專(zhuān)利名稱(chēng)：中藥綿萆薢的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說(shuō)它是中藥綿萆用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis簡(jiǎn)稱(chēng)OP)是以骨量減少，骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病。也是一種以骨密度低下為主要癥狀的一種骨代謝失調(diào)的全身性疾病。骨質(zhì)疏松癥是一種中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病。國(guó)際醫(yī)學(xué)界已將骨質(zhì)疏松癥與糖尿病、心血管病等并列為嚴(yán)重危害老年人健康的重大疾病。世界衛(wèi)生組織已將每年10月20日定為全世界的＂骨質(zhì)疏松＂日，并于1998年7月成立了世界衛(wèi)生組織骨質(zhì)疏松專(zhuān)題小組。據(jù)有關(guān)部門(mén)統(tǒng)計(jì)[高素強(qiáng)等，淫羊藿及其復(fù)方防治骨質(zhì)疏松的研究；中國(guó)中藥雜志，1999，24(4)]，1997年中國(guó)骨質(zhì)疏松癥的患者人數(shù)約為8390萬(wàn)人，發(fā)生率占全國(guó)總?cè)丝跀?shù)的6.6％，到2010年約為1140萬(wàn)人，占8.2％。上海調(diào)查資料顯示，老年人骨質(zhì)疏松患病率男性為60.7％，女性為90.5％。我國(guó)的骨質(zhì)疏松癥及其骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率已呈明顯的遞增趨勢(shì)。骨質(zhì)疏松癥所造成的影響相當(dāng)嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥每年會(huì)導(dǎo)致150萬(wàn)例骨折，有50％的婦女會(huì)因骨質(zhì)疏松癥而骨折?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)骨質(zhì)疏松的病因尚不十分清楚，但目前研究認(rèn)為與雌激素缺乏，鈣攝入不足，體力活動(dòng)減少、陽(yáng)光照射不足、維生素D缺乏及不良嗜好有關(guān)。是多種病因、多個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，且與人體的衰老密切相關(guān)。其主要癥狀為腰膝酸軟、胸背疼痛、肢體麻木、疼痛、頭暈、乏力等。目前尚無(wú)特效藥物能夠治愈此病，用于防治骨質(zhì)疏松癥的藥物目前主要有三類(lèi)，第一類(lèi)是抗骨吸收藥物，包括雌激素、降鈣素、二磷酸鹽等；第二類(lèi)是促進(jìn)骨形成藥物，如氟化物、促進(jìn)合成代謝的類(lèi)固醇等；第三類(lèi)是礦化作用藥物，如鈣制劑和維生素D等〔朱建民。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因及防治。中華內(nèi)科雜志1992；11(31)714〕。雖然激素類(lèi)、生化類(lèi)藥物在治療骨質(zhì)疏松癥上已取得了很大進(jìn)展，但由于副作用的存在及治療費(fèi)用過(guò)高限制了它的長(zhǎng)期使用[Christiansen C.，F(xiàn)ertil Steril..，1994，62(6)1528-1531]。治療骨質(zhì)疏松癥需要很高的費(fèi)用，如僅1995年，美國(guó)45歲以上婦女花在骨質(zhì)疏松性骨折上的醫(yī)療費(fèi)用就高達(dá)110億美元。
中醫(yī)中藥立足于辯證施治，整體調(diào)節(jié)，在骨質(zhì)疏松的治療方面取得了不少成就[李潤(rùn)德《中國(guó)骨傷》1992，5，6，31-34梁立《中醫(yī)雜志》1992，33(11)36吳林生，張?jiān)漆缫狻吨袊?guó)骨質(zhì)疏松雜志》1995，1，2]?！端貑?wèn)·五藏生成篇》中說(shuō)“腎之合骨也，其榮發(fā)?！薄端貑?wèn)·六節(jié)藏象論》中說(shuō)“腎者主蟄，封藏之本，精之所處也，其充在骨?！卑粗嗅t(yī)基礎(chǔ)理論，“腎之在體為骨、主骨生髓，其華在發(fā)”，“齒為骨之余”，也明確指出腎中精氣盛衰在齒、骨、發(fā)的生長(zhǎng)中的作用。而這種腎氣盛衰的規(guī)律與現(xiàn)代生理中骨的代謝極其吻合。即，骨骼的生長(zhǎng)在20歲最為迅速，24歲進(jìn)入持平期；40歲后骨代謝異常，骨質(zhì)日漸疏松；50歲后骨總量可減少30％，因而腎的盛衰史其實(shí)亦是骨的盛衰史。中醫(yī)理論認(rèn)為腎藏精，精氣得到較好的閉藏才能在人體內(nèi)充分發(fā)揮其應(yīng)有的生理效應(yīng)，達(dá)到強(qiáng)筋健骨的作用。所以中醫(yī)認(rèn)為，補(bǔ)腎治療可以強(qiáng)骨壯筋，防治骨質(zhì)疏松。流行病學(xué)調(diào)查表明經(jīng)中醫(yī)辨證為腎虛者的尺、橈骨的骨礦含量，明顯低于健康人?，F(xiàn)代生理的研究也表明，補(bǔ)腎能增加腎臟對(duì)活性維生素D的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收；避免鈣在細(xì)胞內(nèi)沉積，維持血鈣的穩(wěn)定。補(bǔ)腎還能增強(qiáng)生成骨細(xì)胞的作用，阻遏鈣的脫失，從而達(dá)到控制骨質(zhì)丟失，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。近年來(lái)大量的研究證實(shí)和臨床應(yīng)用補(bǔ)腎壯骨中藥治療骨質(zhì)疏松取得了滿(mǎn)意的效果，且毒副作用少，價(jià)格適中，可長(zhǎng)期服用。然而，目前用于骨質(zhì)疏松癥治療的中藥也明顯存在著用藥量大，有效成分不明確，難以進(jìn)行必要的質(zhì)量控制以及無(wú)法用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論進(jìn)行解釋等問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)抗骨質(zhì)疏松的現(xiàn)代中藥以及對(duì)具有抗骨質(zhì)疏松作用的中藥進(jìn)行中藥現(xiàn)代化的研究，尋找其中的活性成分并研究其作用機(jī)理就顯得非常迫切和必要。
由于骨質(zhì)疏松是成骨與破骨不平衡的結(jié)果，破骨細(xì)胞的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成骨細(xì)胞的作用，從而造成骨量下降，骨質(zhì)疏松及脫鈣。因此，在尋找抗骨質(zhì)疏松中藥中的活性成分及其作用機(jī)理時(shí)，需要同時(shí)關(guān)注其對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及礦化的影響情況，采用多指標(biāo)方法，包括促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的活性以及對(duì)骨礦化的影響，才有可能篩選出有效的抗骨質(zhì)疏松活性成分。為了尋找這些抗骨質(zhì)疏松中藥中的活性成分及其作用機(jī)理，我們運(yùn)用了較先進(jìn)的細(xì)胞、組織器官培養(yǎng)模型篩選方法及機(jī)制研究手段，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證方法，并運(yùn)用較先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備如Liquid sicillition counter，PQCT等，篩選具有抗骨質(zhì)疏松作用的中藥活性成分并研究其作用機(jī)理，具有非常重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義的?？捎糜谥笇?dǎo)同類(lèi)中藥的開(kāi)發(fā)以及開(kāi)發(fā)具有療效高、副作用小、針對(duì)性強(qiáng)、目標(biāo)專(zhuān)一的現(xiàn)代中藥制劑。
綿萆又名白萆、川萆、棉萆。為植物綿萆的干燥根莖。綿萆的植物來(lái)源為薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline exR.Knuth和七裂葉萆Dioscorea septemloba Thunb.。其化學(xué)成分包含薯蕷皂甙(dioscin)、纖細(xì)薯蕷皂甙(gracillin)，另含有原薯蕷皂甙(protodioscin)、原纖細(xì)薯蕷皂甙(protogracillin，kikubasaponin)及甲基原纖細(xì)薯蕷皂甙。性平、味苦。功能主治利濕去濁，祛風(fēng)通痹。用于淋病白濁、白帶過(guò)多、濕熱瘡毒、腰膝痹痛。目前對(duì)萆的藥理研究文獻(xiàn)較少，近二十年來(lái)僅有的一篇關(guān)于棉萆總皂苷的文獻(xiàn)(張克錦等，棉萆總皂甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性鵪鶉動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用，中草藥1990，Vol.21(11)25-27)其總皂苷的植物來(lái)為纖細(xì)薯蕷Dioscoreagracillima，與本發(fā)明的植物來(lái)源不同。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了綿萆治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的新醫(yī)藥用途及提取物的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法。綿萆經(jīng)適當(dāng)?shù)墓に囂幚淼玫降奶崛∥?，可作為制備治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物，也可作為制備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細(xì)胞形成和促成骨細(xì)胞增殖活性的藥物。綿萆其植物來(lái)源為下列植物中的一種或多種薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemlobaThunb.。所述提取物為綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物、綿萆的水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及從綿萆中提取得到的用于制備抗骨質(zhì)疏松癥的藥物的其它提取物。所述的醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脫溶劑中，醇在所占的百分含量在40-95％之間。所列綿萆的其它提取物，指含有下列中的一種或多種化合物，并用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物的提取物化合物2綿萆素B(spongiosinB)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol26-O-β-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyrano-syl-(1→2)]-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-gl-ucopyranoside；26(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopy-ranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個(gè)化合物。以中藥綿萆或者新鮮采集的綿萆的干燥塊莖為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹(shù)脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法可制備成以上所述的11種化合物中的一種或多種成分的提取物，使之作為抗骨質(zhì)疏松活性成分與賦形劑相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成的口服給藥的內(nèi)用劑型及非口服給藥的注射劑和外用劑型。所列的溶劑為下列溶劑中的一種或幾種不多于10個(gè)碳原子的鹵代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中鹵代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。所列的吸附樹(shù)脂為苯乙烯類(lèi)、丙烯酸酯類(lèi)、丙烯酰胺類(lèi)或氧化氮類(lèi)大孔吸附樹(shù)脂中的一種或多種；柱層析填料為下列種的一種或多種硅膠、氧化鋁、聚酰胺、吸附樹(shù)脂、葡萄糖凝膠、硅藻土。
1.綿萆治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的新醫(yī)藥用途。
本發(fā)明中的綿萆經(jīng)適當(dāng)工藝制備的提取物包括綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物、綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及化合物2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等11種化合物。我們將綿萆經(jīng)水或醇簡(jiǎn)單處理過(guò)的提取物與成骨細(xì)胞株UMR106共同培養(yǎng)，證實(shí)綿萆呈明顯的促成骨細(xì)胞增殖活性，在隨后進(jìn)行的抑制破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)中，綿萆也顯示了較強(qiáng)的活性。隨之將綿萆以O(shè)VX大鼠為模型，進(jìn)行的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明它具有提高椎骨骨密度的作用。又將綿萆的提取物進(jìn)行促成骨細(xì)胞增殖活性，抑制破骨細(xì)胞形成，抑制骨吸收模型45Ca釋放等實(shí)驗(yàn)的活性篩選后，證實(shí)綿萆的水或醇提取物通過(guò)吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物為主要活性部位。隨后對(duì)其主要活性部位及總皂甙進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)中，它們也顯示了較強(qiáng)的活性，并呈良好的量效關(guān)系。對(duì)其活性部位進(jìn)行的化學(xué)成分研究共分離得到了近30種化合物，對(duì)所有的化合物進(jìn)行了抑制以PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的骨吸收模型的活性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)化合物2綿萆素B(spongiosinB)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glucop-yranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]--D-glucopyranosyffurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個(gè)化合物顯現(xiàn)了較強(qiáng)的抑制骨吸收活性。
以下公開(kāi)其體內(nèi)、體外活性研究方法與結(jié)果1.1.體外活性實(shí)驗(yàn)1.1.1.以成骨細(xì)胞UMR106為模型促成骨細(xì)胞增殖活性按文獻(xiàn)方法對(duì)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物進(jìn)行了促成骨細(xì)胞UMR106增殖活性實(shí)驗(yàn)[5]。綿萆的水或醇的簡(jiǎn)單提取物顯示了非常強(qiáng)的促成骨樣細(xì)胞增殖活性(濃度為400μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率為55～68.9％)。結(jié)果見(jiàn)表1，表1.綿萆提取物對(duì)成骨細(xì)胞株UMR106的增殖促進(jìn)作用增殖率(％)*NaF 37.2綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物 55～68.9*與對(duì)照組的百分比NaF陽(yáng)性對(duì)照組，濃度1μM.“-”細(xì)胞存活率小于對(duì)照組.
1.1.2.抑制破骨細(xì)胞形成活性按文獻(xiàn)方法進(jìn)行抑制破骨細(xì)胞形成實(shí)驗(yàn)，首先，我們從乳鼠的頭蓋骨中消化得到成骨細(xì)胞，然后與小鼠脛骨髓細(xì)胞及樣品，1□，25(OH)2VD3共同培養(yǎng)[7]，考察樣品抑制破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)形成。綿萆的水或醇簡(jiǎn)單提取物在高濃度時(shí)完全抑制了破骨細(xì)胞的形成(濃度為200μg/ml時(shí)，抑制率為100％，并呈明顯的量效關(guān)系)，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2.對(duì)破骨細(xì)胞的形成抑制作用濃度g/mL 抑制率(％)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單 200100.0提取物20 20～39.61,25(OH)2VD3(-)100.01,25(OH)2VD3(+) 0.10Elcitonin(陽(yáng)性對(duì)照 2U/ml 70.8藥)1.1.3.綿萆水或醇簡(jiǎn)單提取物中活性部位的體外實(shí)驗(yàn)確定結(jié)果為了進(jìn)一步確定綿萆水或醇簡(jiǎn)單提取物中的活性部位及活性成分，將萆的干燥根莖10kg經(jīng)水或醇回流提取，提取物經(jīng)非極性吸附大孔樹(shù)脂柱，用不同比例的水及醇的混合溶劑洗脫，得到不同比例的水-醇混合溶劑洗脫部位(見(jiàn)表3)，將其洗脫部位分別進(jìn)行促成骨細(xì)胞株UMR106增殖作用、抑制破骨細(xì)胞形成作用及骨吸收器官培養(yǎng)模型PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放抑制的實(shí)驗(yàn)[8]，發(fā)現(xiàn)含40～95％醇部位在200μg/ml的濃度下促成骨細(xì)胞株UMR106增殖作用可達(dá)66.7～90.6％，并完全抑制了破骨細(xì)胞的形成；抑制PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放達(dá)15.9～85.8％(濃度為440μg/ml)。因而含40～95％醇洗脫部位被認(rèn)定為抗骨質(zhì)疏松的主要活性部位，隨之對(duì)它進(jìn)行了體內(nèi)活性確定實(shí)驗(yàn)。
表3綿萆經(jīng)非極性大孔樹(shù)脂以水-醇混合溶劑的洗脫物用體外實(shí)驗(yàn)篩選抗骨質(zhì)疏松活性的數(shù)據(jù)含0～35％醇部含40～95％醇部位位刺激成骨細(xì)胞株UMR106增11.2～14.766.7～90.6殖率(％)對(duì)破骨細(xì)胞的形成的抑制率 96.1～100.0 100.0(％)對(duì)PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的抑 - 15.9～88.8制率(％)1.1.4.以骨吸收模型45Ca釋放抑制對(duì)化合物的抗骨質(zhì)疏松活性進(jìn)行評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)含40～95％醇的大孔吸附樹(shù)脂洗脫部位進(jìn)行了一系列的分離提取工作。將80g的洗脫物，分別利用大孔吸附樹(shù)脂、硅膠、ODS等柱層析方法進(jìn)行分離，并運(yùn)用薄層層析，高效液相，重結(jié)晶等方法純化，得到了近30個(gè)化合物，運(yùn)用核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，紅外(IR)，氣相(GC)等光譜、色譜手段，確定了它們的結(jié)構(gòu)。對(duì)所有的化合物進(jìn)行了抑制PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的實(shí)驗(yàn)。由J.J.Reynold等在1969年建立的骨吸收亢進(jìn)器官培養(yǎng)法是利用45Ca同位素對(duì)乳鼠進(jìn)行標(biāo)記后，取其顱骨進(jìn)行體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中加入甲狀腺旁素(PTH)，PTH可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的骨組織中45Ca大量釋放，使之發(fā)生骨吸收亢進(jìn)現(xiàn)象[19]。這個(gè)模型綜合考了骨吸收過(guò)程中成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞的協(xié)同作用，可較真實(shí)地反映骨吸收的過(guò)程。表16示部分化合物對(duì)PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的抑制作用，從數(shù)據(jù)中可發(fā)現(xiàn)，2、3、4、5、7、8、11、14、20、22、26等化合物對(duì)PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的具有顯著的抑制作用。見(jiàn)表4。
表4.所有化合物對(duì)由PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的抑制作用45Ca release(％)45Ca release(％)Comp. Comp.
200□M 20□M200□M 20□M2 30.5±0.4 18.2±3.1*1419.6±1.9 20.3±7.53 19.1±1.6*18.2±3.2*2017.4±1.6**24.9±1.24 15.1±1.5**14.7 2216.4±18.5±0.2±0.8**1.3**5 13.6±1.0**22.6±2.52625.6±1.1 17.7±1.67 19.2±2.1 22.8±7.9PTH 25.3±2.68 20.7±4.0 18.8±7.0Control 15.4±1.311 30.9±4.5 17.1±2.5Elcitoni 18.4±n 0.7**PTH乳鼠頭蓋骨在含PTH(2×10-9M)中的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
Control乳鼠頭蓋骨在沒(méi)有PTH和化合物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
Elcitonin乳鼠頭蓋骨在含PTH和elcitonin (2U/ml)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
Sample乳鼠頭蓋骨在含PTH和化合物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。數(shù)值用均值±方差表示。*p＜0.05，**p＜0.001.與PTH對(duì)照，顯著地抑制了鈣的釋放。所有化合物的名稱(chēng)見(jiàn)下2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G[(25ξ)3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopy ranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3□，26-diol 20，22-dione26-O-□-D-glucopyranoside；]8薯蕷皂甙(dioscin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranoside]11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)[(25R)-spirost-5-ene-3□-ol3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-D-glucopyranosyl-(1→3)]-□-D-glucopyranoside]14 pregna-5，16-diene-1□-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[□L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-□-D-glucopyranoside20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopyranoside22(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3□，22，26-triol 26-O-□-D-glucopyranoside26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside1.2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.2.1.以O(shè)VX大鼠為模型，以DXA為測(cè)量手段，對(duì)萆水提取物進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定結(jié)果不論是促成骨樣細(xì)胞增殖活性，還是抑制破骨細(xì)胞形成活性，都是體外活性，不能真正地反映骨質(zhì)疏松機(jī)體內(nèi)的生理病理變化，因此用雙側(cè)卵巢摘出所致雌性骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)疏松模型，以DXA(雙能X射線吸收儀)為測(cè)量手段，考察了綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠椎骨的骨密度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物可顯著改善骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)引起的椎骨骨密度(BMD)降低，結(jié)果見(jiàn)Fig.1。模型組雌性大鼠的骨密度(BMD)較正常組明顯下降(p＜0.01)，椎骨骨密度降至正常組的86.3％。綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物高，低劑量組骨密度分別增加了8.6～13.3％(p＜0.05)，其BMD恢復(fù)了95.6～99.4％，可見(jiàn)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物可顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的椎骨骨密度。結(jié)果見(jiàn)圖1。
1.2.2.以O(shè)VX大鼠為模型，PQCT為測(cè)量手段的體內(nèi)試驗(yàn)上述我們已經(jīng)證實(shí)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物、其水或醇的簡(jiǎn)單提取物的不同濃度的水-醇洗脫物具有抗骨質(zhì)疏松活性。為進(jìn)一步證實(shí)這些提取物的抗骨質(zhì)疏松活性，我們以綿萆的水或醇的簡(jiǎn)單提取物、水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)含40～95％不同醇濃度的水-醇混合溶劑洗脫物、總皂苷為例，詳細(xì)說(shuō)明其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)骨質(zhì)疏松癥的改善效果。
將90只6月齡的健康未交配Wister大鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，進(jìn)行雙卵巢切除術(shù)或假手術(shù)，隨機(jī)分成9組(1)卵巢切除14周組(control組)卵巢切除術(shù)后14周處死。(2)假手術(shù)組(sham組)進(jìn)行手術(shù)，但不摘出卵巢，14周后處死。(3)陽(yáng)性對(duì)照組(positive control組)卵巢切除術(shù)后8周經(jīng)胃腸道給藥灌注0.1mg/kg/d 17β-estradiol(購(gòu)于日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，用藥6周后處死。(4)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提物組(D.s water)卵巢切除術(shù)后8周經(jīng)胃腸道給藥灌注萆水或醇的簡(jiǎn)單提物100mg/kg/d，用藥6周后處死。(5)綿萆40～95％不同醇濃度的洗脫部位組(40～90％EtOH)卵巢切除術(shù)后8周經(jīng)胃腸道給藥灌注綿萆40～95％不同醇濃度的洗脫部位100mg/kg/d，用藥6周后處死。(7)綿萆總皂甙部位組(T.saponin)卵巢切除術(shù)后8周經(jīng)胃腸道給藥灌注綿萆總皂甙100mg/kg/d，用藥6周后處死。所有的動(dòng)物處死前，麻醉狀態(tài)下用外周肢體定量計(jì)算機(jī)斷層掃(PQCT)描測(cè)量大鼠左側(cè)脛骨近端干骺端生長(zhǎng)板下1-5mm范圍內(nèi)的松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨和全骨，掃描4個(gè)斷面，數(shù)據(jù)取自3-4mm處斷面[9]。測(cè)量指標(biāo)全骨礦量(total bone mineralcontent，TOT-CNT，mg/mm)、全骨密度(total bone mineraldensity，TOT-DEN，mg/cm3)、全骨斷面積(total bonearea，TOT-A，mm2)、松質(zhì)骨礦量(trabecular mineralcontent，TRAB-CNT，mg/mm)、松質(zhì)骨密度(trabecular mineraldensity，TRAB-DEN，mg/cm3)、皮質(zhì)骨外周周長(zhǎng)(periderm ofcortical membrance，PERI-C mm)、內(nèi)周周長(zhǎng)(endoderm ofcortical membrance，ENDO-C mm)、皮質(zhì)骨礦量(cortical mineralcontent，CRT-CNT，mg/mm)、皮質(zhì)骨密度(cortical mineral density，CRT-DEN，mg/cm3)、皮質(zhì)骨厚(cortical thickness，CRT-THK-C，mm)、抗壓力(X-axis strength strain index，XSSI)、抗折力(Y-axisstrength strain index，YSSI)、抗扭力(polar-axis strength strainindex，Polar SSI)等。
測(cè)量后所有的大鼠被從主動(dòng)脈中取血，離心后分離血清，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。將所有大鼠的子宮取出、稱(chēng)重。
大鼠體重及子宮重量的變化如表5所示，術(shù)后14周與術(shù)前相比，除陽(yáng)性對(duì)照組外，各組的體重均有增高，尤其對(duì)照組，增高近20％，同時(shí)子宮的重量明顯下降，說(shuō)明對(duì)照組已呈明顯的雌激素缺乏癥狀，造型成功。而其他各組體重雖然也有增加作用，但與對(duì)照組相比，有顯著性差異。因而各給藥組可能都具有抗雌激素缺乏后造成的體重升高。各給藥組與對(duì)照組相比雖然子宮重量有增加，但增量很小，并沒(méi)有顯著性差異。而陽(yáng)性對(duì)照組則顯著提高了子宮的重量。說(shuō)明與雌激素類(lèi)化合物各給藥組相比抗雌激素缺乏后造成子宮萎縮作用極微，因而各給藥組的作用機(jī)制可能與雌激素類(lèi)化合物不相同。
表5各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠體重及子宮重量的影響實(shí)驗(yàn)組體重(a)(g) 體重(b)(g)子宮重量(g)對(duì)照組296.6±16.7351.7±32.6#0.12±0.01#假手術(shù)組290.3±8.5 303.5±16.30.50±0.10陽(yáng)性對(duì)照組 294.4±7.2 265.3±19.6□0.36±0.11□D.sp.Water 290.1±10.3296.6～317.6#0.14～0.1740～299.6±15.3314.4～338.5#0.14～0.1895％EtOH總皂甙 292.1±22.5303.4～334.8#0.14～0.21#p＜0.001與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.001與對(duì)照組對(duì)照對(duì)全骨的影響從表6可發(fā)現(xiàn)，control組大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度都較sham組有明顯的降低，并具有顯著性差異。雖然全骨斷面面積也有微小下降，但不具有顯著性差異，說(shuō)明OVX對(duì)全骨斷面面積沒(méi)有明顯地影響。陽(yáng)性對(duì)照組組與對(duì)照組相比較，較大程度地提高了全骨的骨礦含量、骨密度。40～90％EtOH組也能較大程度地提高了全骨的骨礦含量和骨密度，并且在提高全骨的骨礦含量上，作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組。雖然各給約組都明顯提高了全骨斷面面積，但不具顯著性差異。
表6各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度及骨面積的影響實(shí)驗(yàn)組 鼠 全骨礦量 全骨密度 全骨斷面積數(shù)對(duì)照組 10 8.13±0.75#638.32 ±12.77±1.3835.05假手術(shù)組 10 9.77±1.34760.25 ±12.85±1.7120.29#陽(yáng)性對(duì)照組 10 8.94±1.12709.39 ±12.58±1.2031.08D.sp.Water 10 8.39～9.17639.78 ～13.04～14.04684.7940～95％EtOH 10 8.45～10.03 655.01 ～12.93～14.97745.76總皂甙 10 8.57～9.42636.37 ～13.01～14.53700.49#p＜0.01與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.01與對(duì)照組對(duì)照對(duì)松質(zhì)骨的影響脛骨近端松質(zhì)骨骨礦含量及骨密度的改變對(duì)照組TRAB-CNT比sham組略有升高，但沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明OVX對(duì)TRAB-CNT沒(méi)有明顯地影響。。而水提物組、40～95％EtOH組及總皂甙量組的TRAB-CNT都有顯著增加。但是陽(yáng)性對(duì)照組不能提高TRAB-CNT。對(duì)照組TRAB-DEN與sham組相比，有顯著性差異，所有給藥組的TRAB-DEN都有所提高。其中提高最顯著的在40～95％EtOH部位組。由此說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照組與給藥組對(duì)脛骨近端松質(zhì)骨的作用機(jī)理也可能是不同的。陽(yáng)性對(duì)照組只對(duì)TRAB-DEN有作用，而一些給藥組既對(duì)TRAB-DEN也對(duì)TRAB-CNT有提高作用。
表7各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨礦含量、骨密度影響

#p＜0.05.與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001與對(duì)照組對(duì)照對(duì)皮質(zhì)骨的影響1)對(duì)皮質(zhì)骨內(nèi)、外周周長(zhǎng)的影響由表7所示數(shù)據(jù)可知，除陽(yáng)性對(duì)照組外，其余各組外周周長(zhǎng)均增大，在內(nèi)周周長(zhǎng)組，sham和陽(yáng)性對(duì)照組與control組比下降，而各給藥組的內(nèi)周周長(zhǎng)均增大，但都沒(méi)有顯著性差異。
表8各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠脛骨近端皮質(zhì)骨的內(nèi)、外膜周長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)組 外膜周長(zhǎng) 內(nèi)膜周長(zhǎng)對(duì)照組 12.65±0.68 9.59±0.70#假手術(shù)組 12.68±0.84 8.92±0.80陽(yáng)性對(duì)照組 12.56±0.59 9.14±0.46*D.sp.Water 12.80～12.85 9.63～9.7640～95％EtOH 12.69～12.88 9.62～9.64總皂甙 12.81～13.07 9.73～9.96#p＜0.05與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.05與對(duì)照組對(duì)照2)脛骨近端密質(zhì)骨骨礦含量、骨密度及皮質(zhì)骨厚度的變化對(duì)照組中的大鼠脛骨近端，皮質(zhì)骨骨礦含量CRT-CNT及皮質(zhì)骨厚度CRT-THK-C較sham組有顯著下降，所以O(shè)VX也可影響皮質(zhì)骨。各給藥組均提高了CRT-CNT，其中陽(yáng)性對(duì)照組及在40～95％EtOH組中效果最為明顯。并且只有這兩組提高了CRT-THK-C。因而在對(duì)皮質(zhì)骨的作用上，陽(yáng)性對(duì)照組及40～95％EtOH組作用相似。
表9 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠脛骨近端皮質(zhì)骨的骨礦含量、骨密度及皮質(zhì)骨厚度的影響實(shí)驗(yàn)組 皮質(zhì)骨骨礦含 皮質(zhì)骨骨密度 皮質(zhì)骨厚度量對(duì)照組 5.34±0.41##1251.58±13.82 0.49±0.03##假手術(shù)組 6.09±0.24 1257.85±10.13 0.60±0.02陽(yáng)性對(duì)照組 6.86±0.67**1291.97±15.76 0.54±0.04**D.sp.Water 6.24～6.78**1273.78 ～ 0.49～0.531314.0340～95％EtOH 6.32～7.06**1268.60 ～ 0.49～0.55*1313.06總皂甙 6.25～6.79**1254.27 ～ 0.49～0.521267.03##p＜0.01與偽手術(shù)組對(duì)照*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組對(duì)照骨強(qiáng)度的改變PQCT能用來(lái)測(cè)定骨力學(xué)指標(biāo)(與材料力學(xué)及構(gòu)造學(xué)的力學(xué)特性相關(guān))，是由于材料力學(xué)的特性指標(biāo)彈性系數(shù)與皮質(zhì)骨密度有關(guān)，雖然PQCT不能直接用于測(cè)定彈性系數(shù)，但可以測(cè)出皮質(zhì)骨密度，并且可以用測(cè)出的斷面二次動(dòng)量力矩乘以骨斷面半徑得出構(gòu)造學(xué)的力學(xué)特性，從而計(jì)算出骨強(qiáng)度(SSI).其中XSSI示抗壓力、YSSI示抗折力、Polar SSI示抗扭力。其中XSSI及YSSI受檢體測(cè)定位置的影響很大，有一定的誤差，但Polar SSI幾乎不受此影響，有良好的重現(xiàn)度及精度。
由表10可發(fā)現(xiàn)，OVX后大鼠脛骨近端的抗壓力和抗扭力都顯著下降，但抗折力基本不變。說(shuō)明OVX對(duì)抗折力沒(méi)有明顯地影響。在所有的給藥組中，陽(yáng)性對(duì)照組顯著提高了脛骨的抗壓能力，40～95％EtOH組中顯著提高了抗扭力。其他各組雖然也提高了抗壓力及抗扭力，但沒(méi)有顯著性差異。因而陽(yáng)性對(duì)照組與在49～95％EtOH組中對(duì)骨強(qiáng)度的作用機(jī)制上也存在不同。
表10各實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠脛骨近端骨強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)組X軸抗壓力 Y軸抗折力 極軸抗扭力對(duì)照組3.51±0.51##4.47±0.66 7.17±1.25#假手術(shù)組 4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69陽(yáng)性對(duì)照組4.15±0.94*4.26±0.57 7.87±1.27D.sp.Water3.50～4.18 4.24～5.22 7.40～8.4940～95％EtOH 3.76～4.42 4.54～5.55 7.43～9.41*總皂甙3.67～4.34 4.40～5.21 7.38～8.53
#p＜0.05，##p＜0.01.與偽手術(shù)組對(duì)照*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組對(duì)照結(jié)論上述數(shù)據(jù)以綿萆的水或醇簡(jiǎn)單提取物、水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)含40～95％的不同濃度醇的水-醇混合溶劑洗脫物、總皂苷為例，證實(shí)綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物、其水或醇的簡(jiǎn)單提取物經(jīng)含40～95％醇的水-醇洗脫物以及綿萆總皂苷無(wú)論是在提高OVX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質(zhì)骨的骨礦含量和骨密度、皮質(zhì)骨的骨礦含量和厚度，還是在改善骨強(qiáng)度方面，都顯示了較強(qiáng)的活性。尤其是在提高全骨的骨礦含量和骨密度、松質(zhì)骨的骨礦含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組雌激素類(lèi)化合物，并且作用機(jī)制不同。且含40～95％不同濃度醇的水-醇洗脫物組中存在可顯著提高脛骨的抗扭力強(qiáng)度的組分，這是許多抗骨質(zhì)疏松藥物所達(dá)不到的[10]。
2.綿萆提取物的制備綿萆的化學(xué)成分及藥理研究鮮有報(bào)道，其提取物的制備方法研究也是空白。我們以中藥綿萆或者新鮮采集的綿萆的干燥塊莖為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹(shù)脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法可制備成含有化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyra-nosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabin-opyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個(gè)具有抗骨質(zhì)疏松活性有效成分中的一種或多種成分的提取物。
2.1.綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物的制備方法綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物系經(jīng)過(guò)溶劑提取法或溶劑萃取法得到的提取物，其特征在于含有上述經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗骨質(zhì)疏松活性的6種活性成分中的一種或多種。醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；溫度在10-100℃范圍之內(nèi)經(jīng)過(guò)一次或多次提取或萃取得到的簡(jiǎn)單提取物。使用混合溶劑時(shí)，醇在混合溶劑中的所占的百分含量在1-95％之間。
2.2.綿萆的水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物的制備方法綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物系指將經(jīng)過(guò)溶劑提取法或溶劑萃取法得到的提取物，裝入徑高比為1∶3-1∶7之間的大孔吸附樹(shù)脂柱，經(jīng)含不同比列的水-醇混合溶劑洗脫而得到的洗脫物。其特征在于含有化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)；14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-enc-3，22，26-triol 26-O--D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個(gè)具有抗骨質(zhì)疏松活性有效成分中的一種或多種成分的提取物。醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在洗脫溶劑中，醇在所占的百分含量在40-95％之間。其洗脫物已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)具有抗骨質(zhì)疏松活性。
2.3.綿萆總皂苷及綿萆素B(spongiosin B)；綿萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蕷皂甙(dioscin)；纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O--D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside等11個(gè)具有抗骨質(zhì)疏松活性有效成分以中藥綿萆或者新鮮采集的綿萆的干燥塊莖為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹(shù)脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法可制備。
其中的溶劑包括不多于10個(gè)碳原子的鹵代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中鹵代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)。溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。
樹(shù)脂括非極性大孔吸附樹(shù)脂、極性大孔吸附樹(shù)脂、強(qiáng)極性大孔吸附樹(shù)脂；柱層析中的填料包括聚酰胺、硅膠、葡萄糖凝膠及改性的葡萄糖凝膠如羥丙基葡萄糖凝膠等。


圖1為綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠椎骨骨密度的影響。
圖中Sham偽手術(shù)組；OVX卵巢摘除組；D.s100，D.s50分別表示卵巢摘除5周后分別灌胃給綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物100和50mg/kg/day，給5周。椎骨密度用DXA測(cè)量。#p＜0.01，與偽手術(shù)組相比有顯著性差異；*p＜0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。圖2為化合物2名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式spongiosin B C19H20O3(3R，5R，7R)-1，7-diphenyl-3，7-epoxy-5-hydroxy-heptanone圖3為化合物3名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式spongiosin C C19H24O4(1S，3R，5S，7S)-1，7-diphenyl-1，3，5，7-tetrahydroxyheptane圖4為化合物4名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式piperitol圖5為化合物5名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式sesaminone圖6為化合物7名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式hypoglaucin G or (25ξ)3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosyl-20，22-seco-furost-5-ene-3，26-diol 20，22-dione 26-O-D-glucopyranoside圖7為化合物8與化合物11名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式化合物8dioscin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyramoside11gracilin or(25R)-spirost-5-ene-3-ol 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-D-glucopyranosyl-(1→3)]-D-glucopyranoside纖細(xì)薯蕷皂甙圖8為化合物14名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4]-D-glucopyranoside圖9為化合物20與22的名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式
化合物20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside化合物22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside圖10為化合物26的名稱(chēng)與結(jié)構(gòu)式(R)-3-hydroxyoct-1-ene3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside
表11.綿萆提取物對(duì)成骨細(xì)胞株UMR106的增殖促進(jìn)作用增殖率(％)*NaF37.2綿萆水提取物 66.9*與對(duì)照組的百分比NaF陽(yáng)性對(duì)照組，濃度1μM. “-”細(xì)胞存活率小于對(duì)照組.
2、綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的含40～95％醇的水-醇混合溶劑洗脫物制備方法的實(shí)列與活性實(shí)驗(yàn)綿萆水提取物中含90％乙醇洗脫物活性部位的制備方法與活性實(shí)驗(yàn)將萆的干燥根莖100g經(jīng)1000ml水回流提取3次，每次1小時(shí)，經(jīng)減壓或凍干得水提取物36克，經(jīng)Diaion 101柱，用90％乙的醇的混合溶劑洗脫，得到90％乙醇部位1.05克，將這部位進(jìn)行促成骨細(xì)胞株UMR106增殖作用、抑制破骨細(xì)胞形成作用及骨吸收器官培養(yǎng)模型PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放抑制的實(shí)驗(yàn)，90％乙醇部位在200μg/ml的濃度下促成骨細(xì)胞株UMR106增殖作用可達(dá)89.6％，并完全抑制了破骨細(xì)胞的形成；抑制PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放達(dá)82.8％(濃度為440μg/ml)，結(jié)果見(jiàn)表10。以O(shè)VX大鼠為模型，PQCT為測(cè)量手段的體內(nèi)試驗(yàn)表明，含90％乙醇的水醇混合溶劑洗脫部位在提高OVX大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量和骨密度、松質(zhì)骨的骨礦含量和骨密度、皮質(zhì)骨的骨礦含量和厚度，還是在改善骨強(qiáng)度方面，都顯示了較強(qiáng)的活性。尤其是在提高全骨的骨礦含量和骨密度、松質(zhì)骨的骨礦含量和骨密度及骨的抗扭力方面，作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組雌激素類(lèi)化合物，并且作用機(jī)制不同結(jié)果見(jiàn)表11-表16，實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分1.2.2節(jié)。從而體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)含90％乙醇水-醇混合溶劑洗脫部位為抗骨質(zhì)疏松的活性部位之一。
表12萆水提取物的90％乙醇部位體外實(shí)驗(yàn)篩選抗骨質(zhì)疏松活性的數(shù)據(jù)90％乙醇部位刺激成骨細(xì)胞株UMR106增 89.5殖率(％)對(duì)破骨細(xì)胞的形成的抑制率 100.0(％)對(duì)PTH誘導(dǎo)的45Ca釋放的抑 82.8制率(％)表1390％乙醇部位對(duì)大鼠體重及子宮重量的影響實(shí)驗(yàn)組 體重(a)(g) 體重(b)(g) 子宮重量(g)對(duì)照組 296.6±16.7 351.7±32.6#0.12±0.01#假手術(shù)組290.3±8.5 303.5±16.3 0.50±0.10陽(yáng)性對(duì)照組 294.4±7.2 265.3±19.6□0.36±0.11□90％EtOH304.4±8.5 319.4±20.1□0.14±0.03#p＜0.001與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.001與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d表1490％乙醇部位對(duì)大鼠脛骨近端全骨的骨礦含量、骨密度及骨面積的影響實(shí)驗(yàn)組 鼠 全骨礦量 全骨密度全骨斷面積數(shù)對(duì)照組 10 8.13±0.75#638.32 ±12.77±1.3835.05假手術(shù)組8 9.77±1.34 760.25 ±12.85±1.7120.29#陽(yáng)性對(duì)照組 9 8.94±1.12 709.39 ±12.58±1.2031.0890％EtOH9 9.17±0.86 695.36 ±13.26±1.7150.40#P＜0.01與偽手術(shù)組對(duì)照□P＜0.01與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d
表1590％乙醇部位對(duì)大鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨礦含量、骨密度影響

#p＜0.05.與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.05，□□p＜0.01，□□□p＜0.001與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d表1690％乙醇部位對(duì)大鼠脛骨近端皮質(zhì)骨的內(nèi)、外膜周長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)組 外膜周長(zhǎng) 內(nèi)膜周長(zhǎng)對(duì)照組 12.65±0.68 9.59±0.70#假手術(shù)組12.68±0.84 8.92±0.80陽(yáng)性對(duì)照組 12.56±0.59 9.14±0.46*90％EtOH12.88±0.85 9.62±0.98#p＜0.05與偽手術(shù)組對(duì)照□p＜0.05與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d表1790％乙醇部位對(duì)大鼠脛骨近端皮質(zhì)骨的骨礦含量、骨密度及皮質(zhì)骨厚度的影響實(shí)驗(yàn)組 皮質(zhì)骨骨礦含 皮質(zhì)骨骨密度 皮質(zhì)骨厚度量對(duì)照組 5.34±0.41##1251.58±13.820.49±0.03##假手術(shù)組 6.09±0.241257.85±10.130.60±0.02陽(yáng)性對(duì)照組 6.86±0.67**1291.97±15.760.54±0.04**90％EtOH 6.62±0.44**1294.43±18.930.52±0.03*##p＜0.01與偽手術(shù)組對(duì)照*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d表18 90％乙醇部位對(duì)大鼠脛骨近端骨強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)組 X軸抗壓力Y軸抗折力極軸抗扭力對(duì)照組 3.51±0.51##4.47±0.66 7.17±1.25#假手術(shù)組4.87±0.86 4.44±0.97 8.71±1.69陽(yáng)性對(duì)照組 4.15±0.94*4.26±0.57 7.87±1.2790％EtOH3.85±0.57 4.87±0.68 8.06±1.35*
#p＜0.05，##p＜0.01.與偽手術(shù)組對(duì)照*p＜0.05，**p＜0.01與對(duì)照組對(duì)照，給藥劑量100mg/kg/d3、綿萆總皂苷及綿萆素B(spongiosin B)；綿萆素C(spongiosin C)；piperitol；sesaminone；hypoglaucin G；薯蕷皂甙(dioscin)；纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)；pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；(22S，25R)-22-O-methy[-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyrmosylfurost-5-enc-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個(gè)具有抗骨質(zhì)疏松活性有效成分的制備方法的實(shí)列與活性實(shí)驗(yàn)。
1.綿萆總皂苷的制備方法的實(shí)列與活性實(shí)驗(yàn)(總皂苷的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)已列在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分)制備方法實(shí)例一綿萆根莖粗粉100克經(jīng)600毫升的水回流提取2次每次2小時(shí)，減壓濃縮提取物至小體積，先經(jīng)氯仿萃取除去脂溶性成分，后經(jīng)正丁醇萃取，得綿萆總皂苷36.9克。
制備方法實(shí)例二綿萆根莖粗粉100克經(jīng)600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小時(shí)，提取物經(jīng)減壓回收乙醇，得提取物經(jīng)少量水分散，先經(jīng)氯仿萃取除去脂溶性成分，后經(jīng)正丁醇萃取，得綿萆總皂苷36.9克。
制備方法實(shí)例三綿萆根莖粗粉100克經(jīng)600毫升的95％乙醇回流提取2次每次2小時(shí)，提取物經(jīng)減壓回收乙醇，得提取物。將提取物通過(guò)非極性大孔吸附樹(shù)脂，以50％的含水乙醇洗脫，洗脫物經(jīng)減壓回收溶劑，得綿萆總皂苷16.2克。
2.化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4Piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-]-L-rhamno pyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyran osylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-]-L-rhamnopyranosyl-(1→2]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol26-O-D-glucopyranoside；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11個(gè)具有抗骨質(zhì)疏松活性有效成分的制備方法的與活性實(shí)驗(yàn)(活性實(shí)驗(yàn)已列在體外活性實(shí)驗(yàn)中)制備方法實(shí)例綿萆的干燥根莖10kg水回流提取，水提取物經(jīng)Diaion 101柱，用90％的乙醇洗脫，得到將104g 90％乙醇部位，硅膠柱，以氯仿∶甲醇混合溶劑(99∶1～1∶99)梯度洗脫，合并相同組分洗脫物，再經(jīng)ODS柱、高效液相(HPLC)、重結(jié)晶等方法純化，得到了近30個(gè)化合物，其中的11個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗骨質(zhì)疏松活性，分別為化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)；14pregna-5，16-diene-1-ol-20-one 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-.[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)].-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O--D-glu-copyranoside；22(22S，25R)-3-O-[-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3，22，26-triol 26-O-D-glucopyranosid-e；26(R)-3-hydroxyoct-1-ene 3-O-[-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-D-glucopyranoside等11等，并運(yùn)用核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，紅外(IR)，氣相(GC)等光譜、色譜手段，確定了它們的結(jié)構(gòu)、相對(duì)及絕對(duì)構(gòu)型。
權(quán)利要求
1.中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，其特征在于綿萆經(jīng)適當(dāng)?shù)墓に囂幚淼玫降奶崛∥铮勺鳛橹苽渲委熀皖A(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物，也可作為制備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細(xì)胞形成和促成骨細(xì)胞增殖活性的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，其特征在于綿萆其植物來(lái)源為下列植物中的一種或多種薯蕷科綿萆Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蕷Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和Dioscorea septemloba Thunb.。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，其特征在于所述提取物為綿萆水或醇的簡(jiǎn)單提取物、綿萆的水或醇的簡(jiǎn)單提取物通過(guò)吸附樹(shù)脂經(jīng)水-醇混合溶劑洗脫得到的不同比例水-醇混合溶劑洗脫物、綿萆總皂苷以及從綿萆中提取得到的用于制備抗骨質(zhì)疏松癥的藥物的其它提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，其特征在于所述的醇通常具有以下通式的飽合一元醇或不飽合一元醇CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脫溶劑中，醇在所占的百分含量在40-95％之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥綿萆的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，其特征在于所列綿萆的其它提取物，指含有下列中的一種或多種化合物，并用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物的提取物化合物2綿萆素B(spongiosin B)；3綿萆素C(spongiosin C)；4piperitol；5sesaminone；7hypoglaucin G；8薯蕷皂甙(dioscin)；11纖細(xì)薯蕷皂甙(gracilin)14pregna-5，16-diene-1β-ol-20-one3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；20(22S，25R)-22-O-methyl-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosylfurost-5-ene-3β，22，26-triol 26-O-β-D-glucopyranoside；22(22S，25R)-3-O-[□-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-□-D-glucopyranosylfu-rost-5-ene-3□，22，26-triol26-O-□-D-glucopy ranoside；26(R)-3-hydro-xyoct-1-ene3-O-[□-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-□-D-glucopyranoside等11個(gè)化合物。
6.一種如權(quán)利要求1所述的中藥綿萆提取物的制備方法，其特征在于以中藥綿萆或者新鮮采集的綿萆的干燥塊莖為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹(shù)脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法可制備成權(quán)利要求5所述的11種化合物中的一種或多種成分的提取物，使之作為抗骨質(zhì)疏松活性成分與賦形劑相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成的口服給藥的內(nèi)用劑型及非口服給藥的注射劑和外用劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥綿萆提取物的制備方法，其特征在于所列的溶劑為下列溶劑中的一種或幾種不多于10個(gè)碳原子的鹵代烷、醇、酮、酯或其混合溶劑等，其中鹵代烷具有以下通式CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯類(lèi)溶劑具有以下通式CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶劑洗脫方式包括單一或混合溶劑的正相、反相或梯度洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥綿萆提取物的制備方法，其特征在于所列的吸附樹(shù)脂為苯乙烯類(lèi)、丙烯酸酯類(lèi)、丙烯酰胺類(lèi)或氧化氮類(lèi)大孔吸附樹(shù)脂中的一種或多種；柱層析填料為下列種的一種或多種硅膠、氧化鋁、聚酰胺、吸附樹(shù)脂、葡萄糖凝膠、硅藻土。
全文摘要
本發(fā)明是中藥綿萆薢的新醫(yī)藥用途及其提取物的制備方法，綿萆薢經(jīng)適當(dāng)?shù)墓に囂幚淼玫降奶崛∥?，可作為制備治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物，也可作為制備提高椎骨骨密度、抑制骨吸收活性、抑制破骨細(xì)胞形成和促成骨細(xì)胞增殖活性的藥物。以中藥綿萆薢或者新鮮采集的綿萆薢的干燥塊莖為原料，采用溶劑提取法、溶劑萃取法、樹(shù)脂吸附法、正相柱層析法、反相柱層析法等工藝中的一種或者多種工藝，并結(jié)合濃縮干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等常用干燥方法可制備成含有一種或多種有效成分的提取物。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1415364SQ02144850
公開(kāi)日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月18日
發(fā)明者陳英杰, 殷軍, 付文衛(wèi), 裴玉萍, 竇德強(qiáng) 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)