專利名稱：無細(xì)胞百日咳疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及百日咳疫苗的制備方法以及百日咳疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及百日咳有效抗原成分的分離純化、無細(xì)胞百日咳疫苗的制備方法和無細(xì)胞百日咳疫苗。
背景技術(shù)：
百日咳疫苗是預(yù)防該病最有效、最經(jīng)濟(jì) 的手段，其包括全細(xì)胞百日咳疫苗(wholecell pertussis vaccine, WPV)和無細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)。全細(xì)胞百日咳疫苗于1914年首次研制成功，其是通過將細(xì)菌大量培養(yǎng)增菌后采用適宜的方法殺菌，使其滅活成無傳染性但具有良好免疫原性的百日咳全菌體，再加入佐劑制備而成。在控制和降低兒童百日咳發(fā)病方面，全細(xì)胞百日咳疫苗發(fā)揮了巨大作用，其優(yōu)點在于價格低，有效性已經(jīng)確認(rèn)，只要達(dá)到一定的接種覆蓋面，就可有效預(yù)防百日咳的流行。但該制品存在一些缺點:副反應(yīng)較大，安全性還存在一定問題。在這種情況下，日本于80年代率先研制并使用了以百日咳毒素(pertussistoxin,PT)和絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)為主要有效成分的無細(xì)胞百日咳疫苗。無細(xì)胞百日咳疫苗被認(rèn)為是近二十年來疫苗學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一。無細(xì)胞百日咳疫苗的主要成分有PT、FHA、粘附素(pertacin, Prn)、凝集原(agglutigogen, AGG)等。PT:是百日咳桿菌致病的主要毒力因子，同時也是其所產(chǎn)生的諸多生物活性物質(zhì)中唯一不受爭議的保護(hù)性抗原。在鮑特氏菌屬中，百日咳桿菌是唯一能產(chǎn)生PT的細(xì)菌。PT是由S1、S2、S3、S4和S5等5個亞單位以1:1:1:2:1的比例組成，相對分子質(zhì)量為117 X IO3,為一個典型的“A-B核糖基轉(zhuǎn)移酶”模式的細(xì)菌毒素。A部分由毒性亞基構(gòu)成，主要具有識別生物學(xué)活性的功能，PT的大部分酶活性是SI的作用，例如促淋巴細(xì)胞增多、激活胰島素細(xì)胞、簇集CHO細(xì)胞生長和組胺致敏等，而B部分由S2、S3、S4(2個)和S5組成，參與與真核細(xì)胞表面受體結(jié)合及毒性亞基的跨膜運輸。FHA:是由鮑特氏菌屬百日咳桿菌產(chǎn)生的一種具有粘附作用的表面蛋白質(zhì)分子，因?qū)t細(xì)胞有凝集作用而得名。FHA相對分子量為220X 103。FHA與百日咳桿菌粘附和定居在呼吸道器官的上皮細(xì)胞有關(guān)，也是百日咳桿菌致病的重要毒力因子，同時還具有較強免疫原性，能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異的保護(hù)性抗體。Prn:是一種非纖毛性的凝集原，存在于百日咳桿菌表面，它在百日咳桿菌侵襲宿主呼吸系統(tǒng)上皮細(xì)胞的感染粘附過程發(fā)揮著重要的作用，也具有較強的免疫原性。AGG:百日咳桿菌有8種AGG，其中6種是百日咳桿菌所特有的。百日咳桿菌以AGG1、2、3為主，其他幾種AGG為輔。研究證實AGG2和3在細(xì)菌感染過程中對宿主支氣管細(xì)胞有粘附作用，所以，AGG也是百日咳桿菌的致病因子之一。一些國家的臨床試驗報道，百日咳菌體疫苗中的效價與小鼠的免疫應(yīng)答和疫苗對兒童的免疫保護(hù)性之間有著良好的相關(guān)性。因此，WHO推薦在百日咳疫苗生產(chǎn)中應(yīng)選用含有2、3型AGG的菌株，目前世界上一些國家生產(chǎn)的無細(xì)胞百日咳疫苗中含有AGG2或3，或者兩者均有。無細(xì)胞百日咳疫苗是通過純化工藝，提取細(xì)菌中具有免疫原性的抗原成分，去除無免疫原性并且引起不良反應(yīng)的毒性物質(zhì)制備而成的。目前抗原提取的方法有兩種。第一種方法是日本首先研制成功的共純化方法，同時收集PT和FHA等有效成分。該方法通過硫酸銨反復(fù)沉淀來獲得保護(hù)性抗原，然后通過蔗糖密度梯度離心去除雜質(zhì)，之后制成疫苗。這種方法生產(chǎn)無細(xì)胞百日咳疫苗的產(chǎn)率較高，成本較低，但是抗原之間的比例不穩(wěn)定。第二種方法是分別純化的方法。該方法通過各種理化方法如柱層析先分別純化各抗原組分，再將這些抗原組分按一定的比例混合制成疫苗?，F(xiàn)有的百日咳有效抗原成分的分離純化方法采用羥基磷灰石-結(jié)合珠蛋白柱層析和凝膠過濾法、藍(lán)膠親和層析和胎球蛋白親和層析法、藍(lán)膠親和層析和羥基磷灰石層析法。親和層析法所采用的親和配基來源于人的珠蛋白或牛的胎球蛋白，因此不能保證配基來源的生物安全性。同時在純化過程中配基容易脫落從而污染成品，限制了該方法的應(yīng)用。羥基磷灰石層析法一般和疏水層析、珍珠巖層析等層析介質(zhì)結(jié)合在一起分離PT和FHA。該方法的洗脫條件復(fù)雜，收率低。另外，羥基磷灰石材料作為填料使得液相流動的阻力較大，導(dǎo)致吸附、洗脫時流速較低，處理通量較小(王愛娟等，羥基磷灰石在生物活性物質(zhì)分離與提純領(lǐng)域中應(yīng)用的研究進(jìn)展，材料導(dǎo)報，2006年6月，20 (6): 111-118)。而且，片狀或球狀燒結(jié)的羥基磷灰石填料對較大直徑層析柱的填裝效果不佳，柱效重現(xiàn)性差，不利于工藝放大；柱內(nèi)發(fā)生菌體蛋白或毒素蛋白的吸附或沉淀后，填料容易板結(jié)不易再生(陳浩軍等，無細(xì)胞百日咳疫苗抗原精致的新技術(shù)，中國生物制品學(xué)雜志，2010年9月，23:1032)。羥基磷灰石填料的這些性質(zhì)嚴(yán)重阻礙了其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。再者，雖然這些方法可以相對容易地對各抗原成分的比例等進(jìn)行質(zhì)量控制，但是純度與收率之間有沖突，尤其是在PT純度達(dá)到90 %以上時，產(chǎn)率很難超過70 %。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種從百日咳桿菌培養(yǎng)上清液分離純化百日咳有效抗原成分的方法，所述方法包括以下步驟:I)將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；2)將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Pm)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Pm)。本發(fā)明的又另一個目的是提供一種制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括:I)將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；2)將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)；4)將PT單獨制成無細(xì)胞百日咳疫苗，或者將PT同F(xiàn)HA和/或Prn混合在一起制成無細(xì)胞百日咳疫苗。本發(fā)明的再又一個目的是提供一種通過上述制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法獲得的無細(xì)胞百日咳疫苗。本發(fā)明中PT和FHA分離純化采用的是陽離子層析柱，通過樣品蛋白與填料介質(zhì)帶相反電荷，將蛋白質(zhì)結(jié)合到柱子上，然后改變條件，使結(jié)合物逐步被洗脫。因此，可以通過一次上樣，改變洗脫條件，分別收獲PT和FHA。該層析柱以高流速的瓊脂糖為骨架，具有更高的流速和更高的載量，大大提高生產(chǎn)效率。且CM柱的非特異性吸附較低，收獲蛋白純度更高。該方法穩(wěn)定性好，介質(zhì)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以通過增加柱徑直接進(jìn)行線性放大，易于進(jìn)行大規(guī)模放大生產(chǎn)。此外，CM柱可使用氫氧化鈉在位清洗與除菌，符合GMP要求。本發(fā)明中Prn的純化采用的是多結(jié)合性陰離子交換層析，優(yōu)選采用的是以Capto-adhere為介質(zhì)的多結(jié)合性陰離子交換層析。將分離PT和FHA后的流穿液通過Capto-adhere樹脂，Prn及一些雜蛋白結(jié)合在Capto-adhere上,通過洗脫，收獲目的蛋白Prn。Capto-adhere主要是起離子交換作用，但其他形式的作用如氫鍵和疏水作用也參與層析過程。因此，Capto-adhere介質(zhì)的基質(zhì)為高流速瓊脂糖，因此較常規(guī)使用的羥基磷灰石介質(zhì)具有高流速、高載量的特點，可以處理粘度較高的樣品，獲得蛋白的純度也較高。使用該層析工藝純化Pm，工藝簡單，處理步驟較少，可以不對樣品進(jìn)行硫酸銨沉淀等處理，且該層析介質(zhì)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以進(jìn)行氫氧化鈉在位清洗，適合產(chǎn)品生產(chǎn)需要。


圖1.細(xì)菌生長(~k IO8細(xì)胞/ml)和時間(小時)圖。圖2.CM柱層析分離純化PT和FHA的紫外監(jiān)測圖。圖3.CM柱層析分離PT和FHA的SDS_PAGE(15% )電泳圖。圖4.S-200 分離 FHA 的 SDS_PAGE(15% )電泳圖。圖5.Capto-adhere層析柱分離純化Prn的紫外監(jiān)測圖。圖6.Capto-adhere層析柱分離純化Prn的Western-blot鑒別圖。圖7.Capto-adhere 層析柱分離純化 Prn 的 SDS-PAGE(15% )電泳圖。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種從百日咳桿菌培養(yǎng)上清液分離純化百日咳有效抗原成分的方法，所述方法包括以下步驟:I)將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；2)將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Pm)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百 日咳粘著素(Pm)。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括:I)將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；2)將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Pm)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)；4)將PT單獨制成無細(xì)胞百日咳疫苗，或者將PT同F(xiàn)HA和/或Prn混合在一起制成無細(xì)胞百日咳疫苗。任何可以產(chǎn)生PT抗原和FHA抗原的百日咳桿菌均可使用。在一個具體的實施方案中，使用了百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)CSI相菌株。百日咳桿菌的培養(yǎng)可以使用液體綜合培養(yǎng)基，例如SS綜合培養(yǎng)基。在一個具體的實施方案中，使用的是改良的SS液體培養(yǎng)基，即加入有0.25%酸水解酪蛋白氨基酸和
0.1% β -環(huán)糊精的SS液體培養(yǎng)基。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述百日咳桿菌培養(yǎng)上清液事先進(jìn)行過離心處理。在上述方法中，對百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行了超濾濃縮處理。用超濾處理替代共純化方法中的硫酸銨沉淀，可以大大縮短工藝周期:兩次硫酸銨沉淀需要約28-40天，而超濾僅需要幾天即可。由此，也就不需要硫酸銨鹽析沉淀蛋白，從而可節(jié)約大量硫酸銨:100L發(fā)酵液約需要35Kg硫酸銨。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述超濾濃縮處理為切向流超濾處理。本文所提及的“切向流超濾處理”是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用截留分子量為10KD/30KD的中空纖維柱進(jìn)行超濾。在一個具體的實施方案中，所述超濾濃縮處理采用的是例如GE公司的Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)。通過采用切向流超濾，液體流動在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力，減少了濾餅層或凝膠層的堆積，保證了穩(wěn)定的過濾速度。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過超濾濃縮處理，將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液的體積縮減至初始體積的1%至10%。優(yōu)選地,該體積縮減至初始體積的4% -7%。通過陽離子交換層析法，可從經(jīng)過上述超濾濃縮處理得到的濃縮液中純化出PT和FHA。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述陽離子交換柱層析為CM-Sepharose柱層析。采用陽離子交換層析柱有以下優(yōu)點:(I)可以通過一次上樣，改變洗脫條件，分別收獲PT和FHA ；
(2)生產(chǎn)效率大大提高；(3)收獲的蛋白純度更高；(4)該方法穩(wěn)定性好，介質(zhì)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以通過增加柱徑直接進(jìn)行線性放大，易于進(jìn)行大規(guī)模放大生產(chǎn)；和(5)CM柱可使用氫氧化鈉在位清洗與除菌，符合GMP要求。在優(yōu)選的實施方案中，所述PT的洗脫是在PH 7.4-7.6的條件下進(jìn)行的，優(yōu)選地，所述PT的洗脫是用pH為7.4-7.6的0.5-2M尿素+20_50mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行的；所述FHA的洗脫是在0.2M-0.6M NaCl的條件下進(jìn)行的，優(yōu)選地，所述FHA的洗脫是用pH為
7.0-8.0的0.2-0.6M氯化鈉+20_50mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以將在步驟2)中得到的FHA抗原進(jìn)一步純化，例如通過Sephacryl S_200High Resolution柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化。任選地，所述方法包括將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，或者百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Pm)。優(yōu)選地，可以將在步驟2)中得到的流穿液事先進(jìn)行硫酸銨沉淀處理，然后再進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析。優(yōu)選地，百日咳桿菌菌體使用尿素溶解。優(yōu)選地,所述多結(jié)合性陰離子交換層析所用的層析介質(zhì)為Capto-adhere。優(yōu)選地，在所述多結(jié)合性陰離子交換層析中，Prn是用以下溶液連續(xù)洗脫獲得的:i)5-10mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.6-7.5)、ii)0.5-1M NaCl 磷酸鹽緩沖液(pH 6.6-7.5);和 iii)5_10mM 醋酸鉀緩沖液(pH 4.0-5.0)。在制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法的一個優(yōu)選實施方案中，對所得PT抗原脫毒。脫毒可以用例如戊二醛或者甲醛進(jìn)行。優(yōu)選地，所述脫毒包括:使所述50-200 μ g/ml PT與
0.5% -1.5%戊二醛室溫作用4-8小時，隨后加入L-賴氨酸使其終濃度為0.01-0.02M,再在室溫下作用2-4小時，終止反應(yīng)。優(yōu)選地，在脫毒過程中可加入保護(hù)劑，例如賴氨酸、甘氨酸或天冬氨酸等等。優(yōu)選地，在脫毒過程中還可加入分散劑，例如吐溫20或吐溫80。傳統(tǒng)的脫毒處理通常需要3至5天的時間。相對而言，采用本發(fā)明的脫毒方法，整個脫毒處理僅需I天即可。所制得的無細(xì)胞百日咳疫苗可以僅包含抗原成分PT，但是也可包含其他成分，例如FHA、Prn、防腐劑和/或佐劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述無細(xì)胞百日咳疫苗包含抗原成分PT、FHA和Pm。優(yōu)選地，在步驟4中，相對于3重量份PT，F(xiàn)HA為0_3重量份，Prn為0_3重量份。更優(yōu)選地，所述抗原PT、FHA和Prn的混合比例為3: 3:1至3: 3: 3，更優(yōu)選為3:3:1。 優(yōu)選地，所述防腐劑為硫柳汞或苯氧乙醇。更優(yōu)選地，所述防腐劑為硫柳汞。優(yōu)選地，所述佐劑為氫氧化鋁或磷酸鋁。更優(yōu)選地，所述佐劑為氫氧化鋁。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種通過本發(fā)明第二方面的方法獲得的無細(xì)胞百日咳疫苗。實施例下面參照附圖，并結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。應(yīng)理解，在下文給出具體實施方式
并非意欲以任何方式對本發(fā)明的范圍作出任何限制。本發(fā)明的范圍應(yīng)該根據(jù)隨附權(quán)利要求書作出解釋。在不背離本發(fā)明的精神和主旨的情況下，可以對本發(fā)明作出任何修飾和改進(jìn)。實施例1.百日咳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)試驗材料:菌種:百日咳博德特氏菌CS I相菌株培養(yǎng)基:采用改良的SS液體培養(yǎng)基:即加入0.25%酸水解酪蛋白氨基酸和0.1%β -環(huán)糊精的SS液體培養(yǎng)基補液:谷氨酸鈉4g/L，酸水解酪蛋白氨基酸2g/L，pH7.6主要設(shè)備:40L發(fā)酵罐(B10-FL0W5000，NBS)、300L 發(fā)酵罐(B10F-6300B 300L，上海高機(jī)生物工程有限公司)
試驗方法:將百日咳CS株的凍干菌種于含有25%脫纖維的羊血鮑姜瓊脂培養(yǎng)基上，37°C，培養(yǎng)72小時后，傳至活性碳瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)48小時；傳3代(活性碳瓊脂培養(yǎng)基)，繼續(xù)37°C培養(yǎng)48小時后，刮種于150ml磷酸鹽緩沖液(即PBS緩沖液，137mM NaCl,
2.7mMKClU0mM Na2HPO4,2mM KH2PO4 ；PH7.2)內(nèi)，獲得菌懸液，調(diào)整菌濃度在 800-1200 X IO8個細(xì)胞/ml。然后將150ml菌懸液接種于40L的發(fā)酵罐中，40L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基裝量為15L(121°C，30分高壓滅菌)，于34 37°C通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中控制pH7.0 8.0、攪拌轉(zhuǎn)速200 500rpm、通氣量80 200L/min、溶解氧在50%以上。培養(yǎng)至12小時時開始取樣，之后每隔2小時取樣一次，監(jiān)控菌濃度及培養(yǎng)物的純度。當(dāng)菌濃度達(dá)80 160X IO8個細(xì)胞/ml時，將該種子液轉(zhuǎn)移至含有150L培養(yǎng)基的300L發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中控制溫度34 37°C、pH 7.0 8.0、攪拌轉(zhuǎn)速200 500rpm、通氣量80 200L/min、溶解氧在50%以上，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)至20小時，開始補料(速度控制在2 8ml/min)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)至40小時以上，菌濃度達(dá)300X IO8個細(xì)胞/ml以上、血凝活性(測定方法參照文獻(xiàn)Sato H.Monoclonal antibody against pertussis toxin:Effect on toxin activity andpertussis infections.1nfect Immun, 1984,46 (2):422)達(dá)到 1: 128 以上時，停罐收獲。試驗結(jié)果:隨著培養(yǎng)時間的增加,菌濃度也逐漸上升,培養(yǎng)12小時菌濃度為40 X IO8個細(xì)胞/ml;培養(yǎng)終止時( 42小時)，菌濃度為380 X IO8個細(xì)胞/ml。培養(yǎng)開始時，上清中的血凝效價較低(1:2)，當(dāng)菌濃度達(dá)到80 X IO8個細(xì)胞/ml時，血凝效價開始上升，收獲時血凝效價為1: 256，結(jié)果見圖1。實施例2.發(fā)酵液的超濾處理試驗材料及樣品:中空纖維濾柱:UFP-10/30-C-4MA-0.065m2, GE切向流處理系統(tǒng):Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE樣品:百日咳發(fā)酵收獲菌液，經(jīng)離心或其他方法分離菌體后的上清液，過0.22 μ m濾膜除雜，樣品量為3000ml。試驗方法:將3000ml菌體分離后的上清液加入磷酸鹽緩沖液(pH8.0)及尿素使其終濃度分別為50mmol/l和lmol/1，作為超濾過程的保護(hù)劑。加入保護(hù)劑的上清液使用10KD/30KD截留分子量的中空纖維柱在4000/sec流速下進(jìn)行超濾濃縮，保持濃縮過程進(jìn)液端壓力在15 20psi。當(dāng)體積濃縮至約200ml時,用平衡液A (50mmol/l磷酸鹽緩沖液、2mol/l尿素，PH 8.0)進(jìn)行洗濾，至收獲液電導(dǎo)率與平衡液A電導(dǎo)率基本一致(電導(dǎo)率儀DDS-307，上海天達(dá)儀器有限公司)。試驗結(jié)果:超濾過程進(jìn)液端壓力保持在15 20psi，體積濃縮后，約使用3X的平衡液A將收獲液的電導(dǎo)率洗濾至0.5S/cm。實施例3.百日咳有效抗原的純化(I)試驗材料及樣品:層析柱:XK26X20，GE
紫外檢測儀:UVD-680_1，上海金達(dá)生化儀器有限公司蠕動泵:BT-300J，保定蘭格恒流泵有限公司離子交換填料:CM_Sepharose,GE ；Capto-adhere, GE凝膠過濾填料:SephacrylS_200High Resolution樣品:超濾濃縮處理后的收獲液200mlPT、FHA 的純化:將60ml CM-S印harose介質(zhì)裝入2.6X20CM層析柱內(nèi)，用ρΗ6.02M尿素、50mM磷酸鹽緩沖液平衡3-5個柱體積。取超濾處理得到的上清液200ml，以300ml/h的流速把該液體通過層析柱，紫外監(jiān)測蛋白質(zhì)A280吸收值，同時收集流穿液，用以分離Pm。然后用pH6.0的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液、pH7.2的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液、pH 7.4的2M尿素+50mM Tris-HCl緩沖液和pH8.0的0.2M氯化鈉+50mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行連續(xù)洗脫(每種洗脫液的體積是180ml)，分別收集洗脫液。其中pH7.4的2M尿素+50mM的Tris-HCl緩沖液收集的洗脫峰為抗原PT (見圖2-1，峰2)，pH8.0的0.2M氯化鈉+50mM磷酸鹽緩沖液洗脫的為抗原FHA(見圖2-1，峰I)。將收獲的PT抗原用透析、超濾或脫鹽層析柱將溶液體系置換為0.5M氯化鈉、50mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)，2_8°C保存。收獲的FHA 抗原經(jīng)過 Sephacryl S_200High Resolution 層析介質(zhì)分離:將 500mlSephacryl S_200H igh Resolution 層析介質(zhì)裝于 2.6 X IOOCM 層析柱內(nèi)，用 pH 8.0 的 0.5M氯化鈉+50mM磷酸鹽緩沖液平衡3 5個柱體積，將收獲的FHA洗脫液上到S-200層析柱上，監(jiān)測蛋白質(zhì)A280的紫外吸收值。然后用平衡液進(jìn)行洗脫，收集第一個從層析柱上流出的峰，即為FHA。Prn 的純化:在從CM層析柱收集得到的流穿液中加入硫酸銨，使其終濃度為350g/L。將所得混合物于2-8°C至少攪拌2小時或靜置過夜，離心(12000g，30min)，收集沉淀，棄掉上清。沉淀用PH6.6的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液溶解。在得到的上清液中再加入硫酸銨，使其終濃度為250g/L。將所得混合物于2-8°C攪拌至少2小時或靜置過夜，離心(12000g，30min)，收集沉淀。沉淀用PH6.6的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液溶解，再離心(12000g，30min)，收集上清液，并調(diào)節(jié)pH至6.6。取20ml Capto-adhere膠裝入M16 X 20層析柱內(nèi)，然后用ρΗ6.6的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液平衡3-5柱體積。將調(diào)節(jié)好pH的流穿液用蠕動泵以恒定流速把該液體加入到裝好的Capto-adhere層析柱內(nèi)，然后用以下溶液連續(xù)洗脫該層析柱:i)PH 6.6的IOmM磷酸鹽緩沖液； )ρΗ6.6的IM NaCl磷酸鹽緩沖液；和iii)pH4.0的IOmM醋酸鉀緩沖液。收集流穿液和每步的洗脫峰，取樣做SDS-PAGE和western檢測。Prn蛋白在醋酸鉀緩沖液的洗脫峰內(nèi)。將得到的Prn蛋白用脫鹽柱、透析或10-30KD膜的方法將溶液置換到0.5MNaCl+50mM磷酸鹽緩沖液內(nèi)，最后用0.22 μ M微孔濾器過濾除菌，置于2_8°C保藏備用。試驗結(jié)果:通過CM柱可以分離PT及FHA，紫外監(jiān)測結(jié)果見圖2_1。將獲得的各峰值蛋白溶液用SDS-PAGE鑒定純度(見圖3-1)，與標(biāo)準(zhǔn)Mark蛋白的電泳圖譜對照比較可知，峰I為純化分離的PT，峰2為FHA。FHA經(jīng)S-200進(jìn)一步分離后，純度明顯增加(電泳結(jié)果見圖4-1)。最終分離純化的PT和FHA蛋白純度均在95%以上，Lowry測定收獲PT的蛋白濃度為166.6 μ g/ml (產(chǎn)率在80%以上)，F(xiàn)HA的蛋白濃度為438.8 μ g/ml (產(chǎn)率85%以上)。通過Capto-adhere柱層析，可分離出外膜蛋白Prn,紫外吸收結(jié)果見圖5-1,Western-blot鑒別結(jié)果見圖6_1。SDS-PAGE鑒定純度分離純化的Prn蛋白純度達(dá)90%以上(產(chǎn)率在85%以上)，結(jié)果見圖7-1。Lowry測定收獲Prn的蛋白濃度為104 μ g/ml。實施例4.百日咳有效抗原的純化(2)試驗材料及樣品:層析柱:XK26X20，GE紫外檢測儀:UVD-680_1，上海金達(dá)生化儀器有限公司蠕動泵:BT_300J，保定蘭格恒流泵有限公司離子交換填料:CM_Sepharose,GE ；Capto-adhere, GE凝膠過濾填料:SephacrylS_200High Resolution樣品:超濾濃縮處理后的收獲液200mlPT、FHA 的純化將60ml CM-S印harose介質(zhì)裝入2.6X20CM層析柱內(nèi)，用ρΗ6.02M尿素、50mM磷酸鹽緩沖液平衡3-5個柱體積。取超濾處理得到的上清液200ml，以300ml/h的流速把該液體通過層析柱，紫外監(jiān)測蛋白質(zhì)A280吸收值，同時收集流穿液，用以分離Pm。然后用pH6.0的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液、PH7.6的0.5M尿素+20mM Tris-HCl緩沖液和0.6M氯化鈉+pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行連續(xù)洗脫(每種洗脫液的體積是180ml)，分別收集洗脫液。其中PH7.6的0.5M尿素+20mM Tris-HCl緩沖液收集的洗脫峰為抗原PT ；0.6M氯化鈉+pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液收集的是抗原FHA。將收獲的PT抗原用透析、超濾或脫鹽層析柱將溶液體系置換為0.5M氯化鈉、50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，2-8°C保存。收獲的FHA 抗原經(jīng)過 Sephacryl S_200High Resolution 層析介質(zhì)分離:將 500mlSephacryl S_200High Resolution 層析介質(zhì)裝于 2.6 X IOOCM 層析柱內(nèi)，用 pH 8.0 的 0.5M氯化鈉+50mM磷酸鹽緩沖液平衡3 5個柱體積，將收獲的FHA洗脫液上到S-200層析柱上，監(jiān)測蛋白質(zhì)A280的紫外吸收值。然后用平衡液進(jìn)行洗脫，收集第一個從層析柱上流出的峰，即為FHA。Prn蛋白的純化:將收獲的菌體按照1: 5 (W/V)的比例溶解于含有4M尿素pH7.4PBS緩沖液(IOmM磷酸鉀，0.15mM NaCl)內(nèi)，混合攪拌一小時，離心(12000g，30min)收集上清液，棄掉沉淀。將得到的上清液用0.22 μ M澄清，然后用10-30KD的膜濃縮到原體積的1/5，濃縮液然后加入250g/L的硫酸銨，2-8°C攪拌至少2小時或靜置過夜，離心(12000g，30min)收集沉淀，沉淀用PH7.5的2M尿素+50mM磷酸鹽緩沖液溶解，再離心(12000g，30min)，收集上清液，并調(diào)節(jié)pH至7.5。然后上Capto-adhere層析柱,用以下溶液連續(xù)洗脫:i) PH 7.5的51111磷酸鹽緩沖液； )ρΗ7.5的0.5M NaCl磷酸鹽緩沖液；和iii)pH5.0的5mM醋酸鉀緩沖液。收集流穿液和每步的洗脫峰，取樣做SDS-PAGE和western檢測，Prn蛋白在醋酸鉀緩沖液的洗脫峰內(nèi)。試驗結(jié)果:通過CM柱可 以分離PT及FHA，紫外監(jiān)測結(jié)果見圖2_2。將獲得的各峰值蛋白溶液用SDS-PAGE鑒定純度(見圖3-2)，與標(biāo)準(zhǔn)Mark蛋白的電泳圖譜對照比較可知，峰I為純化分離的PT，峰2為FHA。FHA經(jīng)S-200進(jìn)一步分離后，純度明顯增加(電泳結(jié)果見圖4-2)。最終分離純化的PT和FHA蛋白純度均在95%以上，Lowry測定收獲PT的蛋白濃度為147.1 μ g/ml (產(chǎn)率在80%以上)，F(xiàn)HA的蛋白濃度為395.2 μ g/ml (產(chǎn)率83%以上)。通過Capto-adhere柱層析，可分離出外膜蛋白Prn,紫外吸收結(jié)果見圖5-2,Western-blot鑒別結(jié)果見圖6_2。SDS-PAGE鑒定純度分離純化的Prn蛋白純度達(dá)90%以上(產(chǎn)率在87%以上)，結(jié)果見圖7-2。Lowry測定收獲Prn的蛋白濃度為141 μ g/ml。實施例5.百日咳有效抗原的脫毒(I)試驗材料及樣品:中空纖維濾柱:UFP-10-C-4MA-0.065m2, GE
切向流處理系統(tǒng):Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE試驗方法:將制備的純PT調(diào)整蛋白濃度50 μ g/ml，加入終濃度為0.004M的賴氨酸，再加入終濃度I %的吐溫20作為分散劑；然后將I %的戊二醛溶液分2-3次加入，至終濃度為0.5%，使其室溫作用4小時，脫毒。然后加入0.2M L-賴氨酸使其終濃度為0.02M,室溫作用2小時終止反應(yīng)。將脫毒收獲的混合物經(jīng)IOKD的中空纖維濾柱進(jìn)行換液透析處理，透析液為20mM PB+0.5M NaCl (ρΗ7.6)。對脫毒后的PT樣品的特異性毒性檢查:用體重14 16g的NIH小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml，于注射前和注射后16 18小時分別稱取小鼠體重；每只小鼠于腹腔注射后3天進(jìn)行末梢血白細(xì)胞計數(shù)；每只小鼠于注射后4天，腹腔注射0.5ml溶液(含二鹽酸組胺4mg)，30分鐘后測小鼠的肛溫。將該脫毒PT樣品置37°C 4周，然后再進(jìn)行組織胺致敏毒性的活性檢查。試驗結(jié)果:注射PT樣品的小鼠體重減輕毒性的活性為0.06BWDU/ml ;小鼠白細(xì)胞增多毒性的活性為0.08LPU/ml ;小鼠組織胺致敏毒性的活性為0.13HSU/ml。脫毒PT樣品置37°C 4周，小鼠組織胺致敏毒性的活性為0.22HSU/ml,以上結(jié)果均符合藥典的相關(guān)規(guī)定。實施例6.百日咳有效抗原的脫毒(2)試驗材料及樣品:中空纖維濾柱:UFP-10-C-4MA-0.065m2, GE切向流處理系統(tǒng):Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE試驗方法:將制備的純PT調(diào)整蛋白濃度200 μ g/ml，加入終濃度為0.004M的甘氨酸，再加入終濃度I %的吐溫80作為分散劑；然后將I %的戊二醛溶液分2-3次加入，至終濃度為
1.5%,室溫作用8小時,脫毒。然后加入0.2M L-賴氨酸使終濃度為0.01M,室溫作用4小時終止反應(yīng)。將脫毒收獲的混合物經(jīng)IOKD的中空纖維濾柱進(jìn)行換液透析處理，透析液為20mM ΡΒ+0.5M NaCl (ρΗ7.6)。脫毒后的PT樣品進(jìn)行特異性毒性檢查:用體重14 16g的NIH小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml，分別于注射前和注射后16 18小時稱取小鼠體重，觀察小鼠體重減輕情況。然后每只小鼠于腹腔注射后3天進(jìn)行末梢血白細(xì)胞計數(shù)；每只小鼠于注射后4天，腹腔注射0.5ml溶液(含二鹽酸組胺4mg)，30分鐘后測小鼠的肛溫，觀察小鼠對組織胺的致敏活性。此外，將該脫毒PT樣品置37°C 4周，然后再進(jìn)行組織胺致敏毒性的活性檢查。試驗結(jié)果:注射PT樣品的小鼠體重減輕毒性的活性為0.08BWDU/ml，小鼠白細(xì)胞增多毒性的活性為0.05LPU/ml，小鼠組織胺致敏毒性的活性為0.16HSU/ml。脫毒PT樣品置37°C 4周后，小鼠組織胺致敏毒性的活性為0.23HSU/ml,以上結(jié)果均符合藥典的相關(guān)規(guī)定。實施例7.組分百日咳疫苗的配制將PT、FHA, Prn分別吸附到氫氧化鋁上，將適宜體積的氫氧化鋁無菌條件下分別加入PT、FHA、Prn中，均和均勻，室溫下?lián)u動2天。按以下比例進(jìn)行配置，每0.5ml人用劑量
的疫苗包含:
權(quán)利要求
1.一種從百日咳桿菌培養(yǎng)上清液分離純化百日咳有效抗原成分的方法，所述方法包括以下步驟: 1)將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮(切向流超濾濃縮)處理，從而得到濃縮液； 2)對所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析(CM-Sepharose柱層析)，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)； 3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析(Capto-adhere柱層析)，分離出百日咳粘著素(Prn)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析(Capto-adhere柱層析)，分離出百日咳粘著素(Prn)。
2.一種制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括: 1)將百日咳桿菌培養(yǎng) 上清液進(jìn)行超濾濃縮(切向流超濾濃縮)處理，從而得到濃縮液(濃縮至初始體積的I %至10 %，優(yōu)選為4 %至7 % ); 2)將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析(CM-Sepharose柱層析)，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)； 3)任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析(Capto-adhere柱層析)，分離出百日咳粘著素(Prn)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析(Capto-adhere柱層析)，分離出百日咳粘著素(Prn)； 4)將PT單獨制成無細(xì)胞百日咳疫苗，或者將PT同F(xiàn)HA和/或Prn混合在一起制成無細(xì)胞百日咳疫苗。
3.權(quán)利要求1-2任一項的方法，其中所述PT的洗脫是在pH7.4-7.6的條件下進(jìn)行的，優(yōu)選地，所述PT的洗脫是用pH為7.4-7.6的0.5-2M尿素+20_50mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行的；所述FHA的洗脫是在0.2M-0.6M NaCl的條件下進(jìn)行的，優(yōu)選地，所述FHA的洗脫是用pH為7.0-8.0的0.2-0.6M氯化鈉+20_50mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中將所述FHA進(jìn)一步進(jìn)行S印hacrylS-200HighResolution 柱層析。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中將在步驟2)中得到的流穿液事先進(jìn)行硫酸銨沉淀處理。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中，在所述多結(jié)合性陰離子交換層析中，Prn是用以下溶液連續(xù)洗脫獲得的:i)5-10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.6-7.5)、ii)0.5_1M NaCl磷酸鹽緩沖液(pH 6.6-7.5);和 iii)5-10mM 醋酸鉀緩沖液(pH 4.0-5.0)。
7.權(quán)利要求2-6任一項的方法，其中將所述PT脫毒，優(yōu)選地用戊二醛或甲醛脫毒；優(yōu)選地，所述脫毒過程包括:使所述50-200 μ g/ml PT與0.5% -1.5%戊二醛室溫作用4_8小時，隨后加入L-賴氨酸使其終濃度為0.01-0.02M,再在室溫下作用2-4小時，終止反應(yīng)；優(yōu)選地，在脫毒過程中加入保護(hù)劑(賴氨酸、甘氨酸或天冬氨酸)和/或分散劑(吐溫20或吐溫80)。
8.權(quán)利要求2-7任一項的方法，其中，在步驟4)中，相對于3重量份PT，F(xiàn)HA為0-3重量份，Prn為0-3重量份；優(yōu)選地，所述抗原PT、FHA和Prn的混合比例為3: 3:1至3:3: 3，更優(yōu)選為3: 3:1。
9.權(quán)利要求2-8任一項的方法，其中在步驟4中，將抗原成分與防腐劑和/或佐劑混合起來，所述防腐劑為硫柳汞或苯氧乙醇，更優(yōu)選為硫柳汞，和/或所述佐劑為氫氧化鋁或磷酸鋁，更優(yōu)選為氫氧化鋁。
10.一 種通過權(quán)利要求2-9任一項所述的方法獲得的無細(xì)胞百日咳疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備無細(xì)胞百日咳疫苗的方法，所述方法包括將百日咳桿菌培養(yǎng)上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，從而得到濃縮液；將所述濃縮液進(jìn)行陽離子交換柱層析，分離出百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)；任選地，將在步驟2)中得到的流穿液進(jìn)行多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)，或者將百日咳桿菌菌體溶解、濃縮，并進(jìn)行硫酸銨沉淀和多結(jié)合性陰離子交換層析，分離出百日咳粘著素(Prn)；將PT單獨制成無細(xì)胞百日咳疫苗，或者將PT同F(xiàn)HA和/或Prn混合在一起制成無細(xì)胞百日咳疫苗。
文檔編號A61P31/04GK103242434SQ201210027499
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月8日
發(fā)明者王雪云, 王長永, 谷義平, 徐艷艷, 姜濤, 曾紅, 柏建力, 崔善海, 夏富文, 王洪飛 申請人:長春百克生物科技股份公司