專利名稱：針對hiv p17蛋白、能夠中和p17與p17受體(p17r)結合的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種針對HIV pl7蛋白的單克隆抗體，所述抗體能夠中和pl7蛋白和在免疫活性細胞表面表達的P17蛋白受體(pl7R)之間的結合。
背景技術：
已知pl7蛋白在AIDS的發(fā)病機理方面起重要作用。也已知P17代表針對HIV-I的中和抗體的靶標，且高水平的抗pl7抗體與較慢的AIDS病情發(fā)展是相關的。除了在病毒復制中的支持作用之外，pl7還表現(xiàn)出若干免疫調(diào)節(jié)特性，這些特性在病毒發(fā)病情況下有重要意義。P17確實被證明可以增加HIV-I的體外復 制，并影響除組成病毒的靶細胞如CD4+T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、漿樣樹突狀細胞的增殖能力外，還影響其活化和分化狀態(tài)。P17干擾免疫系統(tǒng)各種細胞的生理功能及其增加促炎癥分子產(chǎn)生的能力，很可能是病毒引起的用以逃避免疫反應，同時創(chuàng)造一個更適合病毒感染和復制的場所的一種機制。近來，也觀察到P17被輸出到被感染細胞的外部，且其可以在被感染HIV-I病人的血清中檢測到，其殘留在淋巴結中，也可以在用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物成功治療且因此沒有病毒復制的病人中檢測到。這些發(fā)現(xiàn)導致相信在體外觀察到的反應機制也可能同樣發(fā)生在體內(nèi)。此外，在先前的研究中本發(fā)明人證實了 pl7蛋白通過與在若干免疫活性細胞表面表達的特異性受體(P17R)相互作用，而直接發(fā)揮其生物活性。本發(fā)明人也鑒定出與受體結合有關的P17N末端區(qū)域內(nèi)的表位。該表位的氨基酸序列已被鑒定，并可用于設計長度為20個氨基酸、命名為AT20的合成肽，HIV-1BH10分離物(HIV-1B亞型)的pl7的功能區(qū)域代表。連接有鑰孔戚血藍素(KLH)蛋白的合成肽AT20導致產(chǎn)生抗pl7中和抗體，其能夠封閉pl7/P17R的相互作用，從而發(fā)揮其生物活性。在后來的研究中，本發(fā)明人也已經(jīng)證實用全長pl7 BHlO蛋白或合成肽AT20-KLH對動物進行免疫，可引起產(chǎn)生中和血清，其能夠抑制下列蛋白結合到P17R，不僅包括pl7BHlO蛋白，而且還有一系列這類蛋白的非洲突變體(African variants),分別被鑒定為S75X、S85X、S92X 和 S012X (Fiorentini 等人·，Vaccine 26 (2008) 4758-4765)。然而，多克隆抗體表現(xiàn)出若干的缺點。首先，不論什么時候需要產(chǎn)生多克隆抗體，都需要訴諸于動物的免疫反應。第二，每次免疫反應中產(chǎn)生的多克隆抗體都必須要描述特征，并被檢驗其結合和中和的特性及其安全特征。由于如所附的權利要求中所述的抗pl7單克隆抗體，這些缺點現(xiàn)在已經(jīng)克服，權利要求的內(nèi)容是本說明書技術教導的一個完整部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主題抗pl7單克隆抗體，下面被命名為“MBA1抗體”，其表現(xiàn)出意料之外的特性，例如，即使其是單克隆抗體，卻具有類似于多克隆抗體的寬范圍的中和活性；但另一方面，其不能識別中和的AT20表位，而上述Fiorentini等人2008年的參考文獻中描述的中和血清，以及先前被描述的且被命名為MBS3的抗pl7中和單克隆(De Francesco等A · Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jul 23; 99 (15) : 9972-7; W02003/016337)卻可以識別中和的AT20表位。下面的實驗部分顯示了現(xiàn)有技術的MBS3抗體和本發(fā)明的MBAl抗體兩者之間結合和中和特性的比較。特別是，與現(xiàn)有技術的MBS3抗體相比，本發(fā)明的MBAl抗體觀察到了更寬范圍的中和活性。歸因于HIV-I pl7蛋白多種突變體和pl7R受體之間的結合以及結合中和能力，本發(fā)明的MBAl單克隆抗體尤其適合用作治療與人類免疫缺陷病毒相關的病癥的藥物。該表達“與人類免疫缺陷病毒相關的”意味著該種病癥是直接或間接地由所述病毒引起的。優(yōu) 選地，與人類免疫缺陷病毒相關的病癥是從由獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、癡呆和淋巴瘤組成的組中選擇的。本發(fā)明的單克隆抗體可能以任一藥學上可接受的方式給藥。例如，該抗體可能通過非腸道途徑給藥，優(yōu)選靜脈注射或緩慢灌注。其他預期的給藥方式有，例如，口服、鼻腔途徑、眼用途徑、直腸途徑以及局部途徑。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可以配制成用于所希望的給藥途徑的任何適合的劑型。除了起活性成分作用的抗體之外，劑型還包括適合于所希望的給藥途徑的藥學上可接受的輔料和/或載體。給藥途徑、劑型、藥學上可接受的輔料和/或載體的選擇在本領域技術人員的技能中已很充分。在特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的單克隆抗體通過注射方式給藥。在這種情況下，該抗體的給藥劑量在約O. lmg/kg至約IOOmg/kg之間的范圍內(nèi)。如果該抗體是通過緩慢灌注方式給藥的，可能使用如約30分鐘到2小時的灌輸周期。對于急性、慢性和間歇性的治療，優(yōu)選在一個月、兩個月或更高的基準上重復給藥。
具體實施例方式下面的實驗部分描述了本發(fā)明的主題MBAl單克隆抗體的制造程序。進一步，報導了為了檢測其結合和中和特性，本發(fā)明人所實施的研究。下面的實驗部分以說明的方式單獨提供，且其并不限制如權利要求所述的本發(fā)明的范圍。實驗部分I.免疫反應第一次注射，用251^/小鼠用在弗式完全佐劑中乳化的pl7BH10蛋白免疫9周的雌性Balb/c小鼠，并用弗式不完全佐劑進行剩下3次的注射。每間隔7天通過腹腔途徑進行上述免疫反應。最后一次免疫接種的3天后實施尾內(nèi)免疫(intra-caudalimmunization)。2.細胞融合和雜交瘤細胞的產(chǎn)生因此為了繼續(xù)與骨髓瘤細胞(NSO)融合，利用無菌操作從每只小鼠中除去脾臟以回收其脾細胞，其在遺傳上除去了次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。將這樣形成的細胞懸浮混合物與聚乙二醇輕輕地緩慢地混合在一起幾分鐘，然后將其轉(zhuǎn)移到在96孔板上含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中，在5%C02及37° C條件下溫育。細胞融合的當天視為第O天，大約3天后檢測到第一個菌落，第一個雜交瘤細胞菌落大約在細胞融合后的15天出現(xiàn)。為了評定存在抗原特異性抗體的可能性，對上清液做篩選。篩選過程是通過ELISA技術完成的。收集陽性雜交瘤克隆，并將其克隆至合適的96孔板中，用以選擇能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞，并分離出源于單克隆的細胞系，從而獲得能夠針對P17BHlO蛋白及其非洲突變體(見下文)的MBAl單克隆抗體。3. pl7 BHlO蛋白的非洲突奪體的產(chǎn)牛及特征用病毒RNA提取試劑盒(Qiagen, Milan,意大利)從烏干達(Uganda)病人的質(zhì)粒中分離出了 HIV-I基因組RNA。然后用MULV逆轉(zhuǎn)錄酶(Applera，Monza,意大利)將提取物逆轉(zhuǎn)錄，并將所得到的cDNA用作通過Pfu DNA聚合酶完成高保真PCR的模板。用下面的引物擴增包括 P17BH10 基因的部分 HIV-I 基因組序列:UGF1(5，_GTG CCC GTC TGT TGTGTGA-3’，SEQID NO: I)和 UGRl (5，-AAT CTT GTG GGG TGG CTC CTT3，，SEQ ID 勵2)用于第一步，呢卩2(5，-ACA GGG ACC TGA AAG CGA AAG-3’，SEQ ID NO: 3)和 UGRl 用于第二步。純化 PCR 產(chǎn)物(Strataprep PCR純化試劑盒；Stratagene, La Jolla, CA,美國)，并將其插入到SrfI消化的pPCR-Script Amp SK(+)克隆載體(Stratagene)中。此后,檢驗核苷酸序列和插入片 段的方位(CRIBI BMR, Padua,意大利)。用下面的引物通過PCR進一步擴增先前克隆的pl7BHlO 片段UGpl7For (5，-TAA GGA TCC ATG GGT GCG AGA GCG TCA-3'，SEQ ID N0:4)和UGpl7Rev (5，-CGG GAA TTC TCA GTA ATT TTG GCT GAC C-3/，SEQ ID N0:5)，其分別包含限制性位點BamHI和EcoRI。將擴增得到的DNA片段以10:1比例(插入片段載體)連接到原核生物的pGEX_4T表達載體(GE Healthcare, Piscataway, NJ,美國)上16° C持續(xù)3個小時。分別被命名為S75X、S85X、S92X和S012X的4個克隆產(chǎn)物，隨后被轉(zhuǎn)入到E. coliBL2UDE3)細胞(Stratagene)中。其核苷酸序列得以確認，且產(chǎn)物通過異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導得以表達，并通過谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4Β珠(GE Healthcare)純化。S75X、S85X、S92X、S012X和GST蛋白通過反向高效液相色譜(HPLC)得到進一步純化(>98%)。這些蛋白制劑中內(nèi)毒素污染物的存在是通過LAL (鱟變形細胞溶解物)技術(Bioffhittaker, ffalkersville, ME)測定的。最后,這些蛋白被生物素-AH-N-輕基琥拍酰亞胺(生物素-AH-NHS，BioSPA，Milan，意大利)生物素化，為使其用于細胞熒光中和測試(cytofluorimetric neutralization test)。4. ELISA實施ELISA測試以選擇分泌能夠識別P17BH10蛋白及其非洲突變體(S75X、S85X、S92X和S012X)的抗體的雜交瘤細胞及克隆。96孔板的每個孔在100 μ I體積PBS，pH 7. 2的條件下，用1μ g/ml的pl7 BH10、S75X、S85X、S92X和S012X在室溫下溫育過夜。第二天，在洗滌液(PBS/Tween20 0. 1%)中洗滌若干次之后，在37° C下用每孔200 μ I PBS/BSA 3%封閉這些孔I小時，隨后用要被檢驗的細胞上清液37° C溫育這些孔I小時。4次洗滌后，加入標記有HRP酶的抗小鼠的山羊二抗(Thermo Scientific, Waltham, MA),其允許通過作用于OPD底物(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)使其顯影。通過使用自動讀出器在492nm波長下完成光密度的讀數(shù)。5.蛋白免疫印跡為了更詳細的確認針對pl7 BHlO蛋白及其非洲突變體的抗體特異性，選擇的雜交瘤細胞的上清液用蛋白免疫印跡技術進行測試，該技術允許檢驗抗體結合到變性的蛋白上的情況。首先，蛋白經(jīng)受高溫使其變性，并經(jīng)受SDS-PAGE電泳。后一項技術允許變性的蛋白根據(jù)它們的大小在聚丙烯酰胺凝膠上運行，然后通過電場作用其被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。為了顯露出與這些蛋白相應的條帶，用麗春紅(Ponceau Red)對膜進行染色，并讓其干燥。隨后，在用PBS/BSA 5%封閉特異性位點并溫育樣品后，其經(jīng)受免疫組織化學法檢測，通過該方法，在用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠的山羊二抗溫育并用DAB化合物(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)顯影后,可以評定MBAl單克隆抗體結合到蛋白(pl7 BHlO蛋白及其非洲突變體)的情況。6.單克隆抗體同種型種類的測定使用Isostrip單克隆抗體分型試劑盒(Saint-Cruz Biotechn)測定同種型,其特征在于能產(chǎn)生和選擇MBAl單克隆抗體。7.單克降抗.體的細胞費光中件測試(cytofluorimetric neutralization test) 獲得的單克隆抗體也要經(jīng)受最優(yōu)化的中性檢驗，以檢驗其封閉pl7蛋白(BH10及其非洲突變體)和P17R受體之間相互作用的能力。為此，使用了一種腫瘤B淋巴細胞系，即Raji細胞系，其表達結合pl7蛋白的表面受體(pl7R)。第一，用pl7BH10蛋白或其生物素化的非洲突變體溫育抗體，以允許形成抗原-抗體復合物，然后加入Raji細胞4° C溫育30’。若干次洗漆后,用鏈霉親和素進一步溫育,通過細胞突光(cytofluorimetric)分析，來檢測結合到P17R表面受體上且沒有被單克隆抗體中和的蛋白存在的可能性。8.核苷酸序列通過使用RNA提取試劑盒(Qiagen, Milan,意大利),從分泌MBA I單克隆抗體的克隆中分離出細胞RNA。通過使用高容量cDNA庫試劑盒(High Capacity cDNAArchive Kit)(Applied Biosystem)使提取物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄,且獲到的cDNA作為通過PCR擴增編碼單克隆抗體輕鏈(Vk)和重鏈(Vh)可變區(qū)的部分序列的模板。使用下面的引物來擴增這些特異的區(qū)域Vk 5’ 正義5，-CAGATCAGATCTCGTGATGACCCAG-3，，SEQ ID N0:6 ;3’ Vk 反義5，-agcccgtttgagctccagcttgg-3’，SEQ ID NO: 7 ；MuG102, Fd 5’正義5’-TGTCCACCTCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGG-3，, SEQ ID N0:8 ;3，Vh 反義5，-gagactgtcaccggtgtgccttgg-3，，SEQ IDN0:9。通過采用“T/A克隆”方法將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T克隆載體(Promega)中，之后對包含插入片段的克隆進行測序和分析。先前分離的小鼠Ig基因的輕鏈和重鏈可變區(qū)用限制性酶(Bgl II和Sac I用于Vk; ；Xho I和SgrAI用于Vh)消化后，被亞克隆至表達載體構建體中，分別被命名為L122S和 L126S (Fiorentini S 等人·，Scand J Immunol 55,284-292,2002)。9.結果形成的單克隆抗體，被命名為MBA1，結果對若干生物化學分子的特征非常有意義。免疫酶學ELISA和蛋白免疫印跡測試獲得的結果說明MBAl識別三級構像和線性結構的P17BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白。此外，顯示這種抗體不能識別AT20表位。圖I顯示MBAl抗體對不同基質(zhì)蛋白的結合反應性。圖表顯示MBAl單克隆抗體識別并結合有意義的蛋白(目標蛋白，the proteins of interest),與非相關的蛋白不同。蛋白免疫印跡技術也確認了這些結果。實際上MBAl單克隆抗體顯示可結合到變性的pl7BHlO蛋白及其非洲突變體上。本發(fā)明人也鑒定了 MBAl單克隆抗體的抗體同種型，其顯示為一種IgGl/k鏈同種型的免疫球蛋白。為了測定本發(fā)明中的單克隆抗體對pl7BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白的中和結合能力，實施了進一步的測試。通過在Raji細胞上完成的細胞熒光分析，其中Raji細胞特征是在其表面存在P17R，用復合在檢查的抗體上的蛋白溫育，能注意到?jīng)]有細胞結合到生物素化的P17蛋白及其非洲突變體上，因為單克隆抗體的存在，通過封閉pl7-pl7R相互作用，以限制性方式妨礙了其結合(圖2)。本發(fā)明人檢驗了存在具有與MabMBAl同樣特征的其他抗體時，P17和它的受體之間的相互作用是否會被改變事實上，選擇作為這個比較的MBA15單克隆抗體是IgGlk鏈免疫球蛋白，與MBAl —樣，通過ELISA和蛋白免疫印跡顯示其識別不同的P17蛋白，甚至在不同的表位上。然而，如圖2顯示，MBA15，不像本發(fā)明中的抗體，其不能改變檢測的蛋白和它們的受體之間的相互作用。事實上，圖2中描述的柱狀圖顯示P17BH10蛋白及其非洲突變體能結合到所有分析的Raji細胞上表達的特異性受體。
最后，為了嵌合抗體本身，本發(fā)明人進行了關于編碼被檢測的MBAl單克隆抗體的重鏈(Vh)和輕鏈(Vk)可變區(qū)的核苷酸序列的研究。用特異性的引物分離出的Vh和Vk可變區(qū)，插入到包含其余的人類抗體區(qū)域的兩種不同的表達載體構建體中，為了最后在單一的最終載體中組裝嵌合抗體。MBAl單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列在序列列表中分別被命名為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11。顯然，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的任一單克隆抗體(重鏈可變區(qū)包含從核苷酸序列SEQ ID NO: 10中獲得的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含從核苷酸序列SEQ ID NO: 11中獲得的氨基酸序列)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于遺傳密碼的簡并性，事實是一個氨基酸可由若干個核苷酸三聯(lián)體編碼，表達“從中獲得”意味著上述的核苷酸序列SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11沒有限制的意思。作為嵌合的可選情況，本發(fā)明的MBAl單克隆抗體可以通過本領域技術人員所熟知的傳統(tǒng)技術，以人源化的形式制造，因此不需要進一步的描述。10. MBA-I和MBS-3針對HIV p!7蛋白系BHlO及其非洲突變體的中和能力的比較測定通過蛋白免疫印跡技術測試了針對pl7蛋白的單克隆抗體MAB-I (本發(fā)明)和MBS-3 (現(xiàn)有技術)，該技術允許檢驗抗體結合到變性的，從而呈線性的蛋白上的情況。首先，根據(jù)SDS-PAGE技術，pl7BH10蛋白及其非洲突變體(S92X、S85X、S75X和S012X)被變性且經(jīng)受電場。在聚丙烯酰胺凝膠上電泳結束后，蛋白被轉(zhuǎn)移至兩張不同的硝酸纖維素膜上。為了顯露出與這些蛋白相應的條帶，從而檢驗其轉(zhuǎn)移情況，用麗春紅對膜進行染色，并讓其干燥。在用PBS/BSA 5%封閉特異性位點并溫育這兩張膜后，實施免疫組織化學檢測，通過該方法，每個具有兩個單克隆抗體中一個的將會被測試(MAB-1和MBS-3)，在用HRP標記的抗小鼠的山羊二抗溫育并在X射線膠片(化學發(fā)光)上顯影后，可以測定抗體結合到蛋白(Pl7 BHlO蛋白及其非洲突變體)的情況。單克隆抗體MAB-I和MBS-3也經(jīng)受了最優(yōu)化的中和測試，以檢驗它們封閉pl7BHlO蛋白及其非洲突變體和它們的細胞受體(pl7R)之間相互作用的能力。使用Raji細胞，其是表達結合pl7蛋白的表面受體(pl7R)的一種腫瘤B淋巴細胞。每個抗體用pl7 BHlO蛋白或其生物素化的非洲突變體溫育，為了允許形成抗原-抗體復合物，然后用Raji細胞4° C溫育30分鐘。若干次洗滌后，通過細胞熒光分析，用鏈霉親和素進一步溫育，來檢測結合到表面受體上且沒有被單克隆抗體中和的蛋白的存在可能性。檢測的單克隆抗體(MBA-1和MBS-3)經(jīng)免疫酶學測試，該測試顯示這兩種抗體達到的不同結果。如圖3顯示(蛋白免疫印跡技術)，單克隆抗體MBA-I以同樣的親和力結合到所有變性的pl7 BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白上。相反，MBS-3以不同的親和力結合到P17BH10蛋白和其突變體S75X、S92X和S012X蛋白上；而S85X突變體沒有被識別。進行細胞熒光測試以檢驗兩個單克隆抗體MBA-I和MBS-3中和pl7BH10、S75X、S85X、S92X和S012X蛋白結合到細胞受體的能力。所有分析的pl7蛋白可以結合到在Raji細胞上表達的P17受體上(圖4a-e)。向pl7蛋白中加入MBA-I抗體完全抑制了它們與細胞受體相互作用的能力。相反，MBS-3單克隆抗體完全封閉了蛋白pl7 BHlO和S012X之間的 相互作用，以及部分封閉了 S75X、S92X與在Raji細胞上表達的pl7受體之間的相互作用。相同的抗體不能封閉S85X突變體和pl7細胞受體之間的相互作用(圖4a-e)。
權利要求
1.ー種針對人類免疫缺陷病毒Hiv-I的P17或其功能片段的單克隆抗體，包含至少ー個重鏈可變區(qū)和ー個輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含通過核酸序列SEQ ID NO: 10獲得的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含通過核酸序列SEQ ID NO: 11獲得的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是全長免疫球蛋白(Ig)。
3.根據(jù)權利要求2所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是IgG類免疫球蛋白。
4.根據(jù)權利要求3所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是同種型IgGl/k鏈的免疫球蛋白。
5.根據(jù)權利要求I所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是Fab片段。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是嵌合抗體。
7.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是人源化抗體。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的單克隆抗體或其功能片段，用作藥物。
9.根據(jù)權利要求8所述的單克隆抗體或其功能片段，用作治療與人類免疫缺陷病毒(HIV)相關的疾病的藥物。
10.根據(jù)權利要求9所述的單克隆抗體或其功能片段，其中與人類免疫缺陷病毒相關的疾病選自由獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、癡呆和淋巴瘤組成的組。
11.一種用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)相關的疾病的藥物組合物，包含治療有效量的權利要求1-7中任一項所述的單克隆抗體或其功能片段，與一種或多種藥學上可接受的賦形劑結合。
12.—種編碼權利要求1-7中任一項所述的單克隆抗體或其功能片段的分離的核酸序列。
13.根據(jù)權利要求12所述的獨立的核酸序列，包含核酸序列SEQID NO: 10和/或核酸序列 SEQ ID NO: 11。
14.ー種包含根據(jù)權利要求12或權利要求13所述的核酸序列的重組表達載體。
15.一種用權利要求14所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種抗HIV p17的單克隆抗體，其能夠中和多個HIV-1P17蛋白突變體和p17R受體之間的結合。此外，描述了本發(fā)明的單克隆抗體可以作為針對HIV及其相關病癥如AIDS、癡呆、淋巴瘤的藥物使用。
文檔編號A61K39/395GK102844330SQ201180017975
公開日2012年12月26日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權日2010年3月31日
發(fā)明者阿納爾多·卡魯索, 朱莉婭·費代麗卡·梅里齊, 安東尼奧·索萊蒂 申請人:梅迪斯蒂研究及生產(chǎn)股份有限公司