專利名稱：抗癌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供一種新型的IL-12誘發(fā)劑。具體講是涉及一種包含具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份的IL-12誘發(fā)劑。而且是涉及一種通過(guò)經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，可望能增強(qiáng)NK細(xì)胞活性能力、NKT細(xì)胞活性能力的抗癌組合物。
背景技術(shù)：
在用于有效預(yù)防及治療癌癥(malignant neoplasms)(cancer)的物質(zhì)的分級(jí)時(shí)，人們一直重視對(duì)癌細(xì)胞的直接作用。雖然已經(jīng)意識(shí)到免疫賦活劑對(duì)癌癥治療有效果，但是，作為免疫賦活劑制成的化合物其抗癌效果都微弱，即使通過(guò)單獨(dú)的免疫療法或者與化學(xué)療法相結(jié)合實(shí)施治療，也不能達(dá)到理想的癌癥治療效果。
本發(fā)明人八木田醫(yī)學(xué)博士，首先采用了劃時(shí)代的治療癌癥的方法，研究了在活體內(nèi)誘發(fā)白介素12(IL-12)的物質(zhì)的功能，發(fā)現(xiàn)香菇菌絲提取物具有以上功能，從而確立了稱作新免疫療法(Novel Immunotherapy forcancer，NITC)的癌癥治療方法。以前，IL-12事實(shí)上雖然具有抗癌效果，但由于直接投于活體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生副作用，患者耐以忍受治療。其IL-12本身不能作為抗癌劑使用。但是，八木田報(bào)導(dǎo)的含香菇菌絲體提取物的制劑在癌癥治療中取得了加快痊愈、延長(zhǎng)患者生命的效果。即，八木田通過(guò)投食能在活體內(nèi)誘發(fā)IL-12有效量的香菇菌絲體提取物，達(dá)到了治療癌癥的目的(特開平10-139670號(hào)公報(bào))。
IL-12按TNFα→IFNγ→IL-12→CTL活性的順序，對(duì)殺傷性T細(xì)胞具有活化效果及增強(qiáng)效果。即，IL-12的生成增強(qiáng)通過(guò)帶動(dòng)殺傷性T細(xì)胞的活化及增強(qiáng)有望達(dá)到抗癌功效。
八木田認(rèn)為，除IL-12的生成增強(qiáng)的體系外，NKT細(xì)胞活化也有助于抗癌作用。谷口等發(fā)現(xiàn)能識(shí)別NKT細(xì)胞的Vα24Vβ11這種特異性T細(xì)胞抗原受體(TCT)的特異性糖脂抗原，該抗原是KRN7000(α-半乳糖神經(jīng)酰胺)。而且，通過(guò)給藥KRN7000的患癌老鼠，證明NKT細(xì)胞被活化，未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞消失，但癌細(xì)胞擴(kuò)散得到抑制。
報(bào)告認(rèn)為在NKT細(xì)胞中，作為另一種受體，有NK細(xì)胞抗原受體(NKR-P1；自然殺傷細(xì)胞受體P1)(特集NKT細(xì)胞基礎(chǔ)和臨床最新醫(yī)學(xué)55卷4號(hào)2000年818～823頁(yè))。八木田發(fā)現(xiàn)，NKR-P1也與NKT細(xì)胞的活化相關(guān)，其活化的抗癌功效更強(qiáng)。
報(bào)告認(rèn)為，NK細(xì)胞與活體的抗癌作用相關(guān)。八木田證明，NK細(xì)胞的活性與臨床抗癌效果沒(méi)有關(guān)系，IL-12的生成誘發(fā)量和NK細(xì)胞的活性具有完全相反的關(guān)系。NK細(xì)胞在人體中的抗癌作用令人懷疑。
之前，八木田博士研究各種IL-12活體內(nèi)的誘發(fā)劑，發(fā)現(xiàn)了與癌癥周期之間關(guān)系的香菇絲體構(gòu)成的新IL-12誘發(fā)劑(ILY注冊(cè)商標(biāo)東方癌癥治療株式會(huì)社，SERABI產(chǎn)品名稱)。八木田醫(yī)學(xué)博士發(fā)現(xiàn)，含有β1，3/1，6葡聚糖的蘑菇絲體有抗腫瘤功效，這種抗腫瘤功效源于使Th1系統(tǒng)免疫綜合活化的白介素(IL-12)，并申請(qǐng)了涉及商品名稱AHCC、ILX、ILY、云芝多糖K(克癌星)、SPG等產(chǎn)品的新用途專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的課題包括，提供有用的IL-12誘發(fā)劑，特別是在癌癥發(fā)展過(guò)程中(進(jìn)行性癌、晚期癌)等情況下，更為有效的IL-12誘發(fā)劑；提供通過(guò)經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，期待能增強(qiáng)NK細(xì)胞活化能力、NKT細(xì)胞活化能力的抗癌組合物。
本發(fā)明一直研究酵母新型材料，并新發(fā)現(xiàn)，含有具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份是一種從來(lái)沒(méi)有的有效的IL-12誘發(fā)劑。此外，新發(fā)現(xiàn)通過(guò)經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，能有效增強(qiáng)NK細(xì)胞活化、NKT細(xì)胞活化的抗癌組合物，從而能提供本發(fā)明組成的抗癌組合物。
即，本發(fā)明包括1.含有具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份的IL-12誘發(fā)劑。
2.前項(xiàng)1中所述的IL-12誘發(fā)劑，作為活體攝取量，按10mg～2000mg/kg體重/天經(jīng)口攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
3.經(jīng)口攝取用健康補(bǔ)品制劑的前項(xiàng)1或者2所述的IL-12誘發(fā)劑。
4.以IL-12誘發(fā)能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，以此為特征的癌癥治療方法。
5.以NK細(xì)胞活化及/或者NKT細(xì)胞活化能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，以此為特征的癌癥治療方法。
6.以IL-12誘發(fā)能力、NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞活化能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，以此為特征的癌癥治療方法。
7.以IL-12誘發(fā)能力為指標(biāo)，以具有β1，3葡聚糖的釀酒酵母組成成份為備選化合物的新型抗癌劑的篩選方法。
8.在前項(xiàng)7所述的篩選方法中，以NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞的活化能力為指標(biāo)的新型抗癌劑的篩選方法。
9.使用有由前項(xiàng)7或者8的篩選方法得到的具有β1，3葡聚糖的釀酒酵母組成成份的抗癌劑。
10.將前項(xiàng)4～9的信息負(fù)載到使用有自然法則的媒介的商業(yè)用媒介。
11.利用前項(xiàng)10的商業(yè)用媒介的商業(yè)方法。


圖1表示對(duì)腫瘤體積的影響。6d表示第6天的結(jié)果。
圖1-2表示對(duì)腫瘤體積的影響。9d、13d分別是第9天、第13天的結(jié)果。
圖2表示對(duì)IL-12誘發(fā)量的影響。7d是第7天的結(jié)果。
圖2-2表示對(duì)IL-12誘發(fā)量的影響。10d、14d分別是第10天、第14天的結(jié)果。
圖3臨床例1圖4臨床例具體實(shí)施方式
本發(fā)明釀酒酵母組成成份的主要成份具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)。研究的酵母使用釀酒酵母組成的商品名稱Y-1095(三共イ-スト伊斯特(音)M)、實(shí)用發(fā)面酵母(使用ァルペンロ-ゼAlpine rose)等進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母成份是強(qiáng)力的IL-12誘發(fā)劑，特別是對(duì)于正在惡化的、處于晚期的癌癥患者來(lái)說(shuō)，是非常有效的IL-12誘發(fā)劑。而且，研究發(fā)現(xiàn)抗癌組合物，通過(guò)經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母成份，可期待增強(qiáng)NK細(xì)胞活化功能力、NKT細(xì)胞活化功能力。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在IL-12生成誘發(fā)劑中，除像AHCC那樣，對(duì)早期癌癥患者能夠特別有效地產(chǎn)生IL-12生成誘發(fā)的物質(zhì)外，存在如本發(fā)明構(gòu)成的具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的酵母組成成份的藥物，對(duì)處于發(fā)展性癌或者晚期癌的患者來(lái)說(shuō)，也能產(chǎn)生出IL-12生成誘發(fā)效果的物質(zhì)。
本發(fā)明的組合物或者經(jīng)口攝取用健康補(bǔ)品制劑對(duì)于肺癌、肺腺癌、胸腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、直腸癌、盲腸癌、尿道癌、乳腺癌、子宮頸癌、腦瘤、舌癌、咽頭癌、鼻腔癌、喉頭癌、胃癌、肝癌、膽癌、精巢癌、卵巢癌、子宮癌、惡性黑色癌、脂肪肉腫等的治療有效，但并不僅僅局限于以上癌癥。特別適合于服用了AHCC(AMINOUPァミノァップ株式會(huì)社)等的IL-12生成誘發(fā)劑，但I(xiàn)L-12量仍處于低值的患者(如7.8pg/ml以下)。
本發(fā)明涉及的IL-12生成誘發(fā)劑、NK活化劑、NKT活化劑，以免疫測(cè)定法測(cè)定的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，用于能夠誘發(fā)或者增強(qiáng)其活化、甚至能維持其活化的處方。即，基于標(biāo)準(zhǔn)，選擇使用誘發(fā)或者增強(qiáng)其活化，甚至能夠維持其活化的給藥量及給藥時(shí)間。上述IL-12生成誘發(fā)劑、NK活化劑、NKT活化劑適合經(jīng)口攝取。當(dāng)然，也可以將其制成可以非口服的產(chǎn)品，減少用量，非經(jīng)口攝取(靜脈注射或者肌肉注射等)。
另外，通過(guò)以下標(biāo)志物來(lái)測(cè)定、研究服用具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母成份對(duì)免疫活化的影響。
①IL-12生成能力CTL活性可通過(guò)CD8(+)穿孔蛋白生成能力來(lái)進(jìn)行判定。該CD8(+)穿孔蛋白值中有細(xì)胞抑制性T細(xì)胞(CTL)和免疫抑制性T細(xì)胞(STC)，前者抑制癌細(xì)胞，后者的活化最終會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的增生。所以，不能使用其絕對(duì)值來(lái)進(jìn)行評(píng)估。但是，前者只要是IFNY以10IU/ml以上或者IL-12值在7.8pg/ml以上，則為CTL；只要是IFNY和IL-12都是低值，則判定為STC。所以，CTL活性可通過(guò)IFNY生成能力(IFNY值)或者IL-12生成能力(IL-12值)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。
②NK和NKT細(xì)胞活化能力所謂的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞共同擁有NKR-P1(NK細(xì)胞受體CD161(+))，前者可通過(guò)CD3(-)CD161(+)的表面標(biāo)志物，測(cè)定NK細(xì)胞數(shù)量，其活化可通過(guò)CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力進(jìn)行判定。另一方面，后者的NKT細(xì)胞可通過(guò)CD3(+)CD161(+)來(lái)測(cè)定其細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)其穿孔蛋白生成能力可對(duì)NKT細(xì)胞的活化進(jìn)行測(cè)定。
所以，用于治療癌癥的新免疫療法(NITC)及普通的免疫療法都可以通過(guò)以下測(cè)定項(xiàng)目來(lái)對(duì)各自的受動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體來(lái)講，CTL活性可通過(guò)IFNY或者IL-12的誘發(fā)生成能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。NK細(xì)胞的活化可通過(guò)CD3(-)CD161(+)或者CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白值來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。NKT細(xì)胞的活化可通過(guò)CD3(+)CD161(+)或者CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白值進(jìn)行評(píng)價(jià)。
下面舉例說(shuō)明細(xì)胞及各標(biāo)志物的測(cè)定方法。
NKT細(xì)胞的測(cè)定、NK細(xì)胞的測(cè)定、CD8的測(cè)定具有NKR-P的NKT細(xì)胞測(cè)定可通過(guò)測(cè)定NKT細(xì)胞的細(xì)胞表面特異性存在的細(xì)胞表面抗原(CD3及CD161)來(lái)進(jìn)行。具體地講，對(duì)于末梢血中的淋巴球，檢定CD3為陽(yáng)性而且CD161為陰性(CD3(+)CD161(+))的細(xì)胞。即，通過(guò)用單克隆抗體，使用細(xì)胞流計(jì)數(shù)儀的Two Color檢查來(lái)測(cè)定NKT細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原CD3及CD161。這里，所謂的NKT細(xì)胞被活化是指在淋巴球中，CD3(+)CD161(+)NKT細(xì)胞的比例為10％以上，特別優(yōu)選16％以上。所謂的NKT細(xì)胞活化能力是指使NKT細(xì)胞比例增加到10％以上，特別是16％以上的功能，或者，在給藥某種物質(zhì)后，NKT細(xì)胞比例進(jìn)一步增加的功能。
同樣，所謂的(CD3(-)CD161(+))是鑒定CD3呈陰性而且CD161呈陽(yáng)性的細(xì)胞。本發(fā)明確認(rèn)，這種方法對(duì)測(cè)定NK細(xì)胞是有用的。
CD8(+)是指對(duì)CD8呈陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行檢定。本發(fā)明確認(rèn)，這種方法對(duì)測(cè)定CTL活性有用。
在實(shí)施例中，使用患者的血液，對(duì)血中細(xì)胞，細(xì)胞表面抗原的CD3、CD161、CD8分類為陽(yáng)性·陰性，通過(guò)使用細(xì)胞流計(jì)數(shù)儀的Two Color檢查對(duì)各細(xì)胞比例進(jìn)行常規(guī)測(cè)定。此時(shí)，針對(duì)CD3、CD161、CD8的單克隆抗體分別使用コ-ルタ-Coulter公司生產(chǎn)或者ベクトンデイッキンソンBEKUTONDHIKINSON公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
穿孔蛋白生成細(xì)胞測(cè)定對(duì)于末梢血中的淋巴球，對(duì)細(xì)胞表面抗原的CD3、CD8、CD161中的兩個(gè)和穿孔蛋白，通過(guò)使用細(xì)胞流計(jì)數(shù)儀的Three Color檢查進(jìn)行常規(guī)測(cè)定。具體地說(shuō)，在采得的血液內(nèi)添加固定液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，然后添加膜透過(guò)液，之后，添加抗穿孔蛋白抗體(Pharmingen公司生產(chǎn))，使其發(fā)生反應(yīng)，然后再添加PRE-Cy5標(biāo)識(shí)二次抗體(DAKO公司生產(chǎn))，使其發(fā)生反應(yīng)，然后，添加抗CD3-PE(Coulter 6604627)抗體和抗CD161-FITC(B-D)抗體，使其發(fā)生反應(yīng)，其后用細(xì)胞流計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。圖中的略語(yǔ)表示PERF。
制備用于測(cè)定細(xì)胞因子的試樣首先，從血液中分離制備出單核細(xì)胞部分。將肝素加末梢血用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)稀釋2倍，進(jìn)行混和，然后，復(fù)層到Ficoll-Conray液(比重1.077)上，以400G進(jìn)行20分鐘的離心(沉淀)，之后提取單核細(xì)胞部分。洗凈后，加入添加有10％的牛胎兒血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞數(shù)制備成1×106個(gè)。在制備好的細(xì)胞懸浮液200ul中加入Phytohemagglutinin公司(DIFCO公司制造)的植物血球凝集素，調(diào)配成濃度為20ug/ml。用96孔微量培養(yǎng)板Microplate在5％CO2、37℃環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)，制成測(cè)定該培養(yǎng)好的細(xì)胞溶液中細(xì)胞因子的試樣。
IL-12量的測(cè)定對(duì)誘發(fā)的IL-12量進(jìn)行測(cè)定，在后述的使用老鼠的實(shí)施例中，血清中誘發(fā)生成足夠的IL-12量，可利用對(duì)患者不用間接測(cè)定的酶免疫測(cè)定法(ELISA)的測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。在使用老鼠的體系中，使其經(jīng)口連續(xù)攝取IL-12生成誘發(fā)物質(zhì)，通過(guò)觀察其血中IL-12量的增加，可檢定IL-12生成誘發(fā)能力。
另外，對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，不能通過(guò)在血中存在抑制劑的情況，直接對(duì)血液中的IL-12量進(jìn)行測(cè)定。如，對(duì)于癌癥患者誘發(fā)的的IL-12生成量，可通過(guò)如下方法進(jìn)行測(cè)定，首先向從該癌癥患者的血液中分離制備出末梢血單核球中，添加刺激物質(zhì)，培養(yǎng)，之后進(jìn)行離心沉淀，制成去除細(xì)胞的培養(yǎng)液，然后進(jìn)行測(cè)定。用于培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量以0.5×106個(gè)/ml～1×107個(gè)/ml，最好是1×106個(gè)/ml。另外，刺激細(xì)胞的物質(zhì)可以通過(guò)如下方法進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)一直使用的分裂素植物凝集素(PHA)培養(yǎng)成最終濃度為0.1～100ug/ml，最好是1～20ug/ml的物質(zhì)。刺激細(xì)胞的物質(zhì)并不僅限于PHA，為了達(dá)成本發(fā)明的目的，只要是能刺激細(xì)胞，使其生成免疫生理活性物質(zhì)的物質(zhì)就可以，例如PMA(佛波醇12-豆蔻酸-13-醋酸)、PMA+離子霉素、LPS(脂多糖)、PWM(刺草分裂素)等。測(cè)定IL-12量可利用普通的臨床、生化檢查，也可使用R&D系統(tǒng)S公司和MBL公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。這里所述的IL-12生成誘發(fā)能力是指通過(guò)刺激末梢血單核球生成的IL-12量增加到7.8pg/ml以上的功能，或者是在給藥某種物質(zhì)后，IL-12生成量增加的功能。
本發(fā)明的經(jīng)口攝取用組合物作為具有IL-12生成誘發(fā)能力的活性成份，含有具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
本發(fā)明的含有誘發(fā)IL-12生成的活性成份，具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份的口服藥物，在癌癥的各個(gè)時(shí)期的IL-12生成誘發(fā)能力與眾所周知的AHCC相比有較大的差別。
本發(fā)明的以具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份為有效成份的藥物，在癌癥的早期階段具有足夠的IL-12生成誘發(fā)能力，有特征性的是在已發(fā)展的晚期癌癥中，也能發(fā)揮相同或者更好的IL-12生成誘發(fā)能力。另一方面，AHCC在癌癥的早期能發(fā)揮理想的IL-12生成誘發(fā)能力，但隨著癌癥的發(fā)展，其誘發(fā)能力呈下降趨勢(shì)。
本發(fā)明的經(jīng)口攝取組合物的給藥量，為每天1～2000mg/kg體重，最好是10～2000mg/kg體重，10天～1年、1～數(shù)次/天，適合進(jìn)行經(jīng)口攝取。當(dāng)然，也可以減少用量，將其制成可不必口服的產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)非口服方式。
本發(fā)明的主要成份具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，作為一種食品素材是公知的。如三共イ-スト伊斯特(音)·M(海洋性干燥酵母)等。下面，本發(fā)明以市售品為試樣進(jìn)行說(shuō)明。
經(jīng)口攝取制劑可制備成片劑、散劑、膠囊、糖漿制劑等。制劑配合常用的賦形劑、崩壞劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑等必要的添加物，也可以使用普通方法進(jìn)行制劑化。也可以根據(jù)需要，添加矯味劑、上色劑、香料、穩(wěn)定劑、滅菌劑和防腐劑等。
如上所述，因?yàn)楸景l(fā)明主要確定了以具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份為有效成份的經(jīng)口攝取用組成與癌癥的不同發(fā)展階段的IL-12生成誘發(fā)能力之間的關(guān)系，只要將以上技術(shù)應(yīng)用到商業(yè)媒介上，就會(huì)得到不同的效果。所以，擔(dān)持有上述信息于商業(yè)性媒介的產(chǎn)品是非常有用的產(chǎn)品。而且，因?yàn)橹灰獙⑸鲜鲂畔⒗迷谏虡I(yè)中，就能使該產(chǎn)品的價(jià)值提高，利用上述信息的商業(yè)方法是非常有用的方法。
上述信息，只要擔(dān)持在運(yùn)用自然法的媒介中，就形成商業(yè)用媒體，其商業(yè)用媒體提高有用的商業(yè)方法。
實(shí)施例下面，結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明并不僅僅局限于本實(shí)施例。
實(shí)施例1
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的分離和利用分離試樣的采集主要在東北地區(qū)的南部和關(guān)東地區(qū)沿太平洋岸的巖石上進(jìn)行，收集海水2061和海藻及海產(chǎn)小動(dòng)物292個(gè)。分離海水，在采集地使用孔徑為0.45um的膜濾器過(guò)濾，之后，將濾網(wǎng)置于分離瓊脂細(xì)菌培養(yǎng)基上，在氣密封厭氧罐(BBL公司制造、二氧化碳·氫氣發(fā)生 使用)中，在27℃的條件下培養(yǎng)10天時(shí)間。另外，海藻及海產(chǎn)小動(dòng)物的分離，將試樣約1g置入儲(chǔ)存用的培養(yǎng)基9ml內(nèi)，在厭氧條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，之后，將其少量用于分離瓊脂細(xì)菌培養(yǎng)基劃線，在厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
分離株的鑒定通過(guò)Van Der Walt和D.Yallow的方法研究形態(tài)學(xué)性質(zhì)和生理學(xué)性質(zhì)，基于酵母(ed.by N.W.Kreger van Rij)進(jìn)行。另外，實(shí)施與S.cerevisiae的標(biāo)準(zhǔn)株相同的DNA-DNA相同性試驗(yàn)，確認(rèn)為S.cerevisiae。結(jié)果，可以分離從海水分離出的10株和海藻分離出的3株組成的S.cerevisiae。
酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌體的制備(A)三共海洋性干燥酵母(B)使用Alpine rose實(shí)用發(fā)面PAN酵母將150ml的YPD培養(yǎng)基(酵母浸出物10g、聚肽20g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml、pH5.0)置于500ml的坡口燒瓶?jī)?nèi)，將27℃、24小時(shí)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)制成的菌體用作接種菌。本培養(yǎng)向5.0L用發(fā)酵缸內(nèi)加入上述培養(yǎng)液3.0L，滅菌后(121℃、40分鐘)后，提取上述振蕩培養(yǎng)菌體，在25℃、培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌體置入離心分離機(jī)(8,000rpm、10min)，將其分為上清液和沉淀部分。用0.85％的生理鹽水沖洗提取的菌體2次，在70℃的條件下干燥24小時(shí)，之后用研缽進(jìn)行研磨，制成菌體粉{(A)約20g、(B)約22g}。
實(shí)施例2通過(guò)發(fā)面PAN酵母(Alpine rose實(shí)用PAN酵母(300mg/kg)、三共(株)海洋性干燥酵母(Y-1095商品名稱 三共イ-スト伊斯特(音)·M)(300mg/kg)、三共(株)海洋性生酵母(1g/kg))，研究免疫學(xué)抗腫瘤作用和IL-12生成能力。另外，調(diào)整各組給藥量使各組中的β1，3葡聚糖的含量相同，分別給藥。
將3LL腫瘤移植到B10老鼠(C57BL/10)上，用第13天的腫瘤體積進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)圖1、圖1-2)。
移植腫瘤后強(qiáng)制經(jīng)口給水的對(duì)照(A)為239.41±150mm3(第13天)，普通發(fā)面PAN酵母、干燥酵母(B)(300mg/kg)組與對(duì)照相比，呈明顯增大趨勢(shì)。
另一方面，三共(株)的釀酒酵母(C、D)與對(duì)照相比，都呈縮小趨勢(shì)。
三共釀酒酵母組(D｀E｀)與強(qiáng)制經(jīng)口給水的一組對(duì)照(A)相比，血中IL-12濃度呈明顯的高值圖2、圖2-2)。IL-12的濃度通過(guò)AmershamPharmacia的Biotrak RPN2702白介素-12共{(m)IL-12}、(p40andp70)，鼠ELISA系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
與強(qiáng)制經(jīng)口給水對(duì)照(A｀)組相比較，試驗(yàn)組的IL-12都呈高值。但是，綜合比較腫瘤縮小作用和IL-12生成能力，發(fā)現(xiàn)三共(株)的釀酒酵母組最有效。
另外，本實(shí)驗(yàn)例所示的釀酒酵母為Y-1095。其它的釀酒酵母也具有相同的作用(以下表1)。
表1


臨床例下面，結(jié)合臨床例具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于本臨床例。
另外，在各臨床例中測(cè)定的各種腫瘤標(biāo)志物均通過(guò)公知的方法進(jìn)行測(cè)定。另外，所用療法的有效性符合基于日本厚生省GCP的抗癌劑效果判斷標(biāo)準(zhǔn)(Standard for judgement of the efficacy of anti-cancer agent underGCP of the Japan Ministry of Health and Welfare)，表示為完全治愈(CR)、部分治愈(PR)、無(wú)反應(yīng)(癌癥無(wú)發(fā)展)(NC無(wú)變化)、及無(wú)效(PD疾病繼續(xù)發(fā)展)。
臨床例1M.Y.59歲、女性 卵巢癌20XX年8月7日初診，開始服用擔(dān)子菌制劑的ILX(注冊(cè)商標(biāo))6.0g/天、ILY(注冊(cè)商標(biāo))3.0g/天、SHARK-BETTER LO 20g/天等。八木田稱這種治療方法為NITC。
IL-12的生成能力和NKT細(xì)胞活性增強(qiáng)，腫瘤標(biāo)志物CA15-3(30U/ml以下為正常值)從100U/ml持續(xù)明顯下降，CA125(35U/ml以下為正常值)也從1200U/ml同樣明顯持續(xù)下降。200XX年7月1日上述腫瘤標(biāo)志物都恢復(fù)到正常值以下，判斷為CR。
但是，開始治療后，從第17個(gè)月開始，CA125值開始上升，CA72-4及STN的卵巢部相關(guān)腫瘤標(biāo)志物也開始出現(xiàn)異常值。
從治療開始后的第26個(gè)月(20XX年9月14日)開始口服SP-1(商品名稱Y-1095三共イ-スト伊斯特(音)M)的釀酒酵母6.0g/天(每次2g分3次服用)。
服用后第2個(gè)月，CA125從1900U/ml明顯下降到120U/ml，CA72-4從38U/ml明顯下降到3.0＞U/ml，至第3個(gè)月，CA125、STN抗原、CA72-4都恢復(fù)到正常值以下。
期間，通過(guò)經(jīng)口給藥SP-16g/天(將2g分3次給藥)，IL-12生成能力由7.8pg/ml以下上升為16.1pg/ml及12.6pg/ml，確認(rèn)有生成增強(qiáng)作用。
由以上結(jié)果可知，給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份在臨床上是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份和IL-12生成能力增強(qiáng)之間具有相關(guān)性，以IL-12誘發(fā)能力為治療標(biāo)志物，確認(rèn)攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份對(duì)于癌癥的治療是有效的。
詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3。
臨床例2M.K.72歲、男性 肺腺癌和胃癌的復(fù)合癌200X年7月24日，由于患肺腺癌和胃癌復(fù)合癌不能實(shí)施切除手術(shù)，住進(jìn)本院。
開始經(jīng)口給藥ILX(注冊(cè)商標(biāo))6.0g/天、ILY(注冊(cè)商標(biāo))3.0g/天、SHARK-BETTER LO 20g/天。
但是，癌癥惡化時(shí)，腫瘤標(biāo)志物(CEA、NCC-ST439、CA15-3、SLX-1)沒(méi)有上升，曾判定為NC，但第5個(gè)月時(shí)，SLX-1由120U/ml惡化到150U/ml，判定為PD。另外，IL-12的生成能力也明顯降低。
所以，開始經(jīng)口給藥SP-1(商品名Y-1095三共イ-スト伊斯特(音))6g/天(將2g分三次服用)。之后，各種腫瘤標(biāo)志物開始持續(xù)下降，IL-12的生成能力也回復(fù)，而且，NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞也呈活化，一直維持PR狀態(tài)。
從以上結(jié)果可以確認(rèn)，給藥具有β1，3葡聚醣結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份在臨床上是有用的。另外，可見(jiàn)服用具有β1，3葡聚醣結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份和IL-12生成能力增強(qiáng)、NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞的活化之間有相關(guān)性。另外，以IL-12誘發(fā)能力、NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞活化為治療標(biāo)志物，攝取具有β1，3葡聚醣結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份確認(rèn)對(duì)癌癥治療是有效的。
詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。
產(chǎn)業(yè)利用的可能性新發(fā)現(xiàn)含有具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份的組合物是一種原來(lái)沒(méi)有的有效的IL-12誘發(fā)劑。而且發(fā)現(xiàn)抗癌組合物，經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份，可期待得到NK細(xì)胞活化能力、NKT細(xì)胞活化能力，利用本發(fā)明可以提供新型抗癌物。
權(quán)利要求
1.含有具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份的IL-12誘發(fā)劑。
2.如權(quán)利要求1的IL-12誘發(fā)劑，以10mg～2000mg/kg體重/天作為活體的服用量，經(jīng)口攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
3.如權(quán)利要求1或者2的IL-12誘發(fā)劑，經(jīng)口攝取用健康補(bǔ)品制劑。
4.一種癌癥的治療方法，其特征在于，以IL-12誘發(fā)能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
5.一種癌癥治療方法，其特征在于，以NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞的活化能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
6.一種癌癥治療方法，其特征在于，以IL-12誘發(fā)能力、NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞的活化能力為治療標(biāo)志物，使其攝取具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
7.一種新型抗癌劑的篩選方法，以IL-12誘發(fā)能力為指標(biāo)，以具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份為備選化合物。
8.在如權(quán)利要求7的篩選方法中，以NK細(xì)胞及/或者NKT細(xì)胞的活化能力為指標(biāo)的新抗癌劑篩選方法。
9.一種抗癌劑，使用如權(quán)利要求7或者8的篩選方法制成的具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成份。
10.將權(quán)利要求4～9的信息擔(dān)持于利用自然法則的媒介的商業(yè)用媒介。
11.利用權(quán)利要求10的商業(yè)用媒介的商業(yè)方法。
全文摘要
提供一種抗癌組合物，詳細(xì)地說(shuō)，新發(fā)現(xiàn)包含具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成分的組合物是一種從來(lái)沒(méi)有的有效的IL－12誘發(fā)劑，而且通過(guò)經(jīng)口給藥具有β1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的釀酒酵母組成成分，可期待有效增強(qiáng)NK細(xì)胞活化能力、NKT細(xì)胞活化能力，成功地提供本發(fā)明組成的抗癌組合物。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1578667SQ0282170
公開日2005年2月9日 申請(qǐng)日期2002年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者八木田旭邦 申請(qǐng)人:東方癌癥治療株式會(huì)社