專利名稱：一種抗tom22蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言本發(fā)明提供一種單克隆抗體，該抗體能特異識(shí)別線粒體中的Tom22蛋白；以及所述抗體在制備用于治療肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含所述單克隆抗體作為活性成分。
背景技術(shù)：
抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展和完善，抗體藥物已從鼠單克隆抗體發(fā)展到人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人源抗體。截至2010年美國FDA已批準(zhǔn)超過40個(gè)抗體藥物。此外還有超過120種抗體藥物處于臨床研究，超過500種抗體藥物處于臨床前研究。這些抗體主要應(yīng)用于自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤的治療。線粒體含有1000-2000種蛋白質(zhì)，作為半自主性細(xì)胞器，其中，2%是由線粒體基因編碼;98%的蛋白是由核基因編碼的，它們經(jīng)胞質(zhì)核糖體合成后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，每一種蛋白在特定位置才能發(fā)揮功效，所以定向的將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體的各部位十分重要。Tom復(fù)合體作為線粒體前體蛋白進(jìn)入線粒體的門戶，它調(diào)節(jié)未折疊的前體蛋白通過線粒體外膜。Tom復(fù)合體包括 核心亞基Tom40、Tom22、Tom5、Tom6和Tom7,以及外周亞基Tom20和Tom70。其中hTom22、Tom20以及Tom7是線粒體前體蛋白定位到線粒體上的受體；Tom40是Tom復(fù)合體的核心組成,形成了蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的通道(GIP) ;Tom5、Tom6和Tom7具有組裝以及穩(wěn)固Tom復(fù)合體的功能。它們各司其職，實(shí)現(xiàn)線粒體前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。線粒體的不同前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)不是一個(gè)重復(fù)的過程，具有不同的路徑，不同的機(jī)制，分別定位于外膜、內(nèi)膜、基質(zhì)以及膜間隙。高文祥等的“線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展”綜述了有關(guān)轉(zhuǎn)位分子介導(dǎo)的線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展，從不同復(fù)合物介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)角度出發(fā)敘述線粒體前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑:Τ0Μ- Μ23介導(dǎo)內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、Τ0Μ- Μ22介導(dǎo)內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、TOM-SAM介導(dǎo)外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、IMS蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及OXAl復(fù)合物介導(dǎo)蛋白向外轉(zhuǎn)運(yùn)。孟紫強(qiáng)等的文章中簡述了線粒體前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的有意義部分:轉(zhuǎn)運(yùn)需要的能量、分子伴侶、線粒體前體蛋白的導(dǎo)肽、Tom復(fù)合體、Tim復(fù)合體以及位于膜間隙的異型多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用。而楊福愉的“蛋白質(zhì)跨線粒體膜的運(yùn)送”一文中從轉(zhuǎn)送的目標(biāo)位點(diǎn)出發(fā)，闡述了定位于基質(zhì)蛋白質(zhì)運(yùn)輸途徑、定位于外膜的蛋白質(zhì)運(yùn)送途徑、定位于膜間隙的蛋白質(zhì)運(yùn)輸途徑。hTom22是線粒體外膜上轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體前體蛋白的重要組成成分。hTom22由三部分組成包括N-端、C-端以及虛擬存在的橫跨膜。hTom22 N-端暴露在細(xì)胞溶質(zhì)區(qū)域，富含84個(gè)酸性氨基，包括19個(gè)負(fù)電荷域以及9個(gè)正電荷域。這一區(qū)域主要是通過靜電作用與線粒體前體蛋白帶正電荷的導(dǎo)肽(含有將要到達(dá)線粒體部位的信息，致使線粒體前體蛋白準(zhǔn)確定位)結(jié)合，是線粒體前體蛋白結(jié)合的受體領(lǐng)域之一。對(duì)于組裝hTom22以及定位于線粒體外膜上hTom22正電荷域發(fā)揮著重要的作用，但是Court DA等提出hTom22的負(fù)電荷域卻不是必需的成分，也不是線粒體前體蛋白的結(jié)合以及轉(zhuǎn)運(yùn)的必要成分。T0M22 N-端的轉(zhuǎn)移膜螺旋束縛著Tom40的兩個(gè)亞基，這樣的作用并不影響線粒體前體蛋白的前序列。hTom22C-端即IMS功能域暴露在膜間隙區(qū)域具有將自身組裝成Tom復(fù)合體以及轉(zhuǎn)運(yùn)前體蛋白的作用，但是對(duì)于前體蛋白的定位以及結(jié)合不是必需的組成部分。hTom22的MS功能域?qū)τ赥0M22-TIM23前體蛋白三聚物的穩(wěn)定性是必需的。hTom22的MS功能域和Tim23 N-末端50個(gè)氨基酸殘基的片段可以促使前體蛋白由TOM復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至 Μ23復(fù)合物。DEBORAH A.COURT通過中斷方法使N.crassa的基因失活，使用遺傳學(xué)的方法分析特定突變的等位基因。通過實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了 2種hTom22突變蛋白(缺乏2/3或者整個(gè)IMS)，發(fā)現(xiàn)hTom22的MS域不是hTom22組裝成Tom復(fù)合體必須的組成部分,也不是線粒體前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的至關(guān)重要的組分，但是對(duì)于反式結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別的前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)具有提高效率的作用。hTom22的IMS可以方便的將線粒體前體蛋白釋放到線粒體外膜的脂質(zhì)雙分子中或是IMS，也是Tom復(fù)合體與線粒體內(nèi)膜的接口。肝是人體內(nèi)十分重要的器官，俗稱“化工廠”，具有解毒以及代謝產(chǎn)物的作用。在Silvia Curado等的實(shí)驗(yàn)中，他們提出了 T0MM22突變體為肝再生提供了模型，是一個(gè)重要的脊椎動(dòng)物的遺傳模型，用來研究線粒體生物學(xué)和線粒體肝疾病。奧利弗突變體tom22s469在內(nèi)胚層器官中高度的表達(dá)(如肝臟、腸)，是肝臟的特異性表型。他們在實(shí)驗(yàn)中使用tom22mo誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡以及嗎啉反義寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表達(dá)。當(dāng)使用tom22mo處理肝時(shí)誘發(fā)肝細(xì)胞的凋亡，肝細(xì)胞中出現(xiàn)奧利弗突變體tom22s469。用嗎啉反義寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表達(dá)，使T0MM22基因瞬時(shí)中斷。當(dāng)T0MM22出現(xiàn)中斷表達(dá)時(shí)，就會(huì)在tom22s469中出現(xiàn)肝細(xì)胞特異性再生表型并且可以達(dá)到野生水平并且在T0MM22恢復(fù)之時(shí)已經(jīng)完成肝細(xì)胞的再生。T0MM22基因的臨時(shí)中斷對(duì)于成熟的肝細(xì)胞無影響。因此，我們可以發(fā)現(xiàn)，抑制T0MM22基因的表達(dá)或者抑制tom22蛋白的功能將有助于肝細(xì)胞和肝臟的再生恢復(fù)，本發(fā)明就是基于這個(gè)規(guī)律，篩選特異識(shí)別人源tom22蛋白的抗體，再運(yùn)用該抗體來中和tom22蛋白的功能，從而為各種肝臟疾病患者的肝細(xì)胞再生提供一種新的治療藥物。

本發(fā)明的特色是運(yùn)用重組表達(dá)的tom22蛋白膜外區(qū)直接在非免疫鼠源ScFv噬菌體表面呈現(xiàn)表達(dá)庫中篩選。本發(fā)明提供的單克隆抗體命名為HX1，經(jīng)過檢測單克隆抗體對(duì)特異性識(shí)別結(jié)合tom22蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體可與Tom22蛋白特異性結(jié)合，從而可以用于制備治療肝病的藥物。具體地，本發(fā)明提供以下:
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區(qū)由120個(gè)氨基酸殘基組成，序列如
下:Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lyslie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys GlnAla Leu Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro ThrTyr Val Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Asp Thr Thr AlaTyr Leu Gln lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg AspGly Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala LysThr
編碼重鏈可變區(qū)的cDNA序列為:
gaggtgaagcttgaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctggatataccttcagaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctctaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaacatatgttgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgacaccactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacgcggctacatatttctgtgtaagagatggttcttatggtatggactactggggtcaaggaactccagtcaccgtctcctcagccaaaacg
其輕鏈可變區(qū)由108個(gè)氨 基酸殘基組成，序列如下:
Thr Leu Cys Ser Pro Ser Leu Gln Gln He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr He His Trp Tyr Gln Gln Lys SerGly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Val Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Asn Thr Met Glu AlaGlu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Ser Pro He Thr Phe GlyGly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg
編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA序列為:
acattgtgctcacccagtctccagcaaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatacactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatgggtttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcaacaccatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaagtcacccatcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg
2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權(quán)利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列是與以上I和2所述的可變區(qū)的序列是一致的；該基因工程抗體可以是:人一鼠嵌合抗體(chimericantibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshapedantibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(single chain FVfragment, SCFv);或者是重鏈可變區(qū)和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ;或者是重鏈和輕鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR的排列、串聯(lián)或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進(jìn)行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。4.如權(quán)利要求書1-2所述的單克隆抗體或權(quán)利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結(jié)合能力。5.如權(quán)利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結(jié)合能力，并廣泛用于肝臟疾病的治療
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權(quán)利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學(xué)上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。7.如權(quán)利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種肝臟疾病。附圖表說明:

圖1.與恒定區(qū)連接后表達(dá)的全長HXl抗體的12% SDS-PAGE檢測。泳道1_4為經(jīng)DTT還原后的HXl抗體重鏈和輕鏈；泳道5為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量參考；泳道6-7為未還原的全長HXl抗體。
具體實(shí)施例方式為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，下文將參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)施例一、人源Tom22蛋白的重鉬表汰和鈍化
設(shè)計(jì)引物(Primerl: 5，G ATAT CC ATG GCT GCC GCC GTC G 和Primer2:5，GATACTCGA GCTATG CCC TGG A AA ACC TG)從人肝細(xì)胞cDNA中通過PCR擴(kuò)增(PCR主要反應(yīng)條件:94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸35秒；共30個(gè)循環(huán))，得到的目的片段經(jīng)NcoI/XhoI雙酶切后連接到表達(dá)載體pHAT2的Ncol/Xhol位點(diǎn)之間，篩選陽性克隆后，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)得到的序列與理論序列完全一致:
ATGGCTGCCGCCGTCGCTGCTGCCGGTGCAGGGGAACCCCAGTCCCCGGACGAATTGCTCCCGAAAGGCGACGCGGAGAAGCCTGAGGAGGAGCTGGAGGAGGACGACGATGAGGAGCTAGATGAGACCCTGTCGGAGAGACTATGGGGCCTGACGGAGATGTTTCCGGAGAGGGTCCGGTCCGCGGCCGGAGCCACTTTTGATCTTTCCCTCTTTGTGGCTCAGAAAATGTACAGGTTTTCCAGGGCA ；
其編碼的氨基酸序列為:
MAAAVAAAGAGEPQSPDELLPKGDAEKPEEELEEDDDEELDETLSERLWGLTEMFPERVRSAAGATFDLSLFV
AQKMYRFSRA
得到的重組質(zhì)粒pHAT2-tom22轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，從該轉(zhuǎn)化平板上挑單克隆于IOml新鮮培養(yǎng)基(含100ug/ml的氨芐青霉素)中37°C培養(yǎng)過夜；將過夜的IOml菌液轉(zhuǎn)入IL新鮮培養(yǎng)基(含100ug/ml的氨芐青霉素)于37°C培養(yǎng)4小時(shí)后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)6小時(shí)；于4°C 6000rpm離心收集菌體沉淀。將得到的菌體沉淀用60ml裂解緩沖液(25mM Tris，pH8, 500mM NaCl)重懸后，超聲裂解細(xì)菌；15000rpm離心30分鐘(4°C )，收集上清，加入到經(jīng)裂解緩沖液平衡好的Iml的N1-NTA填料中，上樣速度30ml/小時(shí)；再用裂解緩沖液清洗非親和結(jié)合的吸附蛋白；然后用 IOml 洗脫緩沖液(25mM Tris, pH8, 500mM NaCl,200mM imidazole)將目的蛋白洗脫下來，15%SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果。純化的蛋白脫鹽換到PBS緩沖體系中，_80°C凍存?zhèn)溆?。?shí)施例二、Panning篩選
噬菌體表面呈現(xiàn)文庫是專利申請者之前構(gòu)建的一個(gè)非免疫鼠源ScFv表達(dá)庫。本專利就是從該文庫中篩選能特異識(shí)別Tom22蛋白的抗體。用Tom22蛋白抗原包被塑料培養(yǎng)皿后，將重組噬菌體上清傾至其上，37°C培養(yǎng)2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的TGl傾至免疫吸附后的培養(yǎng)皿上，37°C培養(yǎng)I小時(shí)。如此“吸附一洗脫一繁殖”的過程即為Panning篩選，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌體表面呈現(xiàn)文庫。以后按上述方法進(jìn)行7輪篩選。
實(shí)施例三、單個(gè)重組噬菌體克隆的抗原結(jié)合活性的鑒定
1.制備單克隆重組噬菌體
Panning篩選后，將TGI茵液按原液；1:10 ;1:100 ；1:1000 4個(gè)稀釋度稀釋，鋪于SOBAG瓊脂板上，3 (TC倒置培養(yǎng)過夜。挑選90個(gè)單菌落，分別接種于100 u I的2XYTAG中，30°C培養(yǎng)過夜，取20u I培養(yǎng)物，加入200u I含5X10pfu/ml M13K07的2XYTAG中，37°C振蕩培養(yǎng)2h，離心，用2XYTAK 200u I重懸沉淀，30°C培養(yǎng)過夜.離心后的上清即為單個(gè)重組噬菌體。2.ELISA 檢測抗原結(jié)合活性(Douillard , et al., Enzyme-linkedImmunosorbent Assay for Screening monoclonal antibody production usingenzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74, 1983)
設(shè)I個(gè)陰性對(duì)照孔，I個(gè)陽性對(duì)照孔，90個(gè)待測孔。100 u 10.5% BSA包被陰性對(duì)照孔，100 u I羊抗M13噬菌體抗體包被陽性對(duì)照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待測孔。1%BSA 3 7°C封閉I小時(shí)。對(duì)照孔加M I 3噬菌體，待測孔加5 O u I待測上清與5 O u I封閉液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 uI工作濃度的HRP/羊抗M13噬茵體抗體，37 V反應(yīng)I小時(shí)。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在 4 I O n m 測每孔 OD 值。
實(shí)施例四、陽性克隆的ScFv基因序列測定，真核表達(dá)和純化
選擇篩選獲得的陽性克隆分別送公司進(jìn)行DNA測序。設(shè)計(jì)引物將陽性克隆的輕重鏈可變區(qū)與鼠源IgG的對(duì)應(yīng)的輕重鏈恒定區(qū)連接后插入到真核表達(dá)；然后分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞篩選穩(wěn)定表達(dá)株。取Iml的ProteinG-sepharose FF介質(zhì)到柱子中，經(jīng)PBS平衡后，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)ProteinG-sepharose FF柱子純化，然后用PBS清洗50柱體積后，用IOOmMGlycine (pH3)將目的蛋白洗脫到IM Tris, pH8.5平衡液中。在分別透析到PBS緩沖液中。10%SDS-PAGE鑒定純化得到的抗體純品。
實(shí)施例五、抗體的活性鑒定
設(shè)I個(gè)陰性對(duì)照孔，I個(gè)陽性對(duì)照孔，4個(gè)待測孔。IOOul 10.5% BSA包被陰性對(duì)照孔，100 u I羊抗鼠抗體包被 陽性對(duì)照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待測孔。1%BSA 3 7°C封閉I小時(shí)。對(duì)照孔加IgG，待測孔加5 O u I待測抗體與5 O u I封閉液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 u I工作濃度的HRP/羊抗鼠抗體，37°C反應(yīng)I小時(shí)。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在4 I O n m測每孔OD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株抗體與抗原有很強(qiáng)的反應(yīng)。命名為HX1。
參考文獻(xiàn)
Curado S et al.The mitochondrial import gene tomm22 is specificallyrequired for hepatocyte survival and provides a liver regeneration model.DisModel Mechj 2010，3(7-8): 486 - 495
Shiota T et al.1n vivo protein-1nteraction mapping of a mitochondrialtranslocator protein Tom22 at work.PNASj 2011， 108(37): 15179-15183
Pusnik M et al.Mitochondrial Preprotein Translocase of Trypanosomatids Hasa Bacterial Origin.Curr Biol, 2011， 21(20): 1738-43
Poynor M， Eckert R and Nussberger S.Dynamics of the PreproteinTranslocation Channel of the Outer Membrane of Mitochondria.BiophysicalJournal, 2008，95: 1511 - 1522.Court DA et al.Role of the Negative Charges in the Cytosolic Domain ofT0M22 in the Import of Precursor Proteins into Mitochondria.Mol Cell Biol,1998，18(6): 3173 - 3181
Yano M.et al.1dentification and Functional Analysis of Human Tom22 forProtein Import into Mitochondria.Mol Cell Bioj 2000，20(19): 7205 - 7213
Deborah A.et al .Role of the Intermembrane-Space Domain of the PreproteinReceptor Tom22 in Protein Import into Mitochondria.Molecular And CellularBiology, 1996，16(8): 4035 - 4042
Moczko M et al.The intermembrane space domain of mitochondrial Tom22functions as a trans binding site for preproteins with N—terminal targetingsequences.Mol Cell Biol, 1997，17(11): 6574 - 6584
Bellot G et al.T0M22， a core component of the mitochondria outer membraneprotein translocation pore,is a mitochondrial receptor for the proapoptoticproteinCell death and differentiation.2007， 14(4): 1-10
Yamano K et al.Tom20 and Tom22 Share the Common Signal Recognition Pathwayin Mitochondrial Protein Import.J Biol Chemj 2008， 283(7): 3799-3807
Anandatheerthavarada HKj Sepuri NB, Avadhani NG.Mitochondrial Targeting ofCytochrome P450 Proteins Containing NH2_terminal Chimeric Signals Involves anUnusual T0M20/T0M22 Bypass Mechanism.J Biol Chemj 2009，284(25): 17352 - 17363Mager F.et al.LILBID—mass spectrometry of the mitochondrial preproteintranslocase TOM.Journal of Physics Condensed Matter, 2010， 22(45):454131-454132
Rammohanj K.W.，H.F.McFarland, W.J.Bellini, J.Gheuensj and D.E.McFarlinj 1983， Antibody-mediated modification of encephalitis induced byhamster neurotropic measles virus, J.1nfect.Dis., 147(3): 546-550.Douillard ，et al.， Enzyme-1 inked Immunosorbent Assay for Screeningmonoclonal antibody production using enzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74，198權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區(qū)由120個(gè)氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:1所顯示；其輕鏈可變區(qū)由108個(gè)氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:2所顯/Jn ο
2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權(quán)利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。
3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列是與權(quán)利要求書I和2所述的可變區(qū)的序列是一致的；該基因工程抗體可以是:人一鼠嵌合抗體(chimeric antibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshaped antibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(singlechain FV fragment, SCFv);或者是重鏈可變區(qū)和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ；或者是重鏈和輕鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR的排列、串聯(lián)或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進(jìn)行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。
4.如權(quán)利要求書1-2所述的單克隆抗體或權(quán)利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體 中的Tom22蛋白具有特異的結(jié)合能力。
5.如權(quán)利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結(jié)合能力，并廣泛用于肝臟疾病的治療。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權(quán)利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學(xué)上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。
7.如權(quán)利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種肝臟疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能特異性結(jié)合線粒體Tom22蛋白的單克隆抗體及其在治療肝病中的功用。該單克隆抗體穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)。本發(fā)明提供了該抗體的可變區(qū)序列。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P1/16GK103183737SQ20111044498
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者安祺 申請人:北京和信非凡生物技術(shù)有限公司