專利名稱：增強免疫應答的疫苗載體和方法
增強免疫應答的疫苗載體和方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2010年I月21日提交的美國臨時專利申請No. 61/297，098的優(yōu)先權(quán)，其全部并入此處作為參考。
背景技術(shù)：
疫苗用來弓I發(fā)對抗原，尤其是來自病原體、腫瘤細胞等的抗原的適應性免疫應答，以減輕或防止疾病。合成肽或滅活(killed)或減毒微生物疫苗往往在刺激充分保護性的強大免疫應答方面是有效的。在某些情況下，這些疫苗不是保護性的或只有部分保護性，而其它策略必須用于開發(fā)保護性疫苗?；跍p毒微生物的疫苗還與基因轉(zhuǎn)移或突變修復的風險有關(guān)，并可能給免疫力低下的個體帶來風險。需要開發(fā)在刺激持久保護性免疫應答方面安全且有效的新疫苗。流感病毒感染，尤其是禽流感H5N1，呈現(xiàn)出上升的健康及經(jīng)濟關(guān)注。證據(jù)明確地 顯示世界越來越多地區(qū)，H5N1繼續(xù)在易感的鳥類及豬之間傳播。許多科學家相信，如果不加控制，目前的H5N1禽流感將突變成能夠從人到人之間傳播而導致世界范圍的大流行。由于死亡率(mortality rate)為50%以上，這樣的爆發(fā)將是災難性的。不論禽流感病毒H5N1導致人類疾病的能力如何，由于受累地區(qū)對禽畜采取消滅措施，該病毒已經(jīng)對巨大經(jīng)濟影響造成威脅。因此，需要開發(fā)疫苗來保護人類、禽類、豬及其它馴養(yǎng)動物免受H5N1流感。能夠保護免受H5N1以及其它流感病毒比如HlNl的流感疫苗將是最好的。

發(fā)明內(nèi)容
此處提供刺激免疫應答的疫苗載體和方法，以及降低與流感感染相關(guān)的發(fā)病率(morbidity)的方法。在一方面中，提供包括抗原多肽和HMGBl多肽或其功能片段的疫苗載體。至少部分抗原多肽和HMGBl多肽存在于疫苗載體的表面上。疫苗載體可能包括編碼抗原多肽的第一多核苷酸以及編碼HMGBl多肽的第二多核苷酸。HMGBl多肽和抗原多肽可連接于比如融合蛋白中。HMGBl多肽和抗原多肽均可以插入到跨膜蛋白的外環(huán)中。在另一方面中，提供包括疫苗載體和可藥用載體的組合物?？伤幱幂d體可能是對于口服或經(jīng)鼻使用可接受的。疫苗載體可能不能復制。在另一方面中，提供芽孢桿菌(Bacillus spp.)疫苗載體。疫苗載體包括編碼表達于疫苗載體表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及編碼表達于疫苗載體表面上的免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列?？乖嚯目赡苁橇鞲蠱2e多肽、流感HA多肽或流感NP多肽或其組合。免疫刺激多肽可能是CD154多肽或HMGBl多肽或其組合。免疫刺激多肽和抗原多肽連接于比如融合蛋白中，并可能插入至跨膜蛋白的外環(huán)中。在另一方面中，提供在受試者中增強免疫應答的方法。在方法中，以有效增強受試者對抗原多肽的免疫應答的量向受試者施用此處提供的疫苗載體或組合物。合適地，口服或鼻內(nèi)施用疫苗載體。在另一方面中，提供通過施用此處所述的芽孢桿菌疫苗載體在受試者中增強免疫應答的方法。疫苗載體包括編碼表達于疫苗載體表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及編碼表達于疫苗載體表面上的免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列。抗原多肽可能是流感M2e多肽、流感HA多肽或流感NP多肽或其組合。免疫刺激多肽可能是⑶154多肽、HMGBl多肽或其組合。在另一方面中，提供降低受試者中流感相關(guān)的發(fā)病率的方法。在方法中，施用此處公開的疫苗載體或組合物降低與隨后流感感染相關(guān)的發(fā)病率。


圖I是一個圖表，其顯示，和用生理鹽水接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl或⑶154的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)疫苗載體對雞進行灌胃(oral savage)后的M2e特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P (樣品相對于陽性對照)比。圖2是一個圖表，其顯示，和用生理鹽水接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A 型流感表位和HMGBl或CD154的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的HALB特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖3是一個圖表，其顯示，和用生理鹽水接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl或CD154的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的HAUA特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖4是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的M2e特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖5是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的HA LB特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖6是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過將指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl或CD154的活或不同程度失活的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的HA UA特異性抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖7是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過將IO6活的或各種指示劑量的表達A型流感表位和HMGBl的福爾馬林失活的枯草芽孢桿菌疫苗載體對雞進行灌胃后的M2e特異性IgG抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖8是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過口服或皮下接種有IO6活的、福爾馬林失活的或者福爾馬林失活且凍干的表達A型流感表位和HMGBl的枯草芽孢桿菌疫苗載體的雞的M2e特異性IgA抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。圖9是一個圖表，其顯示，和用芽孢桿菌載體單獨(BSBB)接種的雞相比，通過口服或皮下接種有IO6活的、福爾馬林失活的或者福爾馬林失活且凍干的表達A型流感表位和HMGBl的枯草芽孢桿菌疫苗載體的雞的M2e特異性IgA抗體生產(chǎn)的ELISA的S/P比。
具體實施例方式重組DNA技術(shù)使得能夠相對容易地操作許多細菌和病毒物種。一些細菌和病毒天然地或可以經(jīng)選擇或工程化為輕度致病性的或非致病性的，但仍然能夠產(chǎn)生強大的免疫應答。這些細菌和病毒制備有吸引力的疫苗載體來引起對異源或外來抗原的免疫應答。細菌或病毒疫苗載體可能會模仿天然感染，并產(chǎn)生強大和持久的免疫力。生產(chǎn)和施用疫苗載體往往是相對低廉的。此外,這種載體往往可以攜帶一個以上抗原并可提供對多種感染性因子的保護?；畹募毦虿《疽呙巛d體仍可能給免疫力低下的個體帶來風險，并需要額外的監(jiān)管審查。因此，使用滅活的或失活的或取得由食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)“通常認為是安全的(GRAS)”資格的生物體的載體是可取的。問題是使用這種載體產(chǎn)生強大的免疫應答。如實施例中所示，通過將HMGBl (高遷移率族I)多肽納入疫苗載體的表面，我們可以使用芽孢桿菌載體產(chǎn)生針對抗原多肽的強大的免疫應答。事實上，實施例證明使用各種方法可以使這種載體失活從而它不能復制而施用后仍然引發(fā)強大的免疫應答。此處提供包括抗原多肽和HMGBl多肽或其功能片段的疫苗載體。至少部分抗原多肽和至少部分HMGBl多肽或其功能片段存在于疫苗載體的表面上。疫苗載體可能包括編碼 抗原多肽的第一多核苷酸以及編碼HMGBl多肽的第二多核苷酸。HMGBl多肽和抗原多肽可連接于比如融合蛋白中或可分開表達。HMGBl多肽和抗原多肽可均插入到跨膜蛋白的外環(huán)中。疫苗載體可能是基于細菌、病毒或脂質(zhì)體的載體。潛在的疫苗載體包括，但不限于，芽抱桿菌(Bacillus)(枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis))、沙門氏菌(Salmonella)(腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis))、志賀氏菌(Shigella)、大腸埃希氏菌(Escherichia)(大腸桿菌(E. coli))、耶爾森氏菌(Yersinia)、百日咳桿菌(Bordetella)、球菌(Lactococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、弧菌(Vibrio)(霍亂弧菌(Vibriocholerae))、李斯特菌(Listeria)、腺病毒(adenovirus)、痕病毒(poxvirus)、抱疫病毒(herpesvirus)、甲病毒(alphavirus)和腺相關(guān)病毒。合適地,疫苗載體是GRAS生物體。疫苗載體可經(jīng)過失活或滅活從而它不能夠復制。使細菌或病毒疫苗載體失活或滅活的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并包括，但不限于，實施例中顯示的那些方法，即福爾馬林失活、基于抗生素的失活、熱處理和乙醇處理?？乖嚯氖且环N能夠被適應性免疫系統(tǒng)特異性識別的多肽?？乖嚯陌庖咴缘娜魏味嚯??？乖嚯陌ǖ幌抻诓≡w相關(guān)、致敏原相關(guān)、腫瘤相關(guān)或疾病相關(guān)的抗原。病原體包括病毒、寄生蟲、真菌和細菌病原體以及蛋白質(zhì)病原體如朊病毒?？乖嚯目赡苁侨L蛋白質(zhì)或其部分。已經(jīng)公認的是許多蛋白質(zhì)的免疫系統(tǒng)識別是基于相對較少數(shù)目的氨基酸，通常稱為表位。表位可能只有8-10個氨基酸。因此，此處所述的抗原多肽可能是全長的蛋白質(zhì)、8個氨基酸長的表位或這兩種極端之間的任何部分。事實上，抗原多肽可能包括來自單一病原體或蛋白質(zhì)的一個以上的表位。來自不同蛋白質(zhì)的相同表位或多表位的多拷貝可包括在疫苗載體中。可以設想，來自相同或不同的病原體或疾病的幾個表位或抗原可在單一疫苗載體中組合施用來產(chǎn)生對多抗原的增強的免疫應答。重組疫苗載體可能編碼來自多病原微生物、病毒或腫瘤相關(guān)抗原的抗原。能夠表達多抗原的疫苗載體的施用具有同時誘導對兩種或更多疾病的免疫力的優(yōu)勢。抗原多肽可能是流感多肽，合適地，它是流感H5N1多肽或與多株流感病毒(如流感M2蛋白的多肽)相關(guān)的多肽。A型流感病毒M2蛋白的胞外域，稱為M2e，突出病毒表面。M2蛋白的M2e部分含有約24個氨基酸。流感中一個分離體(isolate)與下一個之間M2e多肽變化不大。事實上，自1918年流感流行從感染的人類中已分離出的M2e中僅少數(shù)幾個天然發(fā)生的突變。此外，從禽和豬宿主分離的流感病毒具有不同的，但仍然保守的，M2e序列。為了綜述從人、禽和豬宿主分離的M2e多肽序列，見Liu等人,Microbes and Infection7:171-177(2005)以及 Reid 等人，J. Virol. 76:10717-10723 (2002)，其各自全部納入此處作為參考。還參見SEQ ID N0:l-4。合適地，整個M2e多肽可插入疫苗載體或可以使用僅一部分。實施例中，八個氨基酸多肽(具有氨基酸序列EVETPIRN，SEQ ID NO 5的LM2或具有氨基酸序列EVETPTRN，SEQID NO :6的其變體M2eA)并入疫苗載體，并向雞施用后證明產(chǎn)生抗體應答。合適地，插入疫苗載體的M2e多肽的部分是免疫原性。免疫原性片段是能夠引發(fā)細胞或體液免疫應答的肽或多肽。合適地，M2e的免疫原性片段可能是全長M2e多肽，或者合適地可能是全長序列的20個或更多個氨基酸，15個或更多個氨基酸，10個或更多個氨基酸或者8個或更多個氨基酸。
納入A型流感疫苗載體的其它合適表位包括，但不限于，A型流感的血凝素(HA)或核蛋白(NP)的多肽。例如 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 的肽可納入疫苗載體。實施例中，SEQ ID NO 7 (HAUA)和SEQ ID NO 8 (HALB)并入疫苗載體并向雞施用后表現(xiàn)出產(chǎn)生抗體應答。見圖2-3和圖5-6。此外，實施例中SEQ ID NO 9(NP54)和SEQ ID NO 10 (NP147)的NP表位并入疫苗載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解任何這些序列可以和包括源自其它病原體或抗原的表位的任何其它表位組合使用。HMGBl (高遷移率族-I)蛋白首次被鑒定為對DNA結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性關(guān)鍵的DNA結(jié)合蛋白。它是廣泛表達的核蛋白，其無序列特異性地結(jié)合DNA。該蛋白是高度保守的并見于植物到哺乳動物中。斑馬魚、雞和人HMGBl氨基酸序列分別提供于SEQ ID NO : 30、SEQ ID NO:18和SEQ ID N0:29中。整個哺乳動物中的序列是高度保守的，具有98%的氨基酸同一性并且氨基酸的變化是保守的。因此，來自一個物種的HMGBl蛋白可以功能上取代來自另一個物種的HMGBl蛋白。全長HMGBl蛋白或其部分可用作此處所述的疫苗載體中的HMGBl多肽。HMGBl有兩個DNA結(jié)合區(qū)，稱為如SEQ ID NO :23和24所示的A盒(box)以及如SEQ IDNO 25 和 26 所不的 B 盒。見 Andersson 和 Tracey, Annu. Rev. Tmmunol. 2011, 29:139-162,其全部并入此處作為參考。HMGBl是一種炎癥介質(zhì)，并作為比如來自壞死細胞的核損傷信號。在蛋白質(zhì)乙?；?、跨核轉(zhuǎn)運和分泌所需的過程中，HMGBl還可以由單核細胞/巨噬細胞系的細胞主動分泌。胞外HMGBl作為強效的炎癥介質(zhì)通過經(jīng)由晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和經(jīng)由Toll樣受體家族(TLR)的成員(尤其是TLR4)的信號而發(fā)揮作用。RAGE結(jié)合活性已經(jīng)得以鑒定，并需要SEQ ID NO 27的多肽。TLR4結(jié)合需要SEQ ID NO 18的位置106的半胱氨酸，其發(fā)現(xiàn)于HMGBl的B盒區(qū)域中。HMGBl的炎癥活性不需要全長蛋白，并且功能片段已被鑒定。B盒已顯示出足以介導HMGBl的促炎作用，因此SEQ ID NO 25和26是本發(fā)明文中的HMGBl多肽或其功能片段。此外，RAGE結(jié)合位點和促炎細胞因子活性已分別被映射到SEQ ID NO :27和SEQ ID NO 28上。因此，這些多肽是本發(fā)明文中HMGBl多肽的功能片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用比如國際公開號W002092004中的那些方法能夠鑒定能夠刺激促炎細胞因子活性的HMGBl多肽及其片段，其全部并入此處作為參考。合適地，HMGBl多肽包括位于SEQ ID NO 18的氨基酸150-183 (SEQ ID NO 27或其同源物)的RAGE結(jié)合域以及SEQ ID NO : 18的氨基酸89-109 (SEQ ID NO :28或其同源物)之間的促炎細胞因子活性域。尤其是，HMGBl多肽及其功能片段或同源物包括與SEQ ID NO : 18或23-30的HMGBl多肽同一的、或至少99%同一性、至少98%同一性、至少95%同一性、至少90%同一性、至少85 %同一性、或至少80 %同一性的多肽。至少部分抗原多肽和至少部分HMGBl多肽存在于疫苗載體的表面上。存在于疫苗載體表面上包括包含在跨膜蛋白中、與跨膜蛋白、膜脂或膜錨定碳水化合物相互作用、共價或化學交聯(lián)至跨膜蛋白、膜脂或膜錨定碳水化合物的多肽?？梢酝ㄟ^讓包括多肽的氨基酸經(jīng)由肽鍵連接至跨膜蛋白N-端、C-端或其中任何位置上，使多肽包括在跨膜蛋白中(即插入至跨膜蛋白兩個氨基酸之間或取代跨膜蛋白的一個或 多個氨基酸(即刪除-插入))。合適地，多肽可能插入至跨膜蛋白的外環(huán)內(nèi)。合適的跨膜蛋白是cotB和IamB,但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可獲得許多合適的跨膜蛋白?；蛘撸嚯耐ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的方法可共價或化學連接至膜中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或碳水化合物，或衣殼上(如果使用病毒載體的話)。例如，二硫鍵或生物素-抗生物素蛋白交聯(lián)可用于將抗原和HMGBl多肽呈現(xiàn)到疫苗載體表面上。合適地，抗原多肽和HMGBl多肽是融合蛋白的一部分。兩個多肽通過肽鍵直接連接或可通過接頭或它們所插入的第三蛋白的區(qū)段而分開。編碼抗原多肽或HMGBl多肽的多核苷酸可插入疫苗載體，并經(jīng)表達而產(chǎn)生抗原多肽和HMGBl多肽。多肽可插入至疫苗載體的染色體或編碼于質(zhì)?；蚱渌旧w外DNA上。合適地，編碼抗原多肽和/或HMGBl多肽的多核苷酸可單獨表達或插入所表達的疫苗載體多核苷酸中。合適地，疫苗載體多核苷酸編碼表達于疫苗載體表面上的多肽如跨膜蛋白。編碼抗原多肽和/或HMGBl多肽的多核苷酸可插入疫苗載體多核苷酸序列以允許抗原多肽和/或HMGBI多肽在載體表面上的表達。例如，編碼抗原多肽和HMGBl多肽的多核苷酸可在框中插入至細菌多核苷酸的編碼跨膜蛋白外環(huán)區(qū)的區(qū)域中，從而細菌多核苷酸序列仍然在框中。見實施例I?；蛘撸幋a抗原多肽和/或HMGBl多肽的多核苷酸，通過結(jié)合疫苗載體表面上的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或碳水化合物，可插入至展示在或呈現(xiàn)在疫苗載體表面上的分泌多肽中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解編碼抗原多肽和/或HMGBl多肽的多核苷酸可以插入至各種疫苗載體多核苷酸中來向用疫苗載體治療的受試者免疫細胞提供抗原多肽和/或HMGBl多肽的表達和遞呈。在實施例中，從枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)表達質(zhì)粒表達包括M2e表位、HA表位和NP表位的幾個流感表位。如通過圖1-6所示的免疫應答所證明的，獲得的重組細菌表達插入的表位。在實施例中，疫苗載體具有編碼于相同多核苷酸上的并且彼此在框中的抗原多肽(M2e、HA和NP多肽)以及免疫刺激多肽(⑶154或HMGBl )。在替代的實施方式中，免疫刺激多肽和抗原多肽可通過區(qū)別的多核苷酸編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解各種方法可用于獲得抗原多肽和HMGBl多肽在疫苗載體表面上的表達。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。還提供包括疫苗載體和可藥用載體的組合物?？伤幱幂d體是適合于體內(nèi)施用的任何載體。合適地，可藥用載體對于口服、經(jīng)鼻或粘膜遞送是可以接受的?？伤幱幂d體可包括水、緩沖溶液、葡萄糖溶液或細菌培養(yǎng)液。組合物的額外成分可合適地包括賦形劑比如穩(wěn)定齊U、防腐劑、稀釋劑、乳化劑和潤滑劑。可藥用載體或稀釋劑的實例包括穩(wěn)定劑比如碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白質(zhì)比如白蛋白或酪蛋白、含蛋白質(zhì)的制劑比如牛血清或脫脂奶和緩沖液(如，磷酸鹽緩沖液)。尤其是當這種穩(wěn)定劑加入組合物時，組合物適合冷凍干燥或噴霧干燥。組合物中的疫苗載體可能不能復制，合適地在加入組合物之前，疫苗載體經(jīng)失活或滅活。此處所述的組合物可用于增強免疫應答比如對抗原多肽的抗體應答。含有流感多肽的組合物也可用于降低與隨后的流感感染相關(guān)的發(fā)病率。組合物可防止流感在施用此處所述的組合物或疫苗載體的受試者中引起疾病或任何相關(guān)的發(fā)病率。此處所述的組合物和疫苗載體，通過降低疾病的時程(length)、降低與疾病相關(guān)的發(fā)病率或死亡率或降低染上疾病的可能性，可降低疾病后的嚴重程度。和未提供疫苗載體的相似受試者相比，施用此處所述的疫苗載體后，與疾病相關(guān)的發(fā)病率或死亡率可降低25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或甚至 100%。還提供通過施用疫苗載體在受試者中增強免疫應答的方法。疫苗載體可包含能夠 刺激對疫苗載體及其相關(guān)抗原多肽的免疫應答的HMGBl多肽。以可有效增強受試者對疫苗尤其是對抗原多肽的免疫應答的量向受試者施用包括HMGBl的多肽的疫苗載體。合適地，疫苗載體含有編碼包括HMGBl多肽的氨基酸150-183和89-109 (SEQ ID NO :18)或其同源物的多肽的多核苷酸。在實施例中，使用190個氨基酸的HMGBl的多肽。合適地，多核苷酸編碼來自與受試者相同的物種的HMGBl多肽。HMGBl多肽和受試者的異源組合(即人HMGBl多肽用在雞的疫苗中)在本發(fā)明的方法中可能是有用的，因為HMGBl在眾多物種當中是高度保守的。HMGBl多肽可用于在受試者中增強對出現(xiàn)在疫苗載體之中或之上的任何外來抗原或抗原多肽的免疫應答。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解HMGBl多肽可用于增強對出現(xiàn)在疫苗載體之中的一個以上抗原多肽的免疫應答。來自HMGBl的多肽，通過激活樹突狀細胞和巨噬細胞從而刺激細胞因子(比如IL-I、IL-6、IFN-Y和TNF-α )的產(chǎn)生，刺激至少部分免疫應答。在實施例中，HMGBl的多肽表達在疫苗載體的表面上。此外，公開了增強抗A型流感的免疫應答的方法以及降低與A型流感感染后相關(guān)的發(fā)病率的方法。簡言之，方法包括以有效引發(fā)免疫應答的量向受試者施用包括能夠引發(fā)免疫應答的A型流感表位(流感的抗原多肽)的疫苗載體。A型流感表位可能是M2e多肽、HA多肽或NP多肽或如上討論的另一流感多肽?？乖嚯脑谝呙巛d體中的插入可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式而實現(xiàn)，包括但不限于國際專利公開No. WO 2008/036675中所述的無痕(scarless)定點突變系統(tǒng)。細菌也可經(jīng)工程化而表達結(jié)合有如上面所討論的能夠增強免疫應答的多核苷酸的流感多肽。尤其是，CD154或HMGBl的多肽由疫苗載體表達來增強受試者對流感多肽的免疫應答。實施例證明了在雞當中對接種產(chǎn)生強大的IgA和IgG應答。我們期望這種強大的應答將保護免受或至少降低與感染后相關(guān)的發(fā)病率或抗原多肽來源(實施例中的流感病毒)的挑戰(zhàn)?？赏ㄟ^各種手段包括但不限于口服、經(jīng)鼻和黏膜來施用組合物。例如，可通過氣溶膠、通過噴霧、通過加入到食物或水中、通過灌胃、或經(jīng)由滴眼劑來遞送組合物或疫苗載體。在一些實施方式中，通過注射比如皮內(nèi)、腸道外、皮下、腹腔、靜脈、顱內(nèi)、或肌肉內(nèi)施用組合物。對于雞或其它禽，可卵內(nèi)(in ovo)施用組合物。受試者包括但不限于脊椎動物，合適的哺乳動物、合適的人、牛、貓、狗、豬或鳥類，合適的禽比如雞。也可使用其它感染的動物模型。增強免疫應答包括但不限于誘導受試者免疫系統(tǒng)介導的治療性或預防性作用。具體來說，增強免疫應答可包括，比如圖1-3所證明的增強的抗體生產(chǎn)、圖8所示的增強的抗體重鏈的類別轉(zhuǎn)換比如IgA的生產(chǎn)、抗原遞呈細胞的成熟、輔助性T細胞的刺激、細胞毒性T細胞的刺激或T和B細胞記憶的誘導。待施用的有用劑量將取決于受試者的年齡、體重和物種、施用模式和途徑以及所尋求的免疫應答病原體或疾病類型而不同?？梢宰阋詥酒鹈庖邞鸬膭┝康娜魏我呙巛d體施用組合物。可設想，范圍從IO3至101°載體拷貝(即噬菌斑形成或集落形成單位)的劑量，從IO4至IO9載體拷貝，或從IO5至IO7載體拷貝是合適的?？墒┯脙H一次或施用兩次或更多次組合物來提高免疫應答。例如，可施用兩次或更多次組合物，每次隔一周、兩周、或三周、一個月、兩個月、三個月、六個月或以上。施用前細菌可能是有活力的，但在一些實施方式中施用前細菌可能是滅活的或失活的。在一些實施方式中，細菌可能是能夠在受試者中復制的，而在其它實施方式中細菌可能是不能在受試者中復制的。如在實施例中所示的，施用前可使用福爾馬林、乙醇、熱或抗生素使細菌疫 苗載體失活。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解也可以使用失活疫苗載體的其它手段。此處還提供了芽孢桿菌疫苗載體。芽孢桿菌疫苗載體包括編碼抗原多肽的第一多核苷酸序列以及編碼免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列。如上所述抗原多肽和免疫刺激多肽呈現(xiàn)在芽孢桿菌疫苗載體表面上?？乖嚯氖侨缟纤龅牧鞲卸嚯牟⑶颐庖叽碳ざ嚯氖侨缟纤龅腍MGBl多肽或⑶154多肽。編碼與受試者蛋白質(zhì)同源的且能夠刺激免疫系統(tǒng)響應抗原多肽的免疫刺激多肽的多核苷酸也可以插入疫苗載體。如實施例中更詳細所述的，疫苗載體可包括CD154多肽，與上述HMGBl相似，其在受試者中能夠結(jié)合CD40并刺激受試者響應疫苗載體及其相關(guān)抗原多肽。芽孢桿菌疫苗載體可包括HMGBl多肽、CD154多肽或其組合。如上所述，編碼這些多肽的多核苷酸可插入疫苗載體的染色體或維持在染色體外。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些多肽可以插入各種疫苗載體的多肽并表達于疫苗載體的不同部位中或可被分泌。編碼能夠增強對抗原多肽的免疫應答的免疫刺激多肽的多核苷酸也可編碼抗原多肽。編碼免疫刺激多肽的多核苷酸可連接至編碼抗原多肽的多核苷酸，從而在疫苗載體中免疫刺激多肽和抗原多肽由相同的多核苷酸編碼。在實施例中，編碼CD154 (能夠結(jié)合⑶40)或HMGBl的多肽的多核苷酸還編碼A型流感的M2e表位、HA表位和NP表位。見SEQID NO :19-22。在實施例中，編碼流感表位的多核苷酸和編碼免疫刺激多肽的多核苷酸均表達自營養(yǎng)細胞表達的質(zhì)粒。在一些實施方式中，多核苷酸插入至cotB基因或編碼表達于孢子表面的蛋白的另一基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解也可使用編碼其它跨膜蛋白的細菌多核苷酸。如上面所討論的，編碼能夠增強對表位的免疫應答的與受試者蛋白質(zhì)同源的免疫刺激多肽的多核苷酸可納入到疫苗載體中。在實施例中，如通過在對接種應答中增加的抗體生產(chǎn)而測量的，包括編碼能夠結(jié)合CD40的CD154多肽或編碼HMGBl的多肽的多核苷酸的芽孢桿菌疫苗載體，被證明增強對M2e表位和兩個不同HA表位的免疫應答。合適地，⑶154多肽在50個氨基酸長以下，更合適的40個以下、30個以下或20個氨基酸以下的長度。多肽可在10和15個氨基酸之間，10和20個氨基酸之間或10和25個氨基酸的長度。CD154序列和CD40結(jié)合區(qū)在各種物種之間不是高度保守的。雞和人的CD 154序列分別如SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO 12中所提供。 對于一些物種已經(jīng)確定了⑶154的⑶40結(jié)合區(qū)，包括人、雞、鴨、小鼠和牛，并分別顯示在 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 中。盡管物種間CD40結(jié)合區(qū)中在序列上有可變性，如下實施例表明人CD154多肽能夠在雞當中增強免疫應答。因此，人們可能會使用物種特異性CD154多肽或異源CD154多肽來實施本發(fā)明。尤其是⑶154多肽及其功能片段或同源物包括與SEQ ID NO :11-17的⑶154多肽同一的、或至少99%同一性、至少98%同一性、至少95%同一性、至少90%同一性、至少85%同一性、或至少80%同一性的多肽。此處所述的芽孢桿菌疫苗載體可用于如上所述在受試者中增強免疫應答的方法中以及降低流感發(fā)病率的方法中。芽孢桿菌疫苗載體還可用來制造向受試者施用的組合物，比如如上所述的那些?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將編碼抗原多肽的異源多核苷酸在任何非必要位點 處插入細菌基因組中，或者作為替代可插入質(zhì)粒上。一個適合多核苷酸插入的位點位于跨膜蛋白的外面部分當中，或偶聯(lián)至靶向分泌途徑的異源多核苷酸的序列上。適合多核苷酸插入的跨膜蛋白的實例是芽孢桿菌的cotB基因與沙門氏菌的IamB基因。異源多核苷酸包括但不限于編碼選自病原微生物或疫苗載體以外的病毒的抗原的多核苷酸。這種多核苷酸可衍生自病原性病毒比如流感(如，M2e、血凝素或神經(jīng)氨酸苷酶)、皰疹病毒(如編碼皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副粘病毒、冠狀病毒等。異源多核苷酸還可以獲自病原性細菌，如編碼細菌蛋白質(zhì)如毒素和外膜蛋白的基因。此外，來自寄生蟲如艾美球蟲的異源多核苷酸是用于載體疫苗中的有吸引力的候選者。參與引發(fā)免疫系統(tǒng)的額外免疫刺激多肽也可包括在此處所述的疫苗載體中。多核苷酸可編碼以其刺激作用而公知的免疫系統(tǒng)分子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子或干擾素、或參與免疫調(diào)節(jié)的另一多核苷酸。如下實施例只意圖是說明性的，并不意味著作為對本發(fā)明或所附權(quán)利要求的范圍的限制。實施例實施例I :HA/NP/M2e/cCD154和HA/NP/M2e/HMGBl芽孢桿菌載體的構(gòu)建株和培養(yǎng)條件除非另有說明，否則首先將所有質(zhì)粒維持在T0P10大腸桿菌細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。芽抱桿菌用來引入突變(Bacillus subtilis,禽類健康實驗室株，指定為NP122)。攜帶質(zhì)粒pDGIEF和pHTIO的細菌在37° C下培養(yǎng)。Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基用于細胞的常規(guī)生長，而SOC培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用于電穿孔之后表型的表達。在適當時，將以下物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中ImM 異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、100 μ g/ml 氨節(jié)西林(Amp)、100 μ g/ml壯觀霉素(SP)和5μ g/ml氯霉素(Cm)。質(zhì)粒以前描述過質(zhì)粒pDGIEF (芽抱桿菌遺傳儲存中心Bacillus Genetic StockCenter, Columbus, OH)和 pHTIO 用于本研究(Zhang 等人，Nuc. Acids Research2006，34(9) : 1-8 和 Nguyen 等人，Curr. Micro. 2007，55:89-93)。質(zhì)粒 pDGIEF 作為 mazF 基因擴增的模板，mazF基因在芽孢桿菌染色體操作期間用作反選標志物。質(zhì)粒pHTIO用于在芽孢桿菌中編碼和生產(chǎn)禽流感的異源表位序列。質(zhì)粒包含CM抗性基因，通過加入ImM IPTG而誘導并在37° C下維持在芽孢桿菌中。用于營養(yǎng)細胞表達的異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)購自MoBioTec/Boca Scientific, Boca Raton, FL 的質(zhì)粒 pHTIO (Nguyen 等人，2007)通過加入枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的插入序列在多克隆位點進行轉(zhuǎn)化。進行DNA測序來證實正確的序列插入。新改造的質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化至芽孢桿菌中。簡言之，芽孢桿菌培養(yǎng)物在HS培養(yǎng)基(Spizizen培養(yǎng)基，補充有0. 5%葡萄糖、50 μ g/mlDL-色氨酸、50 μ g/ml尿嘧啶、0. 02%酪蛋白水解物、0. 1%酵母提取物、8 μ g/ml精氨酸、0. 4 μ g/ml組蛋白、ImM MgSO4)中在37oC下過夜生長。過夜培養(yǎng)物(Iml)用于接種20ml LS培養(yǎng)基(Spizizen培養(yǎng)基，補充有0. 5%葡萄糖、5 μ g/ml DL-色氨酸、5 μ g/ml尿嘧啶、0. 01%酪蛋白水解物、0. 1%酵母提 取物、ImM MgSO4'2. 5mMMgCl2、0. 5mM CaCl2)并在30oC下振蕩孵育3-4小時。向Iml獲得的LS培養(yǎng)物中加入10 μ I的0. IM EGTA并在室溫下孵育5分鐘。然后加入1_2 μ g質(zhì)粒DNA，37oC下振蕩2小時，并涂覆在帶有選擇性抗生素的LB板上。當用ImM IPTG誘導時，這些轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌現(xiàn)在從Al生產(chǎn)異源表位序列。PCR用于PCR的所有引物在表I中列出。典型的PCR條件由如下組成在50μ L總體積中，大約0. I μ g純化的基因組、質(zhì)?；騊CR產(chǎn)生的DNA (Qiagen, Valencia, CA, USA)、IXPfu 聚合酶緩沖液、5UPfu 聚合酶(Stratagene La Jolla, CA, USA)、ImM dNTP (GEHealthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway,NJ)、每個引物 I. 2 μ M。使用 DNA 工程熱循環(huán)儀(Bio-Rad, Hercules, CA，USA)在以下擴增條件下進行擴增94° C，2分鐘；30個循環(huán)的94° C持續(xù)30秒、58° C持續(xù)60秒、72° C持續(xù)90秒每Ikb ;和72° C持續(xù)10分鐘以進行最后的延伸。每個PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化(Qiagen，Valencia, CA, USA)，并以25 μ L的EB緩沖液洗脫用于制備重疊延伸PCR反應所用的模板，或者以50 μ L的EB緩沖液洗脫，乙醇沉淀，并在5μ L的ddH20中懸浮用于將其電穿孔至芽孢桿菌中。表I :用于產(chǎn)生疫苗載體的引物序列
權(quán)利要求
1.一種疫苗載體，其包括抗原多肽和HMGBl多肽或其功能片段，其中至少部分抗原多肽和至少部分HMGBl多肽出現(xiàn)于疫苗載體的表面上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗載體，其中抗原多肽是流感特異性多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗載體，其中抗原多肽是M2e、HA或NP流感多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗載體，其中流感M2e多肽選自SEQID NO=USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2的免疫原性片段、SEQ ID NO 3的免疫原性片段和SEQ ID NO 4的免疫原性片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗載體，其中抗原多肽選自SEQID NO 7, SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 以及 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO:10的免疫原性片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的疫苗載體，其中HMGBl多肽選自SEQID NO : 18、SEQID NO 29,SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 18,SEQ ID N0:29 或 SEQ ID NO :30 的功能片段及其同源物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗載體，其中HMGBl的功能片段選自SEQID NO :25、SEQID NO :26、SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO :28。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的疫苗載體，其中疫苗載體是細菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗載體，其中細菌是芽孢桿菌Bacillusspp。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的疫苗載體，其中抗原多肽包括在跨膜蛋白中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗載體，其中抗原多肽在跨膜蛋白的外環(huán)中。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項所述的疫苗載體，其中HMGBl多肽包括在跨膜蛋白中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的疫苗載體，其中HMGBl多肽在跨膜蛋白的外環(huán)中。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項所述的疫苗載體，其中跨膜蛋白是cotB。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項所述的疫苗載體，其中抗原多肽和HMGBl多肽是融合蛋白的部分。
16.一種包括權(quán)利要求1-15任一項所述的疫苗載體和可藥用載體的組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中可藥用載體是口服或經(jīng)鼻施用可接受的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的組合物，其中疫苗載體不能復制。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項所述的組合物，其中疫苗載體是失活的或滅活的。
20.一種在受試者中增強免疫應答的方法，包括以有效增強受試者對抗原多肽的免疫應答的量向受試者施用權(quán)利要求1-15任一項所述的疫苗載體或者權(quán)利要求16-19任一項所述的組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中疫苗載體口服或鼻內(nèi)施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中免疫應答是對抗原多肽的IgA抗體應答。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22任一項所述的方法，其中疫苗載體不能在受試者中復制。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23任一項所述的方法，其中疫苗載體在向受試者施用之前被失活或滅活。
25.—種芽孢桿菌疫苗載體,其包括編碼出現(xiàn)于疫苗載體表面上的抗原多肽的第一多核苷酸序列以及編碼免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列，其中抗原多肽和免疫刺激多肽出現(xiàn)于疫苗載體表面上的，其中抗原多肽是流感多肽以及其中免疫刺激多肽是CD154多肽或HMGBl多肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的疫苗載體,其中第一多核苷酸和第二多核苷酸插入編碼跨膜蛋白外面部分的第三多核苷酸序列中。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的疫苗載體，其中跨膜蛋白是cotB。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項所述的疫苗載體，其中抗原多肽是流感M2e多肽、流感HA多肽、或流感NP多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗載體，其中流感M2e多肽選自SEQID NO :1、SEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO :2的免疫原性片段、SEQ ID NO :3的免疫原性片段和SEQ ID NO :4的免疫原性片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗載體，其中流感多肽包括SEQID NO :7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-30任一項所述的疫苗載體，其中HMGBl多肽選自SEQID NO :18、SEQ ID NO 29,SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 18,SEQ ID N0:29 或 SEQ ID NO :30 的功能片段及其同源物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的疫苗載體，其中HMGBl的功能片段選自SEQID NO :25、SEQID NO :26、SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO :28。
33.一種在受試者中增強免疫應答的方法，包括以有效增強受試者的免疫應答的量向受試者施用權(quán)利要求25-32任一項所述的芽孢桿菌疫苗載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中疫苗載體口服或鼻內(nèi)施用。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中免疫應答是對抗原多肽的IgA抗體應答。
36.根據(jù)權(quán)利要求33-35任一項所述的方法，其中疫苗載體不能在受試者中復制。
37.根據(jù)權(quán)利要求33-36任一項所述的方法，其中疫苗載體在向受試者施用之前被失活或滅活。
38.一種在受試者中降低A型流感相關(guān)發(fā)病率的方法，包括以有效降低A型流感相關(guān)發(fā)病率的量向受試者施用權(quán)利要求1-15任一項所述的疫苗載體或者權(quán)利要求16-19任一項所述的組合物。
39.一種在受試者中降低A型流感相關(guān)發(fā)病率的方法，包括以有效降低A型流感相關(guān)發(fā)病率的量向受試者施用權(quán)利要求25-32任一項所述的芽孢桿菌疫苗載體。
40.一種在受試者中增強免疫應答的方法，包括以有效增強受試者對抗原多肽的免疫應答的量向受試者施用權(quán)利要求I所述的疫苗載體。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中疫苗載體口服或鼻內(nèi)施用。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中免疫應答是對抗原多肽的IgA抗體應答。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中疫苗載體不能在受試者中復制。
全文摘要
此處提供了包括存在于疫苗載體表面的抗原多肽和HMGB1多肽的疫苗載體。還提供了包括疫苗載體的組合物，并包括可藥用載體，合適地用于口服或經(jīng)鼻施用的載體。還提供了通過向受試者施用此處公開的疫苗載體或組合物來增強免疫應答的方法，尤其是抗體免疫應答以及合適地IgA應答。
文檔編號A61K39/145GK102811734SQ201180006369
公開日2012年12月5日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者L·貝里曼, W·博蒂杰, B·哈吉斯, S·萊頓 申請人:阿肯色大學評議會, 德克薩斯A&M大學體系