專利名稱：重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗及制備方法
重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗及制備方法摶術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明提供一種重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗，同時(shí)還提供所述疫苗的制備方法，用于預(yù)防犬瘟熱的發(fā)生和流行，屬于動(dòng)物傳染病疫苗生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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犬瘟熱是由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,⑶V)引起多種動(dòng)物的ー種急性、熱性、高度接觸性病毒性傳染病。CDV自然感染宿主在不斷擴(kuò)大，除犬科動(dòng)物外，還可感染大熊貓、小熊貓、獅、虎和豹等食肉目所有8個(gè)科、偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物病。犬瘟熱病毒基因組為非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。負(fù)鏈RNA病毒的主要特點(diǎn)是基因 組RNA不具有感染性，而且裸露的基因組RNA本身也不能作為模板，只有在與核蛋白N/NP結(jié)合成核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體后，才能作為模板起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)和包裝出活病毒，關(guān)鍵是獲得有功能的RNP。RNA病毒感染性克隆的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關(guān)系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置換、或構(gòu)建嵌合病毒等方法對(duì)病毒基因功能進(jìn)行研究。⑶V囊膜表面的纖突是由H和F兩種糖蛋白組成。研究表明H、F蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原。二者在病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中起作用，病毒通過H蛋白吸附到細(xì)胞表面的受體上，并協(xié)助F蛋白介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞的融合，使病毒在宿主體內(nèi)擴(kuò)散。H蛋白主要誘導(dǎo)了體液免疫，并且抗CDV H蛋白單克隆抗體(MoAb)具有中和病毒活性；F蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒増殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生。用相關(guān)或非相關(guān)病毒的糖蛋白基因取代自身糖蛋白基因后的重組病毒也已成功用于疫苗研制。在狂犬病毒(RV)研究中，RABV G蛋白是唯一的膜蛋白并誘導(dǎo)VNA (中和抗體)的產(chǎn)生，額外的RABV G蛋白(2個(gè)或3個(gè))被克隆至RABV基因組，并成功拯救出攜帯2-3個(gè)G蛋白基因的致弱RV，使得G蛋白表達(dá)量增加，其神經(jīng)中樞的致病性進(jìn)ー步下降，免疫原性提高，由此可見，過表達(dá)G蛋白可潛在的增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答及提高免疫保護(hù)率。發(fā)明內(nèi)容:
本發(fā)明提供一種重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗，為ー種新型的犬瘟熱病毒疫苗，以預(yù)防犬瘟熱的發(fā)生和流行。本發(fā)明還公開了重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗制備方法，適用于エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下以臨床上所用的犬瘟熱弱毒疫苗株為基礎(chǔ)，通過反向遺傳技術(shù)改造獲得表達(dá)雙血凝素的新型犬瘟熱弱毒疫苗，用于犬瘟熱新型疫苗的研制與生產(chǎn)。首先在犬瘟熱病毒反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR方法獲得CDV弱毒株的H基因，將H基因定向克隆到真核表達(dá)載體pCI-CDV-EGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建帶有雙H基因的全長真核表達(dá)質(zhì)粒PCI-CDV-JP-2H ;將構(gòu)建的全長質(zhì)粒pCI-CDV-JP-H、和三個(gè)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，拯救包裝獲得重復(fù)表達(dá)血凝素的重組犬瘟熱病毒rCDV-JP-2H。最后用重組病毒進(jìn)行免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)改造后的犬瘟熱病毒弱毒株的免疫效果。本發(fā)明提供的重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗，其特征在于
以犬瘟熱病毒弱毒株(CDV-JP)為基礎(chǔ)在P和M基因之間的非編碼區(qū)額外加入血凝素基因，構(gòu)建表達(dá)雙血凝素(雙H)的重組犬瘟熱弱毒活疫苗(r⑶V-JP-2H)。本發(fā)明所述重復(fù)表達(dá)血凝素H重組犬瘟熱疫苗株的生產(chǎn)方法，包括以下步驟
1)用RNA提取試劑盒提取犬瘟熱弱毒病毒基因組總RNA；
2)RT-PCR方法獲得犬瘟熱血凝素H基因，片段長度為1824bp ；
上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGC CTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’
下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3>
其中5’端分別引入的都為Pme I酶切位點(diǎn)；
3)將步驟2)中目的擴(kuò)增片段連接到克隆載體pBluescript中，構(gòu)建克隆測(cè)序質(zhì)粒pBluescript-H ;pBluescript_cl 質(zhì)粒和 pBluescript-H 經(jīng) Pme I 酶切后，將 H 基因片段定向克隆到pBluescript-cl質(zhì)粒中，構(gòu)建中間克隆載體pBluescript-cl-H ；
4)pBluescript-cl-Η 質(zhì)粒和 pCI-CDV-EGFP 質(zhì)粒經(jīng) Sal I 和 Mlu I 雙酶切后，將 cl_H目的片段定向克隆到真核表達(dá)載體pCI-CDV-EGFP中構(gòu)建帶有雙血凝素基因的全長真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-⑶V-JP-2H ;其中，額外的H蛋白插入的位點(diǎn)是P與M基因之間的非編碼區(qū)；
5)雙血凝素基因的全長真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-⑶V-2H及三個(gè)真核表達(dá)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，拯救包裝獲得表達(dá)雙血凝素血凝素的重組犬瘟熱病毒rCDV-JP-2H ；
6)以重組病毒接種Vero細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)増殖，并對(duì)增殖重組病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，至病毒TCID5tl達(dá)IO5個(gè)TCID5(l/mL，_70°C冰箱中保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的積極效果在于選用了犬瘟熱病毒優(yōu)勢(shì)保護(hù)性抗原基因作為改造目標(biāo)，以增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果，構(gòu)建和拯救的重復(fù)表達(dá)血凝素的重組犬瘟熱病毒r⑶V-JP-2H在細(xì)胞水平上具有較好的細(xì)胞增殖活性，并且出現(xiàn)的CPE更加典型，在臨床上與改造前母本病毒以同樣病毒滴度免疫犬試驗(yàn)，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，從而達(dá)到更好的預(yù)防動(dòng)物犬瘟熱的目的。


圖I :本發(fā)明重復(fù)表達(dá)血凝素(H)的重組犬瘟熱全長質(zhì)粒的構(gòu)建策略 圖2 :本發(fā)明重復(fù)表達(dá)血凝素(H)的重組犬瘟熱全長質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；PCI-CDV-JP-2H全長質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果I 8 :pCI-CDV-JP-2H全長質(zhì)粒分別用Pme I、Sal I 和 Mlu I、Sal I 和 Not I、Pst I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I 酶切結(jié)果;M: Marker15000 ；
圖3 :本發(fā)明疫苗在BSR細(xì)胞上所引起的細(xì)胞病變(CPE)圖(10X10)；
圖4 :本發(fā)明疫苗間接免疫熒光照片(10X 10)；
圖5 :本發(fā)明疫苗電子顯微鏡觀察圖(40000)；
圖6、圖7 :本發(fā)明疫苗與親本疫苗株免疫犬的抗體效價(jià)。
具體實(shí)施方式
:下列實(shí)施例g在進(jìn)ー步舉例(以雙血凝素重組疫苗為例)描述本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例I
I.犬瘟熱弱毒株H基因的RT-PCR擴(kuò)增 I)提取總RNA:
在反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上，用經(jīng)典總RNA提取試劑盒提取犬瘟熱弱毒病毒基因組總RNA，步驟如下； I吸取200ul樣品，加入到EDPC水處理過的I. 5ml EP管中，再加入200ul變性劑(solution I),輕輕混合均勻。2加入1.5ul β-巰基こ醇、20ul醋酸鈉、200ul水飽和酚、40ul異戊醇，震蕩混勻，12000rpm, 4°C離心 IOmin03取出上清,加入到另ー無Rnase的I. 5mlEP管中，加入200ul的異丙醇,混合均勻后，12000rpm，4°C離心 lOmin。4棄上清，加入Iml 75% DEPC酒精溶液上下顛倒混勻，12000rpm，4°C離心IOmin0之后重復(fù)洗滌一次。5棄凈上清液，倒置lOmin，讓酒精充分揮發(fā)。2 )反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增
以⑶V基因組總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT反應(yīng)體系(總體系20ul)
權(quán)利要求
1.一種重復(fù)表達(dá)血凝素囊膜糖蛋白重組犬瘟熱疫苗，其特征在于以犬瘟熱弱毒株(CDV-JP)為基礎(chǔ)在P和M基因之間的非編碼區(qū)額外加入囊膜糖蛋白基因，構(gòu)建表達(dá)雙囊膜糖蛋白(雙H)的重組犬瘟熱弱毒活疫苗(rCDV-JP-2H)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重復(fù)表達(dá)血凝素囊膜糖蛋白重組犬瘟熱疫苗，其特征在于含有以下引物 上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’ 下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3>。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述復(fù)表達(dá)血凝素囊膜糖蛋白重組犬瘟熱疫苗的制備方法，包括以下步驟 1)用RNA提取試劑盒提取犬瘟熱弱毒株(CDV-JP)基因組總RNA； 2)RT-PCR方法獲得犬瘟熱血凝素H基因，片段長度為1824bp ； 上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’ 下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3> 其中5’端分別引入的都為Pme I酶切位點(diǎn)； 3)將步驟2)中目的擴(kuò)增片段連接到克隆載體pBluescript中，構(gòu)建克隆測(cè)序質(zhì)粒pBluescript-H ;pBluescript_cl 質(zhì)粒和 pBluescript-H 經(jīng) Pme I 酶切后，將 H 基因片段定向克隆到pBluescript-cl質(zhì)粒中，構(gòu)建中間克隆載體pBluescript-cl_H ； 4)pBluescript-cl-Η 質(zhì)粒和 pCI_CDV_EGFP 質(zhì)粒經(jīng) Sal I 和 Mlu I 雙酶切后，將 cl_H目的片段定向克隆到真核表達(dá)載體pCI-CDV-EGFP中構(gòu)建帶有雙血凝素基因的全長真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-⑶V-2H ;其中，額外的H蛋白插入的位點(diǎn)是P與M基因之間的非編碼區(qū)； 5)帶有雙血凝素基因的真核表達(dá)全長質(zhì)粒pCI-⑶V-2H及三個(gè)輔助質(zhì)粒pCI-N、pCI-P、PCI-L共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，拯救包裝獲得表達(dá)雙血凝素的重組犬瘟熱病毒r⑶V-JP-2H ； 6)以重組病毒接種Vero細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，并對(duì)增殖重組病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，至病毒TCID5tl達(dá)IO5個(gè)TCID5Q/mL，_70°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供一種重復(fù)表達(dá)血凝素重組犬瘟熱疫苗及制備方法，以犬瘟熱病毒弱毒株(CDV-JP)為基礎(chǔ)在P和M基因之間的非編碼區(qū)額外加入血凝素基因，構(gòu)建表達(dá)雙血凝素(雙H)的重組犬瘟熱弱毒活疫苗(rCDV-JP-2H)。選用了犬瘟熱病毒優(yōu)勢(shì)保護(hù)性抗原基因作為改造目標(biāo)，以增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果，構(gòu)建和拯救的重復(fù)表達(dá)血凝素的重組犬瘟熱病毒rCDV-JP-2H在細(xì)胞水平上具有較好的細(xì)胞增殖活性，并且出現(xiàn)的CPE更加典型，在臨床上與改造前母本病毒以同樣病毒滴度免疫犬試驗(yàn)，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，從而達(dá)到更好的預(yù)防動(dòng)物犬瘟熱的目的。
文檔編號(hào)A61K39/175GK102813919SQ20121010085
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者高玉偉, 王磊, 楊松濤, 馮娜, 李天松, 黃耕, 王鐵成, 趙永坤, 王化磊, 夏咸柱 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所