液提取/(NH4)2SO4分級沉淀法提取白子菜蛋白
取白子菜植株倒數(shù)第3-4片鮮葉20g，加預(yù)冷的提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.5，0.1 mmol/L PMSF，1% PVP,2 mmol/L EDTA-Na2,20 mmol/L DTT,10 mmol/L Vc,1%NaCl) 200ml，勻衆(zhòng)，在4°C提取20min, 2層紗布過濾,取濾液離心(10, 000 rpmX 15min),得上清液，在上清液中加入(NH4)2SO4使飽和度達20%，4°C放置IOmin后離心(4°C，10，000rpmX 15min)，所得沉淀即為提取的白子菜0-20%飽和度的蛋白；取上清液，加入(NH4) 2S04使飽和度達50%，4°C放置10 min后離心(4°C，10，000 rpmX15 min)，所得沉淀即為提取的白子菜20-50%飽和度的蛋白；取上清液，繼續(xù)加入(NH4)2SO4使飽和度達80%，4°C放置IOmin后，離心(4°C，10，000 rpmX15 min)，所得沉淀即為提取的白子菜50-80%飽和度的蛋白。在各部分的沉淀中加入適量50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0，含20 mmol/L DIT)，待完全溶解后，將蛋白溶液裝入透析袋進行透析，去除殘留的(NH4)2SO4，最后將蛋白溶液冷凍干燥，制成白子菜蛋白提取物凍干粉。用該法制得0-20%飽和度的蛋白提取物凍干粉0. 14 g，其中蛋白含量為58. 5% ;制得20-50%飽和度的蛋白提取物凍干粉I. 51 g，其中蛋白含量為48. 1% ;制得50-80%飽和度的蛋白提取物凍干粉0. 61 g，其中蛋白含量為58. 3%。實施例四Tris-HCl緩沖液提取/(NH4)2SO4分級沉淀法提取白子菜蛋白
制備方法如實施例三，提取緩沖液采用濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH7. 5，含有 0.01 mmol/L PMSF，0. 1% PVP,0.2 mmol/L EDTA-Na2, 2 mmol/L DTT,I mmol/L Vc,0.5%NaCl，加入量為100ml。用該法制得0-20%飽和度的蛋白提取物凍干粉0. 12 g，其中蛋白含量為56. 5%，對a -葡萄糖苷酶的IC5tl為0. 51 mg/ml ;制得20-50%飽和度的蛋白提取物凍干粉I. 04 g，其中蛋白含量為48. 3%，對a -葡萄糖苷酶的IC5tl為2. 50 mg/ml ;制得50-80%飽和度的蛋白提取物凍干粉0. 42g，其中蛋白含量為58. 1%，對a -葡萄糖苷酶的IC5tl為0. 55 mg/ml。.實施例五
蛋白提取物對的a-葡萄糖苷酶抑制效果實施例
稱取實施例三制備的白子菜0-20%飽和度和50-80%飽和度的蛋白提取物凍干粉各約20mg,分別加入0. 5ml磷酸鹽緩沖液(67 mmol/L, pH6. 8),配制成濃度約40 mg/ml的蛋白溶液，再稀釋成系列濃度，作為供試樣品，用96孔板測定不同濃度蛋白樣品對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。酶活測定在反應(yīng)孔中依次加入Iul酶液、60iU磷酸鹽緩沖液(67mmol/L，pH6. 8，下同)，在37°C反應(yīng)lOmin，加入IOiil反應(yīng)底物(0. lmmol/L pNPG，磷酸鹽緩沖液配制，下同)，反應(yīng)IOmin后,測定405 nm處的吸光度(AliisX酶空白測定在反應(yīng)孔中依次加入Iul酶液、60iU磷酸鹽緩沖液，在37°C反應(yīng)10分鐘，加入IOu I磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)IOmin后，測定405 nm處的吸光度(AiimX樣品測定在反應(yīng)孔中依次加入Iu I酶液、50iil磷酸鹽緩沖液、10 ill樣品，在37V反應(yīng)10分鐘，加入IOu I反應(yīng)底物，反應(yīng)IOmin后，測定405 nm處的吸光度(Ag)。樣品空白測定在反應(yīng)孔中加入61iU磷酸鹽緩沖液，在37°C反應(yīng)lOmin，加入IOu I反應(yīng)底物，反應(yīng)IOmin后，測定405 nm處的吸光度(A#s空白)。以上所有樣品及空白反應(yīng)均重復3次，取平均值作為實驗數(shù)據(jù)。計算供試樣品對a _甸甸糖昔酶的抑制百分率=[(A酶活-A酶空白)-(A樣品-A樣品空白)]/(Ai8is-Aiss;自)X 100%;半數(shù)抑制濃度(IC5tl):以蛋白濃度為橫坐標，其對a-葡萄糖苷酶的抑制百分率為縱坐標，作圖，得到樣品劑量效應(yīng)曲線，根據(jù)曲線求得樣品對a-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tlX同時以阿卡波糖為陽性對照藥，測定其對a -葡萄糖苷酶的抑制百分率及IC5(I。圖I顯示了白子菜0-20%飽和度的蛋白對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。由圖I可見，當?shù)鞍诐舛扔?. 07 mg/ml增加到0. 70mg/ml，抑制百分率從5. 9%增加到71. 1%，蛋白濃度高于0. 7mg/ml，抑制百分率增加的幅度減小，當?shù)鞍诐舛葹?. 82 mg/ml時，抑制百分率可達91.9%，當?shù)鞍诐舛壤^續(xù)增加，抑制百分率不再顯著提高。由圖I得出白子菜0-20%飽和度的蛋白對于a -葡萄糖苷酶的IC5tl為0. 49 mg/ml。圖2顯示了白子菜20-50%飽和度的蛋白對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用。當?shù)鞍诐舛扔蒊. 54 mg/ml增加到4. 28 mg/ml，抑制百分率從33. 7%增加到69. 3%，以后隨蛋白濃度增加，抑制百分率增加的幅度減小，當?shù)鞍诐舛仍黾拥?. 56 mg/ml時，抑制百分率僅達到77. 3%。由圖2得出白子菜20-50%飽和度的蛋白對于a -葡萄糖苷酶的IC5tl為2. 60mg/ml?！?03s 函3 TQ屮躲50180%菡苦砘昆腳6迓P I*#||_覉部_昆咨產(chǎn)奮油。&M 3 剄岧，腳 Q 簽砘& 0. ^ 3 ±|結(jié)埋 L 13mg/ml,safr!J 細牟猶V-AO05%±| 結(jié)埋 69. 2%,腳瓜簽) ! ^r 13mg/ml,sf!J細牟猶 ±爾結(jié)3歲騎氣、/腳 0 ) 2, S 曰 g\nll , 產(chǎn)細牟猶钚埋92.3%,茬飾，鼐雌腳0簽砘±|結(jié)，咨產(chǎn)細牟猶^#__貓鰣。&函3讁莊，0屮躲50180% s§0mM^r P I Ics ^ 0. 51 mg/ml。
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權(quán)利要求
1.一種白子菜蛋白提取物，以白子菜植物的新鮮葉片為原料，通過蛋白提取方法制備得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白子菜蛋白提取物，其特征在于所述蛋白提取方法為采用Tris-HCl緩沖液提取、硫酸銨鹽析法沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白子菜蛋白提取物，其特征在于所述Tris-HCl緩沖液濃度為20-100 mmol/L, pH 7. 50-8. 80 ;所述緩沖液中含有苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、維生素C和氯化鈉；所述緩沖液中苯甲基磺酰氟的濃度為0.01-1 mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量百分濃度為0. 1-1%,乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.2-2 mmol/L, 二硫蘇糖醇的濃度為2-50 mmol/L,維生素C的濃度為1-10 mmol/L,氯化鈉的質(zhì)量百分濃度為0. 5-1% ;所述緩沖液的加入量為每克白子菜新鮮葉片加入5-10毫升緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白子菜蛋白提取物，其特征在于所述硫酸銨鹽析法沉淀為依次在硫酸銨的飽和度為20%、50%和80%下進行分級沉淀，分別得到0-20%飽和度的蛋白提取物、20-50%飽和度的蛋白提取物以及50-80%飽和度的蛋白提取物；所述0-20%飽和度的蛋白提取物或50-80%飽和度的蛋白提取物為所述白子菜蛋白提取物。
5.一種權(quán)利要求I所述白子菜蛋白提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)提取取白子菜的新鮮葉片，加入預(yù)冷的提取緩沖液，勻漿，在4°C提取20min，用2層紗布過濾，取濾液，離心，所得上清液即為提取液；所述提取緩沖液是濃度為20-100mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 7. 50-8. 80 ;所述提取緩沖液中含有苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、維生素C和氯化鈉；所述緩沖液中苯甲基磺酰氟的濃度為0.01-1 mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量百分濃度為0. 1_1%，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.2-2 mmol/L, 二硫蘇糖醇的濃度為2-50 mmol/L,維生素C的濃度為1_10 mmol/L，氯化鈉的質(zhì)量百分濃度為0. 5-1% ;所述提取緩沖液的加入量為每克白子菜新鮮葉片加A 5-10暈升緩沖液； (2)鹽析法沉淀將步驟(I)中得到的提取液，加入硫酸銨，使飽和度達到20-80%，在4°C沉淀10-30 min后，離心； (3)透析取步驟(2)中離心得到的沉淀，加入溶解緩沖液，使沉淀完全溶解，將溶液裝入透析袋進行透析，得到蛋白質(zhì)溶液；所述溶解緩沖液是濃度為10-50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，PH 7. 50-8. 80 ;所述溶解緩沖液含有2-50 mmol/L的DTT ； (4)冷凍干燥將步驟(3)制得的蛋白質(zhì)溶液進行冷凍干燥，所得干燥粉末即為白子菜蛋白提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中硫酸銨的飽和度為20%,沉淀IOmin,離心15min ,取沉淀，即得0-20%飽和度的蛋白提取物；所述離心的轉(zhuǎn)速為 10000 rpm，溫度為 4°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的鹽析法沉淀采用分級沉淀，具體過程如下在提取液中加入硫酸銨使飽和度達20%，4°C放置lOmin，離心15min，取上清液；在上清液中加入硫酸銨使飽和度達50%，4°C放置lOmin，離心15min，取上清液；在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度達80%，4°C放置lOmin，離心15min，取沉淀，即得50-80%飽和度的蛋白提取物；所述離心的轉(zhuǎn)速為10000 rpm，溫度為4°C。
8.權(quán)利要求I所述白子菜蛋白提取物在制備抑制a-葡萄糖苷酶的保健品或藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白子菜蛋白提取物及其制備方法與應(yīng)用。該白子菜蛋白提取物以白子菜植物的新鮮葉片為原料，通過蛋白提取方法制備得到。本發(fā)明制備的白子菜蛋白提取物對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用，可作為輔助治療糖尿病的保健品或藥物進一步研究開發(fā)。
文檔編號A61K127/00GK102697826SQ20121020076
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者任冰如, 呂寒, 吳菊蘭, 李維林, 梁呈元, 陳劍, 馬麗 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所