專利名稱：長效g-csf綴合物的液體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于確保長效G-CSF綴合物的長期儲存穩(wěn)定性的液體制劑，在所述綴合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段是共價連接的并且顯示出相比于野生型延長的作用持續(xù)時間。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激骨髓干細(xì)胞和白細(xì)胞以使其分化和增殖的細(xì)胞因子。它是分子量范圍為18，000至19，000 Da、pi為6. 1(5. 5-6. 1，取決于糖基化程度)的糖蛋白(Nomura 等，EMBO J. 5 (5) =871-876,1986)

重組DNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 G-CSF的分子和遺傳特性(Clark和Kaman，Science, 236 1229-1237，1987)。自從用分離自CHU-2和人膀胱癌5637細(xì)胞系的mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫克隆人 G-CSF 基因以來(Nagata 等，Nature, 319 :415-418,1986 ；Nagata 等，EMBO J.，5(3) =575-581,1986 ;Souza 等，Science, 232 :61_65，1986)，重組 DNA 技術(shù)就已允許從哺乳動物細(xì)胞和原核生物中生產(chǎn)G-CSF。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)修飾的hG-CSF可以以在其N端不含甲硫氨酸殘基的形式大量分泌到周質(zhì)中，其中所述修飾的hG-CSF與野生型的不同之處在于其中至少一個氨基酸殘基(特別是17位的半胱氨酸殘基)被替換為不同的氨基酸殘基(韓國專利No. 10-356140)。由于多肽易于因其穩(wěn)定性低而變性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通過腎臟或肝臟，因此需要頻繁地向患者施用蛋白質(zhì)藥物(包括作為藥物有效成分的多肽)以維持期望的血液水平濃度和效價。但是，這種蛋白質(zhì)藥物的頻繁施用引起患者疼痛，特別是在通過注射施用的情況下。為了解決這些問題，進(jìn)行了很多努力來改善蛋白質(zhì)藥物的血清穩(wěn)定性并使血液中的藥物在更長的時間內(nèi)維持在高水平，從而使藥物的藥效最大化。為了在長效制劑中使用，必須將蛋白質(zhì)藥物配制成高穩(wěn)定性的且其效價維持在足夠高的水平而不引起患者免疫應(yīng)答。為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)并防止酶促降解和被腎臟清除，通常使用具有高溶解度的聚合物(如聚乙二醇(PEG))來對蛋白質(zhì)藥物表面進(jìn)行化學(xué)修飾。通過與靶蛋白的特定區(qū)域或多個區(qū)域結(jié)合，PEG使蛋白質(zhì)穩(wěn)定并防止水解，而不引起嚴(yán)重的副作用(Sada等，J. Fermentation Bioengineering71 :137-139,1991)。然而，盡管聚乙二醇化能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但其也存在問題，例如大大降低生理活性蛋白質(zhì)的效價。另外，產(chǎn)量隨著PEG分子量的增加而降低，這是由于蛋白質(zhì)反應(yīng)性的降低所致。用于改善生理活性蛋白質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性的一種替代性方法是通過基因重組技術(shù)將生理活性蛋白質(zhì)的基因與編碼具有高血清穩(wěn)定性之蛋白質(zhì)的基因連接，并且培養(yǎng)用該重組基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以生產(chǎn)融合蛋白。例如，融合蛋白可以這樣制備通過基因重組將白蛋白(已知的在增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面最有效的蛋白質(zhì))或其片段與目的生理活性蛋白質(zhì)綴合(PCT 公開 No. WO 93/15199 和 WO 93/15200，歐洲專利公開 No. 413，622)。
另一種方法是使用免疫球蛋白。如美國專利No. 5，045，312中所描述的，通過使用交聯(lián)劑將人生長激素與牛血清白蛋白或小鼠免疫球蛋白綴合。該綴合物與未修飾的生長激素相比具有增強(qiáng)的活性。采用碳二亞胺或戊二醛作為交聯(lián)劑。但是，與肽非特異性結(jié)合的這種低分子量交聯(lián)劑不允許形成均一的綴合物，并且甚至在體內(nèi)是有毒的。此外，該專利表明活性增加僅僅是由于與生長激素的化學(xué)偶聯(lián)。該專利的方法不能保證不同種類的多肽藥物的活性增強(qiáng)，因此該專利甚至沒有認(rèn)識到與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)的因素，如持續(xù)時間、血液半衰期等。最近提出的一種藥物制劑是體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性均改善的長效蛋白質(zhì)藥物制齊U。為了在長效藥物制劑中使用，通過將生理活性多肽、非多肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段共價連接來制備蛋白質(zhì)綴合物(韓國專利No. 10-0567902和10-0725315)。在該方法中，G-CSF可以用作生理活性多肽以提供長效G-CSF綴合物。為了將長效G-CSF綴合物應(yīng)用到藥物產(chǎn)品中，必須維持其在體內(nèi)的藥效，同時抑制在儲存和運(yùn)輸期間的物理化學(xué)變化，如光、熱或添加劑引起的變性、聚集、吸附或水解。與G-CSF多肽自身相比， 長效G-CSF綴合物由于其體積和分子量增加因而更難以穩(wěn)定化。通常，蛋白質(zhì)具有非常短的半衰期，并且當(dāng)暴露于不合適的溫度、水-空氣界面、高壓、物理/機(jī)械應(yīng)力、有機(jī)溶劑、微生物污染等時，其發(fā)生變性，如單體聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在變性后，蛋白質(zhì)失去其物理化學(xué)特性和生理活性。一旦變性，蛋白質(zhì)幾乎不能恢復(fù)其原有特性，因?yàn)樽冃允遣豢赡娴摹Ｌ貏e在所施用的蛋白質(zhì)(如G-CSF)是每次注射幾百微克的微量的情況下，當(dāng)它們喪失穩(wěn)定性并因此吸附到容器表面上時，產(chǎn)生的損失相對較大。此外，在變性過程中吸附的蛋白質(zhì)容易聚集，并且變性蛋白質(zhì)的聚集體在施用到體內(nèi)時，其充當(dāng)抗原(不像體內(nèi)合成蛋白質(zhì)那樣)。因此，蛋白質(zhì)必須以穩(wěn)定形式施用。已經(jīng)進(jìn)行了許多研究以防止蛋白質(zhì)在溶液中變性(John Geigert, J. ParenteralSci. Tech. ,43(5) :220-224,1989 ；David ffong,Pharm. Tech. , 34-48,1997 ；ffei Wang. , Int.J. Pharm. , 185 129-188,1999 ；ffillem Norde,Adv. Colloid Interface Sci. ,25 :267-340,1986 ；Michelle 等，Int. J. Pharm. 120 :179-188,1995)。將凍干法應(yīng)用于一些蛋白質(zhì)藥物以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性目標(biāo)。但是，凍干產(chǎn)品的不便之處在于它們必須重新溶解于注射用水中使用。此外，因?yàn)槠渖a(chǎn)過程包括凍干過程，所以需要在大容量凍干機(jī)上進(jìn)行巨大投資。有人提出通過使用噴霧干燥器使蛋白質(zhì)破碎。但是，該方法由于產(chǎn)量低而不經(jīng)濟(jì)。此外，噴霧干燥過程將蛋白質(zhì)暴露于高溫，因此對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性有負(fù)面影響。作為克服該限制的替代方案，出現(xiàn)了穩(wěn)定劑，當(dāng)將其添加到蛋白質(zhì)的溶液中時，可以抑制蛋白質(zhì)藥物的物理化學(xué)變化并維持體內(nèi)藥效，甚至在長時間儲存之后也是如此。穩(wěn)定劑有糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、表面活性劑、聚合物和鹽。尤其是人血清白蛋白已被廣泛用作多種蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定劑并且其性能已得到證明(Edward Tarelli等，Biologicals, 26 331-346，1998)。人血清白蛋白的典型純化過程包括使生物污染物(如支原體、朊病毒、細(xì)菌和病毒)失活，或者篩選或檢查一種或更多種生物污染物或病原體。但是，總存在因生物污染物未完全去除或失活而使患者處于與其接觸的風(fēng)險。例如，篩選來自供體的人血以檢查其是否包含某些病毒。但是，該過程不總是可靠的。特別地，以非常小的數(shù)目存在的某些病毒不能被檢測到。最近提出了人血清白蛋白的替代物，包括重組白蛋白(韓國專利公開No. 10-2004-0111351)和不含白蛋白的 G-CSF(韓國專利 No. 10-0560697 和 10-0596610)。即便采用不含白蛋白的穩(wěn)定劑，不同蛋白質(zhì)由于其化學(xué)差異可逐漸失活，因?yàn)樗鼈冊趦Υ嫫陂g有不同的比率和條件。穩(wěn)定劑對蛋白質(zhì)儲存期的影響因蛋白質(zhì)而異。即，根據(jù)目的蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性，不同穩(wěn)定劑可以以不同的比例使用。此外，同時使用不同穩(wěn)定劑時，由于其競爭和誤操作可引起相反作用。不同穩(wěn)定劑的組合也引起不同的作用，因?yàn)樗鼈兪沟玫鞍踪|(zhì)的特性或濃度在儲存期間發(fā)生改變。因?yàn)槊糠N穩(wěn)定劑在特定濃度范圍中才適宜地發(fā)揮其穩(wěn)定作用，所以必須做許多努力來謹(jǐn)慎地將不同穩(wěn)定劑的種類和濃度進(jìn)行組合。
特別地，對于體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性改進(jìn)的長效G-CSF綴合物來說，因?yàn)樗鼈冇缮砘钚噪腉-CSF和免疫球蛋白片段Fe構(gòu)成，所以其分子量和體積與普通G-CSF復(fù)合物的相當(dāng)不同。此外，免疫球蛋白Fe片段的穩(wěn)定性因pH而大不相同。因此，不能將用于G-CSF的常規(guī)穩(wěn)定劑原樣使用。因此，需要不同于G-CSF穩(wěn)定劑之組成的特定穩(wěn)定劑來用于長效G-CSF綴合物。開發(fā)長效G-CSF綴合物的穩(wěn)定液體制劑(其能夠長期保持藥效而沒有病毒感染)的大量而充分的研究得到了本發(fā)明，導(dǎo)致了這一發(fā)現(xiàn)，即包含特定PH范圍的緩沖劑和高濃度甘露醇的穩(wěn)定劑賦予長效G-CSF綴合物增強(qiáng)的穩(wěn)定性并且允許形成經(jīng)濟(jì)而穩(wěn)定的長效G-CSF綴合物液體制劑。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此本發(fā)明的一個目的是提供一種包含長效G-CSF綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑的液體制劑，其中所述長效G-CSF綴合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段共價連接，并且所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑和甘露醇。問題的解決方案根據(jù)其中的一個實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種包含長效G-CSF綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑的液體制劑，其中所述長效G-CSF綴合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段共價連接，并且所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑和甘露醇。本文所用術(shù)語“長效G-CSF綴合物”意指蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其中生理活性的G-CSF、一種或更多種非肽聚合物和一種或更多種免疫球蛋白Fe片段共價連接，并且所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體相比于天然形式的G-CSF具有延長的作用持續(xù)時間。本文所用術(shù)語“長效”意指相比于天然形式延長的作用持續(xù)時間。術(shù)語“綴合物”意指其中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段共價連接的構(gòu)建體。為了在本發(fā)明中使用，G-CSF具有人G-CSF或密切相關(guān)類似物的氨基酸序列。可用于本發(fā)明的G-CSF可以是天然蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)。而且，G-CSF可以是經(jīng)插入、缺失或插入氨基酸的突變體，前提是所述突變對其原有生物活性沒有顯著影響?？捎糜诒景l(fā)明的人G-CSF或其類似物可以分離自脊椎動物或可以化學(xué)合成?；蛘撸珿-CSF或其類似物可以得自使用基因重組技術(shù)用編碼G-CSF或其類似物的基因轉(zhuǎn)化的原核生物或真核生物。對此，可以將腸細(xì)菌(如大腸桿菌(E. coli))、酵母細(xì)胞(如啤酒酵母(S. cerevisiae))或哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞、猴細(xì)胞)用作宿主細(xì)胞。根據(jù)宿主細(xì)胞，重組G-CSF或其類似物可以用哺乳動物或真核生物的糖進(jìn)行糖基化，或者是非糖基化的。在表達(dá)時，重組G-CSF或其類似物可包含初始的甲硫氨酸殘基(I位)。優(yōu)選地，使用CHO細(xì)胞作為宿主制備重組人G-CSF(HuG-CSF)。使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞制備的重組人G-CSF(HuG-CSF)適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，重組人G-CSF是突變體(17Ser-G-CSF),其中17位是絲氨酸殘基，而不是野生型的半胱氨酸，并且所述重組人G-CSF可以如韓國專利No. 10-356140中公開的進(jìn)行表達(dá)。為了在本發(fā)明中使用，免疫球蛋白Fe片段具有人免疫球蛋白Fe片段或其密切相關(guān)類似物的氨基酸序列。Fe片段可以從分離自動物(包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠)的天然形式中得到。此外，免疫球蛋白Fe片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fe片段，或者由其組合或雜合體制得。優(yōu)選地，它來自在人血中最豐富的蛋白質(zhì)IgG或IgM，并且最優(yōu)選地來自已知增強(qiáng)配體結(jié)合蛋白的半衰期的IgG。本文中，免疫球蛋白Fe 可以通過分離人或動物有機(jī)體的完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理它們而得自天然免疫球蛋白，或者，它可以是得自經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞或微生物的其重組體或衍生物。優(yōu)選的是由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的重組人免疫球蛋白Fe。另一方面，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型，并且本發(fā)明包括其組合和雜合體。優(yōu)選的是IgG2和IgG4亞型，最優(yōu)選的是很少具有效應(yīng)功能(如CDC (補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性))的IgG4的Fe片段。也就是說，作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fe片段是人IgG4的非糖基化Fe片段。人源Fe片段比非人源Fe片段更優(yōu)選，后者可在人體中充當(dāng)抗原并引起不期望的免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生針對抗原的新抗體。通過將G-CSF與免疫球蛋白Fe片段連接在一起來制備可用于本發(fā)明的長效G-CSF綴合物。對此，G-CSF和免疫球蛋白Fe片段可通過非肽聚合物交聯(lián)，或者可以使用重組技術(shù)形成融合蛋白。用于交聯(lián)的非肽聚合物可選自可生物降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、甲殼素、透明質(zhì)酸及其組合。可生物降解聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚(polyvinyl ethyl ether)、PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)及其組合。最優(yōu)選聚(乙二醇)(PEG)，優(yōu)選聚乙二醇。本領(lǐng)域熟知的并且能夠易于由本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員制備的其衍生物也包含于本發(fā)明的范圍中?？梢允褂没蚬こ碳夹g(shù)制備用于本發(fā)明的長效G-CSF綴合物，如韓國專利No. 10-0725315中所公開的。本發(fā)明的液體制劑包含治療有效量的長效G-CSF綴合物。通常，G-CSF的治療有效量為每個一次性瓶約300mcg。用于本發(fā)明的長效G-CSF綴合物的濃度為約7mg/ml至22mg/ml,優(yōu)選約 llmg/ml 至 22mg/ml。本文所用術(shù)語“穩(wěn)定劑”意指允許長效G-CSF綴合物安全儲存的物質(zhì)。術(shù)語“穩(wěn)定”意指在儲存條件下某時間段內(nèi)活性成分的損失不多于預(yù)定的比例(通常最高10%)。當(dāng)在10°C下儲存2年、在25°C下6個月或在40°C下一至兩周之后，G-CSF保留其原有活性的90%或更高(優(yōu)選其原有活性的95%或更高)時，應(yīng)理解為是穩(wěn)定的。對于諸如G-CSF的蛋白質(zhì)而言，其儲存穩(wěn)定性對于抑制G-CSF樣抗原性物質(zhì)的可能生成以及保證準(zhǔn)確施用量是重要的。在儲存期間，除非制劑中的G-CSF聚集或破裂形成抗原性物質(zhì)，否則可將約10%的G-CSF活性損失理解為是施用所允許的。用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑包含配制成賦予長效G-CSF綴合物以穩(wěn)定性的緩沖溶液和
甘露醇。此外，本發(fā)明的穩(wěn)定劑優(yōu)選不合白蛋白。因?yàn)閺娜搜兄苽?，所以可作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的人血清白蛋白有被人源致病性病毒污染的可能性。明膠或牛血清白蛋白可在一些患者中引起疾病或引起過敏反應(yīng)。由于不含來自人或動物的血清白蛋白或異源蛋白質(zhì)(如純化明膠)，因此本發(fā)明的穩(wěn)定劑沒有病毒感染的問題。穩(wěn)定劑中的緩沖溶液在維持液體制劑pH恒定以防止pH波動中起作用，從而使長效G-CSF綴合物穩(wěn)定?？捎糜诒景l(fā)明的緩沖溶液可包含可藥用pH緩沖劑(包括堿性鹽(磷酸鈉或磷酸鉀、其氫鹽或二氫鹽)、檸檬酸鈉/檸檬酸、乙酸鈉/乙酸、及其組合。適用于本 發(fā)明的是檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑和乙酸鹽緩沖劑，優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑和檸檬酸鹽緩沖劑，更優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑。在磷酸鹽緩沖劑中，磷酸鹽的濃度范圍優(yōu)選為5至IOOmM,更優(yōu)選10至50mM。緩沖劑優(yōu)選pH為4. O至8. 0，更優(yōu)選pH為5. O至7. 0，最優(yōu)選pH為5. O至6. O。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)所用緩沖劑的pH值來評估長效G-CSF綴合物的穩(wěn)定性。在pH 5. 5時，發(fā)現(xiàn)pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖劑確保了比pH6. O更高的長效G-CSF的穩(wěn)定性(見表2和4)。從這些結(jié)果，可理解本發(fā)明的長效G-CSF綴合物根據(jù)緩沖劑的pH值而被不同程度地穩(wěn)定，并且在某一 PH表現(xiàn)出峰值穩(wěn)定性。特別地，發(fā)現(xiàn)在液體制劑包含低pH的緩沖劑時，其中Fe (在中性pH下穩(wěn)定)與G-CSF連接的長效G-CSF綴合物儲存穩(wěn)定性降低。融合了 PEG的市售G-CSF藥物Neulasta采用pH 4的乙酸緩沖劑作為穩(wěn)定劑。但是，不推薦在長效G-CSF綴合物中采用常規(guī)的穩(wěn)定劑組合物及pH，這不僅是因?yàn)楸景l(fā)明的長效G-CSF綴合物的分子量和體積二者均比野生型G-CSF的大，而且還因?yàn)槊庖咔虻鞍譌e在中性pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。甘露醇(一種糖醇)用在本發(fā)明的穩(wěn)定劑中，因?yàn)樗鸬皆鰪?qiáng)長效G-CSF綴合物的穩(wěn)定性的作用。甘露醇優(yōu)選以基于液體制劑總體積的I至20% (w/v)、更優(yōu)選為3至10%(w/v),最優(yōu)選為5至7% (w/v)的濃度使用。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，當(dāng)在檸檬酸鹽緩沖劑的存在下將甘露醇用作穩(wěn)定劑時，長效G-CSF綴合物的儲存穩(wěn)定性顯示比使用山梨醇時大大增加(見表6)。這些數(shù)據(jù)顯示了甘露醇作為長效G-CSF綴合物穩(wěn)定劑相比于其他穩(wěn)定劑的特異性，表明根據(jù)待穩(wěn)定的目標(biāo)需要不同的穩(wěn)定劑。所述穩(wěn)定劑還包含其他糖醇，前提是它們不降低甘露醇與緩沖劑的組合對長效G-CSF綴合物的穩(wěn)定作用。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑除所述緩沖溶液和甘露醇夕卜，可還包含至少一種選自等張劑(isotonic agent)、多元醇、糖、非離子型表面活性劑和中性氨基酸的成分。所述等張劑的作用不僅是使得當(dāng)液體制劑中的長效G-CSF綴合物進(jìn)入體內(nèi)時起維持合適滲透壓，還進(jìn)一步使液體制劑中的長效G-CSF綴合物穩(wěn)定。等張劑的實(shí)例包括水溶性無機(jī)鹽。其中有氯化鈉、硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣及其組合。最優(yōu)選氯化鈉。優(yōu)選地，等張劑的濃度為約5至200mM。在該范圍內(nèi)，可根據(jù)所包含組分的種類和量來調(diào)整等張劑的濃度，以使得液體制劑是等張的。還可以包含的增加長效G-CSF綴合物的儲存穩(wěn)定性的糖的優(yōu)選實(shí)例包括單糖(如甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖)和多糖(如乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖和葡聚糖)。在液體制劑中，糖的使用量優(yōu)選為I至20% (w/v)且更優(yōu)選的使用量為5至20% (w/v)?？捎糜诒景l(fā)明的多元醇的實(shí)例包括丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油和低分子量聚丙二醇。它們可以單獨(dú)或組合使用。并且它們在液體制劑中的濃度優(yōu)選為約I至15% (w/v)，更優(yōu)選約5 至 15% (w/v)。
對于非離子型表面活性劑而言，其降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力以防止蛋白質(zhì)被吸附到或聚集于疏水表面上?；诰凵嚼骢?polysorbate)的非離子型表面活性劑和基于泊洛沙姆(poloxamer)的非離子型表面活性劑適合用在本發(fā)明中。它們可以單獨(dú)或組合使用。優(yōu)選基于聚山梨酯的非離子型表面活性劑。其中有聚山梨酯20、聚山梨酯40和聚山梨酯80，更優(yōu)選聚山梨酯80。不建議使用高濃度的非離子型表面活性劑，因?yàn)槿绻请x子型表面活性劑以高濃度存在，則會干擾UV光譜法或等電聚焦法，使得難以準(zhǔn)確評估蛋白質(zhì)的濃度或穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的液體制劑可包含優(yōu)選濃度為O. 1% (w/v)或更少且更優(yōu)選O. 001至O. 05% (w/v)的非離子型表面活性劑。就長效G-CSF綴合物的儲存穩(wěn)定性而言，比較了聚山梨酯20和聚山梨酯80。發(fā)現(xiàn)相比于聚山梨酯20，長效G-CSF綴合物在存在聚山梨酯80的情況下穩(wěn)定性增加(見表8)。融合了 PEG的G-CSF藥物制劑Neulasta采用聚山梨酯20。但是，與包含聚山梨酯20時相t匕，本發(fā)明的液體制劑在包含聚山梨酯80時對長效G-CSF綴合物確保更高的儲存穩(wěn)定性。從這些數(shù)據(jù)應(yīng)理解，根據(jù)待穩(wěn)定的目標(biāo)需要不同的表面活性劑。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，在40°C下儲存4周的時間中，長效G-CSF綴合物在含有作為非離子型表面活性劑的O. 005% (w/v)聚山梨酯80的液體制劑中比O. 01% (w/v)聚山梨酯80保持更穩(wěn)定(見表10)。氨基酸也可作為液體制劑的穩(wěn)定劑，其在溶液中起將更多水分子吸引到G-CSF周圍的作用，使得G-CSF最外面的親水氨基酸分子被進(jìn)一步穩(wěn)定(Wang，Int. J. Pharm. 185 129-188,1999) ο對此，帶電氨基酸可引起與G-CSF的靜電吸引而促進(jìn)G-CSF聚集。因此，添加中性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)作為穩(wěn)定成分。在液體制劑中，中性氨基酸的使用濃度優(yōu)選為O. I至10% (w/v)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，包含濃度為基于液體制劑總體積的3至12% (w/v)的甘露醇的穩(wěn)定劑使得具有大分子量Fe的長效G-CSF綴合物在即使不添加中性氨基酸的情況下也能穩(wěn)定儲存4周(見表12)。因此，即使在不添加中性氨基酸時也可以使用高濃度的甘露醇來制備用于向長效G-CSF綴合物提供高穩(wěn)定性的液體制劑。但是，超過20% (w/v)的甘露醇濃度超出了等張上限。因此，甘露醇的使用濃度為液體制劑的I至20% (w/v),優(yōu)選濃度為3至10% (w/v),更優(yōu)選濃度為5至7% (w/v)。除了包括緩沖劑、等張劑、糖醇、中性氨基酸和非離子型表面活性劑在內(nèi)的上述組分外，本發(fā)明的液體制劑還可任選地包含本領(lǐng)域已知的其他組分，只要它們不降低本發(fā)明的作用。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所述液體制劑不包含白蛋白并且可包含緩沖溶液、甘露醇、等張劑和非離子型表面活性劑。更詳細(xì)地，本發(fā)明提供了包含長效G-CSF綴合物和穩(wěn)定劑的液體制劑，所述穩(wěn)定劑包含磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑、甘露醇、等張劑和聚山梨酯80，所述等張劑選自氯化鈉、硫酸鈉、檸檬酸鈉及其組合。 優(yōu)選地，所述液體制劑包含濃度范圍為5至IOOmM和pH為5至7的磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖溶液、濃度為I至20% (w/v)的甘露醇、濃度為5至200mM的等張劑以及濃度為O. 001至O. 05% (w/v)的聚山梨酯80，其中所述等張劑選自氯化鈉、硫酸鈉和檸檬酸鈉。更優(yōu)選地，所述液體制劑包含濃度范圍為5至IOOmM和pH為5至6的檸檬酸鹽緩沖溶液、濃度為I至10% (w/v)的甘露醇、濃度為100至200mM的氯化鈉以及濃度為O. 001至O. 05%(w/v)的聚山梨酯80。最優(yōu)選地，所述液體制劑包含濃度為20mM的檸檬酸鹽緩沖劑(pH
5.2-5. 8)、濃度為3至7% (w/v)的甘露醇、濃度為100至200mM的氯化鈉以及濃度為O. 001至O. 05% (w/v)的聚山梨酯80,并且其中不使用中性氨基酸。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，比較了長效G-CSF綴合物液體制劑與已知的G-CSF制劑Neulasta(Amgen)的G-CSF儲存穩(wěn)定性，所述長效G-CSF綴合物液體制劑包含檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5. 5),5% (w/v)甘露醇、150禮氯化鈉和0.005% (w/v)聚山梨酯80。發(fā)現(xiàn)G-CSF在本發(fā)明的液體制劑中比在包含pH 4的檸檬酸鈉的市售制劑中更穩(wěn)定(見表14)。在另一個實(shí)施方案中，測定了本發(fā)明的長效G-CSF綴合物液體制劑的長期儲存穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其使長效G-CSF綴合物穩(wěn)定保存6個月并且即使在加速條件下儲存6個月之后仍確保至少96. 6%的活性(見表16)，其中所述長效G-CSF綴合物液體制劑包含pH 5. 5的檸檬酸緩沖劑、甘露醇、氯化鈉和聚山梨酯80。從數(shù)據(jù)中應(yīng)理解，包含pH范圍為5至6的緩沖劑和濃度為I至20% (w/v)的甘露醇的液體制劑可以在其中穩(wěn)定儲存長效G-CSF綴合物12個月或更久。發(fā)明的有利效果如前所述，本發(fā)明的包含緩沖劑和甘露醇的穩(wěn)定劑是專門用于長效G-CSF綴合物的。由于不含人血清白蛋白和其他對身體有害的潛在因子，因此本發(fā)明的長效G-CSF綴合物液體制劑不存在病毒感染的問題并且確保長效G-CSF綴合物的優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性，所述G-CSF和免疫球蛋白Fe片段連接并且比天然形式的G-CSF有更大的分子量和更長的作用持續(xù)時間。


圖I是表明當(dāng)在40°C下儲存兩周的時間中每周使用SE-HPLC進(jìn)行分析時，G-CSF在長效G-CSF綴合物液體制劑中和在PEG融合物G-CSF制劑Neulasta中的穩(wěn)定性的圖，其中在所述長效G-CSF綴合物液體制劑中使用不同pH值的緩沖劑。發(fā)明實(shí)施方式通過以下實(shí)施例可更好地理解本發(fā)明，列出所述實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實(shí)施例I :構(gòu)建長效G-CSF綴合物
<1-1>使用免疫球蛋白制備免疫球蛋白Fe片段可用于本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段是人非糖基化的IgG4Fc片段，其可如韓國專利No. 725314中描述的由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體表達(dá)。<1-2>制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子本實(shí)施例中使用的重組人G-CSF是突變株(17Ser-G-CSF),其中17位是絲氨酸，而不是野生型的半胱氨酸，并且能夠如韓國專利No. 356140中描述的由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體表達(dá)。<1-3>使用免疫球蛋白Fe片段制備長效G-CSF綴合物本實(shí)施例中的長效G-CSF綴合物是人粒細(xì)胞集落刺激因子與免疫球蛋白Fe片段通過非肽聚合物共價連接的構(gòu)建體。并且其如韓國專利No. 725315和775343中所描述而 得到。 實(shí)施例2 :測定取決于緩沖劑pH的長效G-CSF綴合物穩(wěn)定性為了配制用于穩(wěn)定實(shí)施例I中制備的G-CSF綴合物的液體制劑，進(jìn)行了改變緩沖劑PH值對所述長效G-CSF綴合物穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)。對于該測定，用穩(wěn)定劑組合物制備了表I的長效G-CSF綴合物液體制劑，所述穩(wěn)定劑組合物包含作為穩(wěn)定劑的甘露醇，作為表面活性劑的聚山梨酯80，以及作為緩沖劑的pH為5. O、5. 5或6. O的檸檬酸鈉溶液。將其在40°C下儲存兩周后，用尺寸排阻色譜法進(jìn)行了分析。結(jié)果歸納在下表2中。長效G-CSF綴合物相比于其初始值的保留率表示為SE-HPLC (% )。表I[表 I][表格]
權(quán)利要求
1.一種長效粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)綴合物的液體制劑，其包含治療有效量的長效粒細(xì)胞集落刺激因子綴合物和不合白蛋白的穩(wěn)定劑，其中所述綴合物中G-CSF、非肽聚合物和免疫球蛋白Fe片段共價連接，并且所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑和甘露醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中甘露醇的濃度范圍為基于所述液體制劑總體積的I 至 20 % (w/V)ο
3.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述緩沖劑選自檸檬酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、碳酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽和乙酸鹽緩沖劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述緩沖劑的濃度范圍為5至100mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述緩沖劑的PH范圍為4至8。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述不含白蛋白的穩(wěn)定劑還包含選自等張劑、多元醇、糖、非離子型表面活性劑、中性氨基酸及其組合的成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述等張劑是鹽，其選自氯化鈉、硫酸鈉、檸檬酸鈉及其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述等張劑的濃度范圍為5至200mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述非離子型表面活性劑是基于聚山梨酯或基于泊洛沙姆的非離子型表面活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的液體制劑，其中所述基于聚山梨酯的非離子型表面活性劑選自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述非離子型表面活性劑的濃度范圍為基于所述液體制劑總體積的O. 001 M O. 05% (w/v) O
12.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述糖選自甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、木糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及其組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述糖的濃度范圍為基于所述液體制劑總體積的 I 至 20 % (w/V) ο
14.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述多元醇選自丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油、低分子量的聚丙烯及其組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述多元醇在所述液體制劑中的濃度范圍為I至15% (w/v)。
16.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述中性氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及其組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求6的液體制劑，其中所述中性氨基酸在所述液體制劑中的濃度范圍為 O. I 至 10% (w/v) ο
18.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述不含白蛋白的穩(wěn)定劑包含pH范圍為5至8且濃度范圍為5至100的檸檬酸鹽緩沖劑、濃度為I至20% (w/v)的甘露醇、濃度為5至200mM的氯化鈉和濃度為O. 001 M O. 05% (w/v)的聚山梨酯80。
19.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述G-CSF是由野生型G-CSF通過替換、缺失或插入一個或更多個氨基酸而修飾的突變體G-CSF蛋白質(zhì)，或者是與所述野生型G-CSF具有相似活性的肽類似物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的液體制劑，其中所述G-CSF衍生物是突變體(17Ser-G-CSF)，其中17位為絲氨酸殘基，而不是野生型G-CSF的半胱氨酸殘基。
21.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述長效G-CSF綴合物的濃度范圍為7至22μ g/ml ο
22.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe片段選自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe片段是由選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同來源的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的雜合片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的液體制劑，所述免疫球蛋白Fe片段是單鏈免疫球蛋白的二聚體或多聚體形式，所述單鏈免疫球蛋白由相同來源的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe片段是IgG4Fc片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe片段是人的非糖基化IgG4Fc 片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求I的液體制劑，其中所述非肽聚合物選自可生物降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、甲殼素、透明質(zhì)酸及其組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的液體制劑，其中所述可生物降解聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、PLA (聚乳酸)和PLGA (聚乳酸-乙醇酸)。
全文摘要
公開了一種液體制劑，其使得具有改進(jìn)的體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性的長效G-CSF綴合物能在長時間儲存時穩(wěn)定。所述液體制劑包含以緩沖劑和甘露醇為特征的穩(wěn)定劑組合物。由于不含人血清白蛋白和其他對身體有害的潛在因子，所以所述液體制劑沒有病毒感染的問題并且其確保長效G-CSF綴合物的優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性。
文檔編號A61K47/42GK102740840SQ201180006430
公開日2012年10月17日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者權(quán)世昌, 李才敏, 李炳善, 李美枝, 裴城敏 申請人:韓美科學(xué)株式會社