專利名稱：黑骨藤提取物的制備方法及其產(chǎn)品和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑骨藤提取物的制備方法及其產(chǎn)品和用途，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黑骨藤(Periploca forrestii Schltr.)是蘿摩科杠柳屬，西南杠柳的根莖,具有通經(jīng)活絡(luò)、祛淤止痛、祛風(fēng)除濕的功效，是民間廣泛應(yīng)用于治療閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病的民族藥。黑骨藤是千百年來苗族人用以治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾病及頸肩臂腰腿疼痛的藥中極品，“苗藥三珍寶，黑骨藤、銀杏、結(jié)石草”在民間廣為流傳，因黑骨藤使用方便，效果十分明顯，所以又有“苗藥三珍寶，首為黑骨藤”的美譽(yù)。黑骨藤生長于山野疏林中，分布于貴州、廣西、云南、西藏等地，植物資源比較豐富。近年來對黑骨藤已有一定的研究，其主要化學(xué)成分有萜類、黃酮類、留體類、強(qiáng)心苷以及揮發(fā)油等多類化合物。黑骨藤作為貴 州苗族道地藥材，有廣泛的生物活性，近年來，已經(jīng)得到省內(nèi)各大藥廠的充分利用和開發(fā)，以黑骨藤為主的中藥復(fù)方制劑相繼出現(xiàn)，主要表現(xiàn)在對風(fēng)濕病、類風(fēng)濕病的治療，顯示出良好的發(fā)展前景，有“黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊”、“黑骨藤伸筋透骨液”、“黑骨藤傷濕帖”等。專利申請03146799. 7公開了一種黑骨藤提取物，其藥物組合物及其藥物用途，該申請涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有該提取物的藥物組合物，以及該提取物用于制備治療自身免疫性疾病或炎性疾病藥物的用途。但是該申請僅采用溶劑對黑骨藤藥材進(jìn)行提取，提取液直接濃縮，所得提取物的成分以及藥理活性不夠確切。專利申請200710188099. 2公開了一種黑骨藤的多糖提取物、含有它的藥物組合物及其制備方法和用途。該申請中黑骨藤多糖的主要成分為由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩爾比組成的多種均一分子量多糖，其分子量分布為 4X103 2. 7父105，包括0. 41X104、1. 06X 104、0. 64X 104、0. 56X 104、I. 36 X IO4和I. 54X IO4的多糖。該發(fā)明的主要目的是提取黑骨藤中的多糖類化合物，多糖類化合物通常具有提高機(jī)體免疫能力方面的作用。雖然該申請公開了黑骨藤多糖提取物可用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物用途，但在其說明書的生物活性實(shí)驗(yàn)部分并沒有明確驗(yàn)證該黑骨藤多糖提取物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥理活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種黑骨藤提取物的制備方法及其產(chǎn)品和用途。本發(fā)明采用醇提水沉法對黑骨藤藥材進(jìn)行提取，并對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，所得提取物主要含有黃酮類和三萜類化合物，實(shí)驗(yàn)證明其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用。本發(fā)明的技術(shù)方案黑骨藤提取物的制備方法為取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60% -80%的乙醇，在70-80°C水浴中回流提取1-3次，每次l_3h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為I. 2-1. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏并靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。優(yōu)選的制備方法為取黑骨藤藥材，粉碎，過60目篩，加入8倍重量80%乙醇，在70°C水浴中回流提取2次，每次2h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為I. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏并靜置24h，取上清液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。
前述黑骨藤提取物的制備方法制備得到的黑骨藤提取物。該提取物中主要含有三萜類化合物(如a -香樹脂醇乙酸酯、P -香樹脂醇、熊果酸、P -香樹脂醇乙酸酯、27-羥基-a -香樹脂醇、3 @ -乙?；?烏蘇-12-烯-11-酮、3 @ -羥基-齊墩果-11，13 (18)- 二烯-28-羧酸、3-0-乙酰基齊墩果酸、a -香樹脂醇、齊墩果酸、烏蘇-14-烯_3_醇_1_酮、蒲公英甾醇、Jacoumaric acid、2 a，3 0 - 二輕基熊果酸)、黃酮類化合物(如山柰酹、槲皮素、槲皮素-3-0- P -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酹-3-0-^ -D-半乳糖苷、槲皮素-3-0-a -L-卩比喃阿拉伯糖苷、proanthocyanidin A2)、甾類化合物(如P -谷留醇、P -胡蘿卜甙、滇杠柳苷元A、杠柳甙元)、蒽醌類化合物(如大黃素、大黃素甲醚-8-0-3 -D-葡萄糖苷、大黃素-8-0-3 -D-葡萄糖苷)、苯丙素類化合物(如東莨菪素、反式對羥基肉桂酸、咖啡酸)和神經(jīng)酰胺類化合物(如1-0-0-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E) -2-[ (2R) -2-羥基二十四烷酰氨基]_10_ 十八烷-3，4- 二醇、(2S，3S，4R, 10E) -2-[ (2R) -2-輕基二十四燒酰氨基]-10-十八燒-1,3,4- 二醇)。前述黑骨藤提取物中總黃酮類化合物的含量為20% -40% ;三萜類化合物的含量為 15% -40%。前述黑骨藤提取物在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。為了確保本發(fā)明的效果，申請人在研發(fā)過程中進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)研究，主要相關(guān)試驗(yàn)內(nèi)容如下一、藥效學(xué)研究I.實(shí)驗(yàn)材料I. I 藥物I. I. I受試藥物HGT1、HGT2、HGT3、HGT4、HGT5樣品，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水制成所需濃度混懸液，置于冰
箱妥善保存，供實(shí)驗(yàn)備用。其中HGTl的制備同專利申請031467997中實(shí)施例2所述黑骨藤乙醇提取物的制備。HGT2 (醇提物)的制備取黑骨藤藥材粉碎成粗粉，稱取500g，加10倍量80%的乙醇，回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，減壓干燥，即得。HGT3 (水提物)的制備取黑骨藤藥材500g，加12倍量水煎煮3次，每次2h，濾過，合并濾液，濃縮，干燥，即得。HGT4(醇提水沉物)的制備取黑骨藤藥材粉碎成粗粉，稱取500g，加10倍量80%的乙醇，回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無醇味；濃縮液中緩緩加入等量新鮮熱蒸餾水(70°C )，不斷攪拌，使之充分混合溶解，靜置48h以上，待沉淀完全，過濾至濾液澄明，減壓干燥，即得。HGT5(醚提物)的制備取黑骨藤藥材500g，加12倍量石油醚回流提取3次，每次2h,濾過，合并濾液，回收石油醚，濃縮，干燥，即得。I. I. 2 陽性藥風(fēng)濕骨痛膠囊由安徽精方藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)100902，口服膠囊劑型，每粒裝重0. 3g，每日3次，每次兩粒，成人臨床日用劑量(成人體重60kg計(jì)算)0. 03/kg ;腸溶阿司匹林片，南京第二制藥廠，批號(hào)20100402，成人劑量按每日3g計(jì)算。I. I. 3佐劑弗氏完全佐劑(美國SIGMA)。I. 2 動(dòng)物Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重180±20g，早$各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證(附后)SCXK (渝)2001-0005。I. 3 儀器
電子天平HZT-B500 :美國康州HZ電子科技有限公司提供；紫外分光光度計(jì)澳大利亞照生有限公司提供。X光攝影儀日本富士 FCR. XG5000攝影機(jī)。病理切片分析儀0LYMPUS-BX50顯微鏡、HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)。軟尺(藥理教研室自制)。I. 4實(shí)驗(yàn)場地貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度25_27°C，相對濕度50_70%。2.實(shí)驗(yàn)方法2. I動(dòng)物分組及陽性藥取220只Wistar大鼠，隨機(jī)分為22組，雌雄各半，分別為空白對照組、模型對照組、陽性藥對照組(風(fēng)濕骨痛膠囊0. 21g/kg體重，即為成人日用劑量的7倍；阿司匹林組為0. 35g/kg體重，為成人劑量的7倍)。HGTl樣品高、中、低劑量組分別為0. 2190g/kg體重、0. 1095g/kg體重、0. 0547g/kg體重；HGT2樣品高、中、低劑量組分別為0. 1960g/kg體重、0. 0980g/kg體重、0. 0490g/kg體重；HGT3樣品高、中、低劑量組分別為0. 3284g/kg體重、0. 1642g/kg體重、0. 0821g/kg體重；HGT4樣品高、中、低劑量組分別為0. 0168g/kg體重、0. 0084g/kg體重、0. 0042g/kg體重；HGT5樣品高、中、低劑量組分別為0. 074g/kg體重、0. 037g/kg體重、0. 018g/kg體重。給藥途徑為ig灌胃，容量均為10ml/kg體重。按性別分籠喂養(yǎng)。2. 2AA大鼠造模方法除空白對照組外，其余各組大鼠均以佐劑0. Iml注射于左足跖皮下制做AA大鼠模型。2. 3觀察指標(biāo)2. 3. I觀察AA大鼠原發(fā)性(急性)炎癥期反應(yīng)于造膜后6h、第Id、第2d、第3d、第4d、第5d、第6d每天上午8:00用軟尺由專人測量各大鼠左足跖周長(mm)。2. 3. 2觀察AA大鼠繼發(fā)性(免疫性)炎癥期反應(yīng)于造模后第8d開始采用隔日分別測量各AA大鼠右踝關(guān)節(jié)周長。2.3.3記錄各鼠體重(以此調(diào)整ig給藥劑量及觀察動(dòng)物增長發(fā)育情況)及空白對照組大鼠踝關(guān)節(jié)周長，以此作為正常對照，觀察藥物對AA大鼠體重變化的影響。2. 3. 4實(shí)驗(yàn)第24d，各組大鼠禁食不禁飲12h，分別稱各組大鼠體重后，股靜脈放血處死動(dòng)物；剪取胸腺、脾臟、腎上腺分別稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。2. 3. 5剪取左下肢進(jìn)行X光影像攝影，觀察各鼠踝關(guān)節(jié)影像變化；剝?nèi)プ篚钻P(guān)節(jié)皮膚后，放入盛有生理鹽水5ml試管內(nèi)，靜置12h，離心，取上清液，置入波長278nm處測量踝關(guān)節(jié)炎癥物質(zhì)PGE2 (前列腺素E2)含量，觀察藥物對PGE2釋放影響。2. 3. 6將各鼠右踝關(guān)節(jié)分別放入10%甲醛溶液IOml內(nèi)固定，經(jīng)過脫鈣、蠟埋等步驟進(jìn)行踝關(guān)節(jié)病理切片、觀察踝關(guān)節(jié)病理組織形態(tài)變化(專業(yè)人員進(jìn)行此項(xiàng)檢驗(yàn)，圖片參見附圖
5-圖9)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. IHGT樣品對AA大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎腫脹的影響以佐劑注射于大鼠足跖皮下制做AA大鼠，經(jīng)佐劑注射大鼠足跖皮下后，其大鼠踝關(guān)節(jié)周長與致炎前比較明顯增加，P < 0. 05，出現(xiàn)紅、腫、熱、痛關(guān)節(jié)炎癥狀，表明AA大鼠造模成功。造模后6h至6d的觀察結(jié)果表明樣品HGTl高劑量在第5、6天有一定抑制關(guān)節(jié)炎腫脹的作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT2低劑量在第3、5、6天有一定作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT3高、低劑量在第5、6天有一定作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT4的各劑量組在整個(gè)過程中均顯示出抑制AA大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹的作用(與模型組比較P < 0. 05)，樣品HGT5高劑量在第5、6天顯現(xiàn)出抑制關(guān)節(jié)腫脹的作用(與模型組比較P< 0. 05)。結(jié)合整個(gè)原發(fā)階段中AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改變以及藥物作用的連續(xù)性，樣品HGT4、HGT5具有穩(wěn)定的減輕AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的作用。其結(jié)果見表I :表IHGT對AA大鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎腫脹的影響(X 土 s，n = 10)、~AA造模后踝關(guān)節(jié)周長(mm)
組別 _!_!_!_!_!_!_!_
Oh 6h 24h d2 d3 d4 d5d6
^ 25. 40士 25. 40士 25. 40士 24. 27士 24. 19士 24. 40士 24. 07士24. 15士
0. 72 0.72* 0.72* 0. 68^ 0.59* 0.52* 0.63*0.59*
爐刑細(xì) 25.46+ 34. 25+ 34. 34+ 33. 84+ 32. 65+ 32. 23+ 31.43+31. 02 +
0. 84 0. 82 0. 63 I. 03 0. 66 0.70 0. 240.42 25. 30+ 33. 73+ 33. 18+ 32. 38+ 31. 29+ 30. 65+ 30. 10 土30. 26 +
IJ 口 JUWi Q 99 0.88 0.77* 0.83* 0.77* 0.49 0.51*0. 38
57|,)h^^h 25. 37+ 33. 80+ 33. 69+ 33. 57+ 32. 83+ 32. 07+ 31 . 123 0.94
JXIjM ^ o 35 0. 87 I. 03 I. 52 2.14 2. 34 ±1.15±0.74
古 25. 35+ 33.40+ 33. 24 土32. 94+ 31. 77 土31. 14+ 30. 20+30. 16 +
0. 86 I. 95 1.53* I. 53 I. 69 I. 20 0. 58*0.61*
由 25. 00+ 34. 3+ 33. 82+ 32. 82+ 32. 19+ 32. 27+ 30. 59+30. 37 + T 0. 68 0. 87 I .05 0.99 0.94 I. 58 1.070. 86
伸 24794+ 34. 58+ 33. 63+ 33. 64+ 32.48+ 32. 39+ 30. 67+30. 19 +
0. 75 I .07 0.99 I. 17 1.45 I. 89 I. 090. 66
古 25.41+ 3 3.67 33. 88+ 33. 33+ 32. 25+ 31. 57+ 30. 78+30. 82 +
1.14 ±2.27 1.87 2. 18 2. 15 2. 25 1.401.49
由 24795+ 33. 99+ 33. 91+ 33. 22+ 32. 79+ 32.49+ 30. 87+30. 85 +
°- 83 I- 21 I. 24 I. 29 0. 96 1.73 I. 030. 95
L0050」 併 25. 17+ 33. 92+ 33. 38+ 32. 81+ 31. 39+ 31. 6+ 30. 37+30. 15 +
0.17 I. 78 0. 88 0. 61 0.77* I. 66 I. 05*0.77*
古 24792+ 33. 02+ 33.49+ 32. 80+ 32. 14+ 31. 34+ 30.40+30. 11 +
0. 55 1.26* I. 00 I. 37 I. 82 I. 85 1.70*I. 18^
由 24. 88+ 33. 64+ 34. 03+ 33. 33+ 32.48+ 31. 22+ 30. 58+30. 20 +
T__0. 65 I. 08 I. 06 I . 11 I. 06 I. 11 0. 990. 67
併 24. 90+ 33. 94+ 33. 39+ 32. 38+ 31. 20+ 30. 23+ 29. 74+29. 96 +
0. 86 0. 72 0. 87 1.03* 0. 65^ 0.59* 0.49*0.64*
古 24794+ 33.40+ 33. 05+ 32. 80+ 32.46+ 31.4+ 30. 22+30. 03士
問__0. 35 I. 37 0.98* 0. 91 I . 64 I. 36 0.80*0.88*
由 24. 83+ 33. 58+ 33. 59+ 32. 62+ 31. 34+ 30. 82+ 30. 29+30. 02 +
T 0.42 0. 86 0. 90 1.06* 0. 53 0.67* 0. 920.72*
併 25. 25+ 33. 91+ 33. 69+ 33. 08 土31. 72+ 31. 12+ 29. 89+29. 99 +
低__0.75 I. 54 0. 99 I. 26 0. 97 I. 16 0.45*0.37*
古 25. 11+ 32. 8+ 33. 37+ 32. 82+ 32. 07+ 31 .09 30. 10+29. 97 +
0. 64 1.61* I. 03 I. 35 I. 52 ±1.50 I. 35^1.16*
由 25. 14+ 33. 14+ 33. 29+ 33. 82 土32. 69+ 31. 53+ 31. 30+30. 62 +
T 0. 72 1.00 1.40* I. 52 2. 18 2. 56 2. 31I. 86
併 25. 16+ 34. 32+ 33. 82+ 33. 39+ 32.45+ 31. 90 土30. 75+30. 50 +
1fe I 0. 61 I 1.44 I 0. 86 I 0. 86 | I. 64 | 2. 22 | 1.53*| I. 32
注*與模型組比較P〈0.05。_3. 2HGT樣品對AA大鼠繼發(fā)性反應(yīng)影響3. 2. I造模后第8d-24d為AA大鼠繼發(fā)性反應(yīng)的階段，會(huì)出現(xiàn)大鼠注射佐劑對側(cè)關(guān)節(jié)的腫脹。自第8天開始，每2天測量大鼠右側(cè)關(guān)節(jié)，觀察樣品對繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹的影響。結(jié)果表明樣品HGT2低劑量在一段時(shí)間內(nèi)(8-20天)有一定作用(與模型組比較P < 0. 05)，但在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谧饔貌幻黠@(與模型組比較P > 0. 05)，樣品HGT4的各劑量組在整個(gè)過程中均顯示出抑制AA大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹的作用(與模型組比較P <0.05)。結(jié)合整個(gè)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎腫脹階段中AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改變以及藥物作用的連續(xù)性，樣品HGT4具有穩(wěn)定的減輕AA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的作用，結(jié)果見表2 表2HGT對AA大鼠繼發(fā)性右踝關(guān)節(jié)腫脹的影響(I土s，n = 10)
權(quán)利要求
1.一種黑骨藤提取物的制備方法，其特征在于取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60% -80%乙醇，在70-80°C水浴中回流提取1-3次，每次l_3h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為I. 2-1. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水，冷藏并靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述黑骨藤提取物的制備方法，其特征在于取黑骨藤藥材，粉碎，過60目篩，加入8倍重量80%乙醇，在70°C水浴中回流提取2次，每次2h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為I. 5的流浸膏，再加入I倍體積量的水,冷藏并靜置24h，取上清液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。
3.如權(quán)利要求I或2所述黑骨藤提取物的制備方法制備得到的黑骨藤提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黑骨藤提取物，其特征在于提取物中含有三萜類化合物、黃酮類化合物、留類化合物、蒽醌類化合物、苯丙素類化合物和神經(jīng)酰胺類化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑骨藤提取物，其特征在于所述三萜類化合物包括a-香樹脂醇乙酸酯、3 -香樹脂醇、熊果酸、3 -香樹脂醇乙酸酯；所述黃酮類化合物包括山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-0-a -L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酚-3-0- ^ -D-半乳糖苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特征在于提取物中總黃酮類化合物的含量為20% -40%。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特征在于提取物中三萜類化合物的含量為15% -40%。
8.如權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述黑骨藤提取物在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑骨藤提取物的制備方法及其產(chǎn)品和用途；該制備方法為取黑骨藤藥材，加入8-12倍重量60％-80％乙醇，在70-80℃水浴中回流提取1-3次，每次1-3h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.2-1.5，再加入1倍體積量的水，冷藏并靜置12-48h，取上清液，回收乙醇，濃縮，干燥，即得。本發(fā)明采用醇提水沉工藝對黑骨藤藥材進(jìn)行提取，并對醇提、水沉工藝參數(shù)分別進(jìn)行了優(yōu)化；所得提取物主要含有黃酮類和三萜類化合物，實(shí)驗(yàn)證明其對AA大鼠原發(fā)性及繼發(fā)性炎癥反應(yīng)具有明顯的治療作用，在抗炎、消腫以及延緩AA大鼠關(guān)節(jié)炎損傷方面有較好作用；因而可將該提取物應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的制備中。
文檔編號(hào)A61K36/27GK102631390SQ20121010572
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者周欣, 趙楊, 趙超, 陳華國, 龔小見 申請人:貴州師范大學(xué)