專利名稱：樹突細(xì)胞的體內(nèi)靶向的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
此處描述的本發(fā)明一般涉及為了疾病預(yù)防或?yàn)榱酥委熌康恼{(diào)節(jié)免疫反應(yīng)而將膜相關(guān)抗原(Ag)靶向于樹突細(xì)胞(DC)的制備物的組合物。更加特別地，本發(fā)明涉及修飾含 Ag膜的方法，以實(shí)現(xiàn)了靶向分子和免疫調(diào)節(jié)因子的嫁接(engraftment)和/或摻入，允許經(jīng)修飾的膜體內(nèi)靶向子DC，并且有效地誘導(dǎo)或抑制免疫反應(yīng)。甚至更加特別地，本發(fā)明涉及能夠用于修飾含Ag膜結(jié)構(gòu)的組合物，例如脂質(zhì)體或質(zhì)膜囊泡(PMV)，以實(shí)現(xiàn)所述膜體內(nèi)有效地靶向DC，因而調(diào)節(jié)免疫性，并且使它們?cè)诿庖咧委熤心軌蛴米饕呙缁蛞呙鐦釉噭┮灶A(yù)防或治療人類和動(dòng)物疾病。背景領(lǐng)域樹突細(xì)胞(DC)是一個(gè)罕見的抗原遞呈細(xì)胞(APC)群，能夠獨(dú)特地刺激原發(fā)免疫反應(yīng)，它們?cè)诎┌Y免疫治療中的用途引發(fā)了很強(qiáng)的興趣。1迄今，利用DC刺激有效免疫反應(yīng)的嘗試主要集中在涉及離體(ex vivo)DC操作的過(guò)程。這個(gè)方法通常要求從患者分離DC，數(shù)量擴(kuò)增，荷載抗原(Ag)(參考文獻(xiàn)2-5)，然后重新引入患者。雖然這個(gè)過(guò)程在原理上很簡(jiǎn)單，但是有與分離和培養(yǎng)這類罕見細(xì)胞群相關(guān)的種種困難。6’7顯然，體內(nèi)將Ag直接遞送到 DC并且引發(fā)適當(dāng)免疫反應(yīng)的策略具有巨大的臨床潛能。DC源自骨髓中的祖細(xì)胞，作為未成熟細(xì)胞遷移到外周組織，在那里它們內(nèi)吞Ag并進(jìn)行復(fù)雜的成熟過(guò)程。Ag經(jīng)由很多表面分子被內(nèi)吞，包括補(bǔ)體受體(例如，CDllc/CD18)和內(nèi)吞受體(例如，DEC-205、DC-SIGN和I10Il樣受體)。在Ag獲得過(guò)程中，未成熟DC也接受例如細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)的病原體相關(guān)分子形式的“危險(xiǎn)信號(hào)”，或者經(jīng)由例如IFN-Y 的細(xì)胞因子的炎性刺激。然后DC遷移到次級(jí)淋巴器官，成熟成為感受態(tài)APC8。受體例如 CDllc/CD18、DEC-205、DC-SIGN和I10Il樣受體在Ag捕獲和遞呈過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色，并且主要表達(dá)在DC上。因此可以想象這些受體也能夠用于體內(nèi)Ag直接靶向DC。與這個(gè)觀念一致，已經(jīng)顯示由C，當(dāng)與炎性刺激劑(例如抗CD40抗體)共同給予時(shí)誘導(dǎo)T細(xì)胞激活9’ 10O相反，在沒有這樣的炎性刺激劑存在下，經(jīng)由&FV靶向DC的抗原誘導(dǎo)了 T細(xì)胞的無(wú)應(yīng)答性。合成脂質(zhì)體具有遞送大量Ag至DC的潛能(參考文獻(xiàn)11)，但是至今在實(shí)踐中很難完成它們靶向特異性DC表面分子12’13。顯然，體內(nèi)聯(lián)合脂質(zhì)體Ag運(yùn)輸能力和分子識(shí)別直接靶向DC有或沒有“危險(xiǎn)信號(hào)”的多重Ag的特異性之有效策略將在簡(jiǎn)化DC免疫治療特別是對(duì)于癌癥、感染和自身免疫疾病具有巨大的潛能。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU00/00397(公開號(hào)WO 00/64471)中描述了當(dāng)體內(nèi)給予修飾的生物或合成膜或脂質(zhì)體時(shí)，為了改變免疫的目的或者為了將藥物和其它試劑靶向特異細(xì)胞類型或組織而修飾生物或合成膜或脂質(zhì)體的方法。通過(guò)金屬螯合基團(tuán)的摻入或附著完成了所述膜或脂質(zhì)體的修飾，因而允許擁有金屬親和標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)靶向分子的嫁接。然而，通過(guò)將Ag靶向DC誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的性質(zhì)關(guān)鍵性地依賴于特異性免疫調(diào)節(jié)因子，例如細(xì)胞因子或“危險(xiǎn)”信號(hào)，的存在，在PCT/AU00/00397中沒有公開或提示體內(nèi)引發(fā)合適的免疫反應(yīng)要求膜的修飾或需要免疫調(diào)節(jié)因子。
發(fā)明概要 本發(fā)明的目的，這個(gè)申請(qǐng)的主題，是通過(guò)修飾所述膜提供將含有Ag的脂質(zhì)體和 PMV體內(nèi)靶向DC的組合物，其中所述膜的修飾是經(jīng)由適當(dāng)免疫調(diào)節(jié)因子或“危險(xiǎn)信號(hào)”的摻入以及能夠?qū)⑿揎椖ぐ邢駾C表面受體從而引發(fā)適當(dāng)免疫反應(yīng)的配體的嫁接。為了增強(qiáng)免疫以預(yù)防或治療例如各種癌癥和感染的疾病，或者為了以能夠用于治療或預(yù)防移植排斥的方式抑制對(duì)特定自體Ag的免疫，或抑制自身免疫疾病例如I型糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥的影響，所述組合物能夠用作疫苗或用于免疫治療。進(jìn)一步地本發(fā)明的目的是提供制備合適的組合物的方法以及利用所述組合物治療的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，提供了通過(guò)將抗原體內(nèi)靶向于樹突細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的組合物，所述組合物包含其表面具有多個(gè)金屬螯合基團(tuán)的含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體的制備物；以及所述樹突細(xì)胞上受體的配體，所述配體經(jīng)由所述配體上金屬親和標(biāo)記連接于所述金屬螯合基團(tuán)；其中，所述含抗原囊泡或脂質(zhì)體包括免疫調(diào)節(jié)因子。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案，提供了通過(guò)將抗原體內(nèi)靶向于樹突細(xì)胞制備調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的組合物的方法，所述方法包括如下步驟i)制備含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體；ii)通過(guò)至少一種免疫調(diào)節(jié)因子的摻入修飾所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體；iii)通過(guò)兩性分子的摻入進(jìn)一步修飾所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體，其中所述兩性分子當(dāng)摻入于其中時(shí)包含處于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體表面的螯合基團(tuán)； 以及iv)將步驟(iii)的產(chǎn)物與所述樹突細(xì)胞上受體的配體接觸，其中所述配體包括結(jié)合于所述螯合基團(tuán)的金屬親和標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案，提供了調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予所述受試者根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物。根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)實(shí)施方案，提供了預(yù)防或治療受試者腫瘤的方法，所述方法包括給予受試者根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體內(nèi)的所述抗原是腫瘤抗原。根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)實(shí)施方案，提供了預(yù)防或治療受試者感染的方法，所述方法包括給予受試者根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體內(nèi)的所述抗原是來(lái)自引起感染的物質(zhì)(agent)的抗原。根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)實(shí)施方案，提供了根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物制備調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的藥劑的用途。根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)實(shí)施方案，提供了根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物制備預(yù)防或治療受試者腫瘤的藥劑的用途。根據(jù)本發(fā)明的第八個(gè)實(shí)施方案，提供了根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物制備預(yù)防或治療受試者感染的藥劑的用途。通過(guò)閱讀下面本發(fā)明的詳述，本發(fā)明其它的實(shí)施方案將顯而易見，其中那里的描述將是之后簡(jiǎn)要描述的附隨圖例的參考。


圖1顯示了新型螯合脂質(zhì)(NTA)3-DTDA的結(jié)構(gòu)。圖IB是摻入進(jìn)由棕櫚酰-油酰-磷酸卵磷脂(POPC)和磷脂酰-乙醇胺-聚乙二醇2_(PE-PEG2tlJ組成的含抗原(Ag)隱形脂質(zhì)體(SL)的(NTA)3-DTDA脂質(zhì)圖示。相似地，圖IC是與圖IB的那些組成相似但是沒有能與荷抗原的腫瘤細(xì)胞來(lái)源的質(zhì)膜囊泡(PMV)融合的PE-PEG·的脂質(zhì)體圖示。SL(B)和修飾的PMV(C)兩個(gè)例子中，也能包括脂質(zhì)示蹤物PC-B0DIPY (未顯示)以促進(jìn)脂質(zhì)體或修飾的PMV的追蹤。(NTA)3-DTDA允許組氨酸標(biāo)記的抗DEC-205和⑶Ilc的kFv Ab嫁接在脂質(zhì)體上或修飾的PMV表面，從而，將這些分子靶向DC的表面分子例如DEC-205和⑶11c。圖2顯示了嫁接了 CDlldcFv和DEC-2054cFv的PMV和SL結(jié)合于DC。至于圖 2A，源于B16-0VA細(xì)胞的PMV與由POPC、(NTA) 3_DTDA和PC-B0DIPY組成的脂質(zhì)體融合。然后PMV在與LTC-DC孵育和流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞結(jié)合的BODIPY熒光之前，嫁接對(duì)照肽 (PMV-L2)、CDl Ic-ScFv (PMV-CDllc)或 DEC-205-ScFv (PMV-DEC-205)。圖 2B 顯示了結(jié)合于相似嫁接的由POPC、(NTA) 3-DTDA,PE-PEG2000和PC-B0DIPY組成的SL之LTC-DC。每個(gè)圖譜是三次獨(dú)立試驗(yàn)得到的代表性圖譜。圖3顯示了引流淋巴結(jié)中嫁接了 kFv的PMV靶向DC。小鼠后足墊注射已經(jīng)嫁接對(duì)照蛋白質(zhì)(PMV-L2)或抗 CDllc (PMV-CDllc)和抗 DEC-205 (PMV-DEC-205)的 kFv 的熒光素標(biāo)記之PMV。A.注射后取出引流胭淋巴結(jié)，用生物素標(biāo)記的抗⑶lie mAb和PE-抗生物素蛋白鏈菌素染色分離的淋巴結(jié)細(xì)胞。流式細(xì)胞儀點(diǎn)狀圖顯示雙染色，描述了如指出的淋巴細(xì)胞的PE熒光(圖i、iii和ν)以及相應(yīng)的FITC熒光(圖ii、iv和vi)。B.用生物素標(biāo)記的抗⑶lie mAb和抗生物素蛋白鏈菌素-羅丹明染色的淋巴切片相似的試驗(yàn)結(jié)果，鑒別出有描述了羅丹明熒光(圖像i、ii和ν)和PMV熒光素?zé)晒?圖像ii、iv和vi)相應(yīng)區(qū)域的熒光圖像的DC。圖4顯示了將嫁接的PMV和SL靶向DC刺激T細(xì)胞增生。A.同系C57BL6脾T細(xì)胞與未刺激的DC或與已經(jīng)用嫁接了 L2、CDlldcFv或DEC-205-ScFv的B16-0VA PMV(左圖)、嫁接了 L2、CDlldcFv或DEC-205-ScFv荷SL 的 SIINFEKL-6H(中圖)、以及嫁接了 L2、 CDlldcFv或DEC-205-kFv含OVA的SL(右圖)刺激的DC孵育。評(píng)價(jià)[3H]胸苷摻入之前培養(yǎng)細(xì)胞4天；結(jié)果是cpm士SEM。B. CD4+和CD8+細(xì)胞增生的刺激。CFSE標(biāo)記的同系C57BL6 脾 T 細(xì)胞與用嫁接了 DEC-2054cFv 的 PMV(PMV)、嫁接了 DEC_2054cFv 和 SIINFEKL-6H 的 SL(SIINFEKL-SL)以及嫁接了 DEC-2054cFv 含 OVA 的 SL(0VA-SL)刺激的 DC 孵育。細(xì)胞培養(yǎng)4天，基于CFSE稀釋流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)增生的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的相對(duì)比例。圖5包含了用PMV和SL免疫接種小鼠的結(jié)果并顯示了 CTL抗腫瘤細(xì)胞活性的刺激。A.用Y-照射的B16-0VA細(xì)胞刺激4天并且源自僅僅靜脈注射了 PBS(PBS)、嫁接了 L2 肽(PMV-U)的 B16-0VA PMV、僅僅嫁接了 DEC-205-ScFv 的 PMV (PMV-DEC-205)或與嫁接與LPS (PMV-LPS-DEC-205)、IFN-y (PMV-IFN-y-DEC-205)或 GM-CSF(PMV-GM-CSF-DEC-205) 聯(lián)合的DEC-205-ScFv之PMV的小鼠脾細(xì)胞之CTL活性。B.來(lái)自如下用PMV、含SIINFEKL的 SL和含OVA的SL免疫的小鼠的脾細(xì)胞(25 1 E T比率)之CTL活性，如所示每個(gè)都嫁接了 L2，CDllcScFv或DEC-205-ScFv。也顯示了如所示與嫁接了的PMV和SL摻入的LPS、 IFN- γ和GM-CSF條件下的結(jié)果。星號(hào)指出了 CTL活性顯著高于(η = 6. .，P < 0. 05 .， Ρ<0.01以及..，P <0.001)用相應(yīng)的嫁接了 L2肽的Ag制備物免疫的小鼠。圖A和B 中標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)了在指出E T的比率的特異性裂解。結(jié)果表示為比裂解百分比士 SEM。
圖6顯示了用修飾的PMV和SL的免疫接種引發(fā)了腫瘤免疫。不同組的同系 C57BL6 小鼠用嫁接了 L2、CDllc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的 PMV ；嫁接了 SIINFEKL-6H 和 L2、 CDlIc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的 SL 以及嫁接了 L2、CDlIc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的含 OVA 的SL免疫(共三次每周一次)，如所示每個(gè)疫苗制備物單獨(dú)或者與LPS或IFN- γ聯(lián)合注射。用B16-0VA細(xì)胞靜脈攻擊小鼠，16天后取出肺并檢查肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示了每組小鼠腫瘤灶的平均數(shù)士SEM。點(diǎn)狀線指的是注射了 PBS的對(duì)照鼠中腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)。圖7說(shuō)明了嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(eotaxin)敲除小鼠的抗腫瘤反應(yīng)。A.如所示同系C 57BL6小鼠(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子或C57BL6背景之上的嗜酸細(xì)胞活化趨化因子敲除小鼠(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子+)用PBS或用嫁接了 L2(PMV-L2)或 DEC-205-ScFV (PMV-DEC-205)的含IFN-γ PMV免疫。從小鼠分離脾細(xì)胞，與Y照射的天然 B16-0VA細(xì)胞共培養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)在所指的E T比率的比裂解。結(jié)果表示為比裂解百分比士SEM。B.如上免疫小鼠，然后用B16-0VA細(xì)胞靜脈攻擊，16天后取出肺，檢查腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示了每組小鼠腫瘤灶平均數(shù)士 SEM。圖8顯示了嫁接了 CDl Ic-SCFV和DEC-205-ScFv的BCG分支桿菌膜囊泡結(jié)合于DC。Ni-(NTA)3-DTDA與源自BCG分支桿菌的PMV聯(lián)合，并用6-(熒光素-5 (和6_) 羧氨基)己酸琥珀酸酯標(biāo)記。然后在與JAWS-II DC孵育前用對(duì)照肽(BCG-Lipo+L2)、 CDlIc-ScFv(BCG-Lipo+CDllc)或 DEC-205-ScFv(BCG_Lipo+DEC205)嫁接 PMV，之后流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞結(jié)合的熒光。上圖顯示了 BCG-Lipo+⑶Ilc的結(jié)果而下圖包含了 BCG-Lipo+DEC205的結(jié)果。每個(gè)圖中，左手痕跡線是JAWS-II細(xì)胞單獨(dú)，中間痕跡線是 BCG-Lipo+L2 對(duì)照，而右手痕跡線是 BCG-Lipo+CDllc 或 BCG_Lipo+DEC205。圖9描述了來(lái)自已經(jīng)靜脈免疫接種嫁接了的BCG制備物的C57/BL6小鼠脾細(xì)胞Elispot分析的結(jié)果。這些嫁接物是L2肽作為對(duì)照(BCG超聲處理物+L2)； CDIlc-ScFv (BCG 超聲處理物+CDllc)或 DEC_205_ScFv (BCG 超聲處理物+DEC205)。用用作制備物載體的PBS免疫接種對(duì)照小鼠。發(fā)明詳述此處使用了下列縮寫Ag 抗原APC抗原遞呈細(xì)胞CTL細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞DC樹突細(xì)胞IFN-Y 干擾素-Y
LPS脂多糖(NTA) 3-DTDA三(次氮基三乙酸)雙十四胺OVA卵白蛋白PMV質(zhì)膜囊泡ScFv單鏈抗體片段SL隱形脂質(zhì)體此處使用術(shù)語(yǔ)“抗原”表示為了遞呈給免疫系統(tǒng)而能夠被DC吸收、內(nèi)化和處理的任何分子。此處使用術(shù)語(yǔ)“配體”表示體內(nèi)能特異性結(jié)合于DC表面標(biāo)記物/受體的任何分子。 術(shù)語(yǔ)包括完全抗體和抗體片段例如^Fvs和結(jié)構(gòu)域抗體。此處使用術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)因子”表示能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過(guò)程或結(jié)果的任何“危險(xiǎn)信號(hào)”、細(xì)胞因子或分子。此處使用術(shù)語(yǔ)“受體”表示DC表面上的受體分子并且是能與嫁接了脂質(zhì)體或膜囊泡的配體相互作用的DC表面上的實(shí)體。此處使用術(shù)語(yǔ)“腫瘤”表示良性和惡性實(shí)體腫瘤以及實(shí)體和非實(shí)體癌癥。關(guān)于上面定義的第一個(gè)實(shí)施方案，含抗原的膜囊泡一般是PMV，但是能從任何生物膜或生物結(jié)構(gòu)形成。有利地PMV是腫瘤來(lái)源的PMV。PMV也能是淋巴細(xì)胞來(lái)源的PMV或白細(xì)胞來(lái)源的PMV。PMV還能是細(xì)菌、原生動(dòng)物、病毒或真菌的膜制備物。關(guān)于含抗原的脂質(zhì)體，這些包括能從脂質(zhì)不同混合物產(chǎn)生的隱形脂質(zhì)體(SL)。能如參考文獻(xiàn)14、16、17和觀所述地制備這樣的囊泡和脂質(zhì)體，此處通過(guò)交叉引用引入全部?jī)?nèi)容作為交叉參考。組合物的抗原能夠是期望的免疫反應(yīng)所抵抗的任何抗原或編碼抗原的DNA。組合物包含相同或不同來(lái)源的多個(gè)不同抗體。就是說(shuō)包含腫瘤抗原的組合物可以包括來(lái)自不同腫瘤的抗原。囊泡和脂質(zhì)體表面上的金屬螯合基團(tuán)作為組成囊泡和脂質(zhì)體的磷脂和/或脂質(zhì)內(nèi)存在的兩性分子首基存在。兩性分子有利地是次氮基三乙酸雙十四胺(NTA-DTDA)或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺(PE-NTA)，但是組合物包括含有能摻入脂質(zhì)膜的任何金屬結(jié)合或螯合基團(tuán)的任何分子。組合物還能進(jìn)一步包含兩性分子的混合物。如將在下面更詳細(xì)解釋地，優(yōu)選的兩性分子是(NTA)3-DTDA (三(次氮基三乙酸) 雙十四胺)。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU00/00397(公開號(hào)W000/64471)中更詳細(xì)地描述了相關(guān)分子NTA-DTDA以及其它兩性分子和含有相同分子的囊泡和脂質(zhì)體，此處通過(guò)交叉引用引入全部?jī)?nèi)容作為參考。連接于膜囊泡和脂質(zhì)體上金屬螯合基團(tuán)的配體是能夠特異性結(jié)合于任何DC表面標(biāo)記物的任何金屬親和標(biāo)記的分子。優(yōu)選的金屬親和標(biāo)記是六組氨酸。下面的實(shí)施例中， 使用了抗DC表面分子CDl Ic和DEC-205 (0)20 的六組氨酸標(biāo)記形式的kFv。其它的實(shí)施例包括任何組氨酸標(biāo)記的配體，例如能結(jié)合于DC表面標(biāo)記物例如DC-SIGN(⑶209)、⑶206 和⑶207的抗體或抗體片段。組合物能夠包括DC上不同標(biāo)記物/受體的多個(gè)配體。例如，組合物能夠包含作為配體的抗DEC-205的kFv聯(lián)合抗DC-SIGN的kFv。如上所示，配體的金屬親和標(biāo)記一般是共價(jià)連接在配體上方便位點(diǎn)的六組氨酸基團(tuán)。例如，六組氨酸能連接于蛋白質(zhì)抗原N或C末端。其它金屬親和標(biāo)記包括能螯合金屬并能共價(jià)附著于配體上方便位點(diǎn)的任何基團(tuán)或氨基酸序列。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物的免疫調(diào)節(jié)因子包括能增強(qiáng)或修飾DC對(duì)抗原的反應(yīng)的化合物或分子。這樣的化合物包括“危險(xiǎn)信號(hào)”(例如，細(xì)菌脂多糖)、細(xì)胞因子(例如， 干擾素_ Y、白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β )，以及化學(xué)因子、激素和生長(zhǎng)因子樣分子或編碼這樣分子的DNA。組合物能 包括多于一個(gè)的免疫調(diào)節(jié)因子。關(guān)于本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案，在上面參考的國(guó)際申請(qǐng)(No. PCT/AU00/00397)中描述了制備有配體捕獲在其上的膜囊泡或脂質(zhì)體的合適方法。關(guān)于第二個(gè)實(shí)施方案方法的步驟(i)，膜囊泡一般是PMV但是能從任何生物膜或生物結(jié)構(gòu)形成。脂質(zhì)體包括SL。膜囊泡和脂質(zhì)體的Ag能是將要遞送到DC的蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽或多糖或編碼抗原的DNA或它們的聯(lián)合。第二個(gè)實(shí)施方案方法的步驟(ii)中，與第一個(gè)實(shí)施方案組合物一起，免疫調(diào)節(jié)因子能是“危險(xiǎn)信號(hào)”(例如，細(xì)菌脂多糖)、細(xì)胞因子(例如，干擾素_ Y、白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β )或編碼這樣因子的DNA。根據(jù)第三個(gè)實(shí)施方案的方法的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)在包括移植排斥或自體免疫疾病例如I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥的病變的預(yù)防或治療中有應(yīng)用。在移植患者的情況下，這個(gè)涉及來(lái)自靶向移植受者的供者白細(xì)胞的PMV的給予。這個(gè)例子中免疫調(diào)節(jié)因子能夠是例如細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β。然而，免疫調(diào)節(jié)因子能夠是具有能力產(chǎn)生耐受原性DC的任何分子。第四個(gè)實(shí)施方案的方法能夠用于任何腫瘤的治療，包括但不限于黑素瘤以及前列腺、腸、乳腺和肺的癌癥。所述方法也能用于白血病和淋巴瘤的治療。所述方法能用于治療任何哺乳動(dòng)物的腫瘤，但是特別適合治療人類腫瘤。鑒于接受治療的腫瘤，臨床醫(yī)生在對(duì)受試者評(píng)價(jià)后能夠確立遞送給受試者修飾的含Ag膜囊泡或脂質(zhì)體的量以及給予方案。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將立即認(rèn)識(shí)到根據(jù)第四個(gè)實(shí)施方案的方法提供了體外操縱DC有效的替代以用于癌癥免疫治療。關(guān)于第五個(gè)實(shí)施方案，為了增強(qiáng)對(duì)造成感染的物質(zhì)的免疫和/或用于感染的治療所述方法能用于預(yù)防或治療任何感染，包括細(xì)菌、分枝桿菌、病毒和真菌造成的感染。以與上面給出的移植排斥預(yù)防的實(shí)施例相似的方法，提供有效的方法所要求的就是制備包括來(lái)自傳染物至少一個(gè)抗原的PMV或脂質(zhì)體。那個(gè)抗原是例如病毒(例如HIV、B和C型肝炎) 的包膜蛋白或細(xì)菌(例如分支桿菌)的細(xì)胞壁成分、真菌(念珠菌)和原生動(dòng)物(例如瘧疾)。與本發(fā)明第三至第五個(gè)實(shí)施方案一致地能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將組合物給予受試者。一般靜脈或皮下給予組合物。第三至第五個(gè)實(shí)施方案的方法的受試者一般是哺乳動(dòng)物。所述方法特別適合用于人。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解根據(jù)本發(fā)明第六至第八個(gè)實(shí)施方案的藥劑也將包括組合物的至少一個(gè)載體。所述載體是與PMV和脂質(zhì)體相容的任何溶液。一般的載體是生理鹽水和緩沖鹽水例如PBS。藥劑還包括與藥劑預(yù)期用途相符的活性劑。例如，根據(jù)第七個(gè)實(shí)施方案的藥劑包括其它抗腫瘤試劑，而根據(jù)第八個(gè)實(shí)施方案的藥劑包括以抗細(xì)菌、抗原生動(dòng)物、抗病毒或抗真菌活性作為適當(dāng)靶感染的其它試劑。這樣額外的試劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的。原型研究原型研究中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)為了靶向DC，螯合劑-脂質(zhì)(NTA)3-DTDA能夠用于將 His標(biāo)記的kFv錨定在腫瘤來(lái)源的質(zhì)膜囊泡(PMV)或在含腫瘤抗原的隱形脂質(zhì)體上。以這種方式將Ag直接靶向DC引發(fā)了很強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。脂質(zhì)體因?yàn)榫哂泻芨叩闹委煗撃芏苁軞g迎，但是缺乏靶向分子附著的簡(jiǎn)單方法阻礙了它們的用途。13新型螯合劑-脂質(zhì)(NTA)3-DTDA(圖1A)當(dāng)摻入入SL或腫瘤細(xì)胞來(lái)源PMV(B16-0VA)時(shí)，實(shí)現(xiàn)了靶向DC上表面分子的六組氨酸標(biāo)記WkFv之穩(wěn)定嫁接(圖IB 和圖1C)。嫁接了特異于DC標(biāo)記物CDllc和DEC-205的ScFv的PMV和SLs體外特異性結(jié)合于DC，并且基于流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡研究，體內(nèi)相關(guān)Ags能直接靶向DC(圖2和 3)。最初，檢查了 DC引發(fā)的Ag遞呈試驗(yàn)中嫁接的PMV和SL刺激功能性反應(yīng)的能力。 我們的研究顯示嫁接了 ^Fv的PMV和含Ag的SL比對(duì)照PMV和SLs更加顯著有效地誘導(dǎo) DC刺激T細(xì)胞增生(圖4A)。PMV刺激了⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的增生。PMV具有刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞囊泡中存在的抗原決定簇有反應(yīng)性的所有可能T細(xì)胞克隆介導(dǎo)的反應(yīng)之潛能。相似地，嫁接了 ^Fv的含OVA蛋白質(zhì)的SL可以刺激OVA特異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞；但是期待含有OVA中優(yōu)勢(shì)免疫CTL抗原決定簇SIINFEKL的SL只產(chǎn)生⑶8+T細(xì)胞反應(yīng)。與這個(gè)相符合，我們的數(shù)據(jù)顯示了嫁接的PMV靶向的DC產(chǎn)生了大約相等比例的CD4+和CD8+T細(xì)胞，而含SIINFEKL的SL靶向的DC比含OVA的那些更小程度地主要產(chǎn)生了⑶8+T細(xì)胞(圖4B)。證據(jù)顯示“危險(xiǎn)”信號(hào)在Ag暴露后對(duì)于DC的成熟和遷移很重要，并且能夠避免誘導(dǎo)對(duì)遞呈的Ag的耐受性。9’1(1’18值得注意地，“危險(xiǎn)”信號(hào)在體內(nèi)Ag遞呈試驗(yàn)中不是必需的 (圖4)，推測(cè)是因?yàn)樵诜蛛x過(guò)程中DC被“干擾”或激活。已知LPS和象GM-CSF和IFN-γ的細(xì)胞因子影響DC吸附Ag和成熟的能力。8’19_21所以對(duì)于動(dòng)物研究，我們?cè)赑MV和SL之內(nèi)摻入了 LPS、IFN- γ或GM-CSF，因而提供了同時(shí)遞送Ag和危險(xiǎn)信號(hào)至DC的方法。對(duì)嫁接了 kFv的PMV和含Ag的SL誘導(dǎo)DC以引發(fā)CTL反應(yīng)的能力的檢查揭示， 與對(duì)照細(xì)胞相比，來(lái)自用嫁接了 ^Fv的PMV或荷SL的抗原免疫的動(dòng)物之T細(xì)胞在體外再刺激之后，體外展現(xiàn)了增加的裂解B16-0VA靶細(xì)胞的能力(圖5)。重要地，結(jié)果顯示了體內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞裂解活性依賴于“危險(xiǎn)”信號(hào)的存在，LPS和IFN-Y刺激了最大的反應(yīng)(圖5)。 異種OVA蛋白質(zhì)和六組氨酸標(biāo)記形式的SIINFEKL為了經(jīng)由嫁接的kFv靶向而與SL相連。 因Ag遞呈和CTL試驗(yàn)證明以這個(gè)方法將嫁接了 kFv的PMV和荷SL的Ag靶向DC能夠有效刺激抗腫瘤反應(yīng)，并且強(qiáng)調(diào)了“危險(xiǎn)”信號(hào)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的重要性(圖4&5)。而且，嫁接了 ScFv的含SINFEKL-6H的SL能夠誘導(dǎo)顯著細(xì)胞毒性反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，證明了使用含(NTA) 3_DTDA 的SL的方法是體內(nèi)將任何His標(biāo)記的肽Ag靶向DC的有效策略。這個(gè)工作中最最重要的發(fā)現(xiàn)是我們觀察到用嫁接了 CDlldcFv和DEC-205-kFv 的PMV免疫的同種動(dòng)物在用B16-0VA黑色素瘤攻擊后與對(duì)照相比具有顯著低數(shù)量的肺腫瘤轉(zhuǎn)移。相似地，用嫁接了 SvFv含OVA的SL和LPS或IFN-γ免疫的同種動(dòng)物具有更低數(shù)量的轉(zhuǎn)移(圖6)。結(jié)果進(jìn)一步地顯示腫瘤免疫完全依賴于”危險(xiǎn)信號(hào)”、LPS和IFN- γ (圖5 和6)。所以用嫁接了 CDl Ic-ScFv-和DEC-205-ScFv的PMV和荷SL的Ag免疫小鼠將相關(guān) Ag靶向DC，然后DC處理和遞呈Ags至T細(xì)胞誘導(dǎo)Ag特異性T細(xì)胞激活，并且在體內(nèi)引發(fā)很強(qiáng)的B16-0VA腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制。進(jìn)一步有意義的發(fā)現(xiàn)是如下的事實(shí)不像所有都發(fā)展了嚴(yán)重肺轉(zhuǎn)移的對(duì)照小鼠，已經(jīng)接種嫁接了 DEC-205-ScFv的含IFN- y PMV的小鼠在用 B16-0VA腫瘤細(xì)胞攻擊之后隨后不顯示任何跡象的腫瘤發(fā)展，指出DC靶向疫苗具有治療活性。
這個(gè)研究特別引人的方面是抗B16-0VA黑素瘤的CTL活性的顯著產(chǎn)生與腫瘤保護(hù)無(wú)關(guān)。這點(diǎn)在期待只產(chǎn)生抗B16-0VA腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的OVA的⑶8+CTL反應(yīng)之SIINFEKL-SL 疫苗特別明顯。盡管所述疫苗誘導(dǎo)很強(qiáng)的體外抗B16-0VA腫瘤細(xì)胞的回憶CTL反應(yīng)，免疫并沒有提供抗腫瘤的體內(nèi)保護(hù)。已知B16-0VA黑色素瘤系表達(dá)非常低水平的I型MHC，因此對(duì) CTL裂解有抗性，除非使用高活性CTL。14用DC靶向的PMV或SL制備物免疫的小鼠脾細(xì)胞在體外用腫瘤細(xì)胞刺激后能夠裂解B16-0VA腫瘤細(xì)胞的事實(shí)暗示能夠產(chǎn)生抗這個(gè)腫瘤細(xì)胞系的高親合力的CTLs。推測(cè)，不能產(chǎn)生這樣的CTL，或者這樣的CTLs體內(nèi)無(wú)效。事實(shí)上， 前面的研究指出⑶4+而不是⑶8+T細(xì)胞抗B16-0VA轉(zhuǎn)移有效，有T輔助2 (Th2)細(xì)胞的細(xì)胞因子譜的CD4+細(xì)胞特別有效。14而且，要觀察到腫瘤退化將嗜酸性細(xì)胞嗜酸細(xì)胞活化趨化因子依賴性地招募到腫瘤是必須的。14為了探查CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞的招募在本研究中觀察到的抗腫瘤效果中可能的作用，用嫁接了 ScFv的PMV免疫嗜酸細(xì)胞活化趨化因子敲除小鼠。我們的結(jié)果顯示與對(duì)照相比，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子敲除小鼠展現(xiàn)了顯著降低的抑制B16-0VA腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力(圖7A)。嗜酸細(xì)胞活化趨化因子是很強(qiáng)的嗜酸細(xì)胞趨化因子，所以，這些發(fā)現(xiàn)與將嗜酸細(xì)胞招募至腫瘤組成抗腫瘤反應(yīng)重要部分相符合。與使用DC進(jìn)行腫瘤免疫治療的現(xiàn)行策略比，此處描述的修飾的PMV和SL系統(tǒng)提供了許多優(yōu)點(diǎn)。首先，所述系統(tǒng)能體內(nèi)直接遞送Ags至DC，因而取消了從患者分離DC和為了用于免疫治療體外操縱細(xì)胞的需要。其次，靶向或活性脂質(zhì)體介導(dǎo)的Ag遞送到DC具有同時(shí)遞送更多Ag和/或一些不同Ags的潛能，很可能刺激更加有效的免疫反應(yīng)。相同的方法很可能能遞送任何Ag或免疫調(diào)節(jié)劑至DC，例如“危險(xiǎn)”信號(hào)、RNA、DNA和細(xì)胞因子或它們的聯(lián)合，這個(gè)通過(guò)使用融合于DC靶向蛋白質(zhì)的Ags不能很容易地完成。9a°第三，所述方法是多用途的，將很方便地用于臨床因?yàn)闉榱嗽鰪?qiáng)患者腫瘤免疫很可能擁有組氨酸標(biāo)記的任何DC靶向蛋白質(zhì)能被嫁接到修飾的PMV或SL以遞送特異性腫瘤Ags或其它物質(zhì)。在前面原型研究中已經(jīng)廣泛地描述了本發(fā)明及其特別應(yīng)用，現(xiàn)在在此處使用的材料和方法之后將給出具體實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些實(shí)施例只用于舉例目的，在任何方面都不限制本發(fā)明的范圍。材料和方法試劑[3H]-胸苷和 51Cr (Na51CrO4)得自 Amersham(Buckinghamshire，英國(guó))。棕櫚酰-油酰-磷脂酰膽堿(POPC)、OVAdI級(jí)，F(xiàn)PLC純化的)、LPS (來(lái)自大腸桿菌血清型0111 :B4)、 Isopaque、Ficoll 和 β -巰基乙醇由 Sigma-Aldrich(Castle Hill, New South Wales，澳大利亞)供應(yīng)。磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000 (PE-PEG2tlJ得自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster)。2_(4，4_ 二氟-5-辛?；?~4~ 硼 _3a，4a_ 二氮雜-s-indacene-3-戊?；?-1-十六?；?sn-甘油3-磷酸膽堿(PC-B0DIPY)和5-(和-6) - 二乙酸羧基熒光素、琥珀酸酯、混合異構(gòu)體(CFS^購(gòu)自分子探針(Eugene，Oregon)?；旧先缢?7合成由共價(jià)連接于兩個(gè)雙十四胺(DTDA)的三個(gè)次氮基三乙酸(NTA)首基組成的螯合-脂質(zhì)(NTA)3-DTDA, 但是有額外的步驟將NTA基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)于NTA-DTDA的每個(gè)羧基基團(tuán)以產(chǎn)生(NTA)3_DTDA。 對(duì)于緩沖液中所有Ni2+的加入使用NiS04。單克隆單體和蛋白質(zhì)小鼠⑶56 (克隆42. 18，大鼠IgG^i)mAb來(lái)自第六屆人NK細(xì)胞工場(chǎng)，鼠⑶3mAb (克隆 145-2C11，亞美尼亞倉(cāng)鼠 IgG)購(gòu)自 PharMingen (San Diego，California)。重組鼠 IFN-γ 和GM-CSF由P印roTech公司(Rockey Hill,New Jersey)提供。使用桿狀病毒蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生重組^Fv抗體N418 (抗⑶lie)和NLDC145 (抗-DEC-205)，每個(gè)在羧基末端有六組氨酸(6H)標(biāo)記并分別表示為CDlldcFv和DEC-205-kFv，并且如所述進(jìn)行純化?！?’28 肽由John Curtin醫(yī)學(xué)研究學(xué)校(JCSMR)，ANU, Canberra生物分子資源實(shí)驗(yàn)室合成。常規(guī)地使用在血漿蛋白質(zhì)富含組氨酸的糖蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的10個(gè)氨基酸序列L2肽(GHHPHGHHPH) 嫁接對(duì)照PMV和SL，因?yàn)樗Y(jié)合于有高親合力的Ni- (NTA) 3_DTDA并能阻斷其非特異性結(jié)合于細(xì)胞。使用代表H-2b小鼠OVA優(yōu)勢(shì)免疫CTL抗原決定簇(0VA殘基257464)的有六組氨酸標(biāo)記附著的肽SIINFEKL-6H而將肽Ag遞送至DC。小鼠和細(xì)胞系6-8周齡的雌性或雄性C57BL6小鼠(H_2b)由動(dòng)物培育公司(JCSMR，ANU)提供， C57BL6嗜酸細(xì)胞活化趨化因子敲除小鼠(H-2b)(嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-/-)是生化和分子生物系(JCSMR)Paul !^ster博士的禮物，并用于獲得用于體外試驗(yàn)和腫瘤生長(zhǎng)體內(nèi)研究的淋巴細(xì)胞。分泌OVA的腫瘤細(xì)胞系高轉(zhuǎn)移鼠B16-0VA黑色素瘤[C57BL6 (H-2b)]培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FCS，Trace生物科學(xué)，諾貝爾公園，Victoria，澳大利亞)和0. 5mg/mL 遺傳霉素Qnvitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，hvitrogen，墨爾本，澳大利亞) 中在37°C 5% CO2大氣環(huán)境下。鼠胚胎皮膚樹突細(xì)胞(FSDC) [C57BL6-DBA/2J Fl (H-2b/d)] 培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中但是沒有遺傳霉素。如所述”分離和培養(yǎng)的鼠長(zhǎng)期培養(yǎng)的樹突細(xì)胞 (LTC-DC) [B10.A(2R) (H-2k/b)]是H. 0，Neill博士 (生化和分子生物學(xué)學(xué)院，ANU)的禮物。樹突細(xì)胞和T細(xì)胞的分離從C57BL/6小鼠脾分離鼠DC和T細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，用膠原酶IV(Boerhringer Mannheim)消化分離脾細(xì)胞，接著使用Isopaque-Ficoll梯度的密度梯度離心分離低密度脾細(xì)胞。如所述31通過(guò)可塑性粘附分離DC，然后懸浮在含10%FCS、5X10_5M β-巰基乙醇、100IU/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml新霉素和IOmM HEPES的完全RPMI1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基。為了 T細(xì)胞的分離，脾臟分裂為單個(gè)細(xì)胞懸浮液，低張裂解去除紅細(xì)胞后，使用尼龍絨毛柱分離 T細(xì)胞。32質(zhì)膜囊泡和隱形脂質(zhì)體蔗糖梯度離心制備培養(yǎng)細(xì)胞的PMV，3°并且基本如總結(jié)地進(jìn)行修飾?！?’17如下制備用于修飾PMV的脂質(zhì)體混合POPC, (NTA) 3-DTDA、LPS和PC-B0DIPY (摩爾比例 94 2 2 2)的乙醇溶液或 P0PC、(NTA)3-DTDA 和 PC-B0DIPY (摩爾比例 96 2 2)的乙醇溶液，N2氣流下干燥，然后在含有60 μ M Ni2+的100 μ 1 PBS中再水化。在有指出的的地方，作為L(zhǎng)PS的替代，再水化緩沖液中包括IFN- γ或GM-CSF (50ng)。使用T0SC0 IOOff超聲粉碎機(jī)(測(cè)量和科學(xué)有限公司，倫敦，英國(guó))在最大振幅對(duì)含水混合物進(jìn)行超 聲處理(三次，15秒)。加入15% PEG4qq和用PBS稀釋10倍之前，脂質(zhì)體(100 μ 1)與100 μ 1 B16-OVA 細(xì)胞來(lái)源的PMVaxiO8個(gè)細(xì)胞等同物)混合。用合適的ScFv嫁接之前，通過(guò)容量排除色譜純化含(NTA)3-DTDA和細(xì)胞因子的PMV。17如下制備隱形脂質(zhì)體(SL)溶于乙醇的POPC、(NTA)「DTDA、PE-PEG2000LPS 禾口 PC-B0DIPY (摩爾比例 96 1 1 1 1)或 POPC、(NTA) 3-DTDA、PE-PEG2000 禾口 PC-B0DIPY (摩爾比例97 1 1 1)在N2氣流下干燥，然后在含有30 μ M Ni2+的100 μ 1 PBS中再水化(總脂質(zhì)ImM)。對(duì)于缺乏LPS的混合物，IFN-γ或GM_CSF(50ng)包括在 PBS中。超聲脂質(zhì)混合物并純化SL(如上)。對(duì)于功能性研究，所有脂質(zhì)混合物中省略 PC-B0DIPY。試圖將OVA蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)免疫抗原決定簇SIINFEKL封裝在SL內(nèi)，但是很困難， 因?yàn)檫@個(gè)肽在用于生產(chǎn)SL并嫁接組氨酸標(biāo)記的ScFv的pH(pH 7.4)有很低的溶解度。 然而，所述肽的六組氨酸標(biāo)記形式SIINFEKL-6H允許有效的封裝和/或所述肽嫁接到含 (NTA) 3-DTDA的SL上。使用FACS分析的結(jié)合研究顯示嫁接了 CDl Ic-ScFv-或DEC-205-ScFv 的含SIINFEKL-6H的SL體外能夠有效地靶向DC上的受體(未顯示)。因而，在有指出的地方，包括SIINFEKL-eHOyM)同時(shí)與ScFv嫁接。將干燥的脂質(zhì)混合物在含0. Img OVA (Img/ ml)的PBS中再水化接著短暫超聲將OVA有效地封裝在含POPC、(NTA)3-DTDA和PE_PEG2_ 的SL中。室溫下與合適的ScFv (200 μ g/ml)孵育1小時(shí)嫁接含(NTA) 3_DTDA的PMV和SL。 如前所述地通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)嫁接的PMV和SL與DC的結(jié)合。17DC的體內(nèi)靶向?yàn)榱双@得用于跟蹤研究的高度熒光的PMV，PMV與異硫腈酸熒光素(FITC，分子探針)反應(yīng)，與L2或ScFv嫁接，然后注射到小鼠后足墊。16小時(shí)后，收集每個(gè)動(dòng)物的引流胭淋巴結(jié)并用于淋巴結(jié)細(xì)胞分離以在用生物素化⑶lie mAb和抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(抗生物素蛋白鏈菌素-PE)染色后進(jìn)行雙色流式細(xì)胞儀分析或者用于共聚焦熒光成像。 為了成像，淋巴結(jié)在10%福爾馬林中固定，然后石蠟包埋，切成切片；然后切片粘附到載玻片上并去除石蠟。載玻片與PBS加20%羊血清(PBS-羊血清)中的抗⑶Ilc的mAb N418 室溫下孵育1小時(shí)之前，與PBS-羊血清室溫孵育30分鐘以阻斷。然后水中徹底清洗切片， 用抗生物素蛋白鏈菌素_羅丹明在PBS-羊血清中染色。進(jìn)一步清洗之后，使用Radiance 2000熒光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，Richmond，加利福尼亞)分析載玻片的熒光素和羅丹明熒光。用Kalman平均30個(gè)連續(xù)激光掃描獲得圖像，并使用Bio-Rad圖像軟件進(jìn)行處理?？乖f呈試驗(yàn)在37°C完全培養(yǎng)基中DC與修飾的PMV或SL孵育4個(gè)小時(shí)，然后清洗以去除未結(jié)合的PMV或SL，Y-照射(5000拉德)，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分裝到96孔平底平板(2 X IO4個(gè)細(xì)胞/200 μ 1/孔)。加入同種T細(xì)胞(2 X IO4個(gè)細(xì)胞)，通過(guò)測(cè)量[3H]-胸苷的摻入評(píng)價(jià)增生 14之前細(xì)胞共培養(yǎng)4天。通過(guò)如所述地33在與DC共培養(yǎng)之前用CFSE (5 μ Μ)標(biāo)記T細(xì)胞評(píng)價(jià)Ag遞呈試驗(yàn)中增生的⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞的比例。4天后，清洗共培養(yǎng)的細(xì)胞，用抗小鼠 CD4 (克隆 L3T4) -Cy-Chrome (10 μ g/ml)和抗小鼠 CD8 (克隆 Ly-2) -PE (10 μ g/ml)染色， 通過(guò)流式細(xì)胞儀分析CFSE、Cy-Chrome和PE熒光。細(xì)胞毒性試驗(yàn)
如描述的那些相似地進(jìn)行細(xì)特異性CTL試驗(yàn)。34同種C57BL6小鼠靜脈注射(i. v.) PBS (對(duì)照)或嫁接了 kFv的源于B16-0VA細(xì)胞的PMV或荷抗原的SL(如指出地)進(jìn)行免疫。免疫14天后，取出脾臟，如上分離T淋巴細(xì)胞(效應(yīng)T細(xì)胞)。然后T細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基并IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔的濃度分裝到M孔平底平板(ICN生物醫(yī)學(xué))中與IX IO5個(gè) Y照射(5000拉德)的B16-0VA細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)5天后，如所述地用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性?！?動(dòng)物免疫和體內(nèi)腫瘤攻擊每周i. v.尾靜脈注射PBS (對(duì)照)或者都懸浮在200 μ 1體積PBS中嫁接了 kFv 的816-0￥々細(xì)胞來(lái)源的？1^0\105細(xì)胞等同物)或荷相關(guān)抗原( 0. 2yg OVA或 0. 8ng SIINFEKL-6H)的SL( 0. 16 μ g總脂質(zhì))免疫小鼠三次。最后一次注射兩周后，靜脈注射3X105個(gè)B16-0VA細(xì)胞攻擊小鼠。在第16天，取出肺臟，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)可見的腫瘤灶的數(shù)量?；蛘?，在靜脈注射1. 5X IO5個(gè)B16-0VA細(xì)胞3、6和9天后用嫁接了 kFv的 B16-0VA PMV免疫小鼠。實(shí)施例1體外和體內(nèi)脂質(zhì)體都能夠用于將腫瘤抗原靶向DC兩種類型的脂質(zhì)體制備物用于將腫瘤Ag靶向DC(見下面圖1)。第一個(gè)限定了腫瘤細(xì)胞來(lái)源的通過(guò)靶向DC的kFv的嫁接修飾的PMV粗制備物之用途，第二個(gè)是也嫁接了 DC靶向的kFv的含Ag隱形脂質(zhì)體的制備物。隱形脂質(zhì)體(SLs)是合成的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，它們通過(guò)包含例如PE-PE(i2_的脂質(zhì)而立體穩(wěn)定，并且由于它們逃脫網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性清除的能力，在它們靜脈給予后它們能夠保留在血循環(huán)中數(shù)天。14描述了螯合脂質(zhì)NTA-DTDA 修飾腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來(lái)源的PMV以用于T細(xì)胞共刺激分子的嫁接的用途。15’16最近我們生產(chǎn)了新型脂質(zhì)，(NTA) 3"DTDA(圖1A)，它與NTA-DTDA相關(guān)，但是通過(guò)獲得更高局部密度的NTA首基，允許組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定地錨定到PMV和SL上(未顯示)。因而，脂質(zhì)體經(jīng)由(NTA)3-DTDA附著于組氨酸標(biāo)記的抗DC標(biāo)記物例如⑶Ilc和DEC-205的kFv允許脂質(zhì)體有效地靶向DC (圖1B)。為了確定這種方式制備的脂質(zhì)體是否能用于將腫瘤抗原靶向DC，我們首先探究了這個(gè)系統(tǒng)體外將Ag靶向DC的能力。這個(gè)研究中，我們使用了高度轉(zhuǎn)移的黑色素細(xì)胞系B16-0VA，因?yàn)檫@個(gè)細(xì)胞系分泌低水平的能用作替代分泌的腫瘤特異性Ag的OVA(參考文獻(xiàn)17)，實(shí)現(xiàn)了 OVA特異性免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)。B16-0VA腫瘤系大多對(duì)OVA特異性CTLs 有抗性，除非使用高親合力的CTL。17能夠修飾(B16-0VA來(lái)源的)PMV以通過(guò)與由P0PC、 (NTA)3-DTDA和PC-B0DIPY(摩爾比例96 2 2)組成的合成脂質(zhì)的融合而含有摻入的 (NTA) 3-DTDA。并且，從合適的脂質(zhì)混合物 POPC、PE-PEG2000, (NTA) 3_DTDA 和 PC-B0DIPY (摩爾比例96 :2:1: 1)生產(chǎn)含(NTA)3-DTDA的SL。能夠制造含有OVA或OVA CTL抗原決定簇SIINFEKL的SLs制備物。含(NTA)3-DTDA的PMV和SLs與對(duì)照含六組氨酸的分子(L2 肽)或六組氨酸標(biāo)記的抗⑶Ilc或DEC-205的kFv嫁接。因?yàn)樾揎椀哪ひ埠凶鳛闊晒庾粉櫸锏腜C-B0DIPY，通過(guò)流式細(xì)胞儀能評(píng)價(jià)它們對(duì)DC的靶向。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的DC(LTC-DC)與對(duì)照修飾的PMV(PMV-L2)的孵育稍微增加了細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(背景之上 2倍)，但是它們的熒光在與嫁接了⑶IldcFv(PMV-OTllc) 或DEC-205-kFv (PMV-DEC-205)的PMV孵育后比對(duì)照細(xì)胞高4_8倍(圖2A)。與嫁接了CDlIc-ScFv 的 SL(SL-CDIIc)和嫁接了 DEC-205-ScFv 的 SL(SL-DEC-205)孵育的 LTC-DC 與對(duì)照細(xì)胞比也展現(xiàn)了顯著增加的結(jié)合(3-6倍)(圖2B)。相似地，與對(duì)照細(xì)胞相比，表達(dá) ⑶Ilc的胚胎皮膚DC(FSDC)與嫁接了⑶llc-ScFv的PMV或SL孵育基本上導(dǎo)致了熒光的增加(未顯示)。使用阻斷mAbs能夠測(cè)試嫁接了的PMV和SL的結(jié)合特性。因而，同型匹配的對(duì)照mAb與DC的預(yù)孵育沒有顯著降低嫁接了 CDllc-ScFv或DEC-205-ScFv的PMV或SL與 DC的結(jié)合，但是它們與抗⑶lie mAb N418或抗DEC-205mAb NLDC145的預(yù)孵育抑制 了各自嫁接了 ScFv的SL或PMV大約90%的結(jié)合(未顯示)。這個(gè)證實(shí)了所述結(jié)合是嫁接的ScFv 特異性的。為了確立嫁接了 ScFv的PMV能夠體內(nèi)靶向DC，我們皮下注射熒光素標(biāo)記的嫁接了 ScFv的PMV至小鼠后足墊，然后流式細(xì)胞儀檢查了從引流胭淋巴結(jié)分離的細(xì)胞的熒光素?zé)晒?，或者在每個(gè)切片用CDllc mAb作為DC標(biāo)記物PE染色后共聚焦掃描激光顯微鏡檢查引流淋巴結(jié)的切片。通過(guò)FACS分析和熒光顯微鏡(圖3A和B，圖i、iii和ν)結(jié)果都顯示小鼠注射嫁接了 L2、CDlIc-SCFV或DEC-205-ScFv的PMV導(dǎo)致了相對(duì)較小的淋巴細(xì)胞群 (2-2.5%)中高水平的⑶Ilc特異性熒光，因而鑒定它們是DC。重要地，與注射嫁接了 L2 的PMV的小鼠相比，注射嫁接了 ScFv的PMV的小鼠的淋巴結(jié)中觀察到了 CDllc陽(yáng)性細(xì)胞中更大的熒光素標(biāo)記的細(xì)胞群( 1. 7% )(圖3A和B，圖iv和vi)。這些發(fā)現(xiàn)顯示嫁接了 ScFv的PMV能夠體內(nèi)靶向DC。表1脂質(zhì)體和修飾的質(zhì)膜囊泡制備物
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)抗原體內(nèi)靶向于樹突細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的組合物，所述組合物包含在其表面上具有多個(gè)金屬螯合基團(tuán)的含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體的制備物；以及所述樹突細(xì)胞上受體的配體，所述配體經(jīng)由所述配體上金屬親和標(biāo)記連接于所述金屬螯合基團(tuán)；其中，所述含抗原囊泡或脂質(zhì)體包括免疫調(diào)節(jié)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述含抗原膜囊泡選自腫瘤衍生的質(zhì)膜囊泡、淋巴細(xì)胞衍生的質(zhì)膜囊泡、白細(xì)胞衍生的質(zhì)膜囊泡以及細(xì)菌、原生動(dòng)物、病毒或真菌的膜制備物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述含抗原脂質(zhì)體是隱性脂質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述含抗原的膜囊泡或脂質(zhì)體的抗原包含多個(gè)不同抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述配體選自抗體、抗體片段和結(jié)構(gòu)域抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗體片段是單鏈抗體片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述配體上的所述金屬親和標(biāo)記是六組氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)因子選自危險(xiǎn)信號(hào)、細(xì)胞因子、趨化因子、激素或生長(zhǎng)因子樣分子以及編碼前述任何分子的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述危險(xiǎn)信號(hào)是細(xì)菌脂多糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中所述細(xì)胞因子選自干擾素-Y，白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β。
11.制備通過(guò)抗原體內(nèi)靶向于樹突細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的組合物的方法，所述方法包含如下步驟i)制備含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體； )通過(guò)至少一種免疫調(diào)節(jié)因子的摻入修飾所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體；iii)進(jìn)一步通過(guò)兩性分子的摻入修飾所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體，其中所述兩性分子包括當(dāng)摻入在其中時(shí)處于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體表面的螯合基團(tuán)；以及iv)將步驟(iii)的產(chǎn)物與所述樹突細(xì)胞上受體的配體接觸，其中所述配體包括用于結(jié)合于所述螯合基團(tuán)的金屬親和標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(i)中制備的所述含抗原膜囊泡選自腫瘤衍生的質(zhì)膜囊泡、淋巴細(xì)胞衍生的質(zhì)膜囊泡、白細(xì)胞衍生的質(zhì)膜囊泡以及細(xì)菌、原生動(dòng)物、病毒或真菌的膜制備物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(i)中制備的所述含抗原脂質(zhì)體是隱性脂質(zhì)體。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述含抗原膜囊泡和含抗原脂質(zhì)體的所述抗原選自蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、多糖和編碼前述任何分子的DNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(ii)中摻入的免疫調(diào)節(jié)因子選自危險(xiǎn)信號(hào)、細(xì)胞因子、趨化因子、激素或生長(zhǎng)因子樣分子和編碼前述任何分子的DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述危險(xiǎn)信號(hào)是細(xì)菌脂多糖。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞因子選自干擾素-Y，白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(iii)中摻入的所述兩性分子選自次氮基三乙酸雙十四胺、三(次氮基三乙酸)雙十四胺或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺。
19.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中與步驟(iii)的產(chǎn)物接觸的所述配體選自抗體、抗體片段和結(jié)構(gòu)域抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體片段是單鏈抗體片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述配體是選自⑶11c、DEC-205(⑶205)、 DC-SIGN(CD209)、CD206 和 CD207 的受體的配體。
22.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述配體上的所述金屬親和標(biāo)記是六組氨酸。
23.調(diào)節(jié)受試者免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予所述受試者根據(jù)權(quán)利要求1的組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)是為了移植排斥或自身免疫疾病的預(yù)防或治療。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述自身免疫疾病是I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化癥。
26.預(yù)防或治療受試者腫瘤的方法，所述方法包括給予受試者根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體中的所述抗原是腫瘤抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤是黑色素瘤或者前列腺、腸、乳腺或肺的癌癥。
28.預(yù)防或治療受試者感染的方法，所述方法包括給予受試者根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的組合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體中的所述抗原是來(lái)自造成感染的物質(zhì)的抗原。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述感染的致病物質(zhì)是細(xì)菌、分枝桿菌、病毒或真菌。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至29任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人受試者。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)抗原體內(nèi)靶向于樹突細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的組合物。組合物包含在其上具有多個(gè)金屬螯合基團(tuán)的含抗原膜囊泡或含抗原脂質(zhì)體的制備物；以及樹突細(xì)胞上受體的配體，經(jīng)由配體上金屬親和標(biāo)記連接于金屬螯合基團(tuán)的配體。組合物進(jìn)一步包含免疫調(diào)節(jié)因子。也提供制備組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了調(diào)節(jié)免疫紊亂的方法和治療腫瘤和感染的方法。
文檔編號(hào)A61P37/02GK102172397SQ20111005029
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者C·R·帕里什, J·奧爾廷 申請(qǐng)人:利普泰克有限公司