專利名稱：冬葵子及其提取物在抗sars冠狀病毒感染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及冬葵子及其提取物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
SARS,即傳染性非典型肺炎，全稱為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acuterespiratory syndrome),是一種因感染SARS相關(guān)冠狀病毒而導(dǎo)致的新的呼吸道傳染病，以發(fā)熱、干咳、胸悶為主要癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)快速進(jìn)展的呼吸系統(tǒng)衰竭。SARS傳染性極強(qiáng)，病情進(jìn)展快速。自2002年11月在我國(guó)廣東首次發(fā)現(xiàn)SARS病例以來(lái)，已經(jīng)有許多國(guó)家和地區(qū)的人們受到這種病毒的威脅。該病可通過(guò)人與人的密切接觸和短距離接觸傳染性飛沫感染，而且起病急、傳播快、致死率較高，因此對(duì)人民的健康危害很大。找出非典型肺炎的致病病原體，是開(kāi)展有針對(duì)性的診斷、預(yù)防與治療的基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)全世界科學(xué)家的共同努力，探明這種疾病為一種變異的冠狀病毒所致，后將這種變異的冠狀病毒命名為“SARS病毒”。SARS冠狀病毒2/3到3/4的基因組編碼了兩個(gè)復(fù)制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和 pplab(Ziebuhr, Snijder et al.2000 ；Thiel, Herold et al.2001 ；Anand，Yang et al.2005 ；Ziebuhr 2005)，它們只有在病毒編碼的蛋白酶切割成獨(dú)立亞基之后才能使病毒完成正常轉(zhuǎn)錄、復(fù)制功能(Ziebuhr, Snijder et al.2000 ；Anand, Yang etal.2005 ；Bartlam, Yang et al.2005)，SARS冠狀病毒主要蛋白酶(簡(jiǎn)稱主蛋白酶，mainprotease)在這個(gè)過(guò)程中起主要作用。如果能夠抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會(huì)有效地抵御SARS冠狀病毒對(duì)人體的侵染。因此，SARS冠狀病毒的主蛋白酶是抗SARS藥物篩選的一個(gè)主要靶標(biāo)?，F(xiàn)在已經(jīng)成功研制出SARS主蛋白酶抑制劑，如阿比朵爾、來(lái)氟米特等。但是由于SARS病毒易變異的特點(diǎn)，耐 藥性的問(wèn)題也隨之出現(xiàn)，而長(zhǎng)期的藥物治療也會(huì)帶來(lái)一些副作用，且價(jià)格較高。因此，從天然產(chǎn)物中尋找新型SARS主蛋白酶抑制劑是現(xiàn)階段亟需解決的問(wèn)題。天然產(chǎn)物又稱次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無(wú)可限量的作用，也是當(dāng)今藥物研發(fā)過(guò)程中最具潛力的資源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM.Nat Prod Rep, 2000,17 (3):215-234 ;LeeK-H.J Nat Prod.2004,67(2):273-283)。現(xiàn)在對(duì)中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過(guò)程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾，每年都會(huì)有大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)，這些新穎化合物是合成方法所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，在新藥和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。對(duì)于天然產(chǎn)物尤其是來(lái)源于中藥等的天然產(chǎn)物的研究是很有必要的，因?yàn)橹兴幵谖覈?guó)已有數(shù)千年應(yīng)用的歷史，是藥物小分子化合物的一個(gè)巨大的寶庫(kù)，因此從中藥等天然產(chǎn)物中進(jìn)行重要病毒或重要疾病相關(guān)靶蛋白抑制劑的篩選是很有必要的。冬葵子又名葵子、葵菜子，為錦葵科一年生草本植物冬葵(Malva crispa L.)的成熟種子。全國(guó)各地均產(chǎn)。夏秋季種子成熟時(shí)采收。曬干，生用，搗碎入藥。本品甘寒滑利，既能利水通淋，又能下乳、潤(rùn)腸，二便不利者均宜。其主要成分為脂肪油及蛋白質(zhì)，臨床上主要用于治療淋證、乳房脹痛、便秘等癥?，F(xiàn)代文獻(xiàn)和考證關(guān)于冬葵子來(lái)源的認(rèn)識(shí)主要集中在三種錦葵科植物上:①冬葵(Malva verticillata)的種子,而歷版《中國(guó)藥典》以其果實(shí)為蒙古族習(xí)用藥材冬葵果；②蜀葵(Althaea rosea)的種子；③錦葵(Malva sinensis)的種子。但現(xiàn)今全國(guó)市場(chǎng)上的藥用冬葵子多為錦葵科植物苘麻(Abutilon thcophrasti Medi)的種子。關(guān)于冬葵子的文獻(xiàn)報(bào)道較少。陳燕飛等采用薄層色譜法鑒定冬葵子中阿魏酸，為蒙藥材冬葵子鑒定提供依據(jù)，為促進(jìn)冬葵子的開(kāi)發(fā)和利用奠定了一定的基礎(chǔ)。楊憲煌報(bào)道了含有該藥材的石葦散加減治療泌尿系結(jié)石療效顯著。目前尚無(wú)冬葵子在抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶活性中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在對(duì)冬葵子及其提取物進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)冬葵子及其提取物對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶具有良好的抑制作用。因此可以用于制備SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑，從而用于治療SARS冠狀病毒感染。本發(fā)明提供了冬葵子及其提取物在制備預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶活性的藥物中的應(yīng)用。其中，本文所用的冬葵子為錦葵科植物冬葵(Malva crispa L.)的種子。但其他來(lái)源的冬葵子可能也具有這種應(yīng)用，如錦葵科植物蜀葵(Althaea rosea)、錦葵(Malvasinensis)、和苘麻(Abutilon thcophrasti Medi)。在上面所述的應(yīng)用中，將所述冬葵子用溶劑進(jìn)行提取。其中，所述溶劑選自水、醇或其混合物。所述醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇、乙二醇等，優(yōu)選甲醇或乙醇。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將所述冬葵子用95%乙醇提取得到冬葵子95%乙醇提取物。

本發(fā)明還提供了冬葵子提取物在制備預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了冬葵子提取物的制備方法:將一定量的冬葵子藥材用水、醇、或其混合物提取2 5次，料藥比為1:1 10:1 (L/kg)，每次I 8小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾后合并提取液，減壓濃縮得到冬葵子的粗提物。本發(fā)明選取SARS冠狀病毒主蛋白酶作為靶標(biāo)蛋白，通過(guò)體外酶活高通量篩選(HTS)作為初步篩選方法，評(píng)價(jià)冬葵子及其提取物的活性，結(jié)果表明，冬葵子95%乙醇提取物具有很好的抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶活性的作用，說(shuō)明冬葵子可以成為預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染的潛在藥物，或者其可以與本領(lǐng)域公知的藥物上可接受的適當(dāng)載體或者賦形劑組成藥物組合物，用于預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染。


圖1為在500 μ g/mL終濃度下，冬葵子提取物對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶的酶活動(dòng)力學(xué)曲線。
具體實(shí)施例方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，在下面將詳述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。藥理活性測(cè)試部分1.SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達(dá)與純化根據(jù)文獻(xiàn)(YangH et al.Proc Natl Acad Sc1.2003 Nov ； 100 (23):13190-5)進(jìn)行SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達(dá)與純化。具體方法如下:1.1SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達(dá)載體的構(gòu)建，具體步驟包括:a.利用北京華大基因中心提供的編號(hào)為BJOl的SARS病毒毒株的cDNA文庫(kù)，用PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增；正向引物:5'-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3'
反向引物:5'-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3'b.經(jīng)PCR擴(kuò)增的基因片段經(jīng)BamHI和XhoI雙酶酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為Ikb左右的片段；c.將回收片段與T載體進(jìn)行連接,然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸肝菌(Escherichiacoli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)上，培養(yǎng)過(guò)夜；d.從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有約5mL的LB的試管(該LB溶液中加入氨芐青霉素，使其終濃度為100mg/L)中，培養(yǎng)過(guò)夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒)提取質(zhì)粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用瓊脂糖凝膠回收大小約為Ikb左右的目標(biāo)基因片段；e.將目標(biāo)載體pGEX-4T-l (購(gòu)自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用瓊脂糖凝膠回收酶切的片段；f.將d和e獲得的片段連接(將酶切回收后的目標(biāo)基因片斷和目標(biāo)載體片段按照摩爾數(shù)3:1 6:1的比率混合,按照Takara DNA Ligation的要求在16°C反應(yīng)30分鐘 18小時(shí))，轉(zhuǎn)化大腸肝菌(Escherichia coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)上培養(yǎng)過(guò)夜。將篩選到的陽(yáng)性克隆，用于鑒定和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，SARS冠狀病毒的主蛋白酶的編碼基因已被正確地克隆到pGEX-4T-l載體中。1.2SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達(dá)與純化，具體步驟包括:a.將上述步驟1.1中得到的含有編碼SARS冠狀病毒主蛋白酶基因的pGEX_4T_l載體轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21 (DE3)的菌株,并用LB平板(含100mg/L氨節(jié)青霉素)篩選陽(yáng)性克?。籦.在a中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆(在含有氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)出來(lái)的單克隆)，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入IL的LB培養(yǎng)基(含100mg/L氨芐青霉素)，當(dāng)0D_達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入ImM左右的IPTG，在16°C培養(yǎng)12小時(shí)左右；c.5000 8000rpm離心10 15min收集細(xì)胞，然后冰浴超聲破菌20 30min ;破菌液13000rpm 15000rpm離心20 40min后收集上清液；d.將上清液加入PBS預(yù)平衡的GST親和層析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20 30個(gè)柱床體積去除雜蛋白。最后加入2mL 0.lmg/mL左右的人類鼻病毒3C蛋白酶,在4°C酶切12 20小時(shí)，之后收集SARS冠狀病毒主蛋白酶；e.將上一步驟d中獲得的SARS冠狀病毒主蛋白酶再用Mono Q(GE公司)陰離子交換層析進(jìn)行純化，便可得到純度較高的SARS冠狀病毒主蛋白酶。2.SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的篩選方法本發(fā)明所采用的篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法是饒子和等在CN101418334A中公開(kāi)的篩選方法，具體方法如下:SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性測(cè)定是使用熒光底物MCA-AVLQSGFR-Lys (Dnp) -Lys_NH2 (純度大于95%，上海吉爾生化有限公司)來(lái)完成的。該熒光底物的氨基酸序列來(lái)源于SARS冠狀病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。用于突光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent突光儀(ThermoLabsystems,Helsinki, Finland)，激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為320nm和405nm。在緩沖溶液(5OmMTris-HCl (pH 7.3)，ImM EDTA (含或不含 DTT))中加入 SARS 冠狀病毒主蛋白酶(終濃度0.5 μ M)，加入備選樣品的DMSO溶解物(使其終濃度為:500 μ g/mL,底物濃度為20 μ Μ，298Κ放置10分鐘后，迅速加入熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQSGFRL (DNP)L-NH2，終濃度20μΜ)。設(shè)定陰性對(duì)照:不加入備選樣品，其余條件相同。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為320nm和405nm，溫度保持298K，每3秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定10個(gè)點(diǎn)。以時(shí)間為X軸，熒光值為Y軸作圖得到酶活動(dòng)力學(xué)曲線。通過(guò)圖上前兩個(gè)點(diǎn)的數(shù)值計(jì)算斜率得到反應(yīng)的初速度V，將陰性對(duì)照的反應(yīng)初速度定義為Vtl,加入備選樣品的反應(yīng)初速度定義為Vi,從而計(jì)算出加入相應(yīng)備選樣品后主蛋白酶的剩余活性(ViZiVtl)，相應(yīng)備選樣品的抑制率則為(1-ViAci)。可以對(duì)剩余活性小于20% (或抑制率大于80%)的備選樣品進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化以找到活性更集中的部位。 下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1冬葵子95%乙醇提取物的制備取2公斤的冬葵子藥材(購(gòu)自亳州市中藥飲片廠)，用8升95%乙醇回流提取3次，每次提取2小時(shí)，將提取液經(jīng)過(guò)濾后合并，用EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本理化公司)減壓濃縮，蒸干后得到浸膏74克。實(shí)施例2冬葵子95%乙醇提取物對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性的測(cè)定將實(shí)施例1中得到的冬葵子95%乙醇提取物取出5.0mg，溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中使其終濃度為50.0mg/mL。在緩沖溶液(50mMTris-HCl (pH 7.3), ImM EDTA (含或不含 DTT))中加入 SARS冠狀病毒主蛋白酶(終濃度0.5μΜ)，加入冬葵子95%乙醇提取物樣品的DMSO溶液(使其終濃度為:500 μ g/mL,底物濃度為20 μ Μ，298Κ放置10分鐘后，迅速加入熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQSGFRL (DNP) L-NH2,終濃度20 μ M)。設(shè)定陰性對(duì)照:不加入提取物樣品，其余條件相同。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為320nm和405nm，溫度保持298K，每3秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)，共測(cè)定10個(gè)點(diǎn)。以時(shí)間為X軸，熒光值為Y軸作圖得到酶活動(dòng)力學(xué)曲線，如圖1所示。根據(jù)該曲線，計(jì)算得到下列結(jié)果(樣品平行測(cè)定三次)。經(jīng)計(jì)算備選樣品在500 μ g/mL的終濃度下，對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制率是91.8%。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā) 明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，因此，上面的說(shuō)明書(shū)旨在用于說(shuō)明而不是用于限制。所以，本發(fā)明的范圍不應(yīng)參考上述說(shuō)明書(shū)來(lái)確定，而應(yīng)當(dāng)參照下面所附權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求所享有的等同原則所確定的全部范 圍確定。
權(quán)利要求
1.冬葵子在制備預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述冬葵子用于制備SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述冬葵子為錦葵科植物冬葵(Malvacriispa L.)的種子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述冬葵子經(jīng)溶劑提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述溶劑選自水、醇或其混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述醇是甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求 4所述的應(yīng)用，其中，所述溶劑是95%乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了冬葵子及其提取物在制備預(yù)防或者治療SARS冠狀病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明冬葵子的95％乙醇提取物對(duì)SARS冠狀病毒主蛋白酶活性的抑制率達(dá)到91.8％。
文檔編號(hào)A61K131/00GK103156890SQ20111041485
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者饒子和, 楊誠(chéng), 張春夢(mèng), 馮金磊, 李金楠, 王波, 牛國(guó)君, 陳衛(wèi)強(qiáng), 于飛, 劉影影 申請(qǐng)人:天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院