專利名稱：一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合藥物，具體地說，是一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物。
背景技術(shù)：
非小細(xì)胞肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在由腫瘤引起的死亡原因中排第一位。目前，非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法仍然是化療。對于存在EGFR 858Κ突變或者EGFR19號外顯子存在不同缺失突變的患者(常見于亞洲、女性、非吸煙、非小細(xì)胞肺癌患者)應(yīng)用吉非替尼(又名易瑞沙)靶向治療效果較好。眾所周知，化療的副作用非常大，因?yàn)槠湓跉⑺滥[瘤細(xì)胞的同時(shí)也對正常細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，很多腫瘤患者無法耐受較大劑量的化療而導(dǎo)致治療無法繼續(xù)而死亡。雖然，吉非替尼對部分EGFR存在突變的患者具有一定的治療作用，但是，病人一般在1-2年內(nèi)會發(fā)生復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，或者產(chǎn)生新的突變而對吉非替尼產(chǎn)生耐藥，所以，即使使用吉非替尼(酪氨酸激酶抑制劑)治療仍然不能提高非小細(xì)胞肺癌患者的五年總生存期。關(guān)于一種由三氧化二砷和吉非替尼組成的治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，研究非小細(xì)胞肺癌的聯(lián)合靶向治療方法，使更多的非小細(xì)胞肺癌患者獲益，提供一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物。本發(fā)明再一的目的是，提供一種組合藥物在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例為1-2 μ M :0. 01-10 μ M0為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種組合藥物在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例為1-2 μ M :0. 01-10 μ Μ。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明研究非小細(xì)胞肺癌的聯(lián)合靶向治療方法，首次提出了三氧化二砷和吉非替尼的組合藥物，及其在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用，砷劑和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌將是一個(gè)很有前景的策略，將使更多的非小細(xì)胞肺癌患者獲益。


圖IA :砷劑與Gefitinib作用24h以及48h后引起三種細(xì)胞增殖抑制的情況。圖IB :流式細(xì)胞結(jié)果顯示砷劑與Gefitinib作用48h后引起三種細(xì)胞凋亡的情況CsubGl峰的出現(xiàn))。圖2 :砷劑與Gefitinib對NCI-H1975、HCC827以及A549細(xì)胞EGFR的降解以及上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3以及自噬相關(guān)的信號通路的蛋白，圖2A. As2O3與Gefitinib對NCI-H1975細(xì)胞的作用，圖2B. As2O3與Gefitinib對HCC827細(xì)胞的作用，圖2C. As2O3與Gefitinib對A549細(xì)胞的作用。圖3 :免疫熒光結(jié)果顯示砷劑與Gefitinib對NCI-H1975細(xì)胞自噬的影響(LC3表達(dá))。圖4 :電鏡結(jié)果顯示砷劑與Gefitinib誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞自噬體形成。圖5 :砷劑與Gefitinib對NCI-H1975細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤模型的實(shí)際腫瘤體積與相對腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線。圖6 :砷劑與Gefitinib對NCI-H1975細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤模型小鼠的實(shí)際腫瘤體積與相對腫瘤體積隨時(shí)間變化情況。
圖7 NCI-H1975荷瘤小鼠腫瘤大小以及分離腫瘤大小大體圖片。 圖8 :砷劑與Gefitinib對HCC827細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤模型的實(shí)際腫瘤體積與相對腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線。圖9 :砷劑與Gefitinib對HCC827細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤模型小鼠的實(shí)際腫瘤體積與相對腫瘤體積隨時(shí)間變化情況。圖10 HCC827荷瘤小鼠腫瘤大小以及分離腫瘤大小大體圖片。圖11 :小動物PET-CT顯示原位模型制備成功。圖12 :小動物活體成像顯示原位模型制備成功。圖13 :非小細(xì)胞肺癌原位腫瘤小鼠模型各組小鼠肺部大體照片，綠色細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。圖14A :砷劑與Gefitinib對肺癌患者胸水中腫瘤細(xì)胞的抑制作用，砷劑組以及砷劑與Gefitinib聯(lián)合組可以顯著減少成團(tuán)的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，這兩例均為EGFRW的病人。圖14B :此患者為非小細(xì)胞肺癌晚期在胸腔穿刺放胸水時(shí)在胸腔內(nèi)注入As2O3，給藥后連續(xù)4天收集胸水標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)胞涂片以及胸水標(biāo)本拍照，發(fā)現(xiàn)胸水中的成團(tuán)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，胸水顏色由紅色變?yōu)榈S色。圖15 :非小細(xì)胞肺癌胸水標(biāo)本DNA測序結(jié)果，其中3例存在EGFRl858k突變。圖16 :砷劑與Gefitinib對肺癌病人胸水細(xì)胞(EGFRl858k或者EGFRwt)的作用。圖17 :病人胸水細(xì)胞體外藥物作用后免疫熒光檢測LC3和P62的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。本發(fā)明涉及一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例為1-2 μ M :0. 01-10 μ M。
實(shí)施例材料和方法
1.1細(xì)胞系及藥物
三種不同類型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1975 (EGFRl858e7t790m)，HCC827(EGFRE746-A750dei)以及 A549 (EGFRwi)購自 ATCC，NCI-H1975 和 HCC827 應(yīng)用 1640 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，A549應(yīng)用F12-K培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。NCI-H1975-GFP細(xì)胞株是由慢病毒感染的方法(Clonetech)將Lenti-X-GFP質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入NCI-H1975細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選GFP陽性的細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的NCI-H1975細(xì)胞。三氧化二砷(A)由北京雙鹿制藥有限公司贊助，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成2mM儲液于_20°C分裝保存。高純度的吉非替尼(G)(購自Sigma)溶于DMS0，配成IOmM的儲液于-20°C分裝保存，NH4Cl購自Sigma-Aldrich公司，蛋白酶抑制劑從羅氏公司購得。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)
NCI-H1975，HCC827和A549三種細(xì)胞株I X IO4 2. 5X 104/ml的密度，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200 μ I/孔，三氧化二砷O μ M至2 μ Μ，吉非替尼O μ M至10 μ Μ，單獨(dú)或聯(lián)合處理24小時(shí)和48小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率應(yīng)用CCK-8檢測(購自Dojindo)，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次細(xì)胞凋亡sub-Gl峰檢測
收集細(xì)胞，PBS洗滌1-2次，應(yīng)用70%冷乙醇于-20°C固定過夜，用PBS洗細(xì)胞1_2次，10mg/L的RNA酶于37°C處理30分鐘，加入50mg/L的碘化丙啶(PI)的染色。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量分布,每個(gè)樣品分析I萬個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次?？贵w以及Western blot檢測
免疫沉淀以及 Western blot 抗體，包括 Anti-pmTOR, Anti-mTOR, Anti-pULKl,Anti-ULKl, Anti_PI3KCA， Anti_pp70S6K， Anti-pPDKl, Anti-Beclinl， Anti-PTEN，Anti-p4E_BPl 購自 Cell Signaling Technology 公司，anti-EGFR (ab52894) (Abeam),anti-c-CBL(BD Transduction Laboratories),anti~LC3B(Santa Cruz Biotechnology),anti-β -actin (Sigma-Aldrich 公司)，anti_P62 (MBL)0三種細(xì)胞分別應(yīng)用三氧化二砷和/或吉非替尼處理12，24及48小時(shí)后，收集5父106細(xì)胞應(yīng)用20(^1的1 1 六(50 mM Tris pH 8. 0,150 mM NaCl,0. 1% SDS,0. 5% sodiumdeoxycholate, 1% NP-40)添加蛋白酶抑制劑冰上裂解30分鐘后，12000rpm離心10分鐘，收集上清，BCA法測定蛋白濃度，加入2XSDS loading buffer于100°C煮10分鐘。總蛋白(IOOyg)上樣，根據(jù)蛋白的分子量大小應(yīng)用8-15% SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(GE healthcare)，分別應(yīng)用相應(yīng)的抗體孵育，化學(xué)發(fā)光酶底物HRP Substrate(Millipore公司)，應(yīng)用LAS-4000成像系統(tǒng)成像(富士)。激光共聚焦顯微鏡以及電子顯微鏡檢測
NCI-H1975細(xì)胞在24孔板中鋪于蓋玻片上，應(yīng)用三氧化二砷和/或吉非替尼，以及溶酶體酶抑制劑氯化銨處理24和48小時(shí)，然后應(yīng)用4%多聚甲醛固定，0. 2%TritonX-100的透膜，1%BSA封閉，應(yīng)用LC3的抗體以及actin染液孵育過夜，二抗孵育I小時(shí)，應(yīng)用含DAPI的封片劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡LSM710 Pascal軟件(蔡司，德國)系統(tǒng)成像。NCI - H1975細(xì)胞應(yīng)用三氧化二砷和/或吉非替尼處理24或48小時(shí)后，收集IXlO7細(xì)胞，應(yīng)用2%戊二醛(用0. IM磷酸緩沖液(pH7. 2)配制)固定，然后應(yīng)用1.0% OsO4后固定，再進(jìn)行梯度乙醇脫水以及丙酮溶液處理，環(huán)氧樹脂618包埋，LKB V型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，然后應(yīng)用CM-120透射電鏡(飛利浦，荷蘭)觀察并拍照。非小細(xì)胞肺癌小鼠模型以及砷劑/吉非替尼治療
所有涉及小鼠的實(shí)驗(yàn)和程序都按照上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)進(jìn)行。所有小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF級)的環(huán)境，常規(guī)飲食飲水。所有涉及小鼠的手術(shù)是按照動物保護(hù)和使用委員會的指導(dǎo)。吉非替尼耐藥裸鼠模型采用NCI-H1975-GFP細(xì)胞(7X IO6)于裸鼠的右肩部皮下注射一個(gè)皮丘，每天觀察皮下腫瘤生長情況，應(yīng)用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積(立方毫米)應(yīng)用下面的公式[(短徑2X長徑)/2]，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為四組，分別為對照組(Con) Oi水)、三氧化二砷組(A) (5mg/kg/d ;腹腔注射)(雙鹿,溶解于生理鹽水)、吉非替尼(G) (125mg/kg/d灌胃)(阿斯利康，英國，溶解于無菌蒸餾水)以及三氧化二砷與吉非替尼聯(lián)合用藥組(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。每天測量小鼠的皮下腫瘤的體積，每天給藥，連續(xù)處理18天后將小鼠安樂處死，分別取出皮下腫瘤、肺、肝、脾、腎固定在福爾馬林中進(jìn)行病理學(xué)檢測。相對腫瘤體積根據(jù)公式計(jì)算相對腫瘤體積=TV1ZTVtl，其中TVn是η天的腫瘤體積，TV0是第O天(給藥前測量)的腫瘤體積。吉非替尼敏感裸鼠模型采用HCC827-GFP細(xì)胞 (7Χ106)按照與耐藥裸鼠相同的方法建立模型，待腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為六組，分別為對照組(Con)、三氧化二砷組(A) (5mg/kg/d;腹腔注射)、低劑量吉非替尼組(Gl) (3. 125mg/kg/d;灌胃)、高劑量吉非替尼組(Gh) (6. 25 mg/kg/d ;灌胃)、低劑量吉非替尼與三氧化二砷聯(lián)合組(AGJ以及高劑量吉非替尼與三氧化二砷聯(lián)合組(AGh)，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。測量腫瘤、給藥以及安樂處死小鼠取腫瘤以及各臟器的方式與耐藥裸鼠模型相同。吉非替尼耐藥原位小鼠模型采用NOD-SCID小鼠，將小鼠麻醉后，在右胸壁的部位皮下作一切口，將NCI-H1975-GFP細(xì)胞(3X IO6)濃縮于50 μ I體積內(nèi)經(jīng)肋間隙注射入小鼠的右上肺，縫合皮下切口。于手術(shù)4天后隨機(jī)將小鼠分為四組，分別為對照組(Con)、三氧化二砷組(A) (5mg/kg/d;腹腔注射)、吉非替尼(G) (64mg/kg/d灌胃)以及三氧化二砷與吉非替尼聯(lián)合用藥組(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。每周給藥5天，停藥兩天，給藥3星期后安樂處死小鼠，取出肺、肝、脾、腎固定在福爾馬林中進(jìn)行病理學(xué)檢測。肺部大體形態(tài)拍照片備用。非小細(xì)胞肺癌患者的胸腔積液樣本經(jīng)患者知情同意，收集8例非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液標(biāo)本，患者的診斷根據(jù)支氣管鏡活檢，PET-CT檢查，腫瘤標(biāo)志物，胸腔積液脫落細(xì)胞，經(jīng)皮肺活檢病理綜合作出判斷。2000rpm離心收集胸腔積液標(biāo)本中的包含腫瘤細(xì)胞的組分，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞并用紅細(xì)胞裂解液去除其中的紅細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別接種于IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，應(yīng)用三氧化二砷、吉非替尼或兩藥聯(lián)合處理。收集處理前后的細(xì)胞應(yīng)用離心涂片儀(朗科恩，英國)將細(xì)胞涂于載玻片上，進(jìn)行瑞氏染色或免疫熒光實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用TIANamp血液DNA抽提試劑盒(天根生化)抽提細(xì)胞的基因組DNA，設(shè)計(jì)針對表皮生長因子受體(EGFR)的不同片段的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序確定EGFR的突變情況。應(yīng)用RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行免疫印跡(Western Blot)檢測表皮生長因子受體(EGFR)、LC3等蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析
所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS 13.0 for Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以及顯著性差異分析。顯著性差異為P小于O. 05。結(jié)果
2.I三氧化二砷和吉非替尼能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系增殖，誘導(dǎo)其凋亡三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系用三氧化二砷和吉非替尼處理24小時(shí)和48小時(shí)后，應(yīng)用CCK-8測量OD值，計(jì)算其增殖抑制率。在NCI-H1975細(xì)胞中(吉非替尼耐藥)，雖然三氧化二砷與吉非替尼單獨(dú)應(yīng)用都可以增加細(xì)胞的增殖抑制率，但是作用并不十分明顯，而當(dāng)三氧化二砷和吉非替尼聯(lián)合處理時(shí)可以顯著增加細(xì)胞的增殖抑制率，說明在吉非替尼耐藥的細(xì)胞中砷劑可以增強(qiáng)吉非替尼的治療作用。然而，在HCC827細(xì)胞中(吉非替尼敏感)，雖然單獨(dú)應(yīng)用吉非替尼就可以較好的增加細(xì)胞增殖抑制率，然而當(dāng)三氧化二砷和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高(P〈0. 001)，說明在吉非替尼敏感的細(xì)胞中砷劑仍然可以顯著提高吉非替尼的療效(圖W。
此外，細(xì)胞經(jīng)三氧化二砷和吉非替尼處理48小時(shí)后，通過PI染色，檢測細(xì)胞凋亡sub-Gl峰，結(jié)果顯示單用三氧化二砷處理可以誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞發(fā)生凋亡；然而，與單用吉非替尼相比，聯(lián)合應(yīng)用三氧化二砷和吉非替尼處理的細(xì)胞處于sub-Gl期的百分比顯著提高。HCC827的結(jié)果和NCI-H1975的結(jié)果相似。但是，在A549細(xì)胞中，三氧化二砷和吉非替尼都不能誘導(dǎo)其凋亡(圖1B)。砷劑可以下調(diào)EGFR、pmTOR的表達(dá)，上調(diào)LC3的表達(dá)
隨后，我們在蛋白水平檢測了 EGFR以及自噬相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平。對三種不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，三氧化二砷都可以誘導(dǎo)EGFR降解，下調(diào)磷酸化mTOR的表達(dá)和上調(diào)LC3的表達(dá)。這表明砷劑在治療三種不同類型的非小細(xì)胞肺癌的作用中具有共同的通路，即自噬通路。此外，在砷劑作用下，除了上述三種蛋白，翻譯起始蛋白磷酸化的4E-BP1也表達(dá)下調(diào)，這表明砷劑還可以抑制蛋白的翻譯起始。細(xì)胞經(jīng)吉非替尼處理48小時(shí)后，可以使EGFR的表達(dá)下調(diào)和LC3的微弱上調(diào)。這表明吉非替尼也在自噬調(diào)節(jié)蛋白降解中發(fā)揮一定的作用，但是弱于三氧化二砷的作用(圖2)。三氧化二砷和吉非替尼可以增強(qiáng)NCI-H1975細(xì)胞的自噬和凋亡
應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測了 NCI-H1975細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)三氧化二砷和吉非替尼處理24小時(shí)和48小時(shí)的細(xì)胞，分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的綠色點(diǎn)(LC3在胞漿與胞核內(nèi)呈點(diǎn)狀分布)增多，并且，48小時(shí)綠色點(diǎn)的量和強(qiáng)度都比24小時(shí)的高。為了進(jìn)一步顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們用溶酶體抑制劑NH4Cl (20mM)預(yù)處理細(xì)胞半個(gè)小時(shí)后再用砷劑、吉非替尼，或者兩者聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對照組相比，單用NH4Cl的綠色點(diǎn)有輕微的增加。然而，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)砷劑、吉非替尼或者兩者聯(lián)合處理后，綠色點(diǎn)的量和強(qiáng)度有明顯增加，并且，聯(lián)合組的增加特別顯著(圖3)。這表明，砷劑和吉非替尼可以誘導(dǎo)NCI-H1975自噬，并且，砷劑可以增強(qiáng)吉非替尼的作用。此外，我們應(yīng)用電子顯微鏡觀察經(jīng)砷劑、吉非替尼、或者兩者聯(lián)合處理細(xì)胞內(nèi)的自噬小體和凋亡小體。結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)砷劑處理48小時(shí)(圖4)，雙層膜自噬小體包裹的細(xì)胞質(zhì)成分可以被觀察到。除自噬小體外，一些出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂，染色質(zhì)邊集和線粒體腫脹的凋亡小體也可以觀察到(圖4)。在吉非替尼處理的細(xì)胞中，我們還可以觀察到呈現(xiàn)板層狀結(jié)構(gòu)由多層膜包裹的自噬小體增加，這表明包裹的胞漿成分已經(jīng)被降解。并且，在砷劑和吉非替尼處理的細(xì)胞，可以觀察到相當(dāng)多的自噬小體，其中一些包裹著線粒體。所有的證據(jù)證明砷劑和吉非替尼確實(shí)可以誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞自噬。三氧化二砷和吉非替尼可以抑制非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠的腫瘤增長
為了檢測砷劑和吉非替尼對活體非小細(xì)胞肺癌的療效，我們使用NCI-H1975-GFP細(xì)胞在裸鼠和NOD-SCID小鼠中建立了非小細(xì)胞肺癌小鼠腫瘤模型。在由NCI-H1975-GFP細(xì)胞建立的裸鼠模型中，當(dāng)皮下腫瘤體積大于IOOmm3時(shí)將小鼠隨機(jī)分成四組，包括對照組(Con)(灌水，腹腔注射生理鹽水)；A (三氧化二砷，5mg/kg/d，腹腔注射)；G (吉非替尼，125mg/kg/d，灌胃)和AG，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑并計(jì)算其體積，實(shí)際腫瘤體積的變化曲線(TV)或者腫瘤相對體積(RTV)如圖5A和5B。砷劑組和聯(lián)合組的腫瘤起始體積大于對照組和吉非替尼組，治療后六天，每組的腫瘤體積相接近。六天后，對照組的腫瘤增長率明顯比其它三組快，到治療后第十八天，吉非替尼組、砷劑組和聯(lián)合組的腫瘤體積比對照組小，并且聯(lián)合組和砷劑組的下降特別顯著(圖5，圖6，圖 7)。我們還分析了相對腫瘤體積，斜率表示腫瘤相對生長率，越傾斜，生長率越快，反之亦然。結(jié)果顯示，對照組的相對生長率的總趨勢是最快的，吉非替尼組次之，砷劑組和聯(lián)合組是最慢的(圖5B)。這意味著，砷劑可以抑制腫瘤在活體內(nèi)生長。我們進(jìn)一步通過直 方圖分析腫瘤相對體積隨治療時(shí)間的變異性。結(jié)果顯示，從治療后第六天，砷劑組相對腫瘤體積比對照組小(p〈0.05);在第十二天，砷劑組和聯(lián)合組RTV都比對照組小(p〈0.01);最后，在第十八天，砷劑組和聯(lián)合組相對腫瘤體積明顯小于對照組(P〈0. 01，p〈0. 001)，這表明砷劑在活體內(nèi)有抑制腫瘤增殖的潛能。在治療后第十八天，把小鼠安樂處死，分離腫瘤、肺、脾、肝和腎進(jìn)行病理、免疫組化、免疫熒光和電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)。除了吉非替尼耐藥的細(xì)胞NCI-H1975細(xì)胞外，我們還應(yīng)用HCC827-GFP細(xì)胞在裸鼠建立了對吉非替尼敏感的非小細(xì)胞肺癌小鼠模型。當(dāng)皮下腫瘤體積大于IOOmm3將小鼠隨機(jī)分為六組，分別為對照組(Con)、三氧化二砷組(A)(5mg/kg/d;腹腔注射)、低劑量吉非替尼組(Gl) (3. 125mg/kg/d ;灌胃)、高劑量吉非替尼組(Gh) (6. 25 mg/kg/d ;灌胃)、低劑量吉非替尼與三氧化二砷聯(lián)合組(AGJ以及高劑量吉非替尼與三氧化二砷聯(lián)合組(AGh)，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑并計(jì)算其體積，腫瘤體積的變化曲線或者腫瘤相對體積如圖8A和SB。治療后第二天，每組的腫瘤體積相似。此后，對照組的腫瘤增長率明顯比其它五組快，砷劑單用組腫瘤也呈增長的趨勢，但是比對照組長的慢，吉非替尼組(低劑量組與高劑量組)與聯(lián)合組的腫瘤體積明顯呈下降的趨勢，與對照組相比下降特別顯著(圖8，圖9，圖10)。由于裸鼠皮下腫瘤模型，不能完全等同于人的非小細(xì)胞肺癌，我們又建立了非小細(xì)胞肺癌原位腫瘤模型，先全身麻醉NOD-SCID小鼠，應(yīng)用外科手術(shù)的方法經(jīng)肋間隙注射NCI-H1975-GFP細(xì)胞到肺組織，于手術(shù)4天后隨機(jī)將小鼠分為四組，分別為對照組(Con)、三氧化二砷組(A) (5mg/kg/d ;腹腔注射)、吉非替尼(G) (64mg/kg/d灌胃)以及三氧化二砷與吉非替尼聯(lián)合用藥組(AG)，完全正常的小鼠(Nor)作為正常對照組。每周給藥5天，休息兩天，給藥3星期后安樂處死小鼠，取出肺、肝、脾、腎固定在福爾馬林中進(jìn)行病理學(xué)檢測。小動物PET-CT以及活體成像觀察原位成瘤情況，肺部大體形態(tài)拍照片顯示單獨(dú)應(yīng)用砷劑處理肺部的病變顯著輕于對照組，而單用吉非替尼組與對照組相比也有一定的治療效果，但是治療效果不如砷劑單用組，而當(dāng)兩藥聯(lián)用后，肺部的病變幾乎完全被抑制住，肺部大體照片與正常對照組(Nor)相似，說明在吉非替尼耐藥的腫瘤中，砷劑的確發(fā)揮了較好的治療作用(圖 11，12，13)。三氧化二砷和吉非替尼對非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液標(biāo)本的作用眾所周知，肺癌晩期患者常常會出現(xiàn)胸腔積液，我們與第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院呼吸科合作，嘗試用三氧化ニ砷治療胸腔積液。在研究中，我們對一例有胸腔積液的患者用神劑治療(胸腔內(nèi)注射三氧化ニ神)后，結(jié)果顯示不僅血性胸腔積液轉(zhuǎn)化成淺黃色，并且胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖14B)。隨后，我們探索砷劑和吉非替尼對非小細(xì)胞肺癌患者胸水中腫瘤細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，三氧化ニ砷和吉非替尼可以降低胸腔積液中成團(tuán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量(圖14A)。我們對胸腔積液中腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)ー些病人的EGFR發(fā)生L858R突變，其它的是野生型EGFR(圖15)。我們發(fā)現(xiàn)砷劑和吉非替尼不僅對EGFRub58k病人胸腔積液中腫瘤細(xì)胞有療效，對EGFRwt病人也有療效。我們通過Western Blot檢測經(jīng)砷劑和吉非替尼治療后胸腔積液中腫瘤細(xì)胞的EGFR和其它相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在EGFR WT病人的，砷劑而非吉非替尼可以下調(diào)EGFR，磷酸化mTOR和磷酸化4E-BP1的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)。然而，對ー些EGFRW病人的腫瘤細(xì)胞，神劑下調(diào)EGFR的表達(dá)的作用較強(qiáng)(2011123001);而另ー些EGFRW病人的腫瘤細(xì)胞，吉非替尼下調(diào)EGFR的表達(dá)較強(qiáng)(2012010501)，這表明EGFRl858k病人對EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼具有反應(yīng)性(圖16)。胸腔積液中的細(xì)胞經(jīng)體外應(yīng)用三氧化ニ砷以及吉非替尼處理后免疫熒結(jié)果顯示 砷劑可以上調(diào)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3以及P62的表達(dá)(圖17)。所有的證據(jù)表明砷劑不僅對EGFRwt病人也對EGFRW病人發(fā)揮潛在療效。砷劑和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌將是一個(gè)很有前景的策略。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合藥物，其特征在于，所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例為 l-2uM 0. OI-IOuM0
3.一種組合藥物在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的三氧化二砷和吉非替尼的比例為l-2uM 0. OI-IOuM0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療非小細(xì)胞肺癌的組合藥物，所述的組合藥物由三氧化二砷和吉非替尼組成。本發(fā)明還涉及一種組合藥物在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明研究非小細(xì)胞肺癌的聯(lián)合靶向治療方法，首次提出了三氧化二砷和吉非替尼的組合藥物，及其在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用，砷劑和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌將是一個(gè)很有前景的策略，將使更多的非小細(xì)胞肺癌患者獲益。
文檔編號A61P35/00GK102648921SQ20121015874
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者張汝, 毛建華, 陳竺, 陳賽娟, 馬列 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院