專利名稱：一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法
一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法技術領域
本發(fā)明屬于生物組織和器官的人工制造技術領域，特別涉及利用合成高分子材料、細胞基質材料制備組織器官前體的工藝方法，屬于生物組織工程技術領域。
背景技術：
組織工程學是由美國國家科學基金委員會于1987年正式提出和確定的，是應用細胞生物學、生物材料和工程學的原理，研究開發(fā)用于修復或改善人體病損組織或器官的結構、功能的生物活性替代物的一門科學。Wolter在1984年正式提出“組織工程” 一詞， 1987年美國國家科學基金委員會正式確定組織工程學成為一門新學科。
現(xiàn)存的組織工程技術面臨許多困難和限制，組織工程應用研究所取得的成功均是在那些結構與生理功能較為簡單的組織器官如骨骼、軟骨、皮膚。傳統(tǒng)組織工程方法一般先制備結構支架，在進行細胞培養(yǎng)過程中由于上層細胞消耗大部分的氧氣和營養(yǎng)，限制了這些組分向底層擴散，從而限制了細胞向支架深層的遷移等。這種先制備支架，再培養(yǎng)細胞的方法，耗時又費力，細胞在向支架內遷移的過程中很可能就已經(jīng)變型、老化，達不到及時治療臨床病人的要求。傳統(tǒng)的支架制備技術很難形成具有分支貫通的營養(yǎng)供應通道。同時傳統(tǒng)的組織工程技術不能滿足將不同的細胞在空間準確定位與定點放置，構建復雜組織器官的功能梯度結構的需求。目前心血管系統(tǒng)疾病已成為世界范圍內尤其是發(fā)達國家中的第一殺手，臨床的巨大需求是促使血管組織工程技術不斷進步的動力之一。預計到21世紀末， 60歲以上的老齡人中，動脈硬化的發(fā)病率將高達80%左右。據(jù)統(tǒng)計在美國，每年接受血管移植的患者已經(jīng)超過百萬之多。血管組織工程制造的人造血管組織植入生物體內后，人造血管組織同受體的活組織可有機地整合，促進受損處血管快速、有效地修復。同時，在構建復雜器官時，構建具有復雜分支結構的復雜器官前體也是必須解決的關鍵問題，也是多分支血管支架的重要應用方向。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，旨在前人工作的基礎上，利用分步組合模具/萃取法，實現(xiàn)細胞和支架材料在空間的準確定位，成形帶有復雜多分支的多層結構。利用模具組合、高分子凝固成形等原理實現(xiàn)復雜組織器官的重建，本發(fā)明可成形含不同細胞基質材料與合成高分子支架的復雜多分支三維結構，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導培養(yǎng)細胞需要時間長、細胞分布不均勻，細胞很難滲入到多分支結構中等缺點。
本發(fā)明的技術方案如下
一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行
1)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液按1 9 9 1體積比混合制成多種細胞基質溶液；天然高分子溶液的質量百分濃度為 30% ；
2)預先設計好實心多分支內模具和一組具有不同直徑通道的中間模具，將其中一種中間模具套在實心多分支內模具的外部，將其中一種細胞基質溶液灌注到實心多分支內模具和中間模具之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質層；
3)使用另一種通道直徑比第一種大的中間模具套在第一層細胞基質層的外部，將另一種細胞基質溶液灌注到第一層細胞基質層和第二種中間模具之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質層；
4)重復步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質層結構；
5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質量百分濃度為 30%的合成高分子溶液；
6)將預先設計好的外模具套在多層細胞基質層結構外部，將合成高分子溶液灌入多層細胞基質層結構與外模具的縫隙中，用細胞培養(yǎng)液萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成外層合成高分子材料層，然后去除外模具與實心多分支內模具，制成多分支及多層結構的復雜組織器官前體。
本發(fā)明所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質溶液中還加入體積百分比為 30%的凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。
本發(fā)明所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質溶液中加入體積百分比為0.001% 0. 細胞生長因子。所述的細胞生長因子采用內皮細胞生長因子、細胞轉移因子或肝細胞生長因子。
本發(fā)明所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復合物。所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸和纖粘連蛋白中的至少一種。
上述技術方案中，步驟1)中所述的用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、 生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟幻中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或 1，4-二氧六環(huán)。
本發(fā)明所述的實心多分支內模具由軟性材料制成的實心管組合而成，內模具各分支的直徑相同或不同。所述的中間模具及外模具可根據(jù)實心多分支內模具的分支數(shù)量分為 2 20個等分體結構，實心多分支內模具分支結構采用有序或交錯排列。所述的中間模具及外模具外形截面可以為圓型或多邊形，其材料可為金屬或是硬質合成高分子材料。
本發(fā)明所制備的帶有多分支多層結構復雜組織器官前體中合成高分子支架材料具備優(yōu)異的機械性能，可以與體內的管道系統(tǒng)相連接。其中細胞基質溶液具有優(yōu)異的生物相容性，多種細胞可以在其中形成多種組織。本發(fā)明可以實現(xiàn)不同細胞/天然高分子材料與合成高分子支架材料在空間的準確定位，克服了組織工程目前存在的在三維支架中誘導培養(yǎng)細胞需要時間長，細胞在支架中分布不均勻，細胞很難滲入到多分支結構中等缺點。本發(fā)明利用分步模具/萃取法、高分子凝固成形等原理可以達到復雜器官中不同部位不同細胞類型及結構類型的要求，為實現(xiàn)復雜組織器官的重建打下基礎。


圖1是本發(fā)明實心多分支內模具的三維效果圖(以四分體為例)。
圖2是成形多分支結構第一層細胞基質層時的模具剖面圖(以四分體為例)。
圖3是成形多分支結構合成高分子材料層時的模具剖面圖(以四分體為例)。
圖4是多分支結構各分支管的剖面分層圖(以雙層細胞基質層為例)。
在圖1至圖4中
1-實心多分支內模具；2-第一層細胞基質層；3-中間模具；
4-第二層細胞基質層；5-外模具；6-合成高分子材料層。
具體實施方式
本發(fā)明提供的一種多層結構的復雜組織器官前體的制備方法，其具體工藝步驟如下
1)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液按1 9 9 1體積比混合制成多種細胞基質溶液；天然高分子溶液的質量百分濃度為 30% ；
2)預先設計好實心多分支內模具1和一組具有不同直徑通道的中間模具3，將其中一種中間模具套在實心多分支內模具1的外部，將其中一種細胞基質溶液灌注到實心多分支內模具和中間模具之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質層2 ；
3)使用另一種通道直徑比第一種大的中間模具套在第一層細胞基質層2的外部， 將另一種細胞基質溶液灌注到第一層細胞基質層2和第二種中間模具之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具，形成穩(wěn)定的第二層細胞基質層4 ；
4)重復步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質層結構；
5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質量百分濃度為 30%的合成高分子溶液；
6)將預先設計好的外模具5套在多層細胞基質層結構外部，將合成高分子溶液灌入多層細胞基質層結構與外模具的縫隙中，用細胞培養(yǎng)液萃取合成高分子溶液中的溶劑， 形成外層合成高分子材料層6，然后去除外模具與實心多分支內模具，制成多分支及多層結構的復雜組織器官前體。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是在所述的細胞基質溶液中還加入體積百分比為 30% 的凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。在所述的細胞基質溶液中加入體積百分比為0.001% 0. 細胞生長因子。所述的細胞生長因子采用內皮細胞生長因子、細胞轉移因子或肝細胞生長因子。所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復合物。所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸和纖粘連蛋白中的至少一種。步驟1)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、 生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟幻中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4-二氧六環(huán)。
所述的實心多分支內模具1由軟性材料制成的實心管組合而成，內模具各分支直徑可變也可為一固定值。所述的軟性材料采用塑料、橡膠、纖維、硅膠等材料的一種或幾種。
所述的中間模具3及外模具根據(jù)實心多分支內模具1的分支數(shù)量分為2 20個等分體結構，實心多分支內模具1分支結構采用有序或交錯排列。
所述的中間模具3及外模具5外形截面為圓型或多邊形，其材料為金屬或是硬質合成高分子材料，如黃銅、聚四氟乙烯、硅橡膠等。
實施例1 :1)制備一系列口徑不等的黃銅材質多分支組合模具；幻配制纖維蛋白原溶液，將第一中間模具套在內模具外部，在內模具與第一中間模具間注入明膠/纖維蛋白原與內皮細胞的混合物，細胞密度為IXlO7個/mL，用凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物 2分鐘交聯(lián)形成穩(wěn)定結構；3)將第二中間模具套在上述多分支結構外部。在第二中間模具與PLGA支架中注入纖維蛋白原/脂肪干細胞混合物(細胞密度為1乂105個/!^)，加入肝細胞生長因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生長因子(BB或PDGF_BB50ng/mL)、轉化生長因子β 1 (TGF β 110ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(b_FGF2. 5ng/mL)，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層交聯(lián)形成穩(wěn)定結構；(4)配備濃度為10% (W/V) 的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入(W/W)的肝素，將外模具套在上述雙層結構外部，在外模具與上述雙層結構之間注入復合肝素的PLGA/四乙二醇溶液，然后在細胞培養(yǎng)液中萃取溶劑形成PLGA外支架，完成多分支人工血管前體的制備。
實施例2 1)用硅橡膠制備多分支管道的實心多分支內模具、中間模具及外模具； 2)將第一中間模具套在實心多分支內模具外部，在實心多分支內模具與第一中間模具中注入含紫杉醇的纖維蛋白原/內皮細胞混合物(細胞密度為IX IO7個/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物1分鐘，交聯(lián)形成內層結構材料；幻將第二中間模具套在上述內層結構外部，在第二中間模具與內層結構材料中注入明膠/纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為IX IO6個/mL，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物1分鐘，交聯(lián)形成雙層結構材料；4)將第三中間模具套在上述雙層結構外部，在第三中間模具與雙層結構材料中注入纖維蛋白原/肝細胞混合物(細胞密度為IX IO7個/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL) 浸泡成形物1分鐘，交聯(lián)形成三層結構材料力)將外模具套在上述三層結構外部，在外模具與三層結構間注入5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇，攪拌均勻，然后經(jīng)過PBS 萃取成形外層聚氨酯層，去除模具，完成可植入型人工肝臟前體的制備。
實施例3 1)制備一系列口徑不等的多分支聚四氟乙烯模具；2)將第一中間模具套在多分支內模具外部，在多分支內模具與第一模具間注入檸檬酸鈉的膠原/內皮細胞混合物(細胞密度為1 X IO7個/mL)，采用物理交聯(lián)法在37°C下放置10分鐘，使膠原/內皮細胞混合物結構穩(wěn)定，去掉模具；3)將第二中間模具套在上述內層結構外部，在內層結構與第二中間模具間注入膠原/內皮細胞混合物，采用物理交聯(lián)法在37°C下放置10分鐘， 使膠原/平滑肌細胞混合物結構穩(wěn)定，去掉模具；4)將第三中間模具套在上述在膠原/內皮細胞混合物雙層結構外部，在第三中間模具與雙層結構間中注入膠原/平滑肌細胞混合物(細胞密度為IX IO7個/mL)；采用物理交聯(lián)法在37°C下放置10分鐘，使膠原/平滑肌細胞混合物結構穩(wěn)定，去掉模具；5)將第四中間模具套在上述膠原/內皮細胞混合物、膠原/平滑肌細胞混合物三層結構外部，并在膠原/內皮細胞混合物、膠原/平滑肌細胞混合物與第四中間模具間中注入膠原與脂肪干細胞/乳鼠心肌細胞(1 1)的混合物，細胞密度為1 X IO6個/mL，采用物理交聯(lián)法在37°C孵箱中放置10分鐘，使其四層材料結構穩(wěn)定，去掉模具；6)將外模具套在上述膠原/內皮細胞混合物、膠原/平滑肌細胞混合及膠原與脂肪干細胞/乳鼠心肌細胞混合物外部，在四層材料與外模具間注入濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液，加入30 %的檸檬酸鈉，攪拌均勻，然后經(jīng)過PBS萃取后完成可植入型人工心臟前體的制備。
實施例4 :1)用聚四氟乙烯制備帶分支管道的內模具、中間模具及外模具；2)將第一中間模具套在實心多分支內模具外部，在實心多分支內模具及第一中間模具間注入下列溶液纖維蛋白原和明膠兩種天然生物材料分別溶于磷酸緩沖液(PBQ溶液中制成10%和 30%的高分子溶液，再按1 l(v/v)比例混合均勻。然后按體積比加入10%的二甲基亞砜、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與腎小球細胞按1 1比例混合均勻，加入高分子溶液中，得到脂肪干細胞-腎小球細胞-明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物(細胞密度為IXlO4個/mL)；在實心多分支內模具與第一中間模具間注入上述混合物并用凝血酶溶液(30IU/mL)交聯(lián)2分鐘；3)將外模具套在上述內層結構外部，在內層結構與外模具間注入30% PU/四乙二醇溶液，經(jīng)過PBS萃取溶劑，形成雙層結構；4)將上述三維結構體在4°C 下放置半小時，然后-20°C冰箱中辦小時，最后放入-70°C低溫冰箱液氮中低溫保存，使用時快速復溫，培養(yǎng)以備使用。
實施例5 1)制備一系列口徑不等的黃銅橢圓形帶分支管道的內模具、中間模具及外模具；幻將第一中間模具套在實心多分支內模具外部，在實心多分支內模具及第一中間模具間注入下列混合物將纖維蛋白原溶于磷酸緩沖液(PBQ溶液中制成10%高分子溶液。然后按體積比加入20%的甘油、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與胰島細胞按2 1比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(細胞密度為IX IO7個/mL)，得到脂肪干細胞-胰島細胞、 明膠-纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物；將上述混合物注入到實心多分支內模具與第一中間模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)交聯(lián)2分鐘，形成內層結構；3)將外模具套在上述內層結構外，注入含3%紫杉醇的30%聚酯/四異二醇溶液，經(jīng)過蒸溜水萃取溶劑，形成雙層結構材料；4)將雙層結構材料在4°C下放置半小時，然后-20°C冰箱中辦小時，最后放入-196°C液氮中低溫保存，使用時快速復溫，加入培養(yǎng)液于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)備用。
權利要求
1.一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟進行1)將不同天然高分子溶液與不同動物體細胞懸浮液按1 9 9 1體積比混合制成多種細胞基質溶液；天然高分子溶液的質量百分濃度為 30% ；2)預先設計好實心多分支內模具(1)和一組具有不同直徑通道的中間模具(3)，將其中一種中間模具C3)套在實心多分支內模具(1)的外部，將其中一種細胞基質溶液灌注到實心多分支內模具(1)和中間模具C3)之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具(3)，形成穩(wěn)定的第一層細胞基質層O)；3)使用另一種通道直徑比第一種大的中間模具C3)套在第一層細胞基質層O)的外部，將另一種細胞基質溶液灌注到第一層細胞基質層( 和第二種中間模具C3)之間的縫隙中，采用物理或化學交聯(lián)方法，使細胞基質溶液中的天然高分子交聯(lián)，去除中間模具(3)， 形成穩(wěn)定的第二層細胞基質層；4)重復步驟2)與步驟3)，得到含不同動物體細胞的多層細胞基質層結構；5)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質量百分濃度為 30%的合成高分子溶液；6)將預先設計好的外模具( 套在多層細胞基質層結構外部，將合成高分子溶液灌入多層細胞基質層結構與外模具的縫隙中，用細胞培養(yǎng)液萃取合成高分子溶液中的溶劑，形成外層合成高分子材料層(6)，然后去除外模具(5)與實心多分支內模具(1)，制成多分支及多層結構的復雜組織器官前體。
2.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質溶液中還加入體積百分比為 30%的凍存保護劑，所述的凍存保護劑采用甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。
3.按照權利要求1或2所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于在細胞基質溶液中加入體積百分比為0.001% 0. 細胞生長因子。
4.按照權利要求3所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的細胞生長因子采用內皮細胞生長因子、細胞轉移因子或肝細胞生長因子。
5.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或幾種材料的復合物。
6.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸和纖粘連蛋白中的至少一種。
7.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于步驟1)中用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化鈉、3-羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液；步驟5)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或1，4-二氧六環(huán)。
8.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的實心多分支內模具(1)是由軟性材料制成的實心管組合而成，內模具各分支的直徑相同或不同。
9.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的中間模具C3)及外模具根據(jù)實心多分支內模具(1)的分支數(shù)量分為2 20個等分體結構，實心多分支內模具(1)分支結構采用有序或交錯排列。
10.按照權利要求1所述的一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，其特征在于所述的中間模具C3)及外模具( 外形截面為圓型或多邊形，其材料為金屬或是硬質合成高分子材料。
全文摘要
一種基于組合模具的復雜器官前體的制備方法，該方法首先制備細胞基質溶液和合成高分子溶液，一組具有不同通道直徑的中間模具分別套在實心多分支內模具外部，將細胞基質溶液灌注到實心多分支內模具與中間模具之間經(jīng)物理或化學交聯(lián)形成多層細胞基質層；將外模具套在多層細胞基質層外部，將合成高分子溶液灌注到細胞基質層和外模具之間，用細胞培養(yǎng)液或PBS萃取后形成外支架，去除組合模具即可。本發(fā)明可成形含不同細胞基質材料與合成高分子支架的復雜多分支三維結構，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導培養(yǎng)細胞需要時間長、細胞分布不均勻，細胞很難滲入到多分支結構中等缺點。
文檔編號A61L27/18GK102512261SQ20111044815
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者王小紅, 黃源文 申請人:清華大學