用于人免疫缺陷病毒(HIV)療法的對接和鎖定(DNL)構建體背景相關申請本申請要求2010年11月3日提交的美國臨時申請序列No.61/409,740；2011年5月19日提交的61/487,956；2010年11月17日提交的61/414,592；以及2011年2月28日提交的美國申請序列No.13/036,820；2011年2月4日提交的13/021,302；2010年12月15日提交的12/968,936；2010年12月18日提交的12/949,536的優(yōu)先權。各優(yōu)先申請的文本以引用方式整體本文中。發(fā)明領域本發(fā)明涉及在受感染的受試者中用于治療人免疫缺陷病毒(HIV)的方法和組合物。優(yōu)選地，所述方法和組合物利用通過對接和鎖定(DNL)技術制備的復合物。在特定的實施方案中，DNL復合物包含抗體或抗體片段，其包括針對HIV包膜抗原例如抗-gp120或抗-gp41抗體(例如P4/D10、2G12、2F5或4E10)的那些以及諸如依帕珠單抗(epratuzumab)(抗-CD22)和米拉珠單抗(milatuzumab)(抗-CD74)的其他目標抗體。在更特定的實施方案中，DNL復合物可包含一種或多種試劑，例如治療劑、診斷劑、病毒抑制劑(virostaticagent)和/或細胞毒素劑，包括但不限于諸如阿霉素的化療劑。使用下述的DDD(對接和二聚化結構域)和AD(錨定結構域)結合作用可將這些試劑并入DNL復合物，或者可使這些試劑直接與DNL復合物綴合。更優(yōu)選地，DNL復合物可包含已知具有抗-HIV活性的一種或多種試劑，例如T20(恩夫韋地(enfuvirtide))HIV融合抑制劑。最優(yōu)選地，將抗-HIV試劑并入DNL復合物內(nèi)改善試劑的藥物代謝動力學性質，例如通過增加其血清半衰期；使得可降低給藥頻率和/或改善功效。在可選的實施方案中，DNL復合物可包含一種或多種聚乙二醇(PEG)部分以改善藥學代謝動力學以及降低免疫原性。可單獨或聯(lián)合一種或多種已知抗-HIV試劑來使用DNL復合物。相關技術描述盡管使用抗-逆轉錄病毒療法治療(ART)人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)具有令人鼓舞的優(yōu)勢，但對周圍血液和淋巴結的分析證明靜止性T細胞的持續(xù)儲庫的存在，其具有甚至在療法終止之后多年可自發(fā)激活的潛在原病毒(Berger等人，ProcNatlAcadSciUSA1998，95：11511-11513；Blankson等人，AnnuRevMed2002，53：557-593)。取決于它的結合特異性和效應子功能，抗體通過以下可用于抑制HIV的感染，通過阻斷病毒進入靶細胞內(nèi)、引發(fā)游離病毒粒子的補體介導的病毒裂解(Parren等人，AIDS1999，13[SupplA]：S137-162)，和/或誘導Fc受體介導的活性(Forthal和Moog，CurrOpinHIVAIDS2009，4：388-393)，其包括用于殺死受感染的細胞、抑制和中和在抗原呈遞細胞上HIV的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，和抗體依賴性細胞介導的病毒抑制(ADCVI)。迄今為止，用于經(jīng)HIV感染的患者的免疫療法的抗病毒抗體的使用尚未達到它的初始前景(Hinkula等人，JAcquirImmuneDeficSyndr1994，7：940-951；Trkola等人，NatMed2005，11：615-622)。已經(jīng)嘗試使用各種病毒或細胞組分作為靶以用于抗體遞送治療劑至HIV-感染的細胞(Davey等人，JInfectDis1994，170：1180-1188；Pincus等人，JImmunol2003，170：2236-2241；Ramachandran等人，JInfectDis1994，170：1009-1013；Saavedra-Lozano等人，ProcNatlAcadSciUSA2004，101：2494-2499)。已經(jīng)證實在癌癥患者中類似免疫毒素具有前景(Wu和Senter，NatBiotechnol2005，23：1137-1146)。然而，對治療HIV-感染的細胞的更加有效的方法和組合物仍存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供用于抑制、阻抑、檢測、鑒定、定位和/或消除HIV和/或HIV-感染的細胞的方法和組合物實現(xiàn)本領域尚未解決的需求。在某些實施方案中，所述組合物和方法可利用包含結合HIV抗原的抗體、抗體片段或者其他靶向分子的DNL復合物。HIV-結合分子可包括但不限于親和體(affibodies)、單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、抗體片段和/或抗體類似物。靶向HIV或抗原呈遞細胞的本領域已知的任何抗體或其片段可并入主題DNL復合物內(nèi)，包括但不限于P4/D10、2G12、2F5、4E10和hLL1。在某些實施方案中，可使HIV靶向分子與一種或多種治療和/或診斷劑綴合。這些試劑可包括但不限于藥物、前藥、病毒抑制劑、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、放射性核素、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、標記、熒光標記、發(fā)光標記、順磁標記、MRI標記、膠束、脂質體、納米粒子或其組合。在可選的實施方案中，通過如下所述的DNL技術可使HIV靶向分子附接治療劑?？上蛞阎蛞伤艸IV感染的患者施用DNL復合物?？赏ㄟ^任何本領域已知的途徑來施用，例如正位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)注射?？蛇x地，施用可以為口服、鼻子、面頰、吸入、直腸、陰道或局部。這些施用可破壞循環(huán)中的HIV；可阻斷或預防細胞被HIV感染；可減少或消除患者中HIV-感染的細胞；和/或可減少或消除在之前和/或同時使用其他已知逆轉錄病毒療法治療的患者中HIV-感染的細胞的剩余病灶。熟練技術人員意識到，可單獨或聯(lián)合HIV感染的其他已知治療性治療來施用主題DNL復合物，例如疊氮胸苷(azidothymidine)、其他核苷/核苷酸逆轉錄抑制劑、非核苷逆轉錄抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑和/或融合抑制劑。在某些實施方案中，可聯(lián)合HAART(高活性抗-逆轉錄病毒療法)來使用綴合的HIV靶向分子。許多抗-HIV治療劑是本領域已知的以及可使用任意這些已知試劑，包括但不限于單獨或聯(lián)合使用的阿巴卡韋(abacavir)、氨多索韋(amdoxovir)、阿立他濱(apricitabine)、阿扎那韋(atazanavir)、貝韋立馬(bevirimat)、胡桐素A(calanolideA)、CCR5、CD4、塞拉格尼(ceragenin)、可比司他(cobicistat)、抗病毒藍藻蛋白-N(cyanovirin-N)、地瑞那韋(darunavir)、二芳基嘧啶類化合物(diarylpyrimidine)、去羥肌苷(didanosine)、德羅格韋(dolutegravir)、依法韋侖(efavirenz)、埃替拉韋(elvitegravir)、艾夫他濱(elvucitabine)、恩曲他濱(emtricitabine)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallotachengallate)、費替那韋(festinavir)、福沙那韋(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、格瑞弗森(griffithsin)、格魯博南A(globoidnanA)、羥基脲(hydroxycarbamide)、茚地那韋(indinavir)、KP-146、拉米夫定(lamivudine)、來非那韋(lefinavir)、來司韋林(lersivirine)、洛匹那韋(lopinavir)、米替福新(miltefosine)、MK-2048、奈非那韋(nelfinavir)、奈韋拉平(nevirapine)、拉西韋(racivir)、雷特格韋(raltegravir)、利托那韋(ritonavir)、沙奎那韋(saquinavir)、塞利西利(selicicib)、司他夫定(stafudine)、司他匹定(stampidine)、雙脫氧胸苷(stavudine)、Tat拮抗劑、替諾福韋(tenofovir)、替拉那韋(tipranavir)、天花粉蛋白(trichosanthin)、TRIM5α、韋瑞康(vivecon)、扎西他濱(zalcitabine)、齊多夫定(zidovudine)或齊多夫定。主題DNL復合物可包含附接毒素或肽基融合抑制劑(peptide-basedfusioninhibitor)的多個拷貝的目標抗體或抗體片段。毒素可具有微生物、植物或動物來源，包括但不限于蓖麻毒、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(ranpimase)(Rap)或Rap(N69Q)。肽基融合抑制劑(Naider和Anglister，CurrOpinStructBiol2009，19：473-482)包括但不限于靶向gp41的C-末端螺旋區(qū)的那些(例如，T-20、T1249、C34、DP和西夫韋肽(sifuvirtide))或者靶向gp41的N-末端螺旋區(qū)的那些(例如，IZN17、N38、N42、N36F10和T21)。更優(yōu)選地，這些DNL復合物展示以納摩爾或更低濃度計的抗-HIV活性。又一實施方案涉及用于遞送諸如人工基因或siRNA的治療性核算種類的DNL復合物。在這些實施方案中，DNL復合物可包含附接諸如樹狀高分子(dendrimer)、魚精蛋白、組蛋白、含有組氨酸可還原聚陽離子、陽離子梳型共聚物、殼聚糖-硫胺素焦磷酸酯、聚乙烯亞胺或聚賴氨酸的核酸載體的一種或多種拷貝的抗-HIV抗體或其片段。核酸結合聚合物的許多例子是本領域已知的，例如PAMAM、聚賴氨酸、聚丙烯亞胺、聚乙烯亞胺、聚乙二醇或碳硅烷。通常，載體分子是聚陽離子以及通過靜電作用來結合核酸。如下所討論，siRNA或其他治療性核酸的許多例子是本領域已知的，并且使用本文所述的DNL復合物可將任意這些已知種類遞送至靶細胞、組織、器官或病原體。主題(DNL)復合物包含二聚化和對接結構域(DDD)部分的至少兩個拷貝以及錨定結構域(AD)部分的至少一個拷貝。優(yōu)選地，DDD部分來自人蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞單位蛋白(RIα、RIβ、RIIα、RIIβ)，而AD部分來自AKAP(A-激酶錨定蛋白)。DDD部分自發(fā)形成二聚體，其然后結合AD部分以形成DNL復合物。DNL復合物可包含并入AD和DDD部分內(nèi)的融合蛋白，但可選地AD和/或DDD部分可通過諸如化學偶聯(lián)的其他方法來共價附接效應子部分。并入DNL復合物內(nèi)的效應子可包括但不限于蛋白、肽、抗體、抗體片段、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、白介素、干擾素、結合蛋白、肽配體、載體蛋白、毒素、諸如豹蛙酶的核糖核酸酶、諸如siRNA的抑制性寡核苷酸、抗原或異種抗原、諸如PEG的聚合物、酶、治療劑、激素、細胞毒素劑、抗-血管生成劑、促細胞凋亡試劑(pro-apoptoticagent)或已知產(chǎn)生生理作用的任何其他分子。主題DNL復合物可由二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或其他多聚體組成。熟練技術人員意識到，DNL技術使得可有效和可再生形成基本上包括效應子亞單位的任意組合的多聚體復合物。本文也描述編碼如本文所述的融合蛋白或其他DNL亞單位的分離的核酸。其他實施方案涉及包括編碼核酸序列的表達載體和/或宿主細胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞可以為使用已經(jīng)使其適應在無血清培養(yǎng)基中細胞轉化和生長的突變Bcl-2基因轉化的Sp2/0細胞系，例如使用三倍突變Bcl-2基因(T69E、S70E、S87E)。(參見，例如，美國專利No.7,531,327、7,537,930和7,608,425，其實施例部分各自以引用方式并入本文。)通過制備編碼的蛋白或復合物的標準技術可培養(yǎng)經(jīng)編碼DNL復合物或DNL復合物的亞單位的表達載體轉染的宿主細胞。有利地，使宿主細胞適應在無血清條件下生長和產(chǎn)生蛋白。熟練技術人員意識到，上述的DNL復合物及其用途僅為示例性，并且用于治療或診斷用途的DNL復合物的許多其他不同類型均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。附圖簡述以下附圖構成本說明書的一部分，并且將其涵蓋以進一步說明本發(fā)明的特定實施方案的某些方面。通過聯(lián)合本文所示的詳細描述來參考這些附圖中一幅或多幅可更好地理解實施方案。圖1A.體外HIV感染的中和。通過使用HIV-1IIIB實驗室菌株孵育不同濃度的免疫球蛋白，然后分析HIV易受感染的JurkatT-細胞的病毒感染來測定免疫球蛋白的中和能力。10μg/ml阿霉素-P4/D10和未經(jīng)標記的P4/D10中和的HIV-1IIIB顯著優(yōu)于HIV陰性血清(p＝0.001)。圖1B.HIV體外感染的細胞內(nèi)散布的抑制。為了測試免疫球蛋白是否能限制HIV-1感染的細胞內(nèi)散布，將JurkatT-細胞以0.2％、1％、3％和5％經(jīng)感染以及99.8％、99％、97％和95％未受感染的細胞的比例混合。顯示在使用經(jīng)HIV-1IIIB感染的3％JurkatT-細胞和具有不同濃度的免疫球蛋白的97％未受感染的細胞處理之后HIV-1p24產(chǎn)生。結果顯示為在培養(yǎng)物中7天之后對p24產(chǎn)生的抑制百分比。與未經(jīng)標記的P4/D10、對照抗體阿霉素-LL1、游離阿霉素和HIV-陰性血清相比，0.5或0.05μg/ml的濃度下阿霉素-P4/D10具有對HIV-1p24產(chǎn)生的顯著更好的抑制作用(p＝0.002)。圖2.保護免于HIV-1/MuLV體內(nèi)感染。使用HIV-1/MuLV感染的脾細胞在腹膜內(nèi)(i.p.)攻擊小鼠(6-12/組)，并立即使用單克隆抗體(MAb)或游離阿霉素處理。將未綴合的P4/D10Mab以100-800μg/小鼠滴定；游離阿霉素100-400μg以及無關阿霉素-hRS7100-200μg。所有其他處理均以100μg/小鼠給予。在攻擊之后十天，收集腹膜腔細胞以及與HIV易受感染的JurkatT-細胞混合。在18天內(nèi)每3-4天測定在這些細胞培養(yǎng)物中HIVp24產(chǎn)生。顯示在使用100μg的Mab或游離阿霉素處理之后具有p24陽性細胞培養(yǎng)物的小鼠的百分比。僅來自使用100μg阿霉素-P4/D10處理的小鼠的細胞沒有感染性HIV，這與所有其他組顯著不同(p＝0.0001)。圖3.Hex-hA20結合的分析。(A)顯示Hex-hA20的競爭性ELISA對于結合WR2比維妥珠單抗(veltuzumab)具有更高的抗體親抗原性(avidity)。在競爭性結合固定化的維妥珠單抗的WR2的存在下，將Hex-hA20(o)或維妥珠單抗(■)在不同濃度下孵育。相對mAb濃度繪制抑制的百分比，并使用軟件生成EC50值。(B)如使用PE-綴合的抗-人Fab(PE-抗-Fab)或者PE-綴合的抗-人Fc(PE-抗-Fc)通過流式細胞術測定對Daudi細胞的結合。在4℃下進行所有孵育和洗滌。將Daudi細胞以1x106細胞/mL混懸在1％BSA-PBS中以及使用Hex-hA20、維妥珠單抗或拉貝珠單抗(labetuzumab)孵育1小時。使用1％BSA-PBS洗滌細胞，使用PE-抗-Fab或PE-抗-Fc的1∶200稀釋物孵育30分鐘，再洗滌一次，然后在PCA上分析。(C)使用放射性碘化Hex-hA20(■)、維妥珠單抗(▲)或利妥昔單抗(rituximab)(○)以及Raji細胞來進行Scatchard分析。(D)由Daudi或Raji細胞離解。使用R-藻紅蛋白人IgG標記試劑盒(InvitrogenCorp.)經(jīng)PE標記Hex-hA20(·)、維妥珠單抗(■)和利妥昔單抗(▲)。將細胞混懸在CM(使用1x106細胞/mL補充有10％FBS的無酚紅RPMI1640)中，并且在室溫下各使用65nmol/L的PE-標記的抗體孵育5x105細胞30分鐘。使用CM洗滌細胞兩次以去除非結合的抗體，在37℃下在1μmol/LCH1-DDD2-Fab-hA20的存在下將其混懸在1.5mL的CM中，并在上多時間點下分析細胞結合的PE-標記的抗體。通過使用軟件的非線性回歸來測定離解半衰期。圖4.細胞增殖的抑制。(A)通過Raji、Ramos或Daudi的4-dMTS分析來測定體外抗增殖。使用Hex-hA20(o)、維妥珠單抗(▲)或者維妥珠單抗+山羊抗-人Fc(■)來處理細胞。也使用Hex-hA20+山羊抗-人來處理Daudi細胞。簡言之，將細胞以5,000細胞/孔放置在完全的RPMI1640中的96-孔板中。將以范圍為2x10-8至6.4x10-12mol/L的最終濃度與山羊-抗人Fc交聯(lián)的Hex-hA20、維妥珠單抗或維妥珠單抗的五倍系列稀釋物一式三份加入孔中。將板孵育4天，此后將20μL的CELLTITER水性單溶液試劑(AqueousOneSolutionReagent)(PromegaCorp.)加入，并繼續(xù)孵育另外的4小時，此后在490nm下讀板。(B)通過Ramos(左)或Raji(右)的活細胞計數(shù)分析來測定體外抗增殖。將細胞以1x105細胞/mL接種在T-燒瓶中，并使用規(guī)定濃度的維妥珠單抗、Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20處理。在5天內(nèi)通過流式細胞術每日一次測定活細胞密度(VCD)。在第3天，將培養(yǎng)物以1∶2分開以維持對數(shù)生長。在規(guī)定濃度下將細胞繪制為在第3、4和5天時測定的活細胞/毫升。圖5(A)通過連接蛋白(Nexin)(左)測定的細胞凋亡，其顯示在使用0.5nmol/L(黑色柱子)或5nmol/L(灰色柱子)的維妥珠單抗、Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20孵育24-h之后在Raji中誘導的早期細胞凋亡細胞(膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-PE陽性/7-AAD陰性)的百分比。通過在Hex-hA20(5nmol/L)、維妥珠單抗(5nmol/L)或抗-IgM(5μg/mL)的存在下培養(yǎng)的Raji細胞的多半胱天冬酶(右)測定細胞凋亡，并在使用SR-VAD-FMK染色之后在3、7、16和24小時處分析。將細胞以2x105細胞/mL接種在新鮮培養(yǎng)基中，以及在37℃下使用規(guī)定的濃度下的各測試物品孵育至多24小時，并將孔一式兩份處理以用于分析。(B)在人補體的存在下測定在Daudi細胞中Hex-hA20(o)、依帕珠單抗□()、維妥珠單抗(■)或CH3-AD2-IgG-hA20(●)的CDC(左)。相對納摩爾濃度的log值繪制補體對照的百分比(與僅使用補體處理的細胞相比在測試樣品中活細胞的數(shù)目)。使用Daudi作為靶細胞以及來自兩供體的新鮮分離的周圍血液單核細胞作為效應細胞來測定5μg/mL的Hex-hA20、維妥珠單抗、依帕珠單抗或拉貝珠單抗的ADCC(右)。通過向僅含有靶細胞的孔加入去污劑來生成100％裂解基準。條線圖顯示由兩供體各自獲得的裂解的百分比。圖6.在人淋巴瘤異種移植模型中Hex-hA20的功效。(A)在第0天將Daudi細胞(1.5x107)靜脈(i.v.)注射至SCID小鼠內(nèi)。在第1和8天，給予多組小鼠(n＝9-10)兩不同劑量(30或6μg)的Hex-hA20或者等摩爾量的維妥珠單抗(12.4或2.4μg)。(B)如材料和方法中所述，在施用對小鼠IL-2受體特異的具有抗小鼠Gr-1腹水和TMβ-1mAb的Raji細胞之前使SCID小鼠耗竭NK細胞和嗜中性粒細胞。在第0天，將Raji細胞(1x106)靜脈注射至耗竭和未耗竭的小鼠內(nèi)。在第3、5、7和11天靜脈給予Hex-hA20(465μg)或者維妥珠單抗(200μg)，而給予對照組鹽水。圖7.IgG-(T20)4DNL復合物的示意圖。(A)AD2(SEQIDNO：4)和DDD2(SEQIDNO：2)部分的氨基酸序列。(B)DDD2-接頭-聚-組氨酸-T20部分的氨基酸序列(SEQIDNO：99)。(C)IgG-AD2和DDD2-T20亞單位以及DNL復合物的結構。圖8.P4/D10抗體的(A)Vκ鏈(SEQIDNO：100)和(B)VH鏈(SEQIDNO：101)的氨基酸序列。CDR序列標有下劃線。圖9A.嵌合的P4/D10(cP4/D10)抗體輕和重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。嵌合抗體的氨基酸可變區(qū)序列與鼠P4/D10抗體的那些相同。(A)嵌合的Vκ鏈的DNA序列(SEQIDNO：102)。(B)嵌合的Vκ鏈的氨基酸序列(SEQIDNO：103)。(C)嵌合的VH鏈的DNA序列(SEQIDNO：104)。(D)嵌合的VH鏈的氨基酸序列(SEQIDNO：105)。圖10.cP4/D10和P4/D10的結合的比較。(A)與涂覆在微量滴定板上HIV包膜蛋白gpl60的結合的ELISA分析。(B)與gp120的V-3肽結合的ELISA分析。圖11.如在第9天處通過p24抗原ELISA測定的，在PBMC中通過h734-(T20)4、DDD2-T20和T20對HIV-16920復制的抑制。(A)以μg/mL計的測試物品的濃度用于x軸。(B)當將測試物品的摩爾濃度用于x軸時，揭示與DDD2-T20以及T20相比較的h734-(T20)4較好效能。圖12.比較用于中和HIV的P4/D10、cP4/D10、h734-(T20)4和hLL2-(T20)4的效能。(A)以50TCID50給藥暴露于HIV-1IIIB的JurkatT細胞。(B)以100TCID50給藥暴露于HIV-1IIIB的JurkatT細胞。(C)以50TCID50給藥暴露于以HIV-16794的PBMC。(D)以100TCID50給藥暴露于HIV-16794的PBMC。圖13.在30天的時間段內(nèi)通過SAHA的潛伏病毒激活之后在PBMC中HIV-1的中和。(A)通過p24抗原捕獲來監(jiān)控HIV-1。(B)通過HIV-陽性培養(yǎng)物的數(shù)目來監(jiān)控HIV-1。(C)在第30天處在使用各種試劑處理的細胞中病毒陽性培養(yǎng)物顯示為培養(yǎng)基處理的對照的百分比。圖14.hLL2-(T20)4的血清穩(wěn)定性。在注射hLL2-(T20)4之后30-分鐘、6-h、24-h和72-h處由小鼠收集的血清樣品中完整hLL2-(T20)4和所有含有hLL2種類的濃度，比較在注射hLL2之后相同時間點處由小鼠收集的血清樣品中hLL2的濃度。發(fā)明詳述在本申請中引用的所有文件或文件的一部分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論文，以引用方式明確在此整體并入。定義如本文所使用，“一個(a)”或“一種(an)”可表示一種或多于一種事物。如本文所使用，術語“和”以及“或”可用于表示連接詞或轉折連詞。即，除非另有說明，兩術語應當理解為等同“和/或”。如本文所使用，“約”是指在數(shù)字的正或負10％內(nèi)。例如，“約100”可表示在90和110之間的任意數(shù)字。如本文所述，“抗體”是指全長(即，天然存在或通過正常免疫球蛋白基因片段重組方法形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或者免疫活性(即，特異性結合)部分或者免疫球蛋白分子的類似物，類似于抗體片段?！翱贵w片段”是諸如F(ab)2、F(ab′)2、Fab、Fv、sFv等的抗體的一部分。無論是何種結構，抗體片段結合通過完整抗體識別的相同抗原。術語“抗體片段”也包括通過結合特異性抗原以形成復合物的類似抗體作用的任意合成或遺傳工程蛋白。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離的片段(例如由重和輕鏈的可變區(qū)組成的“Fv”片段)、其中輕和重可變區(qū)通過肽接頭(“scFv蛋白”)連接的重組單鏈多肽分子，以及由模擬高可變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別(CDR)單元。“治療劑”是用于治療疾病的原子、分子或化合物。治療劑的例子包括抗體、抗體片段、藥、病毒抑制劑、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)、螯合劑、硼化合物、光活性試劑、染料和放射性同位素。其他示例性治療劑和使用方法公開在美國專利申請公開No.20050002945、20040018557、20030148409和20050014207中，其各自以引用方式并入本文。本文所使用的“中和抗體”或“中和抗體片段”是指與感染劑(例如病毒)反應和抑制它的感染性的抗體或片段?！霸\斷劑”是用于診斷疾病的原子、分子或化合物?？墒褂玫脑\斷劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如具有生物素-鏈親和素復合物)、造影劑、熒光化合物或分子，以及用于磁共振成像(MRI)的增強劑(例如，順磁離子)?！懊庖呔Y合物”是分子(例如，抗體組分)與原子、分子或高階結構(higher-orderedstructure)(例如，與載體、治療劑或診斷劑)結合的綴合物。“裸抗體”是未與任何其他試劑綴合的抗體?！拜d體”是能夠與治療劑或診斷劑締合以便于遞送這些試劑至靶向細胞的原子、分子或高階結構。載體可包括脂質(例如，能夠形成高階結構的兩親性脂質)、多糖(例如葡聚糖)、蛋白、肽、肽類似物、肽衍生物或其他高階結構，例如膠束、脂質體或納米粒子。在某些實施方案中，例如通過在蛋白或肽中使用D-氨基酸取代天然存在的L-氨基酸可設計載體抵抗蛋白水解或其他酶促降解。如本文所使用，術語“抗體融合蛋白”是指重組產(chǎn)生的抗原結合分子，其中使具有相同或不同特異性的兩種或更多種相同或不同scFv或抗體片段連接。融合蛋白的效價表明融合蛋白對單個抗原或表位具有多少個結合臂(bindingarm)或位點；即，單價、二價、三價或多價?？贵w融合蛋白的多價表示在與抗原結合中它可利用多種相互作用，因而增加對抗原結合的抗體親抗原性。特異性表明抗體融合蛋白能夠結合多少抗原或表位；即，單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，諸如IgG的天然抗體為二價，因為它具有兩個結合臂，但為單特異性，因為它結合一個表位。單特異性、多價融合蛋白具有對于表位的多于一個結合位點，但僅結合一個這種表位，例如與相同抗原反應的具有兩個結合位點的雙特異抗體(diabody)。融合蛋白可包含單個抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合，或者相同抗體組分的多個拷貝。融合蛋白可另外包含抗體或抗體片段以及治療劑。適合這些融合蛋白的治療劑的例子包括免疫調(diào)節(jié)劑(“抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白”)和毒素(“抗體-毒素融合蛋白”)。一種優(yōu)選的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選為重組RNA酶。如果施用的量為生理上顯著的，則據(jù)認為，以“治療有效量”施用本文所述的抗體或免疫綴合物制劑或組合物。如果它的存在導致接受哺乳動物的生理上可檢測改變，則試劑為生理上顯著的。尤其，如果它的存在降低、抑制或消除HIV-感染的細胞或者降低、抑制或消除未受感染的細胞的HIV感染，則抗-HIV抗體制劑為生理上顯著的。如果接受患者可容忍它的施用，則據(jù)認為，組合物為“藥學上可接受的載體”。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥學上可接受的載體的一個例子。其他合適的載體是本領域眾所周知的。參見，例如，REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，第19版(MackPublishingCo.1995)，以及Goodman和Gilman的THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS(Goodman等人編輯，MacmillanPublishingCo.，NewYork，1980和2001版)。使用的縮略語為：ABS，含有150mM氯化鈉的醋酸鈉緩沖劑；ADCC，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性；DNL，對接和鎖定；DTT，二硫蘇糖醇；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定法；ART，抗逆轉錄病毒療法；HIV，人免疫缺陷病毒；MAb或mAb，單克隆抗體；MuLV，鼠白血病病毒；PBMC，周圍血液單核細胞；TCID50，50％組織培養(yǎng)感染劑量使用DNL方法以制備大量多聚體構建體(參見，例如，美國專利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400，其實施例部分各自以引用方式并入本文。DNL方法能夠以非常高的再現(xiàn)性和效率接合在穩(wěn)定復合物中幾乎任何目標效應子亞單位。通常，DNL利用由cAMP-依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)亞單位衍生的二聚化和對接結構域(DDD)序列以及由各種AKAP蛋白中任意衍生的錨定結構域(AD)序列之間的特異性和高親合力結合作用?？墒笵DD和AD肽附接任意蛋白、肽或其他分子。因為DDD序列自發(fā)二聚化和結合AD序列，所以DNL技術使得可在可附接DDD或AD序列的任意選擇的分子之間形成復合物。盡管標準DNL復合物包含具有附接一個AD--連接的分子的兩個DDD-連接的分子的三聚體，但在復合物結構中變化使得可形成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體和其他多聚體。在一些實施方案中，DNL復合物可包含兩種或更多種抗體、抗體片段或融合蛋白，其結合相同抗原的不同表位或者結合兩種或更多種不同抗原。DNL復合物也可包含一種或多種其他效應子，例如蛋白、肽、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、白介素、干擾素、結合蛋白、肽配體、載體蛋白、毒素、諸如豹蛙酶的核糖核酸酶、諸如siRNA的抑制性寡核苷酸、諸如PEG的聚合物、酶、治療劑、激素、細胞毒素劑、抗-血管生成劑、促細胞凋亡試劑或任意其他分子或聚集體。DNL方法利用出現(xiàn)在cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)的調(diào)節(jié)(R)亞單位以及A-激酶錨定蛋白(AKAP)的錨定結構域(AD)之間的特異性蛋白/蛋白質相互作用(Baillie等人，F(xiàn)EBSLetters.2005；579：3264.Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5：959)。在通過第二信使cAMP與R亞單位的結合觸發(fā)的研究最好的信號轉導途徑之一中起著中心作用的PKA是在1968年首先由兔骨骼肌中分離出來的(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的結構由通過R亞單位保持非活性形式的兩個催化亞單位組成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。發(fā)現(xiàn)PKA的同工酶具有兩類R亞單位(RI和RII)，并且各類型具有α和β同種型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。因此，PKA調(diào)節(jié)亞單位的四種同種型為RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。僅將R亞單位作為穩(wěn)定的二聚體分離，并且顯示二聚化結構域由前44個氨基末端殘基組成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP與R亞單位的結合導致廣譜性絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的活性催化亞單位釋放，通過經(jīng)其與AKAP的對接的PKA的區(qū)室化使該活性催化亞單位針對選擇的底物定向(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。自從第一種AKAP、微管相關蛋白-2在1984年被表征以來(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA.1984；81：6723)，位于包括質膜、微絲細胞骨架、核、線粒體和內(nèi)質網(wǎng)的各種亞細胞位點的超過50種AKAP經(jīng)識別在酵母至人的種屬中具有不同結構(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5：959)。對于PKA的AKAP的AD為14-18個殘基的兩親性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。在個體AKAP之間的AD的氨基酸序列非常不同，其RII二聚體所報道的親合力的范圍為2至90nM(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP僅結合二聚的R亞單位。對于人RIIα，AD結合通過23個氨基末端殘基形成的疏水表面(Colledge和Scott，TrendsCellBiol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化結構域和AKAP結合結構域均位于相同N-末端的44個氨基酸序列內(nèi)(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人，EMBOJ.2001；20：1651)，在本文中其稱為DDD。我們已經(jīng)開發(fā)平臺技術以利用人PKA調(diào)節(jié)亞單位的DDD以及AKAP的AD作為用于對接以下稱為A和B的任意兩實體至非共價復合物內(nèi)的接頭組件的極佳對，通過在策略位置處引入半胱氨酸殘基至DDD和AD內(nèi)以便于形成二硫鍵可進一步將該非共價復合物鎖定至DNL復合物內(nèi)?！皩雍玩i定”途徑的一般方法如下。通過連接DDD序列至A的前體來構建實體A，得到以下稱為a的第一組分。因為DDD序列作用于二聚體的自發(fā)形成，A因而由a2組成。通過連接AD序列與B的前體來構建實體B，得到以下稱為b的第二組分。在a2中含有的DDD的二聚基序生成用于結合在b中含有的AD序列的對接位點，因而使得a2和b容易締合以形成由a2b組成的二元、三聚復合物。經(jīng)二硫橋鍵共價固定兩實體的隨后反應使得該結合事件不可逆，因為初始結合作用應當使得活性硫醇基團位于DDD和AD上至更加接近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以位點特異性連接，所以基于有效局部濃度的原理其非常有效地發(fā)生。使用接頭、銜接子組件和前體的各種組合，可產(chǎn)生和使用不同化學計量的大量DNL構建體，包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚和六聚DNL構建體(參見，例如，U.S.No.7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400)。通過遠離兩前體的官能團來附接DDD和AD，也預期這些位點特異性連接保存兩前體的原來的活性。該方法本質上為模塊化的，并可能應用以位點特異性和共價連接大量物質，包括肽、蛋白、抗體、抗體片段和具有大量活性的其他效應子部分。利用在以下實施例部中描述的構建AD和DDD綴合的效應子的融合蛋白方法，可將幾乎任何蛋白或肽并入DNL構建體內(nèi)。然而，技術并不受限制，并可利用其他綴合方法。已知制備融合蛋白的各種方法(包括核酸合成、雜交和/或擴增)以制備編碼目標融合蛋白的合成雙鏈核酸。通過標準分子生物技術可將這些雙鏈核酸插入表達載體內(nèi)以用于融合蛋白制備(參見，例如Sambrook等人，MolecularCloning，Alaboratorymanual，第2版，1989)。在這些優(yōu)選的實施方案中，可使AD和/或DDD部分附接效應子蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟練技術人員意識到，取決于在它的生理活性中涉及的效應子部分以及一部分效應子部分的化學性質，AD或DDD部分與效應子部分附接位置可變化。使用本領域已知技術可進行各種效應子部分的位點特異性附接，例如使用二價交聯(lián)試劑和/或其他化學綴合技術。在AD和DDD部分中結構-功能關系對于不同類型的DNL構建體，可利用不同的AD或DDD序列。以下提供示例性DDD和AD序列。DDD1SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：1)DDD2CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：2)AD1QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)AD2CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQIDNO：4)熟練技術人員意識到，DDD1和DDD2基于蛋白激酶A的人RIIα同種型的DDD序列。然而，在可選的實施方案中，如以下DDD3、DDD3C和AD3所例證，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列以及對應AKAP序列。DDD3SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：5)DDD3CMSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：6)AD3CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQIDNO：7)在其他可選的實施方案中，在DNL復合物的結構中可利用AD和/或DDD部分的其他序列變體。例如，僅有人PKADDD序列的四種變體，其對應于PKARIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是以上公開的DDD1和DDD2的基礎。以下顯示四種人PKADDD序列。DDD序列表示RIIα的殘基1-44、RIIβ的1-44、RIα的12-61以及RIβ的13-66。(注意，DDD1的序列由人PKARIIαDDD部分稍作修飾。)PKARIαSLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQIDNO：8)PKARIβSLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHHFEKLEKEENRQILA(SEQIDNO：9)PKARIIaSHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQIDNO：10)PKARIIβSIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQIDNO：11)AD和DDD結構域的結構-功能關系是研究的主題。(參見，例如，Burns-Hamuro等人，2005，ProteinSci14：2982-92；Carr等人，2001，JBiolChem276：17332-38；Alto等人，2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，BiochemJ396：297-306；Stokka等人，2006，BiochemJ400：493-99；Gold等人，2006，MolCell24：383-95；Kinderman等人，2006，MolCell24：397-408，其全部文本各自以引用方式并入本文。)例如，Kinderman等人(2006，MolCell24：397-408)檢查AD-DDD結合作用的晶體結構，并推斷人DDD序列含有對二聚體形成或AKAP結合均重要的大量保守的氨基酸殘基，其在以下SEQIDNO：1標有下劃線。(參見Kinderman等人的圖1，2006，其以引用方式并入本文。)熟練技術人員意識到，在設計DDD序列的序列變體中，人們最好避免改變?nèi)魏螛擞邢聞澗€的殘基，但對二聚化和AKAP結合并不那么關鍵的殘基可進行保守氨基酸取代。SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：1)如以下更加詳細所討論，保守氨基酸取代的特征在于各20種常見L-氨基酸。因此，基于Kinderman(2006)的數(shù)據(jù)和保守氨基酸取代，在表1中顯示基于SEQIDNO：1的潛在可選的DDD序列。在設計表1中，僅考慮到高保守氨基酸取代。例如，帶電荷的殘基僅取代相同電荷的殘基；具有小側鏈的殘基被小尺寸的殘基取代；羥基側鏈僅被其他羥基取代等。因為脯氨酸對氨基酸二級結構的獨特作用，所以沒有其他殘基取代脯氨酸。即使利用這些保守型取代，但對于44個殘基的肽仍有超過兩千萬可能的可選的序列(2x3x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x4x2x2x2x2x2x4x2x4)。少數(shù)這些潛在可選的DDD部分序列顯示在以下SEQIDNO：12至SEQIDNO：31中。熟練技術人員意識到，通過標準技術可構建在DDD部分的種類內(nèi)可選分類的幾乎不受限制的數(shù)量，例如使用市售肽合成儀或者眾所周知的定位誘變技術。通過諸如公開在Alto等人(2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50)中的標準結合分析也可容易地測定氨基酸取代對AD部分結合的作用。表1.在DDD1(SEQIDNO：1)中保守氨基酸取代。如SEQIDNO：90所公開的共有序列。THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：12)SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：13)SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：14)SHINTPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：15)SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：16)SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：17)SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：18)SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：19)SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：20)SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：21)SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：22)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：23)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：24)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：25)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：26)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：27)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQIDNO：28)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYPTRLREARA(SEQIDNO：29)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQIDNO：30)SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQIDNO：31)Alto等人(2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50)進行各種AKAP蛋白的AD序列的生物信息分析以設計具有對DDD結合常數(shù)為0.4nM的稱為AKAP-IS(SEQIDNO：3)的RII選擇性AD序列。將AKAP-IS序列設計為AKAP與PKA結合的肽拮抗劑。在其中取代傾向于降低與DDD結合的AKAP-IS序列中殘基在以下SEQIDNO：3中標有下劃線。熟練技術人員意識到，在設計AD序列的序列變體中，人們最好避免改變?nèi)魏螛擞邢聞澗€的殘基，但對DDD結合并不那么關鍵的殘基可進行保守氨基酸取代。表2顯示在AKAP-IS的序列(AD1，SEQIDNO：3)中潛在保守氨基酸取代，其類似于在以上表1中所顯示的DDD1(SEQIDNO：1)。即使使用這些保守型取代，對17個殘基AD1(SEQIDNO：3)肽序列仍有超過三萬五千種可能的可選的序列(2x3x2x4x3x2x2x2x2x2x2x4)。少數(shù)這些潛在可選的AD部分序列顯示在以下SEQIDNO：32至SEQIDNO：49中。再次，基于Alto等人(2003)的數(shù)據(jù)，通過熟練技術人員可制備、測試和使用在可能AD部分序列的種類內(nèi)的大量類別。注意，Alto(2003)的圖2顯示基于實際結合實驗可進行的更大數(shù)量的潛在氨基酸取代，同時保留與DDD部分的結合活性。AKAP-ISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)表2.在AD1(SEQIDNO：3)中的保守氨基酸取代。如SEQIDNO：91所公開的共有序列。NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：32)QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：33)QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：34)QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：35)QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：36)QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：37)QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：38)QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：39)QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：40)QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQIDNO：41)QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQIDNO：42)QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQIDNO：43)QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQIDNO：44)QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQIDNO：45)QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQIDNO：46)QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQIDNO：47)QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQIDNO：48)QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQIDNO：49)Gold等人(2006，MolCell24：383-95)利用結晶學和肽篩選以開發(fā)SuperAKAP-IS序列(SEQIDNO：50)，其表現(xiàn)出與RI同種型相比對PKA的RII同種型的五階數(shù)量級的更高選擇性。標有下劃線的殘基表明相對AKAP-IS序列的氨基酸取代的位置，其增加與RIIα的DDD部分的結合。在該序列中，N-末端Q殘基編號為殘基數(shù)4以及C-末端A殘基是殘基數(shù)20。可在其中進行取代以影響對RIIα的親合力的殘基為殘基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。據(jù)預估，在某些可選的實施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-ISAD部分序列以制備DNL構建體。其他可取代AKAP-ISAD序列的可選的序列顯示在SEQIDNO：51-53中。與AKAP-IS序列相關的取代標有下劃線。據(jù)預計，與在SEQIDNO：4中所顯示的AD2序列一樣，AD部分也可包括另外的N-末端殘基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端殘基甘氨酸和半胱氨酸。SuperAKAP-ISQIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO：50)可選的AKAP序列QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：51)QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：52)QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：53）Gold等人的圖2公開來自以下所示的各種AKAP蛋白的另外的DDD-結合序列RII-特異性AKAPAKAP-KLPLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQIDNO：54)AKAP79LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQIDNO：55)AKAP-LbcLIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQIDNO：56)RI-特異性AKAPAKAPceALYQFADRFSELVISEAL(SEQIDNO：57)RIADLEQVANQLADQIIKEAT(SEQIDNO：58)PV38FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQIDNO：59)雙特異性AKAPAKAP7ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQIDNO：60)MAP2DTAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQIDNO：61)DAKAP1QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQIDNO：62)DAKAP2LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQIDNO：63)Stokka等人(2006，BiochemJ400：493-99)也開發(fā)在SEQIDNO：64-66所顯示的AKAP與PKA結合的肽競爭劑。肽拮抗劑稱為Ht31(SEQIDNO：64)、RIAD(SEQIDNO：65)和PV-38(SEQIDNO：66)。Ht-31肽表現(xiàn)出對PKA的RII同種型的更高親合力，而RIAD和PV-38顯示對RI更高親合力。Ht31DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQIDNO：64)RIADLEQYANQLADQIIKEATE(SEQIDNO：65)PV-38FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQIDNO：66)Hundsrucker等人(2006，BiochemJ396：297-306)開發(fā)又其他AKAP與PKA結合的其他肽競爭劑，其具有對PKA的RII形式的DDD的低至0.4nM的結合常數(shù)。各種AKAP拮抗肽的序列提供在Hundsrucker等人的表1中，將其轉載于以下表3中。AKAPIS展示合成RII亞單位-結合肽。所有其他肽均由指定AKAP的RII-結合結構域衍生。表3.AKAP肽序列肽序列AKAPISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)AKAPIS-PQIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQIDNO：67)Ht31KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQIDNO：68)Ht31-PKGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQIDNO：69)AKAP7δ-wt-pepPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：70)AKAP7δ-L304T-pepPEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：71)AKAP7δ-L308D-pepPEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：72)AKAP7δ-P-pepPEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQIDNO：73)AKAP7δ-PP-pepPEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQIDNO：74)AKAP7δ-L314E-pepPEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQIDNO：75)AKAP1-pepEEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQIDNO：76)AKAP2-pepLVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQIDNO：77)AKAP5-pepQYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQIDNO：78)AKAP9-pepLEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQIDNO：79)AKAP10-pepNTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQIDNO：80)AKAP11-pepVNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQIDNO：81)AKAP12-pepNGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQIDNO：82)AKAP14-pepTQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA(SEQIDNO：83)Rab32-pepETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQIDNO：84)參照AKAPIS序列(SEQIDNO：3)通過標記下劃線來標示在不同AKAP蛋白的AD結構域之間高度保守的殘基。除了添加C-末端丙氨酸殘基之外，殘基與Alto等人(2003)觀察到的相同。(參見Hundsrucker等人(2006)的圖4，其以引用方式并入本文。)對RIIDDD序列具有特別高親合力的肽拮抗劑的序列是AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep中那些。AKAP-ISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)Carr等人(2001，JBiolChem276：17332-38)檢查在來自人和非人蛋白的不同AKAP-結合DDD序列之間序列同源性的程度以及識別在DDD序列中殘基，其在不同DDD部分中表現(xiàn)為最高保守。通過參照SEQIDNO：1的人PKARIIαDDD序列標記下劃線來如下標示這些。通過斜體字進一步標示特別保守的殘基。殘基與通過Kinderman等人(2006)表明的對與AKAP蛋白的結合重要的那些重疊，但不相同。熟練技術人員意識到，在設計DDD的序列變體中，最優(yōu)選避免改變最保守的殘基(斜體字表示)，并且也優(yōu)選避免改變保守的殘基(標記下劃線)，對于既未標記下劃線也未斜體表示的殘基可考慮保守氨基酸取代?；贑arr等人(2001)的數(shù)據(jù)，對DDD1(SEQIDNO：1)序列的保守氨基酸取代的修飾集合顯示在表4中。即使使用取代序列的該減少集合，仍有超過65,000種在未過度實驗下通過熟練技術人員可制備、測試和使用的可能的可選的DDD部分序列。熟練技術人員可容易得到如表1和表2以上所公開的這些可選的DDD氨基酸序列。表4.在DDD1(SEQIDNO：1)中的保守氨基酸取代。如SEQIDNO：92所公開的共有序列。熟練技術人員意識到，使用在領域中標準的技術和僅常規(guī)實驗，可利用在DDD或AD氨基酸序列中這些和其他氨基酸取代以制備在AD或DDD部分的種類內(nèi)可選的類別。氨基酸取代在可選的實施方案中，所公開的方法和組合物可涉及具有一種或多種經(jīng)取代的氨基酸殘基的蛋白或肽的制備和用途。例如，可如上所討論修飾用于制備DNL構建體的DDD和/或AD序列。熟練技術人員意識到，通常，氨基酸取代通常涵蓋使用相對類似性質的另一氨基酸取代氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各種氨基酸的性質以及氨基酸取代對蛋白結構和功能的作用是本領域大量研究和知識的主題。例如，可考慮氨基酸的親水指數(shù)(Kyte&Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相關親水特性作用于所得蛋白的二級結構，其反過來定義蛋白與其他分子的相互作用?；谄涫杷院碗姾商卣饕呀?jīng)指定各氨基酸的親水指數(shù)(Kyte&Doolittle，1982)，這些為：異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸鹽(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)以及精氨酸(-4.5)。在進行保守型取代中，優(yōu)選使用親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸；更優(yōu)選±1內(nèi)；并且甚至更優(yōu)選±0.5內(nèi)。氨基酸取代也可考慮到氨基酸殘基的親水性(例如，美國專利No.4,554,101)。已經(jīng)指定氨基酸殘基的親水性值：精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0)、谷氨酸鹽(+3.0)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5.+-.1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。優(yōu)選使用類似親水性的其他氨基酸來取代氨基酸。其他考慮包括氨基酸側鏈的尺寸。例如，通常并不優(yōu)選使用諸如甘氨酸或絲氨酸的緊湊側鏈、使用諸如色氨酸或酪氨酸的龐大側鏈來取代氨基酸。也考慮各種氨基酸殘基對蛋白二級結構的作用。通過經(jīng)驗研究，已經(jīng)測定不同氨基酸殘基對蛋白結構域采用α-螺旋、β-折疊或反轉二級結構的趨向的作用，并且這在本領域為已知的(參見，例如，Chou&Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)?；谶@些考慮和廣泛經(jīng)驗研究，已經(jīng)構建保守氨基酸取代的表格，并且在本領域為已知。例如：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸鹽和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸?？蛇x地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)Val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。對氨基酸取代的其他考慮包括殘基是否位于蛋白的內(nèi)部或者是否暴露于溶劑中。對于內(nèi)部殘基，保守型取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(參見，例如，在rockefeller.edu處的PROWL網(wǎng)站。)對于暴露殘基的溶劑，保守型取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同前)已經(jīng)構建各種矩陣以輔助選擇氨基酸取代，例如PAM250評分矩陣、Dayhoff矩陣、Grantham矩陣、McLaclan矩陣、Doolittle矩陣、Henikoff矩陣、Miyata矩陣、Fitch矩陣、Jones矩陣、Rao矩陣、Levin矩陣和Risler矩陣(同上)。在測定氨基酸取代中，人們也可考慮分子間或分子內(nèi)鍵的存在，例如在帶正電荷的殘基(例如，His、Arg、Lys)以及帶負電荷殘基(例如，Asp、Glu)之間形成離子鍵(鹽橋)或者在相鄰的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。在編碼的蛋白序列中使用任何其他氨基酸取代任意氨基酸的方法是眾所周知的，并且為熟練技術人員的常規(guī)實驗事項，例如通過定位誘變的技術或者通過合成和組裝編碼氨基酸取代以及剪切至表達載體構建體內(nèi)的寡核苷酸?？贵w各種實施方案可涉及結合HIV的一種或多種抗原或者表位的抗體和/或抗體片段。在優(yōu)選的實施方案，抗原或表位是暴露于諸如HIV包膜蛋白的HIV-感染的細胞的表面上?？蛇x地，抗原或表位可以為展示在HIV-感染的細胞的表面上的一種。制備和使用各種基于抗體的構建體和片段的技術是本領域眾所周知的。制備和特征化抗體的方法也是本領域眾所周知的(參見，例如，Harlowe和Lane，1988，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory)。使用的抗體也可由大量已知來源中市售。例如，大量分泌抗體的雜交瘤系獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC，Manassas，VA)。單克隆抗體盡管優(yōu)選的實施方案可涉及P4/D10抗體的使用，但可獲得、制備和/或使用其他抗-HIV抗體。已經(jīng)報道針對HIV的各種抗體，并且在某些實施方案中，可利用任何這些已知抗-HIV抗體。例如，4E10(Rosa等人，Immunity2：163-73，2005)；2F5(Bryson等人，ProteinandPeptideLetters；8：413-18，2001)；3D6(Ruker等人，Ann.NYAcad.Sci.646：212-19，1991)；C37(Cao等人，DNAandCellBiology，12：836-41，2004)；1ACY，1F58，1GGGC(Berry等人，Proteins，45：281-82，2001)；2G12(Armbruster等人，J.Antimicrob.Chemother.54：915-20，2004)，其各自以引用方式并入本文。在可選的實施方案中，通過使用諸如在美國專利4,196,265中示例的那些的眾所周知的技術可容易地制備單克隆抗體。通常，該技術包括使用選擇的免疫原組合物來免疫合適的動物。優(yōu)選諸如小鼠和大鼠的嚙齒類的細胞。更優(yōu)選小鼠，最優(yōu)選BALB/c小鼠，這是由于其最常使用，并且通常給予穩(wěn)定融合的更高百分比。在免疫之后，選擇可能產(chǎn)生抗體的體細胞，具體而言B-淋巴細胞(B-細胞)用于MAb生成方案中。這些細胞可由活檢的脾臟、扁桃體或淋巴結或者由周圍血液樣品中獲得。通常，使一組動物免疫，并且取出具有最高抗體滴度的動物的脾臟，并通過注射器使脾臟均勻來獲得脾臟淋巴細胞。通常，來自經(jīng)免疫的小鼠的脾臟含有約5x107至2x108個淋巴細胞。然后使來自經(jīng)免疫的動物的產(chǎn)生抗體的B-淋巴細胞與永生骨髓瘤細胞的細胞(通常與經(jīng)免疫的動物為相同種類之一)融合。適合在產(chǎn)生雜交瘤的融合工序中使用的骨髓瘤細胞系優(yōu)選為不產(chǎn)生抗體，具有高融合效率，以及導致不能在僅支持所需融合的細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長的酶缺陷。如本領域技術人員所已知，可使用大量骨髓瘤細胞中任一種。例如，在經(jīng)免疫的動物為小鼠時，人們可使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；對于大鼠，人們可使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部可用于與細胞融合相關。生成產(chǎn)生抗體的脾臟或淋巴結細胞和骨髓瘤細胞的雜交物的方法通常包括在促進細胞膜的融合的一種或多種試劑(化學或電)的存在下使體細胞與骨髓瘤細胞以2∶1比率混合，但可分別使用約20∶1至約1∶1的比率。已描述使用仙臺病毒(Sendaivirus)以及使用諸如37％(v/v)PEG的聚乙二醇(PEG)的那些的融合方法。電場誘導融合方法的使用也是合適的。融合工序通常在約1x10-6至1x10-8的低頻率下產(chǎn)生活雜交物。然而，這并未導致問題，因為通過在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，活的、融合的雜交物由親本、未融合的細胞(特別是通常繼續(xù)不明確分化的未融合骨髓瘤細胞)分化。選擇性培養(yǎng)基通常為含有阻斷在組織培養(yǎng)基中核苷酸的從頭合成的試劑的一種培養(yǎng)基。示例性試劑為氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。在使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時，使用次黃嘌呤和胸腺嘧啶來補充培養(yǎng)基作為核苷酸的來源(HAT培養(yǎng)基)。在使用重氮絲氨酸處，使用次黃嘌呤來補充培養(yǎng)基。優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT。僅能夠操作核苷酸補救途徑的細胞能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細胞缺乏補救途徑的關鍵酶，例如，次黃嘌呤轉磷酸核糖基酶(HPRT)，因而它們不能存活。B-細胞可操作該途徑，但它們在培養(yǎng)物中具有有限的生存期間，并且通常在約兩周死亡。因此，在選擇性培養(yǎng)基中能存活的細胞僅有由骨髓瘤和B-細胞形成的那些雜交物。該培養(yǎng)提供雜交瘤的種群，由其選擇特異性雜交瘤。通常，通過在微量滴定板中通過單克隆稀釋來培養(yǎng)細胞，隨后測試用于所需反應性的單獨的克隆上清液(在約兩至三周后)來進行雜交瘤的選擇。測定法應當敏感、簡單和快速，例如放射免疫測定法、酶免疫測定法、細胞毒性測定法、噬菌斑測定法、斑點免疫結合測定法等。然后將選擇的雜交瘤連續(xù)稀釋以及克隆至單獨的產(chǎn)生抗體的細胞系內(nèi)，然后該克隆物可被無限增殖以提供MAb?？梢詢苫就緩讲捎眉毎狄杂糜贛Ab產(chǎn)生?？蓪㈦s交瘤的樣品注射(通常至腹膜腔內(nèi))至用于提供初始融合的體細胞和骨髓瘤細胞的類型的組織相容性動物內(nèi)。注射的動物長出分泌通過融合的細胞雜交物產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤。然后可將諸如血清或腹水的動物體液抽出以提供高濃度的MAb。也可將單獨的細胞系體外培養(yǎng)，其中MAb被天然分泌至培養(yǎng)基內(nèi)，由此可容易地獲得高濃度。如果需要，使用過濾、離心和諸如HPLC或親和層析的各種層析方法可將通過各種方式產(chǎn)生的MAb進一步純化?？贵w片段的產(chǎn)生所要求保護的方法和/或組合物的一些實施方案可涉及抗體片段。通過常規(guī)方法通過全部抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化可獲得這些抗體片段。例如，通過使用胃蛋白酶的抗體的酶裂解可產(chǎn)生抗體片段以提供表示為F(ab′)2的5S片段。使用硫醇還原劑以及任選地由二硫鍵裂解所得的巰基的保護基團可進一步裂解該片段以產(chǎn)生3.5SFab′單價片段。可選地，使用胃蛋白酶的酶裂解產(chǎn)生兩個單價Fab片段以及Fc片段。制備抗體片段的示例性方法公開于美國專利No.4,036,945；美國專利No.4,331,647；Nisonoff等人，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等人，1967，METHODSINENZYMOLOGY，422頁(AcademicPress)；以及Coligan等人(編輯)，1991，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，(JohnWiley&Sons)。也可使用諸如分離重鏈的裂解抗體的其他方法以形成單價輕-重鏈片段、片段的進一步裂解或者其他酶、化學或遺傳技術，只要片段結合通過完整抗體識別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包含VH和VL鏈的締合。如Inbar等人，1972，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA，69：2659所述，該締合可以為非共價的?？蛇x地，通過分子間二硫鍵可使可變鏈連接或者通過諸如戊二醛的化學物質可使其交聯(lián)。參見Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。優(yōu)選地，F(xiàn)v片段包含通過肽接頭連接的VH和VL鏈。通過構建包含DNA序列的結構基因來制備這些單鏈抗原結合蛋白(sFv)，該DNA序列編碼通過寡核苷酸接頭序列連接的VH和VL結構域。將結構基因插入表達載體內(nèi)，該表達載體隨后被引入諸如大腸桿菌的宿主細胞內(nèi)。重組宿主細胞合成具有橋接兩個V結構域的接頭肽的單一多肽鏈。制備sFv的方法是本領域眾所周知的。參見Whitlow等人，1991，Methods：ACompaniontoMethodsinEnzymology2：97；Bird等人，1988，Science，242：423；美國專利No.4,946,778；Pack等人，1993，Bio/Technology，11：1271；以及Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。抗體片段的另一形式為單一結構域抗體(dAb)，其有時稱作單鏈抗體。制備單一結構域抗體的技術是本領域眾所周知的(參見，例如，Cossins等人，ProteinExpressionandPurification，2007，51：253-59；Shuntao等人，MolecImmunol2006，43：1912-19；Tanha等人，J.Biol.Chem.2001，276：24774-780)。通過標準免疫技術由諸如駱駝、羊駝或美洲駝可獲得單一結構域抗體。(參見，例如，Muyldermans等人，TIBS26：230-235，2001；Yau等人，JImmunolMethods281：161-75，2003；Maass等人，JImmunolMethods324：13-25，2007)。它們可具有強效抗原結合能力，并且可與難以到達常規(guī)VH-VL對的新型表位相互作用。((Muyldermans等人，2001)。羊駝血清IgG僅含有約50％駱駝科重鏈IgG抗體(HCAb)(Maass等人，2007)。使用諸如TNF-α的已知抗原可免疫羊駝，并且可將結合和中和靶抗原的單一結構域抗體分離(Maass等人，2007)。已經(jīng)識別幾乎擴增所有羊駝抗體編碼序列的PCR引物，并且可將其用于構建單一結構域噬菌體展示文庫，通過本領域眾所周知的標準生物淘選技術可將其用于抗體片段分離(Maass等人，2007)。在某些實施方案中，可改變抗體或者諸如抗體的Fc部分的抗體片段的序列以最佳化它們生理特征，例如在血清中半衰期。在蛋白中取代氨基酸序列的方法是本領域廣泛已知的，例如通過定位誘變(例如Sambrook等人，MolecularCloning，Alaboratorymanual，第2版，1989)。在優(yōu)選的實施方案，改變可包括添加或去除在Fc序列中的一種或多種糖基化位點(例如，美國專利No.6,254,868，其實施例部分以引用方式并入本文)。在其他優(yōu)選的實施方案中，可制備在Fc序列中特異性氨基酸取代(例如，Hornick等人，2000，JNuclMed41：355-62；Hinton等人，2006，JImmunol176：346-56；Petkova等人2006，IntImmunol18：1759-69；美國專利No.7,217,797)。嵌合和人源化抗體嵌合抗體是重組蛋白，其中諸如人抗體的可變區(qū)被諸如包括小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR)的小鼠抗體的可變區(qū)替代。當向受試者施用時，嵌合抗體表現(xiàn)出降低的免疫原性和增加的穩(wěn)定性。構建嵌合抗體的方法是本領域眾所周知的(例如，Leung等人，1994，Hybridoma13：469)。通過轉染來自小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈的小鼠CDR至人抗體的對應可變結構域內(nèi)可使嵌合的單克隆抗體人源化。也使用人FR序列替代在嵌合的單克隆抗體中小鼠構架區(qū)(FR)。為了保存人源化單克隆的穩(wěn)定性和抗原特異性，通過小鼠對應物殘基可替代一種或多種人FR殘基。人源化單克隆抗體可用于受試者的治療性治療。通過CDR序列的選擇的修飾也可增加靶的人源化抗體的親合力(WO0029584A1)。制備人源化單克隆抗體的技術是本領域眾所周知的。(參見，例如，Jones等人，1986，Nature，321：522；Riechmann等人，Nature，1988，332：323；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534；Carter等人，1992，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，89：4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等人，1991，Biotechnology9：266；Singer等人，J.Immun.，1993，150：2844)。其他實施方案可涉及非人靈長類抗體。在Goldenberg等人，WO91/11465(1991)、以及在Losman等人，Int.J.Cancer46：310(1990)中可找到在狒狒中用于產(chǎn)生治療使用的抗體的一般技術。人抗體在另一實施方案中，抗體可以為人單克隆抗體?？捎梢呀?jīng)工程化以產(chǎn)生應答抗原性攻擊的特異性人抗體的轉基因小鼠中獲得這些抗體。在該技術中，將人重和輕鏈基因座的元件引入源于胚胎干細胞系的小鼠菌株，其含有內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞。轉基因小鼠可合成對人抗原特異的人抗體，并可將小鼠用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。由轉基因小鼠獲取人抗體的方法由Green等人，NatureGenet.7：13(1994)；Lonberg等人，Nature368：856(1994)；以及Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述。使用重組途徑或者經(jīng)人免疫球蛋白基因座轉化的轉基因動物來產(chǎn)生完整人抗體的方法是本領域已知的(例如，Mancini等人，2004，NewMicrobiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.HighThroughputScreen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50，其各自以引用方式并入本文)。據(jù)預計，這些完整人抗體表現(xiàn)出比嵌合或人源化抗體甚至更少的副作用，并且其體內(nèi)基本上用作內(nèi)源性人抗體。在某些實施方案中，所要求保護的方法和工序可利用通過這些技術制備的人抗體。在一種選擇中，噬菌體展示技術可用于生成人抗體(例如，Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40，其以引用方式并入本文)。由正常人或表現(xiàn)出諸如HIV感染或AIDS的特定疾病狀態(tài)的人中生成人抗體。由疾病個體構建人抗體的優(yōu)勢在于可使循環(huán)抗體所有組成部分(repertoire)偏向針對疾病相關抗原的抗體。在該方法的一個非限制性例子中，Dantas-Barbosa等人(2005)構建來自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。通常，全部RNA由循環(huán)血液淋巴細胞獲得(同前)。由μ和鏈抗體所有組成部分克隆重組Fab，并將其插入噬菌體展示文庫內(nèi)(同前)。將RNA轉變?yōu)閏DNA，并使用針對重和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物將其用于制備FabcDNA文庫(Marks等人，1991，JMol.Biol.222：581-97，其以引用方式并入本文)。根據(jù)Andris-Widhopf等人(2000，在：PhageDisplayLaboratoryManual；Barbas等人(編輯)，第一版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NYpp.9.1至9.22，其以引用方式并入本文)來進行文庫構建。使用限制性核酸內(nèi)切酶來消化最終Fab片段，并將其插入噬菌體基因組以制備噬菌體展示文庫。通過諸如生物淘選的標準噬菌體展示方法可篩選這些文庫。熟練技術人員意識到，該技術僅為示例性的，并且可利用通過噬菌體展示來制備和篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法。在另一選擇中，使用如上所討論的標準免疫方案，可將經(jīng)遺傳工程化以產(chǎn)生人抗體的轉基因動物用于生成針對基本上任何免疫原性靶的抗體。這些系統(tǒng)的非限制性例子為Abgenix(Fremont，CA)的(例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods231：11-23)。在和類似動物中，小鼠抗體基因失活，并被功能性人抗體基因替代，而小鼠免疫系統(tǒng)的剩余部分仍然完整。使用包含一部分人IgH和Igκ基因座(包括大部分可變區(qū)序列以及附加基因和調(diào)節(jié)序列)的種系配置的YAC(酵母人工染色體)來轉化可將人可變區(qū)全部組成部分用于生成產(chǎn)生抗體的B細胞，通過已知技術可將其處理至雜交瘤內(nèi)。使用靶抗原免疫的通過正常免疫應答產(chǎn)生人抗體，通過如上所討論的標準技術可將其收獲和/或制備。可獲得各種菌株，其分別能夠產(chǎn)生不同種類的抗體。通過化學交聯(lián)或者其他已知方法可使這些人抗體偶聯(lián)其他分子。已經(jīng)顯示，轉基因產(chǎn)生的人抗體具有治療潛能，同時保留正常人抗體的藥物代謝動力學性質(Green等人，1999)。熟練技術人員意識到，所要求保護的組合物和方法并不限于使用系統(tǒng)，而是可利用經(jīng)遺傳工程化以產(chǎn)生人抗體的任何轉基因動物。HIV中和抗體在某些實施方案中，優(yōu)選能夠抑制HIV的感染性的中和抗體或其片段。本領域已知各種HIV中和抗體，并可使用任意這些已知抗體或其片段，包括但不限于P4/D10、2G12(例如，Joos等人，AntimicrobAgentsChemother2006，50：1773-79)、4E10(Joos等人，2006)、2F5(Joos等人，2006)、b12(例如，Wu等人，JVirol2006，80：2585)、X5(Moulard等人，ProcNatlAcadSci2002，99：6913-18)或其任意組合。在使用多特異性抗體或片段時，熟練技術人員意識到，可使結合相同或不同HIV表位的多種抗體或片段聯(lián)合。盡管優(yōu)選針對HIV包膜蛋白(gp120)和/或gp41的抗體，但熟練技術人員意識到，可利用其他HIV靶抗原以開發(fā)靶向HIV-感染的細胞的抗體或其片段。在一些情況下，可利用結合聯(lián)合T-細胞抗原(例如，CD4、CCR5和/或CXCR4)的一種或多種HIV抗原的抗體或片段。融合蛋白各種實施方案可涉及融合蛋白。這些分子通常具有所有或者大部分在N-或C-末端處連接至所有或一部分第二多肽或蛋白的肽。例如，融合可利用來自其他種類的前導序列以使可在異源性宿主中重組表達蛋白。另一可使用融合包括附接諸如抗體或片段的免疫活性結構域至諸如肽或蛋白毒素或酶的治療劑。融合的又一可使用形式可包括附接用于純化諸如FLAG表位所使用的部分(Prickett等人，1989，Biotechniques7：580-589；Castrucci等人，1992，JVirol66：4647-4653)。生成融合蛋白的方法是本領域技術人員眾所周知的。例如，通過使用功能性交聯(lián)劑的化學附接；通過完整融合蛋白的從頭合成；或者通過使編碼第一蛋白或肽的DNA序列附接編碼第二蛋白或肽的DNA序列，隨后為表達完整融合蛋白可制備這些蛋白。免疫綴合物在各個實施方案中，可將DNL復合物的抗-HIV抗體、抗體片段或其他靶向分子直接綴合至一種或多種治療劑。示例性治療劑可選自細胞毒素劑、藥物、毒素、放射性核素、酶、激素、細胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)劑。使用的治療劑可包括以下一種或多種：aplidin、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、博來霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、薯司他丁-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜樹堿(camptothecin)、10-羥基喜樹堿、亞硝脲氮芥(carmustine)、西樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、頁氯氨鉑(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、SN-38、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、道諾霉素葡糖苷酸(daunomycinglucuronide)、道諾紅菌素(daunorubicin)、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicine)(2P-DOX)、氰基-嗎啉代阿霉素(cyano-morpholinodoxorubicin)、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸(epirubicinglucuronide)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(floxuridine)(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、L-天冬酰胺酶、甲酰四氫葉酸、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、絲裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯、丙卡巴肼(procarbazine)、噴司他丁(pentostatin)、PSI-341、司莫司汀(semustine)、鏈佐星(streptozocin)、紫杉烷類、硫鳥嘌呤(thioguanine)、硫涕巴(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、烏拉莫司汀(uracilmustard)、velcade、長春花堿、長春瑞濱(vinorelbine)、長春新堿、蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、反義寡核苷酸、干擾RNA或其組合。通過諸如至在它們側鏈中含有胺、羧基、硫醇或羥基的氨基酸殘基的共價附接可綴合。各種常規(guī)接頭可用于該目的，例如，二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、馬來酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等。試劑與HIV靶向分子的綴合優(yōu)選與未經(jīng)修飾的結構相比未顯著影響結合活性或特異性。此外，可使細胞毒性和/或病毒抑制劑首先與聚合載體偶聯(lián)，然后使其與HIV靶向分子綴合。對于該方法，參見Ryser等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3867-3870，1978，U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，其以引用方式并入本文。通過用于連接抗體與脂質、糖類、蛋白、放射性核素或其他原子和分子的已知方法可制備本文所述的綴合物。例如，可使本文所述的HIV靶向分子連接一種或多種本文所述的載體(例如，脂質、聚合物、脂質體、膠束或納米粒子)以形成綴合物，然后可將其共價、非共價或者另外并入治療或診斷劑?？蛇x地，可使本文所述的任何HIV靶向分子與本文所述的一種或多種治療或診斷劑直接綴合。例如，可使用131I放射性標記HIV靶向分子，并使其與脂質綴合，使得所得綴合物可形成脂質體。脂質體可并入一種或多種治療(例如，諸如FUdR-dO的藥物)或診斷劑。脂質體和膠束的形成在本領域為已知的。參見，例如，Wrobel和Collins，BiochimicaetBiophysicaActa(1995)，1235：296-304；Lundberg等人，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51：1099-1105；Lundberg等人，Int.J.Pharm.(2000)，205：101-108；Lundberg，J.Pharm.Sci.(1994)，83：72-75；Xu等人，Molec.CancerTher.(2002)，1：337-346；Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，U.S.A.(2003)，100：6039-6044；U.S.5,565,215；U.S.6,379,698；以及U.S.2003/0082154。也已經(jīng)描述由聚合物、二氧化硅或金屬形成的納米粒子或納米囊，其可用于藥物遞送或顯像。參見，例如，West等人，ApplicationsofNanotechnologytoBiotechnology(2000)，11：215-217；U.S.5,620,708；U.S.5,702,727；以及U.S.6,530,944。已經(jīng)描述用于形成治療或診斷劑的靶向載體的抗體或結合分子與脂質體的綴合。參見，例如，Bendas，Biodrugs(2001)，15：215-224；Xu等人，Mol.CancerTher(2002)，1：337-346；Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A(2003)，100：6039-6044；Bally，等人，J.LiposomeRes.(1998)，8：299-335；Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109：73-81；Lundberg，J.Pharm.Pharmacol.(1997)，49：16-21；Lundberg，Anti-cancerDrugDesign(1998)，13：453-461。也參見1999年6月9日提交的U.S.6,306,393、U.S.序列No.10/350,096、U.S.序列No.09/590,284和U.S.序列No.60/138,284。所有這些參考文獻均以引用方式并入本文。可將多種診斷和治療劑有利地用于形成HIV靶向分子的綴合物，或者可使它們與結合在HIV靶向分子上識別位置的半抗原連接。診斷劑可包括放射性同位素、在MRI中使用的增強劑或者用于超聲成像的造影劑，以及熒光化合物。如它們與蛋白或肽的附接方法，許多合適的顯影劑是本領域已知的(參見，例如，美國專利5,021,236和4,472,509，其均以引用方式并入本文)。某些附接方法包括使用金屬螯合絡合物(采用例如，諸如DTPA的有機螯合劑)附接蛋白或肽(美國專利4,472,509)。為了使HIV靶向分子荷載放射性金屬或順磁離子，可能必須首先使它與載體反應，用于結合放射性金屬或順磁離子的螯合基團的多個拷貝已經(jīng)與該載體附接。這些載體可以為聚賴氨酸、多糖或者具有可結合螯合基團的衍生的或可衍生的聚合材料，例如，已知用于該目的乙二胺四醋酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等。使用以最小化聚集和免疫反應性損耗的方式的標準化學方法使含有螯合物的載體與HIV靶向分子偶聯(lián)。可應用制備這些綴合物的其他、較不常見方法和試劑公開在U.S.4,824,659中，其以引用方式整體并入本文。特別有用的金屬螯合物組合包括以60至4,000keV的一般能量范圍的與診斷性同位素使用的2-芐基-DTPA和它的一甲基和環(huán)己基類似物。一些可使用的診斷性核素可包括：18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。當連同本文所述HIV靶向分子和載體使用時，與諸如錳、鐵和釓的非放射性金屬絡合的相同螯合物可用于MRI。將諸如NOTA、DOTA和TETA的大環(huán)的螯合物與各種金屬和放射線金屬使用，最特別地分別使用鎵、釔和銅的放射性核素。通過使環(huán)尺寸適合目標金屬可非常穩(wěn)定地制備這些金屬螯合復合物?？墒褂弥T如用于絡合223Ra的大環(huán)聚醚的其他環(huán)類型的螯合物。治療劑包括諸如化療藥，例如長春花生物堿、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、表鬼臼毒素、紫杉烷類、抗代謝物、烷化劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂物質、抗血管生成劑和促凋亡劑，特別是阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉酚(taxol)、CPT-11、camptothecan以及來自這些和其他種類的細胞毒素劑的其他物質。其他細胞毒素劑包括氮芥類、烷基磺酸鹽、亞硝基脲類、三氮烯類、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡合物等。合適的細胞毒素劑描述在REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，第19版(MackPublishingCo.1995)，以及在GOODMANANDGILMAN′STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，第7版(MacMillanPublishingCo.1985)，以及這些出版物的修訂版中。諸如實驗藥物的其他合適的細胞毒素劑是本領域技術人員已知的，并且使用本領域已知的方法可使其與本文所述的HIV靶向分子綴合。另一類治療劑由發(fā)射α-粒子(例如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、β-粒子(例如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、111Ag、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)或者俄歇電子(Augerelectron)(例如111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)的放射性核素組成。使用如上所述用于診斷劑的方法可使用一種或多種以上放射性核素來標記HIV靶向分子。在某些實施方案中，使用的治療劑可包含一種或多種聚集體抑制劑。聚集體是大的細胞內(nèi)復合物，據(jù)認為，其由應答錯折疊蛋白而形成(參見，例如，Heath等人，J.CellBiol.153：449-55，2001；Johnstone等人，J.CellBiol.143：1883-98，1998；Wileman，Science312：875-78，2006)。最近，據(jù)表明，聚集體可在病毒顆粒的組裝中起著作用(Heath等人，2001；Wileman，2006)。聚集體抑制劑因而可用于阻斷或抑制新的感染性病毒顆粒由經(jīng)HIV或其他病毒感染的細胞中形成。各種聚集體抑制劑為已知的，例如ALLN、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙堿(colchicine)和長春花堿(Johnston等人，1998)、其他微管抑制劑(Gerdes和Katsanis，Hum.Molec.Genet.14：R291-300，2005)、硼替佐米()(Catley等人，Blood108：3441-49，2006)、tubacin、組蛋白脫乙?；敢种苿?Corcoran等人，Curr.Biol.14：488-92，2004)，并且可使用任何這些已知聚集體抑制劑。在各個實施方案中，可使一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑與抗-HIV抗體或片段綴合?？蛇x地，如下所述，可使免疫調(diào)節(jié)劑附接AD或DDD部分以用于并入DNL復合物內(nèi)。如本文所使用，術語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細胞因子、干細胞生長因子、淋巴細胞毒素和諸如白介素的血細胞生成因子、集落刺激因子、干擾素(例如，干擾素-α、-β和-γ)以及稱為“S1因子”的干細胞生長因子。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的例子包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α等。術語“細胞因子”是通過一種細胞群體釋放的蛋白或肽的通用術語，其作為細胞內(nèi)介體作用于另一細胞。如本文所廣泛使用，細胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)多肽激素。生長激素涵蓋在細胞因子內(nèi)，例如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；弛激素原(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成激素(LH)；肝臟生長因子；前列腺素；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳素；OB蛋白；腫瘤壞死因子-α和-β；繆勒氏管抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白(integrin)；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，例如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素例如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配體或FLT-3、血管增生抑制素(angiostatin)、血小板反應蛋白、內(nèi)皮他丁(endostatin)、腫瘤壞死因子和LT。如本文所使用，術語細胞因子包括來自天然來源或者來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等同物。趨化因子通常用作化學引誘物以募集免疫效應細胞至趨化因子表達的位點?？梢杂欣芈?lián)合諸如細胞因子基因表達特定趨化因子基因，從而增強其他免疫系統(tǒng)組分至治療位點的募集。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。熟練技術人員意識到，某些細胞因子也已知具有化學引誘物作用，并且也可歸類于術語趨化因子下。類似地，術語免疫調(diào)節(jié)劑和細胞因子在它們各自成員上重疊。含有可檢測標記(例如，熒光分子)或者抑制病毒和/或細胞毒素劑(例如，放射性碘)的合適的肽可以共價、非共價或者另外與HIV靶向分子締合。例如，通過合并光活性試劑或染料至HIV靶向分子上可獲得治療可使用的綴合物。通過導向合適的光線至病變，對可見光敏感的諸如熒光染料的熒光組合物和其他色原或者諸如卟啉的染料用于檢測和治療病變。在治療中，這稱為光輻射、光線療法或光動力學治療。參見Jori等人(編輯)，PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985)；vandenBergh，Chem.Britain(1986)，22：430。而且，使單克隆抗體與光活化染料偶聯(lián)以完成光線療法。參見Mew等人，J.Immunol.(1983)，130：1473；同前，CancerRes.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；同前，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，LasersSurg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。HIV融合抑制劑HIV融合抑制劑描述在PCT專利申請公開No.WO2007045463中，其全部文本以引用方式并入本文。通常，通過人免疫缺陷病毒(HIV)對細胞的感染受到細胞膜被感染和病毒膜融合的過程影響。病毒包膜糖蛋白復合物(gp120/gp41)與位于待感染的細胞膜上的細胞表面受體相互作用。gp120與聯(lián)合諸如CCR-5或CXCR-4的共受體(co-receptor)的諸如CD4受體的結合導致gp120/gp41復合物的構象改變。由于該構象改變，gp41蛋白能夠插入靶細胞膜內(nèi)。該插入是膜融合過程的開始。由于天然存在的多態(tài)性，已知在不同HIV菌株之間gp41蛋白的氨基酸序列不同。但相同結構域構造可被識別，融合信號、兩個七價重復結構域(HR1、HR2)和跨膜結構域。融合(或基因融合(fusogenic))結構域參與細胞膜的插入和崩解。由gp41的HR1或HR2結構域推斷的具有氨基酸序列的肽是攝取HIV至細胞內(nèi)的有效體外和體內(nèi)抑制劑(參見，例如美國專利No.5,464,933、5,656,480、6,258,782、6,348,568、6,656,906)。例如，T20、HR2肽和T651(美國專利No.6,479,055)是強效HIV感染的抑制劑。通過例如氨基酸取代或化學交聯(lián)嘗試增強由HR2衍生的肽的功效(Sia等人，2002，PNASUSA99：14664-14669；Otaka等人，2002，Angew.Chem.Int.41：2937-2940)。在美國專利No.5,464,933、5,656,480、6,013,263、6,017,536、6,020,459、6,093,794、6,060,065、6,258,782、6,348,568、6,479,055、6,656,906；和PCT專利申請公開No.WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69902和WO2005/067960中找到示例性抗-基因融合肽，其實施例部分各自以引用方式并入本文。熟練技術人員意識到，利用以下實施例所述的技術，可將任何這些HIV融合抑制劑并入主題DNL復合物內(nèi)。干擾RNA在某些實施方案中，可利用DNL復合物以遞送siRNA或干擾RNA種類?？墒箂iRNA、干擾RNA或治療基因附接并入DNL構建體內(nèi)的載體部分。已經(jīng)報道siRNA的各種載體部分，并可使用任何已知載體。載體的非限制性例子包括魚精蛋白(Rossi，2005，NatBiotech23：682-84；Song等人，2005，NatBiotech23：709-17)；樹狀高分子，例如PAMAM樹狀高分子(Pan等人，2007，CancerRes.67：8156-8163)；聚氮丙啶(Schiffelers等人，2004，NuclAcidsRes32：e149)；聚丙烯亞胺(Taratula等人，2009，JControlRelease140：284-93)；聚賴氨酸(Inoue等人，2008，JControlRelease126：59-66)；含有組氨酸可還原聚陽離子(Stevenson等人，2008，JControlRelease130：46-56)；組蛋白H1蛋白(Haberland等人，2009，MolBiolRep26：1083-93)；陽離子梳型共聚物(Sato等人，2007，JControlRelease122：209-16)；聚合物膠束(美國專利申請公開No.20100121043)；以及殼聚糖-硫胺素焦磷酸酯(Rojanarata等人，2008，PharmRes25：2807-14)。熟練技術人員意識到，通常，聚陽離子蛋白或聚合物用作siRNA載體。熟練技術人員進一步意識到，siRNA載體也可用于攜帶其他寡核苷酸或核酸種類，例如反義寡核苷酸或短DNA基因。許多siRNA種類由已知來源市售，例如Sigma-Aldrich(StLouis，MO)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)、Ambion(Austin，TX)、Dharmacon(ThermoScientific，Lafayette，CO)、Promega(Madison，WI)、MirusBio(Madison，WI)和Qiagen(Valencia，CA)以及許多其他來源。siRNA種類的其他公開可獲得來源包括在斯德哥爾摩生物信息中心(StockholmBioinformaticsCentre)的siRNAdb數(shù)據(jù)庫、MIT/ICBPsiRNA數(shù)據(jù)庫、Broad研究所的RNAiConsortiumshRNA文庫以及NCBI的探針數(shù)據(jù)庫。例如，在NCBIProbe數(shù)據(jù)庫中有30,852種siRNA種類。熟練技術人員意識到，對于任何目標基因，已經(jīng)設計siRNA種類，或者人們可容易地使用公開市售軟件工具設計。已經(jīng)報道其他已知siRNA種類，例如，IKK-γ(美國專利7,022,828)；VEGF、Fit-1和Flk-1/KDR(美國專利7,148,342)；Bcl2和EGFR(美國專利7,541,453)；CDC20(美國專利7,550,572)；轉導素(β)-樣3(美國專利7,576,196)；KRAS(美國專利7,576,197)；碳酸酐酶II(美國專利7,579,457)；補體組分3(美國專利7,582,746)；白介素-1受體-相關激酶4(IRAK4)(美國專利7,592,443)；存活素(美國專利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美國專利7,632,938)；MET原癌基因(proto-oncogene)(美國專利7,632,939)；IGF-1R(美國專利7,638,621)；ICAM1(美國專利7,642,349)；補體因子B(美國專利7,696,344)；p53(7,781,575)；以及載脂蛋白B(7,795,421)。使用主題DNL復合物可遞送這些已知siRNA種類。包含豹蛙酶(Rap)的免疫毒素核糖核酸酶，尤其是Rap(Lee，ExpOpinBiolTher2008；8：813-27)和它的偏堿性變體、amphinase(Ardelt等人，CurrPharmBiotechnol2008：9：215-25)是強效細胞毒素劑(Lee和Raines，Biodrugs2008；22：53-8)。Rap是開始由美洲豹蛙(Ranapipiens)的卵母細胞分離的104個氨基酸的單鏈核糖核酸酶。Rap表現(xiàn)出對各種細胞系體外抑制細胞和細胞毒性作用，以及體內(nèi)抗腫瘤活性。兩棲動物核糖核酸酶通過受體介導的胞吞進入細胞，并且一旦內(nèi)化至細胞溶質內(nèi)，則選擇性降解tRNA，導致對蛋白合成的抑制和誘導細胞凋亡。在沒有不恰當免疫應答下可將Rap向患者重復施用，其可逆腎毒性報道為劑量限制性(Mikulski等人，JClinOncol2002；20：274-81；IntJOncol1993；3：57-64)。如首先由LL2-豹蛙酶(Newton等人，Blood2001；97：528-35)，包含Rap和鼠抗-CD22單克隆抗體(MAb)的化學綴合物，以及隨后由2L-Rap-hLL1-γ4P，包含Rap和人源化抗-CD74MAb的融合蛋白(Stein等人，Blood2004；104：3705-11)所證實，Rap與靶向抗體或抗體片段的綴合或融合是有前景的增強其效能的途徑。用于生成2L-Rap-hLL1-γ4P的方法使得我們可開發(fā)通常稱為2L-Rap-X的一系列結構類似的免疫毒素，其全部由兩個Rap分子組成，各自通過撓性接頭連接至目標抗體(X)的一條L鏈的N-末端。通過使用稱為Rap(Q)的Rap的非糖基化形式來替代Rap，我們也已經(jīng)生成另一系列的稱為2LRap(Q)-X的相同設計的免疫毒素，該Rap(Q)表示在Asn69處可能糖基化位點改變?yōu)镚in(或者Q，單字母代碼)。對于兩個系列，我們制備IgG作為IgG1(γ1)或IgG4(γ4)，并且為了預防IgG4半分子的形成(Aalberse和Schuurman，Immunology2002；105：9-19)，我們轉化在IgG4的鉸鏈區(qū)(S228)中絲氨酸殘基為脯氨酸(γ4P)。在Rap的N-末端處焦谷氨酸殘基需要RNA酶為完全功能性(Liao等人，NucleicAcidsRes2003；31：5247-55)。熟練技術人員意識到，適合在本發(fā)明中使用的細胞毒性RNA酶部分包括具有天然豹蛙酶結構的多肽及其所有酶活性變體。這些分子有利地具有N-末端焦谷氨酸殘基，其對于RNA酶活性為必要的并且基本上不會被哺乳動物RNA酶抑制劑所抑制。通過克隆和限制合適的序列或者使用聚合酶鏈反應(PCR)的DNA擴增可制備編碼天然細胞毒性RNA酶的核酸。由Ardelt等人，J.Biol.Chem.，256：245(1991)中可獲得美洲豹蛙酶的氨基酸序列，并且通過類似于在hLL2人源化中使用的整體V-基因組裝方法可基因合成編碼天然豹蛙酶的cDNA序列或其保守修飾的變化形式。(Leung等人，Mol.Immunol.，32：1413，1995)。制備細胞毒性RNA酶變體的方法是本領域已知的，并在操作者的技術范圍內(nèi)。如以下實施例中所述，使用DNL技術可制備靶向抗體的Rap綴合物。DNLRap-抗體構建體顯示強效細胞毒性活性，可使其靶向疾病相關的細胞。配制和施用可將DNL構建體進一步配制以獲得包括一種或多種藥學上合適的賦形劑、一種或多種另外的成分或這些的一些組合的組合物。通過已知方法可將這些完成以制備藥學上可使用的劑量，由此將活性成分組合在具有一種或多種藥學上合適的賦形劑的混合物中。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥學上合適的賦形劑的一個例子。其他合適的賦形劑是本領域技術人員眾所周知的。參見，例如，Ansel等人，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，以及Gennaro(編輯)，REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，(MackPublishingCompany1990)，及其修訂版。施用本文所述組合物的一種途徑為胃腸外注射。在胃腸外施用中，將組合物配制在與藥學上可接受賦形劑締合的單位劑量可注射形式中，例如溶液、混懸物或乳劑。這些賦形劑固有無毒以及無治療作用。這些賦形劑的例子為鹽水、林格氏溶液、葡聚糖溶液和漢克斯溶液(Hank′ssolution)。也可使用諸如固定油和油酸乙酯的非水性賦形劑。優(yōu)選的賦形劑是在鹽水中5％葡聚糖。賦形劑可含有微量的添加劑，例如增強等張性和化學穩(wěn)定性的物質，包括緩沖劑和防腐劑。也涵蓋包括口服施用的其他施用方法。通過諸如快速推注注射或連續(xù)輸液可將包含DNL復合物的配制的組合物用于靜脈內(nèi)施用。用于注射的組合物可以單位劑型呈現(xiàn)，例如在安瓿或多次給藥容器中，其具有添加的防腐劑。組合物也可采用在油性或水性媒介物中混懸物、溶液或乳劑的形式，并可含有諸如混懸、穩(wěn)定和/或分散劑的配制試劑?？蛇x地，在使用之前，組合物可以在與諸如無菌無熱原水的合適媒介物配制的粉末形式中。可以溶液形式施用組合物。溶液的pH應當為pH5至9.5，優(yōu)選pH6.5至7.5。其配制物應當在具有諸如磷酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷-HCl或醋酸鹽等的合適藥學上可接受的緩沖劑的溶液中。緩沖劑濃度應當在1至100mM的范圍內(nèi)。配制的溶液也可含有50至150mM的濃度的諸如氯化鈉或氯化鉀的鹽。也可包括諸如甘油、白蛋白、球蛋白、去污劑、明膠、魚精蛋白或者魚精蛋白的鹽的有效量的穩(wěn)定劑。如果使用抗-HIV抗體的人源化形式，則通常每兩至三天或者每周一次進行配制的組合物的系統(tǒng)施用。常見施用為肌肉注射或者靜脈內(nèi)輸液?？善は禄蛲ㄟ^其他胃腸外途徑來施用組合物。而且，通過連續(xù)輸液或者通過單次或多次快速推注可施用?？蓪⒂糜诳贵w或免疫綴合物的方法應用于本文所述的組合物。通常，人施用免疫綴合物、融合蛋白或裸抗體的劑量取決于多種因素，例如患者的年齡、體重、高度、性別、一般健康條件以及既往病史。通常，盡管如果條件要求也可施用更低或更高劑量，但提供接受者活性成分的理想劑量為約1mg/kg至20mg/kg的范圍作為單一靜脈內(nèi)輸液量。如果需要，可重復該劑量，例如，4-10周內(nèi)每周一次，優(yōu)選8周內(nèi)每周一次，并且更優(yōu)選為4周內(nèi)每周一次。也可以更低頻率給藥，例如數(shù)月內(nèi)每隔一周一次。只要適當調(diào)節(jié)劑量和時間表，可通過各種胃腸外途徑來給予劑量。用于控制免疫綴合物或抗體的持續(xù)作用時間的藥物方法可應用于本文所述的配制的組合物。通過使用諸如聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)的基質和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酐共聚物的基質的用于復合或吸收免疫綴合物或裸抗體的生物相容性聚合物可得到控制釋放制劑。參見Sherwood等人，Bio/Technology(1992)，10：1446。從這些基質的釋放速率取決于DNL復合物的分子量、在基質內(nèi)DNL復合物的量以及分散顆粒的尺寸。參見Saltzman等人，Biophys.J(1989)，55：163；Sherwood等人，見上。其他固體劑型描述在Ansel等人，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，和Gennaro(編輯)，REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(MackPublishingCompany1990)，及其修訂版。連接放射性核素的DNL復合物可有效地治療。在已經(jīng)測定出DNL復合物位于受試者中一個或多個感染位置處之后，注射更高劑量的標記的組合物，通常為131I的每次給藥的20mCi至150mCi；90Y的每次給藥的5mCi至30mCi；或者186Re的每次給藥的5mCi至20mCi，其各自基于70kg患者體重?？伸o脈內(nèi)、動脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、鞘內(nèi)或腔內(nèi)(即，胃腸外)注射，并且可重復進行。對于一些療法，可有利地多次、分開劑量施用，這因而提供較高的毒性劑量，而通常不會導致對正常組織的輻射成比例增加。試劑盒一些實施方案可涉及實施所要求保護的方法的試劑盒。試劑盒可包括DNL構建體?？蓪⒃噭┖薪M件包裝在含有適合重構的組合物的無菌、凍干配制物的諸如小瓶的容器內(nèi)。試劑盒也可含有適合于重構和/或稀釋其他試劑的一種或多種緩沖劑。可使用的其他容器包括但不限于：小袋、盤子、盒子、管子等?？蓪⒃噭┖薪M件無菌包裝和保存在容器內(nèi)?？砂ǖ牧硗獾慕M件是針對使用試劑盒人員的說明書。實施例涵蓋以下例子以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應當理解，在隨后實施例中公開的技術代表在本發(fā)明的實施中發(fā)現(xiàn)運用良好的技術，因而可認為其構成它實施的優(yōu)選方式。然而，鑒于本公開，本領域技術人員理解，在未違背本發(fā)明的精神和范圍下，可對所公開的具體實施方案進行許多改變，并仍獲得同樣或類似結果。實施例1.使用綴合的抗-HIV抗體對HIV體外和體內(nèi)感染的抑制概述使針對HIV的包膜抗原的鼠單克隆抗體(MAb)(P4/D10)與常見抗癌藥物、阿霉素綴合，并體外和體內(nèi)針對感染性病毒和受感染的細胞測試。使用游離病毒(中和)或HIV-感染的細胞(抑制)來孵育P4/D10抗體，并通過p24捕獲酶聯(lián)免疫吸附測定法來測定所得感染。在HIV-1/MuLV小鼠攻擊模型中，測定綴合物抑制體內(nèi)感染的能力。阿霉素-綴合的P4/D10中和HIV-1IIIB以及消除在體外受感染的Jurkat細胞中細胞內(nèi)散布和HIV復制。它也以比游離抗體所需低八倍的濃度保護小鼠免受HIV-1IIIB/MuLV攻擊，而游離藥物或無關綴合物對照未觀察到作用。這些結果表明：通過P4/D10抗體使阿霉素集中至HIV-感染的細胞，顯著(p＝0.0001)有助于HIV消除。在該研究中，我們使阿霉素、具有已知藥理、毒理和在患者中抗腫瘤活性的抗癌蒽環(huán)霉素與針對HIV-1外包膜gp120(第三可變環(huán)區(qū))開發(fā)的中和和ADCC介導單克隆抗體(MAb)綴合。體外測試與阿霉素綴合的P4/D10抗體通過去除來自腹膜內(nèi)腔的受同系基因細胞感染的HIV-1/MuLV(鼠白血病病毒)來消除在非受感染的細胞之間和在小鼠模型中HIV-1-受感染的細胞的功效。抗-gp120抗體、P4/D10中和HIV-1病毒以及介導ADCC(Broliden等人，1990)。也已經(jīng)將它的未綴合的形式用于晚期HIV-1感染個體的I-期臨床研究中，其中它降低HIV抗原的時間段延長(Hinkula等人，1994)。本研究首次檢查與游離MAb、游離藥物和與阿霉素類似綴合的無關抗體hRS7相比在臨床前HIV模型中藥物綴合形式的P4/D10的組合(Stein等人，IntJCancer1993，55：938-946)和hLL1Griffiths等人，ClinCancerRes2003，9：6567-6571；Sapra等人，ClinCancerRes2005，11：5257-5264)。材料和方法抗體和藥物綴合。根據(jù)Griffiths等人(2003)進行阿霉素與IgG1κ抗-gp120抗體P4/D10(Broliden等人，1990)和對照抗體的綴合以及具有馬來酰亞胺基團的雙功能性阿霉素腙衍生物的制備。簡言之，使用約2.2mM最終DTT濃度，對應相對抗體的38倍摩爾過量的還原劑，經(jīng)在含有5mMEDTA的PBS(pH7.5)中DTT(二硫蘇糖醇)使約9mg/ml的最終濃度的抗體P4/D10、hLL1(人源化抗-CD74)和hRS7(人源化抗-EGP-1)輕度還原。在37℃下將溶液孵育40分鐘。將還原的MAb在含有150mMNaCl和2mMEDTA的50mM醋酸鈉緩沖劑(pH5.3)中G50/80的離心柱(spin-column)上純化。通過埃爾曼測定法(Ellman′sassay)來測定在抗體上生成的硫醇基團的數(shù)量。對于綴合，使在6.5mg/ml下輕度還原的抗體與雙功能性阿霉素混合。將孵育物保存在冰上15分鐘，然后在0.1M醋酸鈉(pH6.5)中G50/80的離心柱上純化，隨后通過在相同緩沖劑中平衡的Bio-BeadsSM2(Bio-Rad，Hercules，CA)的短柱。通過測定吸收率來分析產(chǎn)物的阿霉素/MAb取代比率。將來自HIV感染患者的產(chǎn)生GMP的大量IgG(HIVIgG)(Guay等人AIDS2002，16：1391-1400)用作陽性對照，并將來自HIV陰性個體的血清用作陰性對照。包括游離阿霉素以及與阿霉素類似綴合的抗癌人源化MAbLL1和RS7作為綴合的P4/D10抗體的對照。HIV-1中和測定法。將阿霉素P4/D10、未經(jīng)標記的P4/D10、HIV免疫球蛋白(HIVIgG)和HIV-陰性血清與HIV-1分離HIV-1IIIB(LAI)混合，并且在將50,000JurkatT-細胞/孔加入之前在37℃下孵育1小時。在孵育1小時之后，使用培養(yǎng)基洗滌細胞，并將新的完全培養(yǎng)基加入(200μl/孔)。在培養(yǎng)7天之后，通過p24捕獲ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)來測定產(chǎn)生的p24的量，并計算對HIV-1p24的產(chǎn)生的抑制百分比。HIV-1體外抑制。通過混合5-10x106細胞與100xTCID50HIV-1IIIB以及在37℃下孵育1小時，使用HIV-1IIIB來感染JurkatT細胞。將細胞在培養(yǎng)基中洗滌，并在37℃下孵育。每隔三天，更換培養(yǎng)基，并檢查上清液中p24產(chǎn)生。當接近100％的細胞被感染時，將不同比例的HIV-1IIIB感染的細胞與未感染的細胞混合。使用抗體、血清或100至0.00001μg/ml的游離阿霉素的系列稀釋物來處理細胞。在37℃下培養(yǎng)7天之后，測定HIV-1p24抑制以及收集來自之前使用0.1-10μg/ml的阿霉素-P4/D10、未綴合的P4/D10以及0.05-0.5mg/mlHIV-陰性血清處理的細胞的上清液，并將其轉染至新鮮JurKatT-細胞以測試感染性HIV在開始培養(yǎng)后3、7、10、12和15天是否通過p24ELISA識別。HIV-1/MuLV攻擊模型。使用HIV-1IIIB感染具有遺傳整合的MuLV基因組的人T-細胞系，CEM-1B，其導致具有HIV-1基因組和MuLV包膜的假病毒的產(chǎn)生(Adang等人，PNASUSA1999，96：12749-753；Hinkula等人，CellsTissuesOrgans2004，177：169-184)。將這些病毒上清液用于感染來自HLA-A201的C57B1/6xDBAFlKb/d小鼠轉基因的脾細胞。使用HIV-1IIIB/MuLV感染的脾細胞腹膜內(nèi)攻擊等基因小鼠，并立即腹膜內(nèi)給予綴合的抗體、游離抗體或游離阿霉素。在攻擊之后十天，處死小鼠，并收集腹膜腔細胞。沉淀腹膜腔細胞，并加至在24-孔板中生長的1x106HIV易受感染的JurkatT-細胞或人PBMC。由這些繼代培養(yǎng)物，每3-4天將上清液去除，并加入新鮮培養(yǎng)基。通過p24ELISA測定3周內(nèi)從上清液中回收的感染性HIV的量。統(tǒng)過分析。為了比較抗-gp120MAb和對照抗體的體外HIV-1中和能力，使用學生t檢驗和非參數(shù)克魯斯卡爾-瓦里斯檢驗(non-parametricKruskal-wallistest)。使用非參數(shù)曼-惠特尼U(Mann-WhitneyU)和克魯斯卡爾-瓦里斯檢驗來進行使用不同抗體處理的各組小鼠之間統(tǒng)計比較。當獲得的p值＜0.05時，則認為該差異具顯著性。使用版本4.0a(Software，SanDiego，CA)來進行非參數(shù)單因素方差分析(one-wayANOVAtest)，并將其用于比較各研究組之間HIV-1分離和p24抗原陽性的比較。結果在最終純化的綴合物中通過輕度還原在各抗體上生成的硫醇基團的數(shù)目以及阿霉素/MAb取代比率的范圍介于8.8(P4/D10，hRS7)至9.4(hLL1)之間，其得到約9的藥物分子/IgG比率。高壓液相色譜分析顯示：綴合物和天然MAb具有零至最小聚集(數(shù)據(jù)未顯示)的類似保留時間?？稍诎⒚顾?綴合的P4/D10MAb以及未綴合的P4/D10MAb或HIVIgG抗體之間顯示在游離HIV-1病毒(圖1A)的HIV-1中和能力中無顯著差異。然而，在中和HIV-1IIIB上，所有抗HIV-1特異性抗體均顯著優(yōu)于陰性對照血清(p＝0.001)。當使3％HIV-1IIIB感染的Jurkat細胞與97％未受感染的細胞混合時，在0.5或0.05μg/ml的濃度下的阿霉素-P4/D10介導比游離P4/D10、阿霉素-綴合的對照抗體、hLL1或游離阿霉素顯著(p＝0.002)更強對HIV-1感染的細胞內(nèi)散布的抑制(圖1B)。在所有其他濃度的經(jīng)感染和未受感染的細胞下均觀察到類似結果。令人特別感興趣的是，相比由作為中和劑的阿霉素-P4/D10所獲得的作用，似乎更加有力地抑制感染的細胞內(nèi)散布。而且，在使用高劑量的阿霉素-P4/D10處理的培養(yǎng)物中無法找到感染性病毒，因為在將來自這些細胞培養(yǎng)物的上清液轉移至未經(jīng)感染的Jurkat細胞之后未檢測到p24產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。從游離HIV-1病毒的中和結合尚無法預測在阿霉素-P4/D10和未綴合的P4/D10之間作用的顯著差異(圖1A)。為了測試阿霉素-P4/D10抗體體內(nèi)功效，將等基因HIV/MuLV-感染的細胞連同綴合物腹膜內(nèi)給予小鼠。類似之前的研究，在10天之后收獲腹膜腔細胞，并在所有對照中證實感染性HIV(Hinkula等人，2004)。阿霉素-P4/D10抗體完全保護小鼠免受HIV-1感染的初級淋巴細胞的攻擊(p＝0.0001)(圖2)。在攻擊和使用100μg的阿霉素-P4/D10抗體處理之后未從腹膜腔細胞中回收感染性HIV。當使用100μg的未綴合的P4/D10抗體處理小鼠時，對于p24產(chǎn)生，所有均為陽性。僅當劑量增加八倍、至800μg未綴合的P4/D10/小鼠時，觀察到單獨的抗體的完全保護。在100-200μg的劑量或100-400μg的劑量的游離阿霉素下沒有任何阿霉素-綴合的對照抗體(hLL1或hRS7)提供任何保護。概述阿霉素-P4/D10能夠體外以及在實驗性體內(nèi)攻擊模型中消除HIV-1感染的細胞。未綴合的P4/D10MAb介導針對HIV-1感染的靶細胞的ADCC以及中和HIV-1(Broliden等人，1990；Hinkula等人，1994)的能力可以無毒方式增強其作為藥物免疫綴合物的功效。類似地，利用以下實施例中所公開的組合物和方法，可將有效的抗-HIV免疫綴合物并入DNL復合物內(nèi)。實施例2.對接和鎖定(DNL)構建體的制備DDD和AD融合蛋白DNL技術可用于制備包含幾乎任何抗體、抗體片段、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子、PEG部分、毒素或其他效應子部分的二聚體、三聚體、四聚體、六聚體等。對于某些優(yōu)選的實施方案，可將抗-HIV抗體或抗體片段以及HIV抑制劑制備為包含二聚化和對接結構域(DDD)或者錨定結構域(AD)序列的融合蛋白。盡管在優(yōu)選實施方案中，DDD和AD部分可以為作為融合蛋白的效應子部分，但熟練技術人員意識到，存在其他綴合方法，例如化學交聯(lián)、點擊化學反應(clickchemistryreaction)等。技術是非限制性，并可將使用的任何蛋白或肽制備為用于并入DNL復合物內(nèi)的AD或DDD融合蛋白。在利用化學交聯(lián)時，AD和DDD綴合物可包含使用本領域已知任何交聯(lián)技術可交聯(lián)至AD或DDD序列的任何分子。表達載體將質粒載體pdHL2用于制備大量抗體和基于抗體的構建體。參見Gillies等人，JImmunolMethods(1989)，125：191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。雙順反子哺乳動物表達載體引導IgG的重和輕鏈的合成。載體序列與許多不同的IgG-pdHL2構建體幾乎相同，其差異僅存在于可變結構域(VH和VL)序列中。使用本領域技術人員已知的分子生物工具，可將這些IgG表達載體轉化至Fab-DDD或Fab-AD表達載體內(nèi)。為了生成Fab-DDD表達載體，使用編碼鉸鏈的前4個殘基、14個殘基Gly-Ser接頭和諸如人RIIα的前44個殘基(稱為DDD1，SEQIDNO：1)的DDD部分的序列替代鉸鏈、重鏈的CH2和CH3結構域的編碼序列。為了生成Fab-AD表達載體，使用編碼鉸鏈的前4個殘基、15個殘基Gly-Ser接頭和諸如稱為AKAP-IS的17個殘基合成AD(簡稱AD1，SEQIDNO：3)的AD部分的序列替代鉸鏈、IgG的CH2和CH3結構域的序列，使用生物信息和肽陣列技術來生成該AD部分，并顯示其以親合力(0.4nM)結合RIIα二聚體。參見Alto,等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。如下所述，設計兩種穿梭載體以便于轉移IgG-pdHL2載體至Fab-DDD1或Fab-AD1表達載體。CH1抗體結構域的制備通過使用pdHL2質粒載體作為模板的PCR來擴增CH1抗體結構域。左側PCR引物由CH1結構域和SacII限制性核酸內(nèi)切酶位點的上游(5′)端組成，其是CH1編碼序列的5′。右側引物由編碼鉸鏈的前4個殘基的序列(PKSC，SEQIDNO：85)組成，其后為四個甘氨酸和絲氨酸，其最后兩個密碼子(GS)包含BamHI限制性位點。將410bpPCR擴增引物克隆至PCR克隆載體(Inc.)內(nèi)，并篩選克隆物以用于在T7(5′)定向中插入。合成雙鏈體寡核苷酸以編碼前面為接頭肽的11個殘基的DDD1的氨基酸序列，其前兩個密碼子包含BamHI限制性位點。終止密碼子和EagI限制性位點附接至3′端。以下顯示編碼的多肽序列。GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：86)合成在它們3′端上重疊30個堿基對的稱為RIIA1-44頂部和RIIA1-44底部的兩種寡核苷酸，并使其聯(lián)合以包含174bpDDD1序列的中心154個堿基對。使寡核苷酸退火，并使用Taq聚合酶進行引物延伸反應。在引物延伸之后，通過PCR擴增雙鏈體。將擴增引物克隆至內(nèi)，并篩選以用于在T7(5′)定向中插入。合成雙鏈體寡核苷酸以編碼前面為接頭肽的11個殘基的AD1的氨基酸序列，該接頭肽具有包含BamHI限制性位點的前兩個密碼子。終止密碼子和EagI限制性位點附接至3′端。以下顯示編碼的多肽序列。GSGGGGSGGGGSQEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：87)合成和退火稱為AKAP-IS頂部和AKAP-IS底部的編碼以上肽序列的兩互補重疊寡核苷酸。通過PCR擴增雙鏈體。將擴增引物克隆至載體內(nèi)，并篩選以用于在T7(5′)定向中插入。接合DDD1與CH1使用BamHI和NotI限制性酶將編碼DDD1序列的190bp片段由切除，然后使其接合至在CH1-中相同位點內(nèi)以生成穿梭載體CH1-DDD1-接合AD1與CH1使用BamHI和NotI將含有AD1序列的110bp片段由切除，然后將其接合至在CH1-中相同位點內(nèi)以生成穿梭載體CH1-AD1-克隆CH1-DDD1或CH1-AD1至基于pdHL2的載體內(nèi)使用該模型設計，可將CH1-DDD1或CH1-AD1并入在pdHL2載體中任何IgG構建體內(nèi)。通過由pdHL2中去除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)以及使用由穿梭載體分別切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段代替它，使用以上構建體之一來替代全部重鏈恒定結構域。h679-Fd-AD1-pdHL2的構建h679-Fd-AD1-pdHL2是產(chǎn)生具有AD1的h679Fab的表達載體，所述AD1通過由14個氨基酸殘基組成的撓性Gly/Ser肽間隔子與Fd的CH1結構域的羧基末端偶聯(lián)。通過使用由具有SacII和EagI的CH1-AD1-SV3穿梭載體切除的CH1-AD1片段代替SacII/EagI片段來將含有h679的可變結構域的基于pdHL2的載體轉變?yōu)閔679-Fd-AD1-pdHL2。679抗體是對組胺琥珀酰甘氨酸(HSG)特異的半抗原-結合抗體(參見，例如，美國專利No.7,429,381、7,563,439)。h679-Fab-AD1的制備和純化通過使用SalI限制性核酸內(nèi)切酶消化使h679-Fd-AD1-pdHL2載體直線化，并通過電穿孔將所述載體轉染至Sp/EEE骨髓瘤細胞內(nèi)。雙順反子表達載體引導h679κ輕鏈和h679Fd-AD1的合成和分泌，使該它們聯(lián)合以形成h679Fab-AD1。在電穿孔之后，將細胞接種在96-孔組織培養(yǎng)平板中，并使用0.05μM氨甲蝶呤(MTX)來選擇轉染子克隆物。通過使用經(jīng)BSA-IMP260(HSG)綴合物涂覆的微量滴定板的ELISA和使用HRP-綴合的山羊抗-人Fab的檢測來篩選用于蛋白表達的克隆物。通過測定由注入稀釋的培養(yǎng)基樣品獲得的初始斜率，將使用HSG(IMP239)傳感器芯片(sensorchip)的BIAcore分析用于測定產(chǎn)率。最高處生成克隆物具有約30mg/L的初始產(chǎn)率。通過單步驟IMP291親和層析將總計230mg的h679-Fab-AD1由4.5升的滾瓶培養(yǎng)物中純化。在荷載至IMP291-affigel柱之前，通過超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍。使用PBS將柱子洗滌至基線，并使用1M咪唑、1mMEDTA、0.1MNaAc(pH4.5)來洗脫h679-Fab-AD1。洗脫物的SE-HPLC分析顯示具有與50kDa蛋白(未顯示)的保留時間一致的單尖峰。通過還原SDS-PAGE分析(未顯示)證實代表h679-AD1的多肽成分的僅兩條帶。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的構建C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是產(chǎn)生包含融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的兩個拷貝的穩(wěn)定二聚體的表達載體，其中DDD1在CH1的羧基末端處通過撓性肽間隔子來連接hMN-14Fab。通過使用SacII和EagI限制性核酸內(nèi)切酶消化，將用于制備hMN-14IgG的質粒載體hMN-14(I)-pdHL2轉化為C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2以去除CH1-CH3結構域和插入由具有SacII和EagI的CH1-DDD1-SV3穿梭載體切除的CH1-DDD1片段。將相同技術用于制備諸如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和許多其他抗體的大量已知抗體的Fab表達的質粒。通常，抗體可變區(qū)編碼序列存在于pdHL2表達載體中，并將表達載體轉化以用于制備如上所述的AD--或DDD-融合蛋白。使包含任意這些抗體的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以每一種AD-融合蛋白中兩種DDD-融合蛋白的合適比率聯(lián)合以生成包含第一抗體的兩個Fab片段和第二抗體的一個Fab片段的三聚DNL復合物。C-DDD1-Fab-hMN-14的制備和純化通過電穿孔將C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉染至Sp2/0源的骨髓瘤細胞內(nèi)。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是雙順反子表達載體，其引導hMN-14κ輕鏈和hMN-14Fd-DDD1的合成和分泌，使它們以形成C-DDD1-hMN-14Fab。通過與DDD1結構域相互作用，融合蛋白形成穩(wěn)定的同型二聚體。在電穿孔之后，將細胞接種在96-孔組織培養(yǎng)平板中，并使用0.05μM氨甲蝶呤(MTX)選擇轉染子克隆物。通過使用經(jīng)WI2(大鼠抗-id單克隆抗體至hMN-14)涂覆的微量滴定板的ELISA以及使用HRP-綴合的山羊抗-人Fab檢測來篩選用于蛋白表達的克隆物。最高處產(chǎn)生C-DDD1-Fab-hMN14Fab克隆物的初始產(chǎn)率為60mg/L。通過使用AD1柱的親和柱層析可純化分泌的C-DDD1-Fab-hMN14。AD1-C是由AD1序列和羧基末端半胱氨酸殘基組成的合成肽，在巰基與氯乙酸酐的反應之后將其用于偶聯(lián)肽與Affigel。在中性pH下使含有DDD的二聚體結構特異性結合AD1-C-Affigel樹脂，并在低pH(例如，pH2.5)下可將其洗脫。通過樣品的SE-HPLC分析來測定C-DDD1-Fab-hMN-14的結合活性，其中將測試物品與各種量的WI2混合。通過以0.75∶1的摩爾比混合WI2Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14制備的樣品顯示三個峰，其歸因于非結合的C-DDD1-Fab-hMN14(8.71分鐘)、結合一個WI2Fab的C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95分鐘)和結合兩個WI2Fab的C-DDD1-Fab-hMN14(7.37分鐘)(未顯示)。當分析含有4的摩爾比的WI2Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14的樣品時，僅觀察到在7.36分鐘處單峰(未顯示)。這些結果表明：hMN14-Fab-DDD1為二聚以及具有兩個活性結合位點。競爭性ELISA證實C-DDD1-Fab-hMN-14結合具有類似hMN-14IgG，但比單價hMN-14Fab(未顯示)顯著更強的抗體親抗原性的CEA。C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是產(chǎn)生C-DDD2-Fab-hMN-14的表達載體，其具有通過14個氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附接hMN-14的Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和對接結構域序列(SEQIDNO：2)。分泌的融合蛋白由通過DDD2結構域的非共價相互作用連接至一起的hMN-14Fab的兩個相同拷貝構成。如下將表達載體工程化。合成制備包含DDD2的一部分接頭肽和殘基1-13的編碼序列的兩重疊、互補寡核苷酸。將寡核苷酸退火以及使用T4PNK將其磷酸化，得到在5′和3′端上與分別使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和PstI消化的DNA的接合相容的突出端。使雙鏈體DNA接合至通過使用BamHI和PstI的消化制備的穿梭載體CH1-DDD1內(nèi)以生成穿梭載體CH1-DDD2使用SacII和EagI由CH1-DDD2切除507bp片段，并使其與通過使用SacII和EagI的消化制備的IgG表達載體hMN-14(I)-pdHL2接合。最終表達構建體稱為C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已經(jīng)利用類似技術以生成大量不同人源化抗體的Fab片段的DDD2-融合蛋白。h679-Fd-AD2-pdHL2設計h679-Fab-AD2以與C-DDD2-Fab-hMN-14配對。h679-Fd-AD2-pdHL2是產(chǎn)生h679-Fab-AD2的表達載體，其具有通過14個氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附接CH1結構域的羧基末端的AD2的錨定結構域序列(SEQIDNO：4)。AD2具有在AD1的錨定結構域序列的前面的一個半胱氨酸殘基以及另一在AD1的錨定結構域序列的后面的另一半胱氨酸殘基。如下工程化表達載體。合成制備包含AD2和一部分接頭序列的編碼序列的兩重疊、互補寡核苷酸(AD2頂部和AD2底部)。將寡核苷酸退火以及使用T4PNK將其磷酸化，得到在5′和3′端上與分別使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和SpeI消化的DNA的接合相容的突出端。使雙鏈體DNA接合至通過使用BamHI和SpeI的消化制備的穿梭載體CH1-AD1-內(nèi)以生成穿梭載體CH1-AD2-使用SacII和EagI限制性酶由穿梭載體切除含有CH1和AD2編碼序列的429個堿基對片段，并將其接合至使用那些相同酶消化制備的h679-pdHL2載體內(nèi)。最終表達載體是h679-Fd-AD2-pdHL2。C-H-AD2-IgG-pdHL2表達載體的產(chǎn)生制備質粒穿梭載體以便于轉變?nèi)我釯gG-pdHL2載體至C-H-AD2-IgG-pdHL2載體內(nèi)。使用pdHL2載體作為模板以及FcBglII左側和FcBam-EcoRI右側引物來擴增Fc(CH2和CH3結構域)的基因。將擴增引物克隆在PCR克隆載體中。使用XbaI和BamHI限制性酶由中切除Fc插入片段，并與通過使用XbaI和BamHI消化h679-Fab-AD2-pdHL2制備的AD2-pdHL2載體來接合以生成穿梭載體Fc-AD2-pdHL2。FcBglII左側5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQIDNO：88)FcBam-EcoRI右側5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQIDNO：89)為了轉化任意IgG-pdHL2表達載體至C-H-AD2-IgG-pdHL2表達載體，將861bpBsrGI/NdeI限制性片段由前者中切除，并使用由Fc-AD2-pdHL2載體切除的952bpBsrGI/NdeI限制性片段替代。BsrGI切割CH3結構域以及NdeI切割表達盒的下游(3′)。實施例3.TF2DNL復合物的生成通過使C-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2反應來獲得稱為TF2的三聚DNL復合物。如下生成小試批次的TF2，具有＞90％產(chǎn)率。以1.4∶1摩爾比將蛋白L-純化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)與h679-Fab-AD2(60mg)混合。在含有1mMEDTA的PBS中總蛋白濃度為1.5mg/ml。隨后步驟包括TCEP還原、HIC層析、DMSO氧化和IMP291親和層析。在加入TCEP之前，SE-HPLC并未顯示a2b形成的任何證據(jù)(未顯示)。5mMTCEP的加入快速導致與預期為二元結構的157kDa蛋白一致的a2b復合物的形成(未顯示)。通過IMP291親和層析將TF2純化至接近均質(未顯示)。IMP291是含有HSG半抗原的合成肽，679Fab結合至該HSG半抗原(Rossi等人，2005，ClinCancerRes11：7122s-29s)。IMP291非結合的部分的SE-HPLC分析表明a4、a2和游離κ鏈從產(chǎn)物中去除(未顯示)。通過測定法來測定TF2的功能性。將TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共價a2b復合物的對照樣品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非還原a2和b組分的對照樣品)稀釋至1μg/ml(總蛋白)，并使其通過經(jīng)HSG固定的傳感器芯片。TF2的應答約為兩種對照樣品的兩倍，這表明在對照樣品中僅h679-Fab-AD組分結合以及保留在傳感器芯片上。隨后注入WI2IgG，hMN-14的抗-個體基因型抗體表明僅TF2具有如通過另外信號應答表示的與h679-Fab-AD緊密相關的DDD-Fab-hMN-14組件(未顯示)。由固定在傳感器芯片上WI2與TF2的結合所致的應答單元的另外增加對應兩個完全功能性結合位點，其各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個亞單位構成。通過TF2結合WI2的兩個Fab片段的能力證實這個(未顯示)。TF2的血清穩(wěn)定性使用評價人血清中TF2的穩(wěn)定性。將TF2稀釋至新鮮人血清中0.1mg/ml，并在37℃下5％CO2下孵育數(shù)天。將每日樣品稀釋至1∶25，然后通過使用IMP239HSG傳感器芯片的來分析。WI2IgG的注入用于定量完整和完全活性TF2的量。比較血清樣品和由儲液直接稀釋的對照樣品。TF2在血清中高度穩(wěn)定，7天后保留98％的其雙特異性結合活性(未顯示)。實施例4.來自多種抗體的AD-和DDD-連接的Fab和IgG融合蛋白的制備使用在前述實施例中所述的技術，構建在表5中所示IgG和Fab融合蛋白，并將其并入DNL復合物內(nèi)。保留親本抗體和DNL復合物的抗原結合特征的融合蛋白表現(xiàn)出對并入抗體或抗體片段的抗原結合活性。表5.包含IgG或Fab的融合蛋白熟練技術人員意識到，可應用DNL技術以制備包含抗體、抗體片段和/或諸如抗-HIV治療劑的其他治療劑的多聚體復合物。本文的實施例表明：在與親本抗體相比，抗體或其片段可并入DNL復合物內(nèi)而減損任何抗體結合特征。實施例5.多價DNL復合物的制備和使用單特異性或雙特異性的多價抗體可改善包括單一單克隆抗體(mAb)的當前治療干預的功效。多價抗-CD20抗體抗體由維妥珠單抗(hA20，參見美國專利No.7,151,164、7,435,803、7,919,273)生成。我們應用DNL方法以制備稱為Hex-hA20的六價、抗-CD20抗體，其包含六個Fab和一個Fc。我們顯示，Hex-hA20保留在脂筏(lipidraft)中與CD20締合的所有六個Fab的結合活性、受感染的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，但未保留補體-依賴性細胞毒性，并且在亞納摩爾濃度下體外抑制Daudi、Raji和Ramos細胞的增殖而無需交聯(lián)抗體(Rossi等人，2008，CancerRes68：8384-92)。此外，Hex-hA20誘導強同型粘附以及在刺激鈣動員上無效(同前)。因此，如分別通過利妥昔單抗和托西莫單抗(tositumomab)所證實，Hex-hA20表現(xiàn)出歸因于類型I和類型II抗-CD20mAb的生物性質。盡管Hex-hA20具有短血清半衰期，在具有腫瘤的小鼠中與等同劑量下維妥珠單抗相比，它顯示抗腫瘤功效(同前)。也應用DNL方法以生成沒有Fc區(qū)、Tri-hA20和Tetra-hA20的兩種其他多價抗-CD20抗體，所述多價抗-CD20抗體分別包含三和四個維妥珠單抗的Fab。類似于Hex-hA20，將這些純化至接近均質，并顯示其在體外具有強效抗增殖活性(同前)，因而表明需要在細胞表面上簇集三個或更多個CD20分子以誘導生長抑制。材料和方法細胞系。Daudi、Raji和Ramos購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。將Sp/ESF，經(jīng)工程化以在無血清培養(yǎng)基中生長的Sp2/0-Ag14的變體用作轉染的宿主細胞。Hex-hA20的生成。通過使用SacII和EagI切除CH1-鉸鏈-CH2-CH3結構域的編碼序列以及使用由使用相同酶由C-DDD2-hMN-14-pdHL2表達載體(如在以上實施例2中所述)切除的編碼CH1-DDD2的507-bp序列將它替換，由CH3-AD2-IgG-hA20-pdHL2來生成編碼CH1-DDD2-Fab-hA20的表達載體。通過使用SalI的消化將各30μg的表達載體CH3-AD2-IgG-hA20-pdHL2或CH1-DDD2-Fab-hA20-pdHL2直線化，并通過電穿孔(450V，25μF)轉染至Sp/ESF(2.8x106細胞)內(nèi)。pdHL2載體含有用于二氫葉酸還原酶的基因，因而使得可克隆選擇以及使用氨甲蝶呤(MTX)來基因擴增。在轉染之后，將細胞接種在96-孔板中，并在含有0.2μmoI/LMTX的培養(yǎng)基中選擇。通過使用經(jīng)WR2(大鼠抗-個體基因型抗體至維妥珠單抗)涂覆的96-孔微升平板的夾心ELISA來篩選克隆物的CH3-AD2-IgG-hA20或CH1-DDD2-Fab-hA20產(chǎn)率以捕獲融合蛋白，使用辣根過氧化物酶-綴合的山羊抗-人IgGF(ab′)2來檢測該融合蛋白。使給予最高信號的孔擴張，并最終用于制備。將CH3-AD2-IgG-hA20和CH1-DDD2-Fab-hA20在滾瓶中制備，通過親和層析分別在蛋白A和蛋白L上純化，并保存在PBS中。為了生成Hex-hA20，在室溫下使用1mmol/L還原的谷胱甘肽來處理CH1-DDD2-Fab-hA20(134mg)和CH3-AD2-IgG-hA20(100mg)的混合物16小時，隨后為2mmol/L氧化的谷胱甘肽處理24小時，由此通過蛋白A純化Hex-hA20。通過使CH3-AD2-IgG-hA20與CH1-DDD2-Fab-hMN-14反應類似地制備DNL-20/14。Tetra-hA20和Tri-hA20的生成。通過在SUPERDEXTM-200柱上純化CH1-DDD2-Fab-hA20的四聚形式來獲得Tetra-hA20。通過使CH1-DDD2-Fab-hA20的二聚形式與如在h679-Fab-AD2的以上實施例2中制備的CH1-AD2-Fab-hA20共價連接來獲得Tri-hA20。競爭性ELISA。使用5μg/mL下維妥珠單抗將微量滴定板涂覆過夜，并使用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻斷1小時。將連續(xù)稀釋一式三份的Hex-hA20和維妥珠單抗各自與1nmolL下WR2混合，并添加至涂覆的孔中。使用過氧化物酶綴合的山羊抗-大鼠IgG和O-苯二胺二鹽酸鹽定量結合的WR2。流式細胞術。使用生產(chǎn)商試劑、方案和軟件在PCA(GuavaTechnologies，Inc.)上通過流式細胞術進行細胞凋亡、活細胞計數(shù)、細胞結合和解離率測定。Scatchard分析。通過使用軟件(Software，Inc.)由放射性碘化樣品和Raji細胞獲得的飽和結合數(shù)據(jù)的非線性回歸分析獲得結合位點的最大數(shù)目/細胞和明顯親合力常數(shù)。樣品一式三份進行。如通過與WR2的結合所測定，各放射標記制劑的免疫活性為90％或更大。細胞增殖測定法。使用通過代謝活性細胞化學還原至甲臜(formazan)內(nèi)的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)來測定體外細胞毒性，并且所得顏色強度與活細胞數(shù)目成比例。CDC。將細胞以5x104細胞接種在50μl/孔的黑色96-孔微升平板中，并在37℃和5％CO2下在人補體(1∶20最終稀釋)的存在下使用測試和對照mAb的連續(xù)稀釋物(濃度范圍，3.33x10-8至2.6x10-10mol/L)來孵育2小時。然后使用VYBRANTTMCellMetabolicAssayResazurin試劑盒(Invitrogen)來定量活細胞。對照包括經(jīng)0.25％TritonX-100處理的細胞(100％裂解)和經(jīng)單獨的補體處理的細胞(背景)。ADCC。在37℃和5％CO2下使用5μg/mL的各測試樣品一式三份孵育Daudi細胞30分鐘。然后在預定最佳效應子下將由健康志愿者中獲得的新鮮分離的周圍血液單核細胞添加至50∶1的靶比率。在4-h孵育之后，通過CYTOTOX-ONETM(Promega)來評估細胞裂解物。鈣動員。使用BectonDickinson和FlowJo程序(TreeStar，Inc.)在荷載有20μmol/LFluo-3AM(Invitrogen)的Ramos細胞中測定細胞內(nèi)鈣。對于所有樣品，在添加包括離子霉素和作為陽性對照的抗-人IgM的各測試樣品之前獲得60秒的基線。為了評估交聯(lián)的作用，使用1μg/mL維妥珠單抗、利妥昔單抗或托西莫單抗進一步孵育細胞15分鐘，并使用合適的第二抗體(最終50μg/mL)來刺激。同型粘附。使用在1nmol/L下維妥珠單抗、Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20處理Daudi細胞(1.5x106/mL)20小時，然后使用反向物相-對比顯微鏡來檢查。根據(jù)Polyak和Deans(2002，Blood99：3256-62)來半定量計分結果。動物研究。在雌性Swiss-Webster天然鼠中進行藥物代謝動力學分析，并使用放射性碘化樣品比較靜脈或皮下(s.c.)給予的Hex-hA20和維妥珠單抗。在具有腫瘤的SCID小鼠中評估體內(nèi)功效，如所述(Hernandez-Ilizaliturri等人，2003，ClinCancerRes9：5866-73)進行以下修改來進行自然殺傷(NK)細胞和嗜中性粒細胞的耗竭。簡言之，在接種Raji細胞之前，使小鼠接受抗小鼠Gr-1腹水(100μL)和TMβ-lmAb(100μg)的腹膜內(nèi)注射1天，并在第6、13和20天每周接受更多三次的抗小鼠Gr-1腹水的腹膜內(nèi)注射以維持嗜中性粒細胞耗竭，通過由一只經(jīng)處理和一只未經(jīng)處理的小鼠中在第3、13和20天時取樣的血液樣品的熒光-激活的細胞分類分析來證實。當出現(xiàn)后肢麻痹或者如果它們垂死，則將認為已經(jīng)屈服于疾病進展的小鼠人道處死。另外，如果小鼠損耗＞20％的初始體重，則將它們處死。使用Kaplan-Meier繪制(時序檢驗)和軟件來分析存活曲線。結果通過DNL制備的六價抗體。通過在氧化還原條件下混合CH1-DDD2-Fab-hA20與CH3-AD2-IgG-hA20，隨后純化蛋白A可容易地獲得Hex-hA20。以良好產(chǎn)率制備CH1-DDD2-Fab-hA20和CH3-AD2-IgG-hA20作為在骨髓瘤細胞中融合蛋白，隨后分別通過蛋白L和蛋白A來純化培養(yǎng)上清液。通過還原SDS-PAGE的Hex-hA20的純度顯示組成性多肽的僅三條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。由于未觀察到對應CH3-AD2-IgG-hA20的單體形式的帶，Hex-hA20的非還原性SDS-PAGE分析證實它的共價結構(未顯示)。通過MALDI-TOF質譜測定法測定Hex-hA20的分子質量為368,475Da，其與來自構成性多肽的推導的氨基酸序列的Hex-hA20的362kDa的計算分子量相符。結合分析。如通過競爭性ELISA(圖3A)所示，Hex-hA20具有比維妥珠單抗高3倍的抗體親抗原性，這表明六個Fab組件中至少三個或更多個能夠同時結合WR2抗個體基因型抗體。通過流式細胞術比較在肝臟細胞上與維妥珠單抗與CD20的結合相比的Hex-hA20與CD20的結合。當通過PE-抗-Fab探測時，Hex-hA20導致比維妥珠單抗大40％至50％的熒光強度(圖3B)。相反，觀察的具有PE-抗-Fc的Hex-hA20的信號比維妥珠單抗的要低。這些結果與具有比維妥珠單抗多四個Fab、但僅一個Fc類似維妥珠單抗的Hex-hA20一致。通過與Raji細胞的結合的Scatchard分析提供Hex-hA20的更高效價和抗體親抗原性的另外的證據(jù)(圖3C)，其顯示：Hex-hA20的締合常數(shù)[～3.9x108(mol/L)-1]比維妥珠單抗[～1x108(mol/L)-1]顯著高～4倍(P＜0.0001)，而F檢驗判斷出利妥昔單抗和維妥珠單抗的飽和結合曲線類似(P＝0.1859)。更重要地，據(jù)發(fā)現(xiàn)，由Hex-hA20獲得的最大結合位點數(shù)(Bmax)計算的每細胞的受體數(shù)目為維妥珠單抗所獲得的～1/4(～100,000比對～437,5000)，這表明因為相同數(shù)目的CD20分子需要如維妥珠單抗所需的三倍數(shù)量以占有它們，所以Hex-hA20的所有六個Fab均能夠在細胞表面上結合CD20。由解離率測定所獲得的數(shù)據(jù)(圖3D)也表明Hex-hA20比維妥珠單抗離解慢～3倍，該維妥珠單抗離解比利妥昔單抗慢～2倍至3倍(Glennie等人，2007，MolImmunol44：3823-37)?？乖鲋郴钚??；贛TS分析(圖4A)，Hex-hA20強烈抑制在三種Burkitt淋巴瘤細胞系(Raji、Ramo和Daudi)中增殖，其分別具有0.064、0.15和0.15nmol/L的EC50。相反，在缺乏交聯(lián)抗體下僅在＞10nmol/L下維妥珠單抗顯示在所有三種細胞系中可檢測效能。如所預期，維妥珠單抗與山羊抗-人Fc的交聯(lián)導致對增殖的顯著抑制。對于Hex-hA20，交聯(lián)不會進一步增加在Daudi中的效能。另外的實驗通過活細胞計數(shù)比較在5天內(nèi)Hex-hA20、Tri-hA20和Tetra-hA20對細胞增殖的作用。Raji和Ramos的代表性結果顯示在圖4B中，其顯示在低至0.5nmol/L的濃度下在未交聯(lián)下Tri-hA20、Tetra-hA20和Hex-hA20抑制50％或更多細胞增殖的能力。獲得Daudi的類似結果(數(shù)據(jù)未顯示)。細胞計數(shù)分析也顯示，當使用Ramos評估3天時，Hex-hA20((EC50＝0.17nmol/L)比抗-B1(EC50＝4.65nmol/L)相對更強效。細胞凋亡和半胱天冬酶(caspase)和鈣的作用。使用在0.5或5nmol/L下三種多價抗-CD20構建體來處理Raji細胞，并在24小時之后使用連接蛋白測定法來分析(圖5A，左)。使用Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20處理導致與二價維妥珠單抗(6-9％)和未經(jīng)處理的對照(3％)相比更多細胞早期細胞凋亡(12-16％)。使用Daudi和Ramos細胞獲得可比較的結果(數(shù)據(jù)未顯示)。使用多半胱天冬酶測定法在24小時時間段內(nèi)也評估使用5nmol/LHex-hA20或維妥珠單抗處理的Raji細胞的細胞凋亡程度(圖5A，右)。對于Hex-hA20和維妥珠單抗，在24小時處結果分別為17％和6％，其與通過連接蛋白測定的那些相一致。在Ramos中測定Z-VAD-FMK(廣譜半胱天冬酶抑制劑)對由Hex-hA20誘導的細胞凋亡的作用，并且結果(未顯示)表明在100μmol/L處Z-VAD-FMK完全抑制通過抗人IgM誘導的細胞凋亡，但不抑制通過Hex-hA20誘導的細胞凋亡，這表明Hex-hA20出現(xiàn)半胱天冬酶-依賴性和半胱天冬酶-非依賴性途徑。盡管間接通過抗原結合的維妥珠單抗與第二抗體的交聯(lián)或者直接通過Hex-hA20的多價接合可假設性獲得CD20簇集，但前者而非后者導致細胞內(nèi)鈣水平的快速上升(未顯示)。效應子功能。使用人補體和Daudi細胞來體外評估CDC活性(圖5B，左)。維妥珠單抗表現(xiàn)出強效CDC活性。令人驚訝的是，Hex-hA20不能在Daudi細胞中誘導CDC。因為CH3-AD2-IgG-hA20以類似維妥珠單抗的效能誘導CDC，通過加入小AD2肽的維妥珠單抗的羧基末端的修飾不會影響CDC，這表明盡管Hex-hA20具有結合Clq的能力，但加入四個Fab-DDD2基團明顯抑制補體固定(數(shù)據(jù)未顯示)。Hex-hA20和維妥珠單抗具有可比較的ADCC(圖5B，右)。因此，Hex-hA20的Fc誘導ADCC。同型粘附。Hex-hA20、Tetra-hA20和Tri-hA20誘導Daudi細胞的同型粘附，這導致具有中等尺寸至大尺寸的聚集體的＞50％的細胞，而在相同條件下，觀察到的維妥珠單抗的細胞聚集程度類似于未經(jīng)處理對照的細胞聚集程度(未顯示)。CD20/Hex-hA20的膜定位。使用霍亂毒素亞單位B-AlexaFluor488作為神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1(一種常見脂筏標志物)的報道分子，使用免疫熒光顯微術來檢查與維妥珠單抗或Hex-hA20結合后在細胞表面處CD20的分布。使用維妥珠單抗或Hex-hA20對Daudi細胞的孵育導致形成具有標點斑點(punctuatespot)的膜補丁或帽，其與通過霍亂毒素亞單位B獲得的顯像極佳地匹配，這表示在脂筏中CD20的定位(未顯示)。盡管觀察到的熒光圖譜類似，但維妥珠單抗似乎形成比Hex-hA20更大和更系的補丁(未顯示)。血清穩(wěn)定性。據(jù)發(fā)現(xiàn)，Hex-hA20具有如維妥珠單抗在血清中相同穩(wěn)定性，在11天之后其維持86％結合活性(未顯示)。這些結果類似于之前所報道的雙特異性Tri-Fab復合物的那些結果(Rossi等人，2006，ProcNatlAcadSciUSA103：6841-6)。藥物代謝動力學分析。使用放射性碘化制劑，據(jù)發(fā)現(xiàn)，當靜脈給予時，Hex-hA20比維妥珠單抗快～4.5倍清除，這導致與維妥珠單抗相比慢3.7-倍的Hex-hA20的平均停留時間(127小時比對472小時)。當皮下給予時，Hex-hA20(T1/2～3天)以比維妥珠單抗遠遠更快的速率清除(T1/2＞9天)，兩者具有24小時的相同Tmax(未顯示)。然而，相比于維妥珠單抗，Cmax僅為Hex-hA20的一半高度(12.9nmol/比對25.7nmol/L)。體內(nèi)功效。在使用Daudi模型的多劑量研究中，使用30μg(q7dx2)和6μg(q7dx2)的Hex-hA20來處理小鼠。如在圖6A中所示，當與鹽水對照相比時，兩處理導致顯著改善平均存活時間(MST)(21天比對66.5和42；P＜0.0001)。盡管在高劑量下給予Hex-hA20和維妥珠單抗的小鼠之間未觀察到存活率的顯著差異，但似乎接受低劑量的Hex-hA20的小鼠具有比接受等同劑量的維妥珠單抗的那些小鼠顯著更低的MST(P＝0.0044)。我們也檢查使用Raji模型下效應細胞對抑制腫瘤生長的作用(圖6B)。在耗竭NK細胞和嗜中性粒細胞的那些動物中，在鹽水對照和經(jīng)維妥珠單抗或Hex-hA20處理的小鼠之間沒有差異(所有三組均為MST＝17天)。相反，接受Hex-hA20或維妥珠單抗的未耗竭的小鼠具有比鹽水對照顯著改善的存活率(P＝0.0034)，對于Hex-hA20、維妥珠單抗和未經(jīng)處理者分別具有59、41和19天的MST。重要的是，在該較高摩爾等同劑量下觀察到Hex-hA20比維妥珠單抗更好的處理結果(P＝0.05)(465μgHex-hA20比對200μg維妥珠單抗)。討論Tri-hA20而非維妥珠單抗能夠強效體外抑制CD20陽性細胞的增殖的事實與在Tri-hA20中所有三種Fab能夠同時結合CD20的模型一致，這導致CD20的簇集以及信號轉導開始，其導致我們推導出抗-CD20抗體所需的3的最小效價有效地誘導在沒有交聯(lián)下生長抑制?；谠谀承w外測定法中它們的功效，已由Cragg及同事(Cragg等人，2003，Blood101：1045-52)分類抗-CD20mAb為通過利妥昔單抗代表的類型I或者通過托西莫單抗代表的類型II。我們注意到，Hex-hA20表現(xiàn)出可歸因于類型II(例如，對CDC和鈣動員陰性；對抗增殖、細胞凋亡和同型粘附陽性)和類型I(例如，對至脂筏的運輸陽性)的生物性質。因此，轉化類型I抗-CD20mAb至類型II的一種有效方法可通過使類型ImAb多效價來實現(xiàn)。信號轉導途徑的初步研究表明Hex-hA20誘導半胱天冬酶-依賴性以及半胱天冬酶-非依賴性細胞凋亡。鑒定與CD20與Hex-hA20或Tri-hA20的結合相關的亞細胞事件的另外研究在進行中，其可明確揭示解釋具有明確組成的多價抗-CD20抗體的抗增殖效能的分子因子。這些結果證實通過DNL方法制備的多價抗體產(chǎn)生更有效能。熟練技術人員意識到，使用相同技術可構建包含諸如P4/D10、2G12、2F5或4E10的一種或多種抗-HIV抗體或其片段的多價DNL復合物。實施例6.聚乙二醇化DNL復合物在某些實施方案中，可將PEG部分并入DNL復合物內(nèi)以例如提供效應子部分的可再生和均質聚乙二醇化產(chǎn)物。作為第一步，在市售肽合成器上合成用于并入DNL復合物內(nèi)的能夠共價綴合PEG部分的以下肽亞單位。將Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH用于添加SS-tbu殘基。將Fmoc-Gly-EDANS樹脂用于附接G-EDANS部分。IMP350CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-NH2(SEQIDNO：93)IMP360CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-G-EDANS(SEQIDNO：94)IMP421Ac-C-PEG3-C(S-tBu)GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(S-tBu)G-NH2(SEQIDNO：95)IMP362、IMP413和IMP457的生成通過使IMP360與20-kDa或30-kDa的mPEG-OPTE(NectarTherapeutics，SanCarlos，CA)偶聯(lián)來制備兩線性PEG-AD2模件，分別得到IMP362或IMP413。為了制備IMP362，將IMP360(11.5mg)與20-kDamPEG-OPTE(127mg)在7mL的1MTris-HCL，pH7.8中混合。將乙腈(1mL)加入以溶解一些懸浮的材料。在室溫下將反應攪拌4小時以作用于通過酰胺鍵的mPEG與氨基末端半胱氨酸的附接。隨后，將41mg的Tris[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)和43mg的半胱氨酸加入以脫保護剩余半胱氨酸。將反應混合物攪拌1小時，并使用已用20％水中的甲醇平衡的PD-10柱脫鹽。將樣品凍干以獲得約150mg的IMP362。使用30-kDamPEG-OPTE(190mg)類似地制備IMP413。使用mPEG2-MAL-40K(NectarTherapeutics)類似地制備IMP457以獲得支鏈的PEG-AD2模件(IMP457)。在哺乳動物細胞中用于表達的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的構建通過使用全長人IFNα2bcDNA克隆物(InvitrogenULTIMATETMORF人克隆物cat#HORF01克隆物IDIOH35221)作為模板和以下寡核苷酸作為引物的PCR來擴增IFN-α2b的cDNA序列：IFNA2XbaI左側5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG-3’(SEQIDNO：96)IFNA2BamHI右側5’-GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3’(SEQIDNO：97)所得分泌的蛋白由在其C-末端處與由SEQIDNO：98組成的多肽融合的IFN-α2b組成。KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：98)將PCR擴增引物克隆至載體內(nèi)。通過使用XbaI和BamHI限制性核酸內(nèi)切酶的消化來制備用于與IFN-α2b接合的DDD2-pdHL2哺乳動物表達載體。使用XbaI和BamHI由切除IFN-α2b擴增引物，并將其接合至DDD2-pdHL2載體內(nèi)以生成表達載體IFN-α2b-DDD2-pdHL2。通過使用SalI酶消化來使IFN-α2b-DDD2-pdHL2直線化，并通過用于產(chǎn)生表達的蛋白的電穿孔來將其穩(wěn)定地轉染至Sp/EEE骨髓瘤細胞內(nèi)(參見，例如，美國專利No.7,537,930，其實施例部分以引用方式并入本文)。α2b-362(IFN-α2b-DDD2-IMP362)的制備和純化α2b-362的結構具有偶聯(lián)至20kDaPEG-AD的IFNα2b-DDD2的兩個拷貝。通過在250mM咪唑、0.02％吐溫20、150mMNaCl、1mMEDTA、50mMNaH2PO4，(pH7.5)的10倍摩爾過量的2.25mg(3.5ml)的IFN-α2b-DDD2中加入11mg的還原和凍干的IMP362來進行DNL反應。在室溫下在黑暗處6小時之后，將反應混合物凍干以及通過在陽離子交換樹脂上的柱層析來純化。DNL反應導致位點特異性以及IMP362與IFN-α2b的二聚體的共價綴合?？傊?，DNL反應導致均質產(chǎn)物的在通過陽離子交換層析的純化之后＞90％純的接近定量產(chǎn)率(未顯示)。通過類似技術制備聚乙二醇化產(chǎn)物α2b-457(IFN-α2b-DDD2-IMP457)和α2b-413(IFN-α2b-DDD2-IMP413)。藥物代謝動力學在成年雌性Swiss-Webster小鼠(～35g)中進行研究。以作為單次快速推注靜脈注射的等摩爾的蛋白劑量(3μg的rhuIFN-α2a、5μg的11μg的α2b-362以及13μg的α2b-413)來施用各試劑(測試和對照)。在各時間點(給藥前、注射后5-分鐘、2-、8-、24-、48-、72-、96-和168-h)下通過眼眶后方法給小鼠取血。使血液凝結，離心，并將血清分離和保存在-70℃下直至測定IFN-α濃度以及隨后PK-分析。各試劑的PK性質概述在表6中。如所預期，rhIFN-α2a具有從注射小鼠的血液最快的清除率。它的清除率比快約3倍以及比DNL-EFN試劑更快13倍。結果，清除比α2b-362或α2b-413更快4倍。在α2b-362和α2b-413之間的消除率上有較小差異。依據(jù)平均停留時間(MRT)，在各試劑之間與尺寸有明確相關性。19-kDarhIFN-α2a具有比31kDa低7倍的MRT(分別為0.7小時比對5.1小時)，當與70kDaα2b-362(10.3小時)相比時，其具有低2倍的MRT。80kDaα2b-413的MRT(21.7小時)比α2b-362長兩倍。最后，生物等效的測試顯示：根據(jù)PK，沒有測試的試劑相同，這表明該差異是真實的(即，循環(huán)半衰期為：α2b-413＞α2b-362＞＞rhIFN-α2a)。體內(nèi)功效體內(nèi)腫瘤治療研究證實：DNL-聚乙二醇化干擾素比更強效和持續(xù)更久。以1.5x107細胞/動物向8周齡雌性C.B.-17SCID小鼠靜脈注射人Burkitt淋巴瘤細胞系(Daudi)。每7天通過在左或右側皮下注射3種不同劑量(3500、7000和14000單位)來施用等同單位活性的α2b-362和α2b-413。在植入Daudi細胞之后1天開始治療。繪制存活率曲線。當與鹽水對照小鼠相比，α2b-362和α2b-413均證實顯著改善存活率(P＜0.0016)(未顯示)。當?shù)然钚詣┝渴┯脮r，除了3,500IU劑量的α2b-362之外，α2b-413和α2b-362均優(yōu)于(P≤0.0027)(未顯示)。α2b-362顯示比的效能大兩倍(未顯示)。7,000IU和3,500IU的α2b-362的劑量分別優(yōu)于14,000IU(P＝0.0016)和7,000IU(P＝0.0027)劑量的(未顯示)。因為3,500IU劑量的前者優(yōu)于14,000IU的后者，所以α2b-413比更強效四倍(P＝0.0027)(未顯示)。當以等同劑量施用時，α2b-413顯著優(yōu)于α2b-362(P＜0.0025)。然而，即使與3,500IU劑量和其46天存活中值相比14,000IU劑量導致60天的存活中值，在三劑量的α2b-413之間也沒有統(tǒng)計學顯著差異(P＝0.1255)。因此，觀察到的α2b-362、α2b-413和的體內(nèi)功效與PK數(shù)據(jù)較好相關。通過PK分析證實的α2b-362和α2b-413的增加的生物利用率歸因于增強的DNL-聚乙二醇化IFNα的體內(nèi)抗腫瘤效能。結果，這兩個因素使得在腫瘤治療中可以更低頻率的時間表給藥。使用如上的類似體內(nèi)腫瘤治療證實這點，其中使用不同給藥時間表來施用等單位活性的或α2b-413。通過皮下注射在左或右側以14,000IU來施用各試劑(測試和對照)。當與在與相同時間表下處理的那些動物相比較，所有經(jīng)IFN-IMP413處理的小鼠具有顯著改善的存活率(P＜0.0097)(未顯示)。注意，那些每隔一周使用IFN-IMP413(q2wkx4)處理的小鼠不僅具有與那些在相同時間表下使用處理的那些相比顯著改善的存活率(分別MST＝＞54天比對28天；P＝0.0002)，也比使用每周處理的動物(q7dx4)顯著更好(MST＝36.5天；P＝0.0049)(未顯示)。而且，使用IFN-IMP413每三周一次處理(q3wkx4)的小鼠的存活率顯著優(yōu)于使用每兩周處理一次的那些(MST＝54天比對28天；P＝0.002)，并當與使用每周處理一次的那些相比接近顯著(P＝0.0598)(未顯示)。在另一研究中，我們發(fā)現(xiàn)，以14,000IU每4周一次施用α2b-413由鹽水對照的23天增加存活中值至56天，并且比以14,000IU每周一次給予的更強效(未顯示)。為了更好地與比較，我們綴合IFNα2b-DDD2至IMP457，一種40-kDa支鏈PEG的AD2-模件，并獲得所得α2b-457。與α2b-413相比，通過三種不同測定法測定的α2b-457的體外生物活性比更低，并相對比顯著更高(未顯示)。使用單次皮下注射的小鼠中獲得的PK數(shù)據(jù)表明α2b-457比α2b-413或的更長循環(huán)半衰期，三者均比清除更慢(未顯示)。當以20pmol的低劑量每四周一次給予時，α2b-457比以摩爾等同劑量每周一次給予的更有效。當與鹽水組的23天比較時，α2b-457的施用延長具有Daudi的小鼠的存活中值至47天(未顯示)。在相同的研究中，20pmol下α2b-457顯著優(yōu)于20pmol下α2b-413或(MST＝47天比對分別的41和37天；P＜0.0151)(未顯示)。與相比，20pmol劑量的α2b-413也改善存活率(P＝0.002)(未顯示)。在10pmol下，在α2b-457和α2b-413之間沒有差異，但顯著改善在經(jīng)處理的小鼠內(nèi)存活率(P＜0.001)(未顯示)。這些研究證實：即使當與IFNα2b的聚乙二醇化形式相比時，使用DNL技術使治療劑聚乙二醇化也導致改善功效和使功效持續(xù)更長時間，這使得可以更低頻率給藥。熟練技術人員意識到，DNLPEG綴合物可提供抗-HIV治療劑的類似改善的藥物代謝動力學和/或功效。實施例7.抗-HIVDNL復合物在中和HIV-1的各種抗體中，通過它的誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)以消除表達結合P4/D10的抗原性gp120表位的受感染的T細胞的能力來區(qū)分鼠抗-gp120抗體，P4/D10(Broliden等人，1990，JVirol64：936-40)。增強的效能也顯示在阿霉素-綴合的P4/D10的以上實施例1中以中和和抑制體外HIV感染的細胞內(nèi)散布，以及以保護抵抗體內(nèi)HIV-1/MuLV感染(Johansson等人，2006，AIDS20：1911-15)。將對接和鎖定(DNL)方法用于生成包含P4/D10IgG或其他抗體或其片段以及一種或多種抗-HIV試劑的DNL復合物。在本文示出的優(yōu)選的實施方案中，抗-HIV試劑是T20HIV融合抑制劑(恩夫韋地，)(Asboe，2004，HIVClinTrials5：1-6)。然而，熟練技術人員意識到，可使本領域已知、以上更詳細描述的其他抗-HIV治療劑附接抗-HIVDNL復合物或者在施用抗-HIVDNL復合物之前、同時或之后單獨施用。主題DNL復合物的初始靶HIV患者群體是HAART治療失敗的個體，其中多劑量的DNL綴合物可有效地降低受感染的細胞和循環(huán)病毒顆粒的數(shù)目。第二類患者群體是對HAART有效的個體，其目的是為了達到和消除少數(shù)持續(xù)、產(chǎn)生病毒的細胞。在圖7所示的優(yōu)選的實施方案中，DNL方法用于開發(fā)包含連接具有HIV-1的特異性的嵌合、人或人源化抗體的恩夫韋地(T20)的多個拷貝的新型種類的抗-HIV試劑。通過短接頭使IgG抗體的各重鏈的C-末端附接至AD2部分(SEQIDNO：4)，并將其表達為如以上實施例中所述的融合蛋白。使T20HIV融合抑制劑附接DDD2部分(SEQIDNO：2)，并也表達為融合蛋白。DDD2部分的兩個拷貝自發(fā)形成結合AD2部分的二聚體，其形成包含IgG抗體和T20的四個拷貝的DNL復合物。迄今獲得的臨床前研究表明這些IgG-(T20)4綴合物應當使可比未綴合的T20頻率更低地給藥以阻斷HIV-1進入T細胞、中和無HIV-1的細胞以及消除HIV-感染的細胞。DDD2-T20氨基酸序列顯示在以下SEQIDNO：99中。DDD2的序列標有下劃線。這隨后為用于親和純化的短接頭和鉸鏈區(qū)以及聚組氨酸標簽。在C-末端處T20的序列標有粗體。DDD2-T20由LC-MS顯示的大腸桿菌中產(chǎn)生以具有由設計的氨基酸序列預測的精確質量(數(shù)據(jù)未顯示)，并將其用于制備如下所述的DNL復合物。DDD2-T20MCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARAEFPKPSTPPGSSGHHHHHHGSYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQIDNO：99)P4/D10是當向人受試者施用時可誘導人抗-小鼠抗體(HAMA)的鼠抗體。P4/D10的嵌合或人源化形式對于人治療用途更加合適。通過移植P4/D10的VH和Vκ序列(圖8)至人IgG1的恒定區(qū)序列來構建嵌合的P4/D10(cP4/D10)。所得cP4/D10具有如在可變結構域的P4/D10中相同DNA和氨基酸序列(圖9)。制備cP4/D10，并發(fā)現(xiàn)它對gp160(包含gp120和gp41)的結合親合力與鼠P4/D10的結合親合力可比較(圖10A)。也發(fā)現(xiàn)，對位于gp120的V3環(huán)中P4/D10的反應表位的cP4/D10的結合親合力與P4/D10可比較，并不受8M脲存在下影響(圖10B)。除了代表中和抗-HIVmAb的cP4/D10之外，使用兩種人源化IgG1抗體、h734(抗-銦-DTPA)和hLL2(依帕珠單抗；抗-CD22)以及hA20的Fab(維妥珠單抗，抗-CD20)體外研究和證實使T20與其他抗體綴合以增強T20的效能的潛能。結果(圖11至圖13)顯示通過并入它至具有大量既未中和也未針對HIV的細胞表面受體(CD4)或共同受體(CCR5和CXCR4)的抗體或抗體片段的DNL復合物內(nèi)可改善常見HIV-融合抑制劑以及特別是T20的功效。通過共同施用具有諸如2G12(Hessell等人，2009，PLoSPathogens5：e1000433)的廣泛中和抗體和/或靶向CD4、CCR5或CXCR4的抗體的含有T20的DNL復合物可達到對功效的進一步增加。以下表7列出迄今制備的含有T20的選擇性DNL綴合物以及它們各自的抗體組分。hLL2-(T20)4、cP4/D10-(T20)4和hA20-Fab-(T20)2以及它們對應AD2模件的SE-HPLC分析與DNL復合物的所提出結構一致。表7.DNL-T20復合物。DDD2-T20在大腸桿菌中產(chǎn)生以及與h734-IgG-AD2和hLL2-IgG-AD2模件一起使用以制備h734-(T20)4和hLL2-(T20)4、對HIV特異的兩種DNL復合物。圖11A通過p24ELISA比較DDD2-T20h734-(T20)4和未綴合的T20()的體外中和活性(Johansson等人，2006，AIDS20：1911-15)，當以μg/ml的各試劑濃度表示X軸時，其顯示幾乎相等的效能。因為h734-(T20)4的分子量顯著高于DDD2-T20或T20，將這些數(shù)據(jù)以摩爾濃度再進行繪制(圖11B)。當以摩爾計繪制時，顯示h734-(T20)4優(yōu)于DDD2-T20和T20的更好效能(圖11B)。使用選擇性HIV融合抑制劑的公開數(shù)據(jù)對h734-(T20)4的效能的比較提供在表8中。與T20的1至2nM相比，h734-(T20)4復合物表現(xiàn)出約0.1nM的EC50。與T20的約10nM相比，h734-(T20)4復合物表現(xiàn)出約0.6nM的EC90。h734-(T20)4DNL復合物的EC50和EC90值比任何其他HIV融合抑制劑所報道的那些值更低(表8)。這些結果顯示：即使當使用非靶向抗體時，其與T20的DNL復合物表現(xiàn)出比未綴合的T20基本上更高的效能，其顯著優(yōu)于使用非DNL的其他技術制備的融合抑制劑的綴合物。例如，與未綴合的T20相比，EP40111，T20的PEG-戊多糖綴合物具有基本上降低的效能。PC-1505，C34的人血清白蛋白綴合物(與T20相比，顯示一定程度改善的功效，但具有類似半衰期的T20類似物)未顯示超過T20的改善的效能。表8.HIV融合抑制劑的效力DNL試劑的體外功效進一步圖示在圖12A-D中，其比較中和在JurkatT細胞中HIV-1IIIB和在PBMC中HIV-16794的P4/D10、cP4/D10、cP4/D10-(T20)4、h734-(T20)4和hLL2-(T20)4的效力。這些結果表示如下。在中和在JurkatT細胞中HIV-1IIIB上，cP4/D10和P4/D10的效力等同(圖12A)。在中和HIV-1IIIB和HIV-16794上，cP4/D10-(T20)4比cP4/D10更強效(圖12B-D)。在中和HIV-1上，hLL2-(T20)4和h734-(T20)4均令人驚訝地比cP4/D10-(T20)4更高(圖12D)。未綴合的hLL2和hMN-14IgG不具有中和活性(圖12A-D)。表9概述由圖12A-@中所顯示結果評估的EC50值。表9.未綴合的T20、未綴合的抗體和綴合的DNL復合物的相對效力通過測定在SAHA(辛二酰替苯胺異羥肟酸)激活之后在30天的時間段內(nèi)在PBMC中針對HIV-1IIIB的hLL2-(T20)4的中和活性來研究用于治療潛伏受感染的細胞的DNL-T20復合物的潛在用途(圖13)。對于比較，cP4/D10、T20和hLL2也包括在研究中。獲得的結果表明：在30天的時間段內(nèi)在添加SAHA的培養(yǎng)基中觀察到通過p24ELISA(圖13A)或p24-陽性培養(yǎng)物(圖13B)測定的HIV復制的大量和持續(xù)增加，其幾乎可被hLL2-(T20)4、cP4/D10或T20完全抑制。在第30天，如圖13C所示，三種試劑分別降低p24-陽性培養(yǎng)物至小于5％的培養(yǎng)基+SAHA對照。令人驚訝的是，hLL2也降低p24-陽性培養(yǎng)物至約50％的培養(yǎng)基+SAHA對照。hLL2結合存在于成熟B細胞的表面上的CD22抗原。如下測定hLL2-(T20)4的體內(nèi)穩(wěn)定性。向天然SCID小鼠(總計11只)皮下注射hLL2-(T20)4(100μg；500pmol)。分別由2、3、3和3只小鼠中在0.5、6、24和72小時處收集血清樣品，并保存在-70℃下直至通過ELISA分析。以相同方式使用hLL2IgG(75μg；500pmol)來進行平行研究。通過兩種不同ELISA來檢查使用hLL2-(T20)4注射的小鼠的血清樣品，一種設計為僅定量完整hLL2-(T20)4，而另一種定量有或者沒有連接T20的所有含有hLL2的種類。對于hLL2-(T20)4的量化，使用F(ab′)2-特異性、山羊抗-人IgG以及經(jīng)本身發(fā)育的小鼠抗-DDD2mAb(5E3)探測的捕獲抗體，隨后為HRP-綴合的山羊-抗-小鼠來涂覆平板。用于測定所有含有hLL2的種類，使用抗-人F(ab′)2來涂覆平板，并使用大鼠抗-idmAb至hLL2(WN)、隨后為HRP-綴合的山羊抗-大鼠抗體探測捕獲的抗體。將第二次分析也用于測定hLL2的血清水平。在圖14中顯示的結果表明：因為通過兩次分析測定的血清濃度在6、24和72小時處可比較，所以hLL2-(T20)4呈現(xiàn)出至少3天的體內(nèi)穩(wěn)定。在72小時處hLL2-(T20)4的生物利用率約為hLL2的生物利用率的一半。將具有廣譜和有效HIV中和活性的抗體連續(xù)識別和工程化(Burton和Weiss，Science2010；329：770-3)，并且它們中的一些可具有在DNL構建體中使用的更優(yōu)性能。也可將諸如抗-CD4的另外的抗體和諸如下一代產(chǎn)品融合抑制劑的可選的HIV-抑制劑用作DNL綴合物的組分。與在HIV的單一療法中自身有效的未綴合的抗體共同施用也可達到增強的功效。靶向HIV糖類和糖蛋白的多個糖-表位的人源化和完整人mAb有效地靶向在針對早期HIV-1感染的消極免疫中HIV-感染的細胞和病毒粒子或者在HAART有效或失敗下的HIV-1。通過在HIV病毒粒子和/或受感染的細胞的跨膜區(qū)處插入分子自身可進一步輔助HIV-特異性靶向。因此，本設計的DNL綴合物應當選擇性靶向受感染的細胞，而不靶向未受感染的細胞。熟練技術人員意識到，使用上述技術可將其他抗體和/或HIV治療劑并入DNL構建體內(nèi)。其他HIV治療劑的例子包括但不限于：sCD4-D1-D2(West等人，2010，JVirol.84：261-69)；CP32M(He等人，PNAS2008；105：16332-7)；IZN17(Eckert和Kim，PNAS2001；98：11187-92)；C34(Stoddart等人，JBiolChem2008；283：34045-52)；T1144(Dwyer等人，PNAS2007；104：12772-7)；C52L(Deng等人，Biochemistry2007；46：4360-9)；CCR5拮抗劑，例如馬拉韋羅(maraviroc)或維克力韋羅(vicriviroc)；以及以下試劑，例如阿巴卡韋、氨多索韋、AOP-RANTES、阿立他濱、阿扎那韋、貝韋立馬、BMS-378806、胡桐素A、CCR5、CD4、塞拉格尼、可比司他、抗病毒藍藻蛋白-N、地瑞那韋、二芳基嘧啶類化合物、去羥肌苷、德羅格韋、efavirenz、埃替拉韋、艾夫他濱、emtricitabine、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、費替那韋、福沙那韋、膦甲酸、格瑞弗森、格魯博南A、羥基脲、茚地那韋、KP-146、拉米夫定、來非那韋、來司韋林、洛匹那韋、米替福新、MK-2048、奈非那韋、奈韋拉平、拉西韋、雷特格韋、利托那韋、沙奎那韋、塞利西利、司他夫定、司他匹定、雙脫氧胸苷、T61、T651、T1249、T2635、Tat拮抗劑、替諾福韋、替拉那韋、天花粉蛋白、TRIM5α、韋瑞康、扎西他濱、齊多夫定或齊多夫定?？蓪⑦@些其他抗-HIV治療劑附接或并入DNL復合物內(nèi)，或者可選地將其在施用DNL復合物之前、同時或之后向受試者共同施用?？赡苁褂玫钠渌贵w包括：抗-CD4抗體，例如伊巴珠單抗(ibalizumab)(Bruno和Jacobson，2010，JAntimicrobChemother65：1839-41)；抗-Leu3a、L120、OKT4A、13B8.2或L71；抗-CCR5抗體，例如NBP1-43335、ab10397、2D7、HGS004、MC-1、MC-4、MC-5、PA9、PA14或PRO140(參見，例如，Lopalco，2011，JTranslMed9：S4)；或中和抗-HIV抗體，例如2G12(Armbruster等人，J.Antimicrob.Chemother.54：915-20，2004)、2F5(Bryson等人，ProteinandPeptideLetters，8：413-18，2001)、3D6(Ruker等人，Ann.NYAcad.Sci.646：212-19，1991)、b12(例如，Wu等人，JVirol2006，80：2585)、X5(Moulard等人，ProcNatlAcadSci2002，99：6913-18)、C37(Cao等人，DNAandCellBiology，12：836-41，2004)、1ACY、1F58、1GGGC(Berry等人，Proteins，45：281-82，2001)或4E10(Cardoso等人，2005，Immunity22：163-73)。熟練技術人員意識到，使用本文所述的方法可將包含任何抗體或其抗原結合片段的DNL復合物并入DNL復合物內(nèi)。在可選的實施方案中，如以上實施例6中所述，使用PEG將諸如T20的HIV治療劑并入DNL構建體內(nèi)以提供改善的藥物代謝動力學性質和降低的施用頻率。實施例8.聚乙二醇化抗-HIV試劑DNL復合物如在以上實施例6，選自IMP362、IMP413和IMP457中所述制備PEG-AD2部分。如在以上實施例7中所述制備T20-DDD2。由包含附接兩個T20部分的一個PEG部分的PEG-AD2和T20-DDD2形成DNL復合物。聚乙二醇化T20DNL復合物顯示與未綴合的T20相比可比較的功效以及超過其血清半衰期更高的數(shù)量級，使得可每周施用而不是每日施用。與未綴合的T20相比，觀察到DNL復合物的注射位點副反應的發(fā)生率降低。實施例9.具有人源化抗-HIV抗體的DNL復合物根據(jù)Leung等人(1995，Mol.Immunol.，32：1413)，通過使鼠CDR序列附接人抗體構架區(qū)(FR)和恒定區(qū)序列，如在實施例7中所述制備的嵌合的P4/D10抗體用于制備人源化P4/D10(hP4/D10)。使用如人源化抗-CD22抗體依帕珠單抗的相同人IgG供體FR來構建人抗體FR序列(Leung等人，MolImmunol1995；32：1413-1427)。具體而言，選擇重鏈的人EU抗體的FR1、FR2和FR3以及人NEWM抗體的FR4以及選擇hP4/D10抗體的輕鏈的人REI抗體的FR。如在美國專利No.7,151,164中所公開，將關鍵鼠殘基保留在FR中以維持hP4/D10與gp120的結合特異性和親合力。使用引物VK1BACK和VK1FOR來擴增MAb的Vκ序列(Orlandi等人，1989)。使用引物對VH1BACK/VH1FOR來擴增VH序列(Orlandi等人，1989)。將含有10μl的第一鏈cDNA產(chǎn)物、10μl的10XPCR緩沖劑[500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)、15mMMgCl2和0.01％(w/v)明膠](PerkinElmerCetus，Norwalk，Conn.)、250μM的各dNTP、200nM的引物以及5單位的TaqDNA聚合酶(PerkinElmerCetus)的PCR反應混合物進行30次PCR的循環(huán)。各PCR循環(huán)由在94℃下變性1分鐘、在50℃下退火1.5分鐘以及在72℃下聚合1.5分鐘組成。將擴增的Vκ和VH片段在2％瓊脂糖(BioRad，Richmond，Calif.)上純化。通過聯(lián)合如Leung等人(Mo1.Immunol.，32：1413(1995))所述的長寡核苷酸模版合成和PCR擴增來構建人源化V基因。將Vκ的PCR產(chǎn)物亞克隆至含有Ig啟動子、信號肽序列和方便限制性位點的基于pBR327的分級載體，VκpBR內(nèi)以便于VκPCR產(chǎn)物的框內(nèi)接合。將VH的PCR產(chǎn)物亞克隆至基于pBluescript的VHpBS內(nèi)。通過Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977))的方法測序含有各PCR產(chǎn)物的單獨的克隆物。分別通過作為HindIII-BamHI片段的雙重限制性消化從VKpBR和VHpBS中切除含有Vκ和VH序列以及啟動子和信號肽序列的表達盒。如通過Gilles等人(J.Immunol.Methods125：191(1989)中所述以及也顯示在Losman等人，Cancer，80：2660(1997))中，將Vκ和VH表達盒組裝在作為XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段切除的修飾分級的載體VκpBR2和VHpBS2中，并將其亞克隆至單個表達載體pdHL2內(nèi)。將表達載體轉染至Sp-EEE、Sp-ESF或Sp-ESF-X哺乳動物宿主細胞內(nèi)以用于表達和抗體產(chǎn)生。如下由細胞培養(yǎng)基中分離抗體。使用HSFM使細胞作為在滾瓶中500ml培養(yǎng)物生長。將培養(yǎng)物離心以及將上清液過濾通過0.2μl膜。使過濾的培養(yǎng)基通過蛋白A柱。然后使用約10柱體積的PBS來洗滌樹脂，并由具有0.1M含有10mMEDTA的甘氨酸緩沖劑(pH3.5)的柱洗脫蛋白A結合的抗體。將峰部分匯集，針對PBS透析，并使用30濃縮器(Amicon，Beverly，Mass.)來濃縮抗體。如以上實施例7中所述使純化的hP4/D10附接AD2部分。使CP32M融合抑制劑肽附接DDD2以及表達為如上實施例7所述的融合蛋白。如在以上實施例7中734-T20DNL復合物所述制備包含附接DDD2-CP32M的hP4/D10-AD2的DNL復合物。與734-T20DNL復合物相比，hP4/D10-CP32MDNL復合物顯示顯著改善的功效和等同的血清半衰期。實施例10.用于DNL復合物形成的其他抗-HIV抗體的使用2G12抗-HIV抗體購自PolymunScientific(Vienna，Austria)。如以上實施例7中所述制備AD2-2G12融合蛋白。如以上實施例7中所述制備DDD2-T20。如以上實施例7中734-T20DNL復合物所述制備包含附接DDD2-T20的2G12-AD2的DNL復合物。與734-T20DNL復合物相比，2G12-T20DNL復合物顯示顯著改善的功效以及等同的血清半衰期。***鑒于本公開，在沒有過度實驗下可制備和實施本文所公開和所要求保護的所有組合物和方法。盡管依據(jù)優(yōu)選的實施方案已經(jīng)描述組合物和方法，對于本領域技術人員顯然，在沒有違背本發(fā)明的概念、精神和范圍下變化形式可應用于本文所述的組合物和方法以及方法的步驟或者步驟的順序中。更具體而言，化學和生理上相關的某些試劑可替代本文所述的試劑，同時得到相同或相類似的結果。對本領域技術人員顯而易見的所有這些類似的替代和修改均被認為在如所附權利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。