專利名稱：抗癌及抗感染性疾病組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及非致病性病毒作為有效抗癌藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
縮寫單詞表A549 -人肺上皮腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)cNPV-苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒BMDC -骨髓衍生的樹突細(xì)胞BV422-表達(dá)CCL21的重組桿狀病毒BV762-表達(dá)Raf的重組桿狀病毒CCL21-C-C基序配體21趨化因子；次級(jí)淋巴組織趨化因子CD86 -樹突細(xì)胞成熟的標(biāo)記物CR -完全有效CTL -細(xì)胞毒T細(xì)胞溶解DC -樹突細(xì)胞FACS -熒光激活細(xì)胞分選GM-CSF -粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GV -顆粒體病毒HIV -人免疫缺陷病毒i.t. -腫瘤內(nèi)mCCL21 -鼠CCL21MHC -主要組織相容性復(fù)合物MHCII-MHCII類分子MLA-DR -MHCI類分子抗原MOI -感染復(fù)數(shù)NPV -核型多角體病毒
PBMC-外周血單核細(xì)胞PFU -噬斑形成單位qd -每天每天(每日給藥)rhCCL21 -重組人CCL21s.c.-皮下注射Sf(Sf9) -草地夜蛾Tn(Tn5) -粉紋夜蛾UV -紫外線VLP -病毒樣顆粒發(fā)明背景調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療策略。目前在設(shè)計(jì)腫瘤疫苗及免疫治療措施時(shí)注意力主要集中在鑒定腫瘤細(xì)胞特異性的抗原上。利用腫瘤特異性抗原或表達(dá)腫瘤特異性抗原的基因所具有的獨(dú)特的腫瘤免疫原性可以通過疫苗免疫來誘導(dǎo)出腫瘤特異性的免疫應(yīng)答。疫苗接種方法也包括適應(yīng)性細(xì)胞免疫治療方法，其中抗原提呈細(xì)胞經(jīng)改造后可提呈腫瘤相關(guān)抗原。其他的腫瘤免疫治療措施包括給予細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子在抗腫瘤治療中可作為佐劑或藥物產(chǎn)生療效，因?yàn)樗鼈兙哂袛U(kuò)增和補(bǔ)充免疫效應(yīng)細(xì)胞的能力。見Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2175-84；Parmiani等，(2002)J Natl Cancer Inst 94805-18；Bronte(2001)Curr Gene Ther153-100；以及Fehniger等，(2002)Cytokine Growth Factor Rev 13169-83。
免疫治療措施雖然具有上述優(yōu)點(diǎn)，但是要想取得成功還受到下列因素的限制(1)腫瘤特異性的抗原性，因此這種治療方法還只限于某些類型的腫瘤；(2)腫瘤細(xì)胞提呈抗原的能力弱；以及(3)腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫抑制因子來逃避免疫監(jiān)視。因此，在本領(lǐng)域中一直需要找到一種有效而廣譜的腫瘤治療措施。為了滿足這一需求，本發(fā)明提供了新型的免疫刺激方法以治療和預(yù)防腫瘤。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予動(dòng)物一定量的組合物，該組合物包含能有效誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的滅活的非致病性病毒。
本發(fā)明還提供了導(dǎo)致細(xì)胞死亡的方法，該方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予細(xì)胞以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。
另外，本發(fā)明還提供了在動(dòng)物體內(nèi)刺激CTL反應(yīng)的方法，該方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以刺激動(dòng)物體內(nèi)的CTL反應(yīng)，其中非致病性的病毒是昆蟲特異性病毒。
本發(fā)明提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長的方法，該方法包括將一定量的含有昆蟲特異性的非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長。
本發(fā)明還提供了影響動(dòng)物體內(nèi)腫瘤緩解的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地影響腫瘤的緩解。
本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地抑制腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明提供了使動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤耐受的方法，該方法包括將含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物。
另外，本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)的非腫瘤性增生性疾病的方法，該方法包括將含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物。
本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)的異常增生或化生的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地抑制動(dòng)物體內(nèi)的異常增生。
本發(fā)明還提供了抑制患病個(gè)體的一種或多種腫瘤癥狀的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予患病個(gè)體以有效地抑制其體內(nèi)的一種或多種腫瘤癥狀。
另外，本發(fā)明還提供了保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病感染的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性滅活病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病的感染。
本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)感染性疾病的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地防止動(dòng)物發(fā)生感染性疾病。
本發(fā)明提供了導(dǎo)致一群細(xì)胞發(fā)生死亡的方法，該方法包括使細(xì)胞群中的部分細(xì)胞與含有一定量的非致病性病毒的組合物接觸以有效地導(dǎo)致該細(xì)胞群發(fā)生細(xì)胞死亡。
本發(fā)明提供了治療疾病患者疾病的方法，該方法包括滅活非致病性病毒，其中非致病性病毒通過加入濃度約為5-10μg/ml的trioxalen并在約365nm和6W的紫外線下照射15分鐘加以滅活，將滅活的非致病性病毒制備成藥物組合物；以及將藥物組合物給予患者。
本發(fā)明還提供了預(yù)測一種化合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性的方法，該方法包括使化合物與腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞接觸；以及測定腫瘤細(xì)胞的死亡率。能引起被接觸腫瘤細(xì)胞死亡的化合物被認(rèn)為是具有體內(nèi)活性的化合物。
另外，本發(fā)明提供了阻止個(gè)體產(chǎn)生腫瘤的方法，該方法包括將一定量的含有非致病性病毒的組合物給予個(gè)體以有效地防止個(gè)體發(fā)生腫瘤。
另外，本發(fā)明提供了包含非致病性病毒和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的組合物。
本發(fā)明還提供了包含非致病性病毒的組合物，其中的非致病性病毒至少通過兩種不同的方法滅活。
本發(fā)明還提供了包含非致病性病毒和至少一種PBMC的組合物，其中的非致病性病毒用選自如下一組的兩種或兩種以上的方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
本發(fā)明提供了制備包含非致病性病毒的抗腫瘤或抗感染性疾病組合物的過程。該過程包括將病毒暴露于第一滅活劑以有效地滅活活性病毒，將病毒暴露于第二滅活劑以有效地滅活活性病毒，將病毒與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，以及用體外試驗(yàn)證明病毒是無活性的。
本發(fā)明還提供了包含一種非致病性的滅活病毒和至少一種抗原以及至少一種佐劑的藥物組合物，其中的抗原與非致病性的滅活病毒明顯不同。
另外，本發(fā)明還提供了包含佐劑組合物的免疫刺激組合物。佐劑組合物含有非致病性的滅活病毒和至少一種抗原。該抗原與佐劑組合物不同，另外，免疫刺激組合物還能夠提高機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
本文所描述的方法涉及人體的治療，但是這些方法也可用于治療需要治療的任何哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的腫瘤和非腫瘤性疾病包括而不限于肺、乳腺和皮膚的腫瘤和非腫瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，感染性疾病也可被治療或預(yù)防，其中包括病毒感染。
本發(fā)明還提供了可用于本文所描述的抗癌方法中的非致病性病毒，這些非致病性病毒包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。在某些實(shí)施方式中，病毒成分包括肽、蛋白、核酸、脂質(zhì)、糖及其混合物。在某些實(shí)施方式中，病毒成分是gp16。
在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。在某些實(shí)施方式中，昆蟲特異性病毒是桿狀病毒科的病毒。例如，本發(fā)明的非致病性病毒包括核型多角體病毒或顆粒體病毒。在某些實(shí)施方式中，非致病性的病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
在某些實(shí)施方式中，為了治療腫瘤將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐劑通過瘤內(nèi)注射和/或瘤旁注射給予哺乳動(dòng)物受試者。在某些實(shí)施方式中，為了治療非腫瘤性增生性疾病將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐劑通過病變部位內(nèi)注射和/或病變部位旁注射給予哺乳動(dòng)物受試者。治療方案可以是多次注射非致病性病毒，還可以選擇添加其他抗癌治療措施。
附圖簡述

圖1是一個(gè)線形圖，描述的是表達(dá)CCL21的桿狀病毒可在3LL肺癌鼠模型內(nèi)抑制腫瘤的生長以及誘導(dǎo)腫瘤的完全緩解。如實(shí)施例2所描述，CCL21給藥方案包括以所示的濃度在瘤內(nèi)注射6次。隨著注射劑量的增加腫瘤被抑制的程度及完全有效發(fā)生的幾率也增加。24天時(shí)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子變異數(shù)分析(One way ANOVAanalysis)。白蛋白組與治療組相比P＜0.001；25μg mCCL21組與6μg/Alb mCCL21組相比P＜0.01；25μg mCCL21組與25μg rhCCL21組相比P＞0.05。mCCL21，鼠CCL21；rhCCL21，重組人CCL21；B Gold，桿狀病毒表達(dá)的重組鼠CCL21，作為參考點(diǎn)(“GoldStandard”)；Alb，白蛋白；qd，每天(每日給藥)；CR，完全有效。
圖2是一個(gè)線形圖，描述的是注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒后4T1乳腺癌鼠模型中腫瘤生長的抑制，如實(shí)施例3所描述。rhCCL21，重組人CCL21；qd，每天(每日給藥)。
圖3是一個(gè)柱形圖，描述的是注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒后自發(fā)性4T1肺癌轉(zhuǎn)移的抑制，如實(shí)施例6所描述。實(shí)心柱，未進(jìn)行腫瘤手術(shù)切除的動(dòng)物；陰影線柱，最末一次注射CCL21后1天進(jìn)行腫瘤手術(shù)切除的動(dòng)物。
圖4是一個(gè)線形圖，描述的是給予表達(dá)CCL21的桿狀病毒可以使動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤耐受，如實(shí)施例5所描述。簡言之，在Balb/c小鼠體內(nèi)建立4T1腫瘤，其中一部分小鼠通過在瘤內(nèi)注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒進(jìn)行治療。最后一次注射CCL21后1天，通過手術(shù)切除腫瘤。切除腫瘤后1天，在原腫瘤部位的對(duì)側(cè)皮下注射4T1細(xì)胞給小鼠再次接種腫瘤?？瞻资笫侵肝催M(jìn)行腫瘤接種也未進(jìn)行CCL21處理的小鼠；Alb+Surg+Re-chlg，先接種T41腫瘤再進(jìn)行白蛋白處理的小鼠；hCCL21+Surg+Re-chlg，先接種T41腫瘤再進(jìn)行CCL21處理的小鼠。在Alb+Surg+Re-chlg組中，10只小鼠中有1只對(duì)腫瘤具有完全的抵抗力。在hCCL21+Surg+Re-chlg組，10只小鼠中有6只對(duì)腫瘤具有完全的抵抗力。
圖5A-5B說明了桿狀病毒誘導(dǎo)的對(duì)再接種腫瘤的抵抗力。在3LL腫瘤模型中，用表達(dá)CCL21的桿狀病毒成功處理的動(dòng)物對(duì)同種腫瘤的再次接種具有抵抗力，生存期延長。圖5A總結(jié)了一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中，用表達(dá)鼠重組CCL21的桿狀病毒處理后動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤完全緩解(見圖1)，在最后一次給予表達(dá)CCL21的桿狀病毒后60、70和80天在原腫瘤位置的對(duì)側(cè)給小鼠再次接種同種腫瘤。在至少70天內(nèi)動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤具有抵抗力。圖5B總結(jié)了另一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中，用表達(dá)CCL21的桿狀病毒處理誘導(dǎo)腫瘤完全緩解(″腫瘤加強(qiáng)″)后30天給動(dòng)物接種腫瘤，然后在最后一次給予表達(dá)CCL21的桿狀病毒后80、120、160和200天在原腫瘤位置的對(duì)側(cè)給小鼠再次接種同種腫瘤。這些結(jié)果表明利用腫瘤加強(qiáng)可使動(dòng)物在至少200天內(nèi)對(duì)再次接種的腫瘤具有抵抗力。
圖6是一個(gè)線形圖，描述的是酵母或大腸桿菌產(chǎn)生的CCL21在3LL肺癌模型中不能誘導(dǎo)腫瘤緩解。hCCL21-B(HBPG1)，桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-B 1/2(HBPG1)，桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21，lot#HBPG1，稀釋到hCCL21(HBPG1)濃度的一半；hCCL21-B conc.(HBPG1)，來源于濃縮溶液(10mg/ml)的桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-Y(HYPG4)，酵母表達(dá)的重組人CCL21，lot#HYPG4；hCCL21-E(HEDS4)，大腸桿菌表達(dá)的重組人CCL21，lot#HEDS4；qd，每天(每日給藥)。用白蛋白處理的小鼠與用hCCL21-B或hCCL21-B new處理的小鼠相比，其腫瘤的生長受到抑制，P＜0.01；與用hCCL21-B conc或hCCL21-B1/2處理的小鼠相比，其腫瘤的生長也受到抑制，P＜0.05。
圖7是一個(gè)線形圖，描述的是在體內(nèi)無活性的桿狀病毒表達(dá)的CCL21制劑在體外的趨化活性。趨化活性的分析基本按照PCT國際專利文獻(xiàn)WO 00/38706描述的方法進(jìn)行。體內(nèi)活性的評(píng)價(jià)描述于實(shí)施例2-6。HBDS2.p，桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS2.p；MBDS2.c，桿狀病毒來源的重組鼠CCL21，lot#MBDS2.c；HBPG1，桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot# HBPG1；HBPG1+HBDS2.vp，用乙烯吡啶處理的等比例的HBPG1和HBDS2混合物；HYPG4，酵母來源的重組人CCL21，lot#HYPG4；HEDS4，大腸桿菌來源的重組人CCL21，lot#HEDS4。
圖8描述的是一個(gè)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果，其中所示的樣品與抗gp64抗體雜交。條帶1，純化的桿狀病毒；條帶2，未感染的Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶3，感染野生型桿狀病毒的Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶4，感染表達(dá)重組人CCL21的BV422的Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶5，未感染的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶6，感染野生型桿狀病毒的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶7，感染BV422的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶8，桿狀病毒來源的人重組CCL2，lot#HBPG1過濾液，去掉＞50kDa(5μg蛋白質(zhì))的雜蛋白；條帶9，含有＞50kDa(5μg蛋白質(zhì))雜蛋白的條帶8的樣品過濾液殘留物；條帶10，含有雜蛋白(10μg蛋白質(zhì))的條帶8的樣品過濾液殘留物；條帶11，5μg未過濾的桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBPG1；條帶12，5μg未過濾的桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS4；條帶13，5μg未過濾的桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBMCl；條帶14，5μg未過濾的桿狀病毒來源的重組人CCL21，lot#HBDS1。
圖9是一個(gè)線形圖，描述的是經(jīng)過過濾去掉高分子雜蛋白后的桿狀病毒表達(dá)的CLL21的抗腫瘤活性。純化的桿狀病毒是CCL21制備物的污染物(圖8)，與桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物具有一樣的腫瘤抑制活性。
圖10A是一個(gè)線形圖，描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的組合物接觸后PBMC介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，如實(shí)施例8所描述。細(xì)胞團(tuán)所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)比細(xì)胞上清液所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)要高很多。感染表達(dá)CCL21的桿狀病毒或?qū)φ諚U狀病毒BV762的細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性。GAM，未用細(xì)胞培養(yǎng)物調(diào)整的生長分析培養(yǎng)基(對(duì)照)；BV422，表達(dá)CCL21的桿狀病毒；V762，表達(dá)Raf的桿狀病毒。
圖10B是一個(gè)線形圖，描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的經(jīng)0.2μm濾膜過濾的組合物接觸后PBMC介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，如實(shí)施例8所描述。通過過濾去掉高分子物質(zhì)可使細(xì)胞毒活性顯著下降。細(xì)胞團(tuán)樣品顯示出殘留的低度到中度的細(xì)胞毒活性。
圖11A是一個(gè)柱形圖，描述的是樹突細(xì)胞經(jīng)所示的刺激后CD86和MHC II表達(dá)的變化。實(shí)施例9描述了鼠骨髓衍生的樹突細(xì)胞的制備方法和分析方法。表達(dá)HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作為陽性對(duì)照。與VLP一樣，活的桿狀病毒可誘導(dǎo)CD86和MHC II的表達(dá)，這兩個(gè)分子是DC成熟的標(biāo)志。黑色柱，CD86的表達(dá)；灰色柱，MHC II的表達(dá)。
圖11B是一個(gè)柱形圖，描述的是樹突細(xì)胞經(jīng)所示的刺激后CD86和MHC II表達(dá)的變化。實(shí)施例9描述了人單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞的制備方法和分析方法。表達(dá)HIV gag蛋白(p55 VLP)的痘苗病毒作為陽性對(duì)照。與p55 VLP一樣，活的桿狀病毒可誘導(dǎo)DC的成熟。黑色柱，CD86的表達(dá)；灰色柱，HLA-DR的表達(dá)。
圖12描述的是鉻釋放試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)方法見實(shí)施例10的描述。表達(dá)HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作為陽性對(duì)照。與VLP一樣，活的桿狀病毒可作為一種高效的佐劑誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷活性。
圖13描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的組合物接觸后PBMC介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，如實(shí)施例8所描述。
圖14描述的是PBMC細(xì)胞毒活性與體內(nèi)抗腫瘤活性的關(guān)系。
圖15描述的是用抗gp64單克隆抗體阻斷桿狀病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。見實(shí)施例13。
圖16描述的是滅活桿狀病毒在體外誘導(dǎo)的PBMC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。見實(shí)施例14。
圖17表明腫瘤細(xì)胞是桿狀病毒的主要靶位。見實(shí)施例15。
圖18描述的是桿狀病毒在肺癌動(dòng)物模型中的腫瘤生長抑制效應(yīng)。見實(shí)施例16。
圖19描述的是桿狀病毒在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)的對(duì)致病性病毒感染的保護(hù)作用。細(xì)胞在體外和體內(nèi)用水泡性口炎病毒(VSV)感染。見實(shí)施例17。
圖20描述的是旁觀者效應(yīng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞群中20％的細(xì)胞與桿狀病毒接觸后就可以達(dá)到最大殺傷效應(yīng)。
發(fā)明詳述A1.非致病性病毒的抗腫瘤活性治療腫瘤的免疫學(xué)方法包括以趨化因子作為治療性藥物。趨化因子是一族同源性蛋白質(zhì)，其功能包括(a)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的遷移和活化；(2)調(diào)節(jié)血管生成；(c)以及維持免疫平衡和次級(jí)淋巴器官的結(jié)構(gòu)。見Baggiolini等，(1997)Annu Rev Immunol 15675-705；Jung & Littman(1999)Curr Opin Immunol 11319-25；以及Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2175-84。
如實(shí)施例1-6所描述，在研究利用次級(jí)淋巴組織趨化因子(本文稱為“CCL21”；本領(lǐng)域中也被稱為SLC、Exodus-2和6C-kine)進(jìn)行腫瘤的免疫治療的過程中，本發(fā)明的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)非致病性的病毒是具有高活性的抗腫瘤因子。見實(shí)施例7。
因此，本發(fā)明提供了方法以治療需進(jìn)行抗癌治療的患者，其中包括通過給予患者非致病性的病毒以抑制腫瘤的生長，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)對(duì)腫瘤抵抗力。值得注意的是，本文所描述的腫瘤治療方案不需要鑒別出腫瘤特異性的抗原。因此，非致病性病毒的應(yīng)用范圍很寬，對(duì)多種類型的腫瘤都有療效。見實(shí)施例2-6。
雖然發(fā)明者不希望固定于特定的操作模式，但是發(fā)明者認(rèn)為非致病性病毒的抗癌活性應(yīng)該歸功于，至少部分歸功于其免疫刺激活性。例如，桿狀病毒在體外和體內(nèi)都可誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的成熟和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。見實(shí)施例9-10。另外參見Gronowski等，(1999)J Virol.739944-51。
本文所用的術(shù)語“病毒”用于描述一種有效的抗腫瘤組合物，包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。
病毒體和病毒樣顆粒(VLPs)通常包含非致病性病毒的一種或多種蛋白質(zhì)，還可以選擇添加磷脂。在某些實(shí)施方式中，病毒體和VLPs是非復(fù)制型的，不含有任何的天然病毒基因組。病毒蛋白可以是通過重組方法制備的，也可以是從完整病毒中分離的。VLPs在下面的文獻(xiàn)中還有進(jìn)一步描述WO 03/024480，WO 03/024481，Niikura等，(嵌合重組戊型肝炎病毒樣顆粒作為提呈外源表位的口服疫苗載體“ChimericRecombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle PresentingForeign Epitopes”，Virology(2002)293273-280)；Lenz等，(乳頭狀瘤病毒樣顆粒誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的急性活化“Papilloma rivurs-Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells”，Journal of Immunology(2001)5246-5355)；Pinto等，(人乳頭狀瘤病毒(HPV)-16 L1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，用重組HPV-16 L1病毒樣顆粒免疫健康志愿者“Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 HealthyVolunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles”，Journal ofInfectious Diseases(2003)188327-338)；以及Gerber等，(人乳頭狀瘤病毒樣顆粒與大腸桿菌熱穩(wěn)定性的外毒素突變體R192G或CpG聯(lián)合使用時(shí)是一種有效的口服免疫原“Human Papillomavirus Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens whenCoadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG”，Journal of Virology(2001)75(10)4752-4760)。病毒體在下面的文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的描述Gluck等，(未來開發(fā)疫苗的新技術(shù)平臺(tái)“New Technology Platforms in theDevelopment of Vaccines for the Future”，Vaccine(2002)20B10-B16)。
術(shù)語“活病毒”是指感染性與天然病毒相似或一樣的病毒?；畈《居绕淇梢愿腥酒涮烊坏乃拗骷?xì)胞。
術(shù)語“滅活病毒”是指在天然宿主細(xì)胞內(nèi)無法復(fù)制的病毒，下文有進(jìn)一步的描述。例如，非致病性的病毒在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，同樣被滅活后在其天然宿主細(xì)胞內(nèi)也無法復(fù)制。使用滅活病毒可降低人們對(duì)使用活病毒安全性的擔(dān)心。“滅活劑”是指用于滅活病毒的試劑。
術(shù)語“病毒顆粒”是指天然形式經(jīng)改造或修飾后的病毒，因而在天然宿主細(xì)胞內(nèi)無復(fù)制能力。制備病毒顆粒的方法是本領(lǐng)域所熟知的。可通過電鏡、免疫原性分析和標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑形成試驗(yàn)來評(píng)價(jià)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性。例如，Hamakubo等，WO 02/06305描述了去核桿狀病毒樣顆粒的制備方法。
美國專利No.5,750,383描述了利用標(biāo)記獲救系統(tǒng)制備桿狀病毒顆粒的方法。該方法利用了遺傳修飾的桿狀病毒，這種病毒缺乏病毒復(fù)制所必需的基因(如gp64)，只能在能彌補(bǔ)其遺傳缺陷的細(xì)胞內(nèi)繁殖。
術(shù)語‘病毒包含體”是指包含多個(gè)包被在病毒編碼蛋白晶體內(nèi)的病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。蛋白晶體一旦裂解，多個(gè)病毒顆粒就會(huì)釋放出來，每個(gè)病毒顆粒隨后都可以感染宿主細(xì)胞。
病毒，特別是桿狀病毒可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆細(xì)胞系，接種病毒后在適于病毒復(fù)制的條件下孵育足夠的時(shí)間。培養(yǎng)條件如細(xì)胞密度、感染復(fù)數(shù)、時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基等都不是關(guān)鍵的因素，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定選用何種條件。
制備桿狀病毒的典型方法見實(shí)施例1的描述，該方法利用了草地夜蛾(Sf)細(xì)胞。其他有代表性的宿主細(xì)胞及擴(kuò)增方法見美國專利Nos.5,405,770(Heliothis subflexa細(xì)胞系)和6,379,958(草地夜蛾細(xì)胞系，該細(xì)胞系可提高桿狀病毒的產(chǎn)量)的描述。
經(jīng)過孵育以后，產(chǎn)生出的病毒用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)回收，其中包括聚乙二醇(PEG)沉淀、超速離心以及色譜純化，例如利用離子交換樹脂、排阻層析、親和層析或結(jié)合使用。見美國專利申請No.2002/0015945(色譜純化)；美國專利No.6,194,192(病毒吸附到含硫酸巖藻糖的多糖上)。
術(shù)語“病毒成分”用于本文中是指非致病性病毒來源的保留了其親本活病毒的抗腫瘤和/或抗感染性疾病活性的分子。在某些實(shí)施方式中，病毒成分抗腫瘤活性的大小及特異性與其親本活病毒一樣。術(shù)語“病毒成分”包括病毒的任何成分，如蛋白、肽、核酸、脂質(zhì)、糖及其他生物活性分子及其混合物。在某些實(shí)施方式中，病毒成分是gp64。
例如，病毒成分可以是病毒外殼蛋白或病毒核蛋白核心的DNA相關(guān)蛋白。典型的桿狀病毒外殼蛋白見如下文獻(xiàn)的描述Pearson等，(1988)Virology 167407-13；Summers & Smith(1978)Virology 84390-402；Thiem & Miller(1989)J Virol 632008-18以及Vialard & Richardson(1993)J Virol 675859-66。典型的桿狀病毒DNA相關(guān)蛋白見Tweeten等(1980)J Virol 33866-876；Wilson等(1987)J Virol 61661-6以及Rohrmann(1992)J Gen Virol73(Pt 4)749-61的描述。
病毒成分還可以是存在于病毒包含體內(nèi)的蛋白和多糖，其中包括成熟包含體的包含體基質(zhì)以及花萼外層。典型的桿狀病毒包含體蛋白包括多角體和花萼。
本文說明非致病性病毒具有很高的抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本說明書后可以很容易地鑒定、純化或者制備和使用具有親本活病毒抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性的病毒成分。例如，美國專利No.6,001,806描述了一種生物化學(xué)方法，該方法首先裂解桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞并分離其中的不同組分，然后利用其中的洗脫組分鑒定可被親本活病毒識(shí)別的具有抗病毒活性的糖蛋白。
另外，利用本領(lǐng)域熟知的重組方法可以很容易地制備病毒蛋白和核酸，并且同樣可以檢測其抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性。例如，病毒核酸可被克隆、合成、改變、突變等。用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在下列參考書中有描述Sambrook等(編)(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Silhavy等，(1984)基因融合試驗(yàn)技術(shù)(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover & Hames(1 995)DNA克隆操作方法(DNA CloningA Practical Approach)，第二版，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford/New York；以及Ausubel(編)(1995)分子生物學(xué)簡明手冊(ShortProtocols in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。重組制備的多肽也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法純化和鑒定，見Schrder & Lübke(1965)肽(The Peptides)，Academic Press，New York；Schneider & Eberle(1993)肽1992第22界歐洲多肽論壇論文集(Peptides，1992Proceedings of the Twenty-SecondEuropean Prptide Symposium)，9月13-19日，1992，Interlaken，Switzerland.Escom，Leiden；Bodanszky(1993)肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，第二版，Springer-Verlag，Berlin，New York；以及Ausubel(編)(1995)分子生物學(xué)簡明手冊(Short Protocois in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。
特別是AcNPV完整序列已經(jīng)清楚(Kool和Vlak，1993)，因此利用已知的方法可以很容易地系統(tǒng)分析所有的AcNPV蛋白，包括重組表達(dá)和抗腫瘤活性的檢測。
為了更容易地鑒定具有活性的病毒成分，本發(fā)明還提供了一種體外分析方法用于篩選候選病毒成分。見實(shí)施例8。該分析方法包括用外周血單核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)細(xì)胞毒活性。如本文所描述，非致病性病毒可誘導(dǎo)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，這種活性與其在體內(nèi)所觀察到的抗腫瘤活性是相關(guān)的。候選病毒成分包括非致病性病毒的生化組分、純化的或重組的病毒蛋白、純化的或合成的核酸、病毒體、病毒樣顆粒等。
本文所用的術(shù)語“非致病性的”用于描述病毒，是指該病毒不能感染其哺乳動(dòng)物宿主，在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒不能感染任何哺乳動(dòng)物宿主。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒對(duì)人沒有感染性。為了便于描述，除非特別說明，術(shù)語“非致病性的”病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。
術(shù)語“感染性”通常是指對(duì)宿主細(xì)胞或生物體有害的特性，例如通過基因的表達(dá)和/或通過在宿主內(nèi)的復(fù)制對(duì)宿主細(xì)胞或生物體造成損傷。與此定義相一致的是，非致病性并不排除可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是進(jìn)入以后對(duì)宿主細(xì)胞或生物體的健康沒有影響。然而在某些實(shí)施方式中，非感染性的病毒不能進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
非致病性病毒如桿狀病毒在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)是轉(zhuǎn)錄靜止的。因此，在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是一類被目前的基因治療方法排除在外的病毒，因?yàn)槠鋽y帶的外源基因也不表達(dá)。
非致病性病毒的例子包括而不限于昆蟲特異性病毒、兩棲動(dòng)物特異性病毒以及植物特異性病毒?？捎糜诒疚乃枋龅姆椒ㄖ械牡湫筒《景U狀病毒家族的病毒(例如核型多角體病毒(NPV)，其中包括苜蓿銀紋夜蛾NPV，以及顆粒體病毒(GV)，其中包括草地夜蛾顆粒體病毒)，多分DNA病毒科的病毒(如姬蜂病毒(ichnoviruses)，其中包括Campoletis sonorensis virus，以及繭蜂病毒(bracoviruses)，其中包括CotesiaMelanoscela virus)，囊泡病毒，四病毒科和羅達(dá)病毒科(如野田村病毒，其中包括日本庫蚊病毒和禽獸棚病毒(Flock House Virus))。可用于本發(fā)明的許多非致病性病毒在昆蟲中都可以找到。見Fields等編，(1996)，Virology，Lippincott-Rave Publishers，Philadelphia，Pennsylvania。
術(shù)語“感染性疾病”是指對(duì)其宿主有害的因子(如病毒、真菌或細(xì)菌)。在某些實(shí)施方式中是指對(duì)人有害的因子?！翱垢腥拘约膊　钡拇胧┦侵缚深A(yù)防、改善或根除感染性疾病和/或其致病因子的治療措施。
感染性疾病的例子包括而不限于HIV、西尼羅河病毒、甲型、乙型、丙型肝炎、天花、結(jié)核、水泡性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、SARS、流感、埃博拉病毒、病毒性腦膜炎、皰疹、炭疽、萊姆病以及大腸桿菌等。
在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是桿狀病毒。如下面實(shí)施例所描述的，本發(fā)明證明桿狀病毒是一種高活性的腫瘤生長抑制因子，可促進(jìn)腫瘤的完全緩解。本發(fā)明還證明桿狀病毒可用于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，提高動(dòng)物對(duì)再次接種腫瘤的抵抗力，如實(shí)施例5-6的描述。
如本文所述，術(shù)語“腫瘤再次接種”是指癌或腫瘤已被治療或切除的動(dòng)物再次接種新的腫瘤。與本文上面所提供的定義相一致的是，術(shù)語“桿狀病毒”包括桿狀病毒顆粒和桿狀病毒成分。
桿狀病毒的宿主特異性已得到徹底研究。雖然已知桿狀病毒可感染30多種鱗翅類昆蟲，但是它不能感染已經(jīng)研究過的其他昆蟲細(xì)胞和超過35種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。見Tjia等，(1983)Virology 125107-17；Volkman & Goldsmith(1983)Appl EnvironMicrobiol 451085-1093；以及Mdntosh & Shamy(1980)Intervirology 13331-41。但是，桿狀病毒確實(shí)可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞核內(nèi)也可以檢測到病毒DNA。見Groner等，(1984)Intervirology 21203-9；Tjia等，(1983)Virology 125107-17；以及Volkman & Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 451085-93。
術(shù)語“非致病性的”病毒還可以指天然形式是具有致病性的但是經(jīng)修飾后是非致病性的病毒。這種修飾包括基因修飾(如打斷病毒復(fù)制所必需的基因，如本文所描述的桿狀病毒基因gp64；和/或打斷病毒啟動(dòng)子使其在宿主內(nèi)無轉(zhuǎn)錄活性)。例如，桿狀病毒物種特異性的致病性部分是由于桿狀病毒啟動(dòng)子在鱗翅類昆蟲以外的物種內(nèi)保持靜默。當(dāng)異源啟動(dòng)子插入到桿狀病毒基因組時(shí)，被修飾的病毒就可以在非鱗翅類昆蟲細(xì)胞系內(nèi)啟動(dòng)基因的表達(dá)，其中包括各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。見Boyce &Bucher(1996)Proc Natl Acad Sci USA 932348-52；Carbonell等，(1985)J Virol 56153-60；Carbonell & Miller(1987)Appl Environ Microbiol 531412-7；以及Hofmann等，(1995)Proc Natl Acad Sci USA 9210099-103。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)原本有活性的病毒啟動(dòng)子同樣也可以被修飾成無活性的啟動(dòng)子，這樣病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)就是非致病性的。制備堿基對(duì)改變、缺失或小片段插入的位點(diǎn)特異性突變方法也是本領(lǐng)域所熟知的，例如本文上面所提到的參考文獻(xiàn)所描述的方法。
確定經(jīng)修飾的病毒和未經(jīng)修飾的病毒是否是非致病性的可以通過本領(lǐng)域所熟知的確定病毒感染性和復(fù)制能力的方法很容易地加以分析。典型的方法見Tjia等，(1983)Virology 125107-17；Volkman & Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 451085-93；Mdntosh & Shamy(1980)Intervirology 1333 1-41；以及美國專利No.6,248,514等的描述。
本發(fā)明還提供了具有抗癌活性和/或抗感染性疾病活性和/或佐劑活性的非致病性病毒，其中包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、VLPs、病毒包含體以及病毒成分。本發(fā)明還提供了篩選可用于本文所描述的治療方法中的非致病性病毒的方法。
為了篩選具有抗癌活性的非致病性病毒，候選非致病性病毒用實(shí)施例8所描述的體外或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞溶解試驗(yàn)和/或?qū)嵤├枋龅捏w內(nèi)抗癌活性試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠頇z測。在某些實(shí)施方式中，先用體外試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，然后在相關(guān)的動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)價(jià)那些具有體外活性的病毒在體內(nèi)是否也具有抗癌活性。
為了篩選具有佐劑活性的非致病性病毒，需要檢測候選非致病性病毒增強(qiáng)抗原免疫原性的能力。免疫原性可通過檢測T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)來確定。檢測T細(xì)胞反應(yīng)的經(jīng)典方法包括體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)或體內(nèi)延遲型超敏試驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，CCL21聯(lián)合非致病性病毒可在體外誘導(dǎo)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，這種活性與其在體內(nèi)的抗腫瘤活性相關(guān)。另外也可以用其他抗原來代替CCL21。另外還可以通過檢測受試者血清中抗原特異性的抗體和/或證明抗原特異性的抗血清或免疫細(xì)胞具有保護(hù)作用來分析免疫原性。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒可使抗原的免疫原性至少提高約2倍、約5倍、約10倍、約25倍或約100倍。
在某些實(shí)施方式中，非致病性的病毒是被滅活的，如下文將要進(jìn)一步描述的。具有抗癌活性的非致病性病毒可用各種滅活方法使其不再具有感染天然宿主細(xì)胞的能力。利用本文所描述的試驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇能保持病毒抗癌活性的滅活方法。在某些實(shí)施方式中，滅活方法可以保持病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力但是病毒基因組卻失去了轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制能力。在某些實(shí)施方式中，對(duì)病毒進(jìn)行基因修飾使其能進(jìn)入細(xì)胞但是不能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制。
A2.非致病性病毒的抗感染性疾病活性目前所用的治療感染性疾病的方法包括使用一些能引起副作用的藥物。另外，許多有效的治療措施包括疫苗只對(duì)單一的感染因子或其密切相關(guān)的因子具有特異性。本發(fā)明的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)非致病性病毒也具有很高的抗感染性疾病的能力。見實(shí)施例17。
為了篩選具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的體外或體內(nèi)抗感染性疾病檢測方法來檢測候選非致病性病毒。例如，對(duì)于結(jié)核來說，可用TB模型或體外巨噬細(xì)胞模型來檢測病毒的抗感染性疾病活性。Abe等，(Joumalof Immunology，2003，1711133-1139)描述了適于檢測化合物抗感染性疾病活性的其他方法。
在某些實(shí)施方式中，先用體外試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，然后在相關(guān)的動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)價(jià)那些具有體外活性的病毒在體內(nèi)是否也具有抗感染性疾病活性。
因此，本發(fā)明還提供了通過給予患者非致病性病毒對(duì)需要進(jìn)行抗感染性疾病治療的患者進(jìn)行治療的方法。值得注意的是，本文所描述的具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒并不依賴于感染因子特異性抗原的鑒定。而且非致病性病毒具有很寬的使用范圍。
雖然發(fā)明者不希望固定于特定的操作模式，但是發(fā)明者認(rèn)為非致病性病毒的抗感染性疾病活性應(yīng)該歸功于，至少部分歸功于其免疫刺激活性。例如，桿狀病毒在體外和體內(nèi)都可誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的成熟和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。見實(shí)施例9-10。
B.治療方面的應(yīng)用本發(fā)明提供了通過給予受試者非致病性病毒以治療荷瘤哺乳動(dòng)物受試者的方法。本文所描述的方法可用于抑制癌的生長，包括癌的完全緩解，抑制癌的轉(zhuǎn)移以及提高受試者對(duì)癌的抵抗力。
本發(fā)明提供了通過給予受試者非致病性病毒以治療患有一種或多種感染性疾病的動(dòng)物的方法。本文所描述的方法可用于抑制病毒的復(fù)制、抑制真菌的生長。
術(shù)語“癌的生長”通常是指預(yù)示癌向更高階段發(fā)展的多個(gè)指數(shù)中的任意一個(gè)指數(shù)。因此，用于評(píng)價(jià)癌生長抑制效應(yīng)的指數(shù)包括而不限于存活癌細(xì)胞數(shù)量的減少、癌體積的縮小或形態(tài)的改變(如通過CT、超聲或其他影像方法確定)、腫瘤生長的延遲、腫瘤血管的破壞、遲發(fā)型超敏皮膚試驗(yàn)結(jié)果的改善、細(xì)胞毒T細(xì)胞活性的升高以及腫瘤特異性抗原表達(dá)水平的下降。
術(shù)語“腫瘤生長的延遲”是指腫瘤生長到特定大小所需要的時(shí)間減少。例如，治療可以延遲腫瘤體積增加到測量開始時(shí)(第0天)體積的3倍所需要的時(shí)間或者腫瘤生長到1cm3所需要的時(shí)間。
術(shù)語“對(duì)癌的抵抗力”是指受試者對(duì)癌生長抵抗能力的提高，特別是已有癌的生長。另外，術(shù)語“對(duì)癌的抵抗力”也指受試者體內(nèi)癌生長易感性的降低。對(duì)癌的抵抗力與獲得性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)，如下文所描述。
本文所用的術(shù)語“受試者”包括任何哺乳動(dòng)物種。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法優(yōu)選用于治療哺乳動(dòng)物的癌和/或感染性疾病，如人以及那些瀕臨滅絕的對(duì)人類具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和/或社會(huì)價(jià)值的哺乳動(dòng)物。
術(shù)語“癌”通常是指腫瘤，包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤。在某些實(shí)施方式中，腫瘤是實(shí)體瘤。術(shù)語“腫瘤”包括實(shí)體瘤和任何組織的癌，其中包括而不限于乳腺癌；結(jié)腸癌；直腸癌；肺癌；鼻咽癌；喉癌；食管癌；胃癌；胰腺癌；肝癌；膽囊癌；膽管癌；小腸癌；泌尿道腫瘤包括腎癌、膀胱癌和尿路上皮癌；女性生殖道腫瘤包括宮頸癌、子宮癌、卵巢癌(如絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病)；男性生殖道腫瘤包括前列腺癌、精囊癌、睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤包括甲狀腺癌、腎上腺癌和腦下垂體癌；皮膚癌(如血管瘤和黑色素瘤)；骨癌或軟組織癌；血管癌(如卡波西肉瘤)；腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤、眼腫瘤和腦脊膜腫瘤(如星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤)。
術(shù)語“腫瘤”還包括造血系統(tǒng)惡性腫瘤來源的實(shí)體瘤，如白血病，其中包括綠色瘤、漿細(xì)胞瘤、血小板瘤和蕈樣肉芽腫病和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤/白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及淋巴瘤，其中包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。
本文所用的術(shù)語“癌”還包括非腫瘤性的增生性疾病。因此，本發(fā)明的方法還可用于治療或預(yù)防增生、化生，或者更特殊的發(fā)育異常(對(duì)這些異常增生性疾病的綜述見Robbins & Angell(1976)基礎(chǔ)病理學(xué)(Basic Pathology)，第二版，68-79頁，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania)。
增生是一種受控形式的細(xì)胞增殖，其中包括組織或器官內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增加，但是其結(jié)構(gòu)或功能沒有改變。作為一個(gè)非限定性的例子，子宮內(nèi)膜增生通常先發(fā)于子宮內(nèi)膜癌。化生是另一種受控形式的細(xì)胞生長，其中一種類型的成年細(xì)胞或完全分化的細(xì)胞被另一種類型的成年細(xì)胞所替代?；l(fā)生于上皮或結(jié)締組織。不典型的化生包含某些無序的化生上皮。發(fā)育異常通常是癌的前兆，主要見于上皮；它是一種最常見的無序形式的非腫瘤性細(xì)胞生長，包括細(xì)胞一致性的喪失以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的喪失。發(fā)育異常的細(xì)胞通常具有異常巨大而深染的細(xì)胞核，呈現(xiàn)多形性。發(fā)育異常通常見于慢性刺激或慢性炎癥時(shí)，常見于宮頸、呼吸道、口腔和膽囊。雖然癌前病變可以發(fā)展成惡性腫瘤，但是它可以穩(wěn)定相當(dāng)長一段時(shí)間，甚至在刺激因素消失后或損傷受到宿主免疫系統(tǒng)攻擊后可以復(fù)原。
因此，如本文所述給予受試者非致病性病毒可以激發(fā)固有的抗癌免疫應(yīng)答或癌特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。術(shù)語“免疫系統(tǒng)”包括所有的細(xì)胞、組織、系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)和過程，其中包括非特異性的部分和特異性的部分，可以提供一種防衛(wèi)機(jī)制來抵抗含抗原性分子的細(xì)胞，抗原性分子包括而不限于腫瘤、致病原以及自身反應(yīng)細(xì)胞。因此免疫應(yīng)答包括固有的免疫應(yīng)答、獲得性免疫應(yīng)答或者二者的結(jié)合。
術(shù)語“固有的免疫系統(tǒng)”包括吞噬細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、庫弗細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。固有的免疫系統(tǒng)可介導(dǎo)非特異性的免疫應(yīng)答。固有的免疫系統(tǒng)在起始和指導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的反應(yīng)中扮演重要角色。見Janeway(1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 541-13；Romagnani(1992)Immunol Today 13379-381；Fearon & Locksley(1996)Science 27250-53；以及Fearon(1997)Nature 388323-324。固有的反應(yīng)包括樹突細(xì)胞的成熟、巨噬細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子或趨化因子的分泌和/或NFκB信號(hào)通路的活化。
術(shù)語“適應(yīng)性免疫系統(tǒng)”是指對(duì)宿主體內(nèi)的特異性免疫具有影響的細(xì)胞和組織。這些細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞(NK)和淋巴細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)。術(shù)語“適應(yīng)性免疫系統(tǒng)”還包括抗體產(chǎn)生細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗體。
術(shù)語“適應(yīng)性免疫應(yīng)答”是指對(duì)抗原的特異性反應(yīng)，包括體液免疫應(yīng)答(如抗原特異性抗體的產(chǎn)生)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(如淋巴細(xì)胞的增殖)，如下文所定義的。適應(yīng)性免疫應(yīng)答還包括系統(tǒng)免疫和體液免疫。
術(shù)語“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫”和“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是指淋巴細(xì)胞提供的免疫防衛(wèi)機(jī)制，如T淋巴細(xì)胞接近其靶細(xì)胞時(shí)所產(chǎn)生的防衛(wèi)反應(yīng)。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答還包括淋巴細(xì)胞的增殖。測定“淋巴細(xì)胞的增殖”就是測定淋巴細(xì)胞接觸特異性抗原后的增殖能力。淋巴細(xì)胞增殖是指B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞或CTL的增殖。
本文所用的術(shù)語“CTL反應(yīng)”是指抗原特異性細(xì)胞溶解和殺傷表達(dá)特異性抗原的細(xì)胞的能力。如本文所描述，本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)CTL分析方法可用于測定CTL的活性。
術(shù)語“系統(tǒng)免疫應(yīng)答”用于本文中是指淋巴結(jié)、脾或腸道相關(guān)淋巴組織內(nèi)的免疫應(yīng)答，其中免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如B細(xì)胞被活化。例如，系統(tǒng)免疫應(yīng)答包括血清免疫球蛋白(IgGs)的產(chǎn)生。另外，系統(tǒng)免疫應(yīng)答是指血流中循環(huán)的抗原特異性的抗體以及系統(tǒng)免疫器官如脾和淋巴結(jié)中的抗原特異性的細(xì)胞。
術(shù)語“體液免疫”或“體液免疫應(yīng)答”是指獲得性免疫，其中經(jīng)抗原刺激后可分泌抗體分子。
本文所用的術(shù)語“癌特異性的”是用于描述適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是指受試者內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答，其中發(fā)生的反應(yīng)是受試者內(nèi)已有的癌特異性的。如果固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答所包含的免疫細(xì)胞類型是唯一的，那么就不要期望激發(fā)固有免疫應(yīng)答的方法也能激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但是在某些實(shí)施方式中，給予非致病性病毒既可以激發(fā)固有免疫應(yīng)答，又可以激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
在某些實(shí)施方式中，本文所描述的利用非致病性病毒進(jìn)行治療的方法可以和其他一種或多種腫瘤治療方法一起使用。例如，在給予非致病性病毒之前或之后可以將腫瘤或異常增生的細(xì)胞手術(shù)切除。同樣，本發(fā)明的非致病性病毒也可以和其他的藥劑一同給藥或制成一種制劑，例如抗血管生成因子、化療藥和/或其他的免疫刺激因子。可與非致病性病毒聯(lián)合使用的典型藥劑包括而不限于甲氨蝶呤、他莫昔芬、nelandron、尼魯米特、阿霉素、5氟尿嘧啶(5FU)、細(xì)胞因子如干擾素α(IFN-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL2)、白細(xì)胞介素4(IL4)、白細(xì)胞介素6(IL6)、以及腫瘤壞死因子(TNF)。感染性疾病還可以通過給予抗病毒藥物、抗生素或抗真菌藥物治療。
本發(fā)明還涉及用于在哺乳動(dòng)物受試者包括人體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法和組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及利用非致病性病毒誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了制備含有非致病性病毒和抗原的抗原性制劑的方法。術(shù)語“抗原”是指能通過與T細(xì)胞或B細(xì)胞受試者相互作用而活化淋巴細(xì)胞(正性或負(fù)性)的物質(zhì)。正性活化可導(dǎo)致免疫應(yīng)答，負(fù)性活化導(dǎo)致免疫耐受?？乖梢允堑鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、核酸或其混合物?？乖梢允钱愒纯乖?如在宿主體內(nèi)一般情況下不存在的抗原)或自身抗原(自體抗原)。
本發(fā)明還提供了使用本文所描述的抗原制劑作為治療性和/或預(yù)防性藥物的方法。例如，這種抗原制劑可給予哺乳動(dòng)物受試者以治療疾病，其中對(duì)于HIV感染或流感來說CTL反應(yīng)是很重要；另外，這種抗原制劑還可用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染、寄生蟲感染等。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在需要治療的個(gè)體體內(nèi)抑制腫瘤的一種或多種癥狀的方法。該方法包括給予個(gè)體一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制癌癥的一種或多種癥狀。
癌癥癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括生理指標(biāo)和物理指標(biāo)。生理指標(biāo)包括而不限于腫瘤的生長、異常的細(xì)胞增生、腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞死亡或細(xì)胞浸潤。物理指標(biāo)包括而不限于體重下降、出血、呼吸困難、骨折、免疫力下降或疲乏。
如本文所描述，給予受試者非致病性病毒還可以激發(fā)抗感染性疾病免疫應(yīng)答。如上所述，所激發(fā)的免疫應(yīng)答包括固有免疫應(yīng)答、適應(yīng)性免疫應(yīng)答或者二者都存在。
本發(fā)明還提供了保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病影響的方法，該方法包括給予動(dòng)物有效量的包含非致病性病毒的組合物。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是用任何方法或本文所描述的方法滅活的。根據(jù)下面所描述的實(shí)施例可以看到給予無活性的非致病性病毒可產(chǎn)生抗感染性因子(如病毒、真菌或細(xì)菌)的保護(hù)作用。非致病性病毒還可以和其他疫苗、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗細(xì)菌藥物或其混合物一起使用。
C.治療性組合物和方法本發(fā)明還提供了藥物組合物及其使用方法。本發(fā)明的非致病性病毒可制備成安全有效的具有本文所描述的抗腫瘤和/或抗感染性疾病和/或佐劑活性的制劑。
本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防感染性疾病和/或癌的組合物。在某些實(shí)施方式中，組合物包含非致病性病毒和外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在某些實(shí)施方式中，PBMC是從動(dòng)物或人體內(nèi)分離出來的，在體外與非致病性病毒接觸，然后再以混合物或組合物的形式輸入到動(dòng)物或人體內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，PBMC是從被治療動(dòng)物或人體外的其他動(dòng)物或人體內(nèi)分離的，或者本發(fā)明的組合物被輸入到被治療動(dòng)物或人體內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，組合物包含非致病性病毒以及至少一種腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可以是被治療個(gè)體或動(dòng)物自身的，也可以是同種異體的。
在某些實(shí)施方式中，組合物包含非致病性病毒、至少一種腫瘤細(xì)胞以及至少一種PBMC。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是無活性的病毒。
C.1.病毒滅活在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法所用的非致病性活病毒可在給予受試者前被滅活。如上面所定義的，非致病性病毒在哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)不能復(fù)制。滅活可使病毒在其天然宿主細(xì)胞內(nèi)失去復(fù)制能力，從而增加了其安全性。
病毒滅活可用任何適宜的方法完成，其中包括而不限于破壞病毒包被的脂質(zhì)或蛋白組分、對(duì)病毒進(jìn)行改造以使其無法識(shí)別靶細(xì)胞、破壞病毒的核酸和/或改造病毒使其失去復(fù)制能力。典型的病毒滅活方法包括而不限于巴氏消毒法、用去污劑(如Triton-X100)處理、用二乙烯亞胺(BEI)進(jìn)行烷基化、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、輻射滅活、物理裂解(如超聲、電子束)；基因滅活以及上述方法的聯(lián)合。見Rueda等，(2000)Vaccine 19726-34和Henzler & Kaiser(1998)Nat Biotechnol 161077-9。在某些實(shí)施方式中，滅活并不能顯著降低病毒的抗原性和/或活性。病毒滅活以后可用標(biāo)準(zhǔn)的方法來確定其感染性。
“基因滅活”用于本文中是指對(duì)病毒的核酸(如基因)進(jìn)行改造。這種改造包括刪除一個(gè)或多個(gè)基因、突變至少一個(gè)基因；創(chuàng)造溫度敏感突變株、滅活基因等。溫度敏感突變株是指該突變株在某個(gè)溫度下是允許的，而在另一個(gè)溫度下是受限的(如抑制病毒的復(fù)制)。對(duì)于桿狀病毒來說，制備溫度敏感突變株可用于使病毒在室溫(約25℃)下繁殖和制備，而進(jìn)入到具有更高內(nèi)部溫度的動(dòng)物體內(nèi)時(shí)病毒就變成了無活性的。在某些實(shí)施方式中，溫度敏感突變株在約16-28℃、約20-28℃、約25-28℃或27℃的范圍內(nèi)是允許的，而在約30-45℃、約32-40℃、約35-38℃、約37℃溫度下是受限的。在某些實(shí)施方式中，受限溫度是約28℃、約29℃、約30℃、約31 ℃、約32℃，、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃或約37℃以上的任何溫度。在某些實(shí)施方式中，溫度敏感突變株在動(dòng)物或人體內(nèi)是無活性的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)病毒處于受限溫度時(shí)溫度敏感突變株與野生型病毒相比其活性降低約100％、約90％、約80％、約70％、約60％、約50％、約40％、約30％、約20％或約10％。
穩(wěn)定敏感突變株可包含任何突變的基因，該基因的突變可使病毒在一種溫度下的活性比另一種溫度下的活性降低?？杀煌蛔兊幕蚧虻鞍装ǘ幌抻邙B苷?；D(zhuǎn)移酶、RNA三磷酸酶、ATP酶、蛋白激酶(如PK-1)等。下面的文獻(xiàn)中描述了一些溫度敏感突變株的例子Jin等，Journal of Virology，(1998)，卷72，pp.10011-10019和McLachlin等，Virology，(1998)，卷246，pp.379-391，本文都已納入作為參考。
如果病毒經(jīng)加熱處理后足以被滅活則巴氏消毒法是一種簡單的滅活方法。在某些實(shí)施方式中，在保證可滅活病毒的情況下加熱的持續(xù)時(shí)間應(yīng)該盡量短以使對(duì)病毒蛋白的損傷降到最低。另外，可通過使用穩(wěn)定劑和檸檬酸鈉、蔗糖和/或甘氨酸使對(duì)病毒的損傷降到最低。
另外，化學(xué)滅活，如用溫和的胃蛋白酶在低pH條件下處理或者用去污劑處理，可用于破壞脂雙層，因此可用于滅活包膜病毒，其中包括桿狀病毒。見美國專利Nos.4,820,805和4,764,369。氮丙啶二元乙烯亞胺是一種強(qiáng)力烷化劑，可通過與核酸而不是蛋白上的親核基團(tuán)相互作用而滅活病毒。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，病毒滅活可通過光化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。按照這種方法，將輻射致敏的化合物加到非致病性病毒的脂質(zhì)懸液中，然后將混合物在紫外燈下照射或者用離子化射線(γ射線或X射線)照射。
補(bǔ)骨脂素及其衍生物以及具有與補(bǔ)骨脂素類似的線性三環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物可誘發(fā)光敏作用。補(bǔ)骨脂素是一種雙功能的光反應(yīng)分子，在長波紫外線的照射下可與核酸形成共價(jià)鍵。補(bǔ)骨脂素可嵌入到DNA雙螺旋內(nèi)，然后通過光反應(yīng)使DNA分子的兩條鏈發(fā)生交聯(lián)。見Hwang等，(1996)Biochem Biophys Res Commun 219191-7。交聯(lián)使DNA分子無法復(fù)制或被轉(zhuǎn)錄。商品化的補(bǔ)骨脂素化合物有8-甲氧補(bǔ)骨脂素(甲氧沙林)和4，5′，8三甲基補(bǔ)骨脂素(trioxalen)。使用補(bǔ)骨脂素進(jìn)行光化學(xué)滅活最有效的波長在320nm到380nm之間，最大有效波長在33nm到360nm之間。見Pathak，M(1974)，陽光與人類(Sunlight and Man)，Pathak，M & Fitzpatrick，T編，Universityof Tokyo Press，Tokyo。
其他光致敏試劑包括鹵代補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂內(nèi)脂、呋喃并色酮和香豆素，這些化合物都含有一個(gè)鹵素取代基和一個(gè)水溶性基團(tuán)，如第四氨離子或磷離子。據(jù)信在補(bǔ)骨脂素分子上加入鹵原子取代基，特別是溴原子取代基可以提高致敏劑與DNA的結(jié)合常數(shù)，因?yàn)殇逶涌商峁┦杷匦?。在某些?shí)施方式中，可以使用溴化光致敏劑，因?yàn)橹恍枰粋€(gè)光子就可以活化溴化致敏劑，而用非溴化的補(bǔ)骨脂素需要兩個(gè)光子才能使DNA交聯(lián)。見美國專利No.5,418,130。
光化學(xué)滅活的典型方法見實(shí)施例11的描述，該方法聯(lián)合使用trioxalen和長波紫外線照射。見Weightman & Banks(1999)J Virol Methods 81179-82和Cotton等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 896094-8。
為了保持病毒的抗原性，用補(bǔ)骨脂素滅活活病毒時(shí)應(yīng)在非氧化的環(huán)境下進(jìn)行。通過去除滅活培養(yǎng)基中的氧和其他氧化物，由于紫外線照射而引起的抗原降解可得到最大限度的避免。見美國專利No.5,106,619。同樣，通過使用抗氧化劑/淬滅劑可使短波紫外線照射時(shí)產(chǎn)生的自由基和其他活性氧成分降到最少，從而可以使蛋白的損傷大大減少。見Marx等，(1996)Photochem Photobiol 63541-6。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，病毒滅活可以通過改造病毒的基因來完成，從而使病毒受到損傷或無法復(fù)制。例如，對(duì)病毒進(jìn)行基因改造使病毒的必需基因發(fā)生一個(gè)或多個(gè)溫度敏感型的突變。在允許溫度(如25℃)下用Sf9或Tn5細(xì)胞制備和擴(kuò)增病毒。當(dāng)病毒在治療時(shí)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)時(shí)，溫度不再是允許溫度了，這樣溫度敏感基因就很難表達(dá)，或者表達(dá)的基因產(chǎn)物沒有功能，因此病毒是殘缺的。
可被制備的典型溫度敏感突變可在病毒感染所必需的基因上進(jìn)行。例如，編碼PKIP的基因發(fā)生溫度敏感型的突變，這個(gè)蛋白可與病毒編碼的蛋白激酶相互作用，調(diào)節(jié)病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄。在非允許溫度下，攜帶這種突變的病毒在感染宿主時(shí)是有缺陷的。見McLachlin等(1998)Virology 246379和Partington等，(1990)Virology17591。
病毒是否被滅活可通過證明其在天然宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力是否喪失來確定?？衫脴?biāo)準(zhǔn)的噬菌斑試驗(yàn)來證明一個(gè)樣品的感染性。在沒有合適的方法來證明某種病毒是否具有感染性時(shí)，就需要通過滅活一個(gè)具有相似的生物物理特性和結(jié)構(gòu)特性的模型病毒來證明其是否被滅活。見Henzler & Kaiser(1998)Nat Biotechnol 161077-9。為了使病毒完全滅活，本發(fā)明所用的滅活方法可以包括使病毒與滅活刺激物連續(xù)接觸。
C.2.載體如本文所描述，非致病性病毒可以是活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒成分或其混合物。為了促進(jìn)非致病性病毒向受試者癌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，可以給予一種能在受試者體內(nèi)激發(fā)抗癌和/或抗感染性疾病反應(yīng)的組合物，該組合物包含(a)有效量的非致病性病毒；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體。在適當(dāng)?shù)臈l件下可同時(shí)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的載體。
本文所用的術(shù)語“載體”是指可用于將病毒、病毒樣顆粒、病毒成分、病毒蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的漿膜或穿過細(xì)胞的漿膜的化合物或一組化合物。
用于轉(zhuǎn)運(yùn)非致病性病毒或病毒成分的典型載體包括脂質(zhì)體、納米微球(Manome等，1994；Saltzman和Fung，1997)、氨基葡糖多聚糖(見美國專利No.6,106,866)、脂肪酸(見美國專利No.5,994,392)、脂肪乳劑(見美國專利No.5,651,991)、脂質(zhì)和脂質(zhì)衍生物(見美國專利No.5,786,387)、膠原(見美國專利No.5,922,356)、多糖及其衍生(見美國專利No.5,688,931)、納米懸液(見美國專利No.5,858,410)、聚合微膠?；蚓酆衔?見美國專利Nos.4,551,482、5,714,166、5,510,103、5,490,840和5,855,900)以及多核糖體(見美國專利No.5,922,545)。
為了轉(zhuǎn)錄病毒成分，載體還可以用基因治療載體，其中包括病毒載體和質(zhì)粒載體。適于基因表達(dá)的病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAVs)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和Semiliki森林病毒。載體還可以包含病毒樣顆粒、蛋白運(yùn)送載體，其中包括Pro-Ject(Pierce Biotechnology，INC.)和Profect(TargetingSystems)以及Chariot(Active Motif)等。
可以選擇載體使非致病性病毒在需要治療部位達(dá)到穩(wěn)定的生物利用度。術(shù)語“穩(wěn)定的生物利用度”涉及的因素包括而不限于非致病性病毒從載體內(nèi)的延遲釋放、非致病性病毒的代謝穩(wěn)定性、包含非致病性病毒的組合物的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)以及非致病性病毒的有效劑量。
能達(dá)到穩(wěn)定的生物利用度的典型組合物包括而不限于基質(zhì)聚合物，其中包括膨脹的可生物降解的基質(zhì)聚合物(美國專利Nos.6,335,035；6,312,713；6,296,842；6,287,587；6,267,981；6,262,127和6,221,958)，聚合物包被的微粒子(美國專利Nos.6,120,787和6,090,925)，多元醇油懸液(美國專利No.6,245,740)，多孔顆粒(美國專利No.6,238,705)，乳膠/蠟包被顆粒(美國專利No.6,238,704)，殼聚糖微膠囊，以及微球乳劑(美國專利No.6,190,700)。
C.3.劑型、劑量和給藥途徑本發(fā)明組合物的適宜給藥劑型包括水性的和非水性的無菌注射液，其中包含抗氧化劑、緩沖物質(zhì)、抑菌劑、抗生素和抗真菌藥(如parabens，氯代丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞)、將制劑的滲透壓調(diào)整到與受試者體液一致的溶質(zhì)(如糖，鹽和多元醇)，懸浮劑和增厚劑。制劑可置于單次劑量的包裝內(nèi)，也可置于多次劑量的包裝內(nèi)，如密封的安瓿和小玻璃瓶，可以儲(chǔ)存在冷凍條件下活凍干條件下，在使用前只需加入無菌液體載體就可以注射了。
注射到宿主體內(nèi)的組合物包括無菌水溶液或分散液以及可制備成無菌注射液或分散液的無菌粉末?？勺⑸涞慕M合物應(yīng)當(dāng)是液體的，其流動(dòng)性應(yīng)當(dāng)達(dá)到可以很容易地用注射器注射的程度。適宜的溶劑包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其混合物?？梢允褂冒蝗缏蚜字?或通過降低顆粒的直徑來維持組合物的流動(dòng)性。
本發(fā)明的非致病性病毒可通過瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、系統(tǒng)注射、胃腸外途徑(如靜脈注射、肌肉注射、動(dòng)脈內(nèi)注射和輸液)、口服、透真皮注射(局部給藥)、鼻內(nèi)途徑(吸入)以及粘膜內(nèi)注射的方式給藥。選擇何種給藥方式要根據(jù)載體的類型、組合物的療效、需治療的部位以及患者的狀況而定。
本文所用的術(shù)語“蛋白運(yùn)送載體”是指可促使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜或跨過細(xì)胞膜的物質(zhì)。
在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是被直接注射到腫瘤內(nèi)或腫瘤旁部位。術(shù)語“腫瘤旁部位”是指離腫瘤外緣約15cm以內(nèi)的部位、約10cm以內(nèi)的部位、約5cm以內(nèi)的部位、約1cm以內(nèi)的部位或者約0.1cm以內(nèi)的部位。本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到一個(gè)或多個(gè)腫瘤或腫瘤旁部位內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到腫瘤和/或腫瘤周圍的多個(gè)位點(diǎn)內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，如果癌的生長是非腫瘤性的，那么非致病性病毒可以注射到病變部位或病變周圍部位。術(shù)語“病變周圍部位”是指非腫瘤性增生外緣約15cm以內(nèi)的部位、約10cm以內(nèi)的部位、約5cm以內(nèi)的部位、約1cm以內(nèi)的部位或者約0.1cm以內(nèi)的部位。本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到一個(gè)或多個(gè)病變和/或病變旁部位內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到非腫瘤性增生部位和/或非腫瘤性增生部位周圍的多個(gè)位點(diǎn)內(nèi)。
在組合物是用于治療感染性疾病的實(shí)施方式中，非致病性病毒可通過系統(tǒng)途徑給藥。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒被局部注射到損傷部位內(nèi)。
本發(fā)明涉及給予患者有效量的非致病性病毒。術(shù)語“有效量”用于本文中是指足以激發(fā)出抗癌活性，包括抗腫瘤活性和/或抗非腫瘤性增生活性的非致病性病毒的量。如本文所描述，典型的抗癌活性包括而不限于癌細(xì)胞的溶解、癌生長的抑制、癌轉(zhuǎn)移的抑制和/或?qū)Π┑牡挚沽?。在某些?shí)施方式中，“有效量”是指體外試驗(yàn)中可有效抑制癌的生長、轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)對(duì)癌的抵抗力、誘導(dǎo)細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡等所需要的一種藥物的量。在某些實(shí)施方式中，“有效量”的藥物抑制癌的生長、轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)對(duì)癌的抵抗力、誘導(dǎo)細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡至少提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本文中的術(shù)語“有效量”是用于描述足以激發(fā)抗感染性疾病活性的非致病性病毒的量。在某些實(shí)施方式中，與對(duì)照相比，“有效量”的非致病性病毒可以使病毒的復(fù)制至少被抑制10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本發(fā)明的治療性組合物中實(shí)際包含的活性成分的量可以是不同的，只要該劑量的組合物在特定的患者體內(nèi)可以達(dá)到預(yù)期的治療效果。為了激發(fā)出預(yù)期的活性，可以選擇不同的給藥方案。可以進(jìn)行單次注射，也可以進(jìn)行多次注射。劑量和給藥方案的選擇要根據(jù)不同的因素來確定，其中包括治療性組合物的活性、劑型、給藥途徑、與其他藥物或治療措施的聯(lián)合、被治療的疾病類型以及被治療患者的健康狀況及用藥史。確定和調(diào)整有效給藥劑量以及確定何時(shí)和如何調(diào)整都是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
可用各種方法來計(jì)算非致病性病毒的給藥劑量。對(duì)非致病性活病毒來說，可用噬菌斑形成單位來計(jì)算劑量。對(duì)于無活性的非致病性病毒來說，由于不能形成噬菌斑，其劑量用PFU的等價(jià)量來表示。本文所用的術(shù)語“PFU等價(jià)量”是指非致病性病毒的量。PFU等價(jià)量定義為1 PFU的病毒被滅活后所得到的病毒的量。另一種確定病毒給藥量的方法是基于樣品中存在的病毒顆粒數(shù)目。可用任何方法對(duì)顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，如電鏡。也可以通過體外試驗(yàn)所得到的有效量來推算出非致病性病毒，包括滅活病毒的給藥量。體外試驗(yàn)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的測定抗癌活性或抗感染性疾病活性的任何試驗(yàn)，其中包括而不限于測定細(xì)胞毒性、細(xì)胞死亡、細(xì)胞在軟瓊脂上的生長能力等的試驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，劑量是指可使細(xì)胞毒活性或細(xì)胞死亡比對(duì)照組增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。在某些實(shí)施方式中，劑量是指可使細(xì)胞在軟瓊脂上的生長能力比對(duì)照組至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。
其他有關(guān)劑型、劑量和給藥方案的指導(dǎo)原則描述于Berkow等，(1997)Merck醫(yī)學(xué)情報(bào)手冊(The Merck Manual of Medical Information)，Home編，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，New Jersey；Goodman等，(1996)Goodman & Gilman治療學(xué)的藥理基礎(chǔ)(Goodman & Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics)第9版，McGraw-Hill Health Professions Division，New York；Ebadi(1998)CRC臨床藥理學(xué)手冊(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida；Katzung(2001)基礎(chǔ)和臨床藥理學(xué)(Basic & Clinical Pharmacology)，第8版，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division，New York；Remington等，(1975)Remington藥物學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Pub.Co.，Easton，Pennsylvania；Speight等，(1997)Avery藥物治療疾病管理中藥物特性、選擇、治療用途和經(jīng)濟(jì)價(jià)值指導(dǎo)手冊(Avery’s Drug TreatmentA Guide to thePropertie，Choice，Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in DiseaseManagement)，第4版，Adis International，Auckland/Philadelphia，Pennsylvania。
在某些實(shí)施方式中，通過體外或體內(nèi)試驗(yàn)來檢測組合物以確定其“有效量”。例如，在本文所描述的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法中，適用的試驗(yàn)包括而不限于細(xì)胞體外存活能力分析試驗(yàn)，其中包括TUNEL分析或其他熒光分析方法如Cell-Titer Blue(Promega Corp)；監(jiān)測DNA片段化的試驗(yàn)；以及細(xì)胞色素C釋放試驗(yàn)、軟瓊脂生長試驗(yàn)、接觸抑制試驗(yàn)和及腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長試驗(yàn)；給動(dòng)物注射本發(fā)明的組合物后接種腫瘤并監(jiān)測腫瘤緩解情況的試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)，其中轉(zhuǎn)基因小鼠被接種了腫瘤并監(jiān)測其緩解情況；本文所描述的體內(nèi)試驗(yàn)；測定細(xì)胞穿過屏障的體外試驗(yàn)如Matrigel試驗(yàn)(見Cancer Res.2003 Aug 1；63(15)4632-40；Am J Chin Med.2003；31(2)235-46)；Yang等，(Cancer Res.61，5284-5288，July 1，2001)所描述的體外侵襲性和體內(nèi)轉(zhuǎn)移性分析試驗(yàn)。
本發(fā)明包含非致病性病毒的組合物還可以包含一種或多種用于增強(qiáng)藥物組合物療效的佐劑。這些佐劑包括而不限于(1)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(其中含有或不含有其他特異性的免疫刺激因子如胞壁酰肽(見下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，如(a)MF59(國際公開號(hào)No.WO 90/14837)，其中含有5％角鯊烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(雖然不是必須的，但是還可以添加不同劑量的MTP-PE(見下文))，用微射流勻質(zhì)儀如Model 110Y微射流勻質(zhì)儀(Microfluidics，Newton，Mass.)制備成亞微粒，(b)SAF，其中含有10％角鯊烯、0.4％Tween 80、5％Pluronic封閉的聚合物L(fēng)121和thr-MDP(見下文)，或者經(jīng)過微射流勻質(zhì)化制備成亞微粒，或者激烈攪拌成大顆粒乳劑，以及(c)RibiTM.佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)，其中含有2％角鯊烯、0.2％Tween 80和一種或多種選自以下細(xì)胞壁成分monophosphorylipid A(MPL)、雙分枝菌酸海藻糖(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)(在1999年6月24日公開的國際申請WO 99/30739中有關(guān)于適宜亞微粒水包油乳劑的進(jìn)一步描述)；(3)皂甙佐劑，如StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或從它衍生的顆粒如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)；(4)完全福氏佐劑(CFA)和不完全福氏佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL-1、IL-2等)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP核糖酰化毒素的脫毒突變株，如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素(LT)，特別是LT-K63(其中野生型蛋白上的63位氨基酸被賴氨酸替代)、LT-R72(其中野生型蛋白上的72位氨基酸被精氨酸替代)、CT-S109(其中野生型蛋白上的109位氨基酸被絲氨酸替代)，CpG家族分子來源的佐劑，CpG二核苷酸和包含CpG基序的合成寡核苷酸(見Krieg等，Nature，374546(1995)和Davis等，J.Immunol.，160870-876(1998))以及PT-K9/G129(其中野生型蛋白上的第9位氨基酸被賴氨酸替代，129位氨基酸被甘氨酸替代)(見國際專利申請Nos.WO93/13202和WO92/19265)；以及(7)可作為免疫刺激因子增強(qiáng)組合物療效的其他物質(zhì)。
胞壁酰肽包括而不限于N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-dipahitoyl-sn-甘油-3-huydroxyphosphoryloxy)-乙基酰胺(MTP-PE)等。
國際專利公開號(hào)No.WO 98/50071描述了病毒樣顆粒(VLPs)可以作為佐劑用于增強(qiáng)與VLP共同注射的抗原的免疫應(yīng)答。St.Clair等描述了蛋白結(jié)晶在增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用(St.Clair，N.等，Applied Biol.Sci.，969469-9474，1999)。
通過閱讀本發(fā)明的說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地理解通過給予非致病性病毒進(jìn)行治療的方法可以加以變通以激發(fā)出抗癌反應(yīng)和/或抗感染性疾病反應(yīng)。
根據(jù)長久以來形成的慣例，術(shù)語“一個(gè)”、“一種”和“這種”可用于指單數(shù)，也可用于指復(fù)數(shù)。當(dāng)本文所用的術(shù)語“約”和可測量數(shù)值聯(lián)用時(shí)，如腫瘤周圍的距離或病變周圍的距離，是指特定數(shù)值上下20％、10％、5％、1％或0.1％的變化，只要這種變化的數(shù)值能夠?qū)嵤┍景l(fā)明描述的方法或者說能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。在某些實(shí)施方式中，“約”是指特定數(shù)值上下10％的變化。
D1.預(yù)測體內(nèi)的活性要預(yù)測體內(nèi)的抗腫瘤活性常常是困難而偶然的。本發(fā)明提供了預(yù)測體內(nèi)抗腫瘤活性的方法。在某些實(shí)施方式中，該方法包括使化合物與腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞接觸，然后測定腫瘤細(xì)胞的死亡率。在某些實(shí)施方式中，化合物是非致病性病毒或非致病性的昆蟲特異性病毒。任何方法都可用于測定細(xì)胞的死亡率，例如測定細(xì)胞調(diào)亡情況、壞死情況、細(xì)胞的存活能力等?？捎糜诒景l(fā)明的腫瘤細(xì)胞包括而不限于肺癌細(xì)胞(如A549細(xì)胞、3LL-HM細(xì)胞)、乳腺癌細(xì)胞(如4T1細(xì)胞；MT901細(xì)胞；MAT BIII細(xì)胞)、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞(如B16黑色素瘤細(xì)胞)、胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞(如MG-63細(xì)胞)、胃癌細(xì)胞或食管癌細(xì)胞等。
E.1釋放試驗(yàn)在一種藥物上市以前，政府的有關(guān)機(jī)構(gòu)，如食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)，通常需要對(duì)這種藥物進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保該藥物所含有的成分與其被FDA或其他政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的藥物所含有的成分一樣。這種質(zhì)量控制通常通過釋放試驗(yàn)來完成以確保該藥物符合監(jiān)督者制定的法規(guī)。
本發(fā)明提供了用于上市的抗癌和抗感染性疾病組合物的制備過程。在某些實(shí)施方式中，組合物包含一種或多種非致病性病毒。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。在某些實(shí)施方式中，制備過程包括進(jìn)行組合物的釋放試驗(yàn)以確保組合物的安全性、毒性和有效性符合處方的指導(dǎo)原則。
制備抗癌和抗感染性疾病組合物的過程包括使組合物與第一滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒，使組合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，通過體外試驗(yàn)確定滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分是無活性的。在某些實(shí)施方式中，每個(gè)滅活步驟后都要檢測所述病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分被滅活的情況。
在某些實(shí)施方式中，制備過程還包括對(duì)組合物隨機(jī)取樣以分析安全性、有效性或毒性中的一種或多種。在某些實(shí)施方式中，隨機(jī)取得的樣品的安全性和/或有效性和/或有效性與第二種抗癌或抗感染性疾病化合物的安全性和/或有效性和/或有效性比較。比較所得到的數(shù)據(jù)用于上市前藥品評(píng)價(jià)。
在某些實(shí)施方式中，通過噬菌斑形成試驗(yàn)來確定病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分是否已被滅活。在某些實(shí)施方式中，噬菌斑形成試驗(yàn)用的是Sf細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，制備過程還包括對(duì)滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何方法進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，計(jì)數(shù)用EM進(jìn)行。
下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明，并不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該清楚在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以對(duì)本發(fā)明作出修改。
實(shí)施例實(shí)施例1.重組桿狀病毒的制備將編碼人CCL21的全長序列(GenBank登錄號(hào)No.NM 002989)克隆到桿狀病毒運(yùn)送載體pVL1392(Pharmingen of San Diego，California)內(nèi)，按照廠商推薦的方法與BACULOGOLDWT基因組DNA(Pharmingen of San Diego，California)共轉(zhuǎn)染。利用這種方法獲得的重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞內(nèi)通過噬菌斑純化進(jìn)行亞克隆以制備幾株表達(dá)人CCL21的分離株。挑選出一個(gè)克隆，因?yàn)檫@個(gè)克隆與其親本病毒相比具有異常的表達(dá)特征。這個(gè)桿狀病毒分離株的擴(kuò)增以較低的感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行以制備出高滴度低傳代的病毒種用于蛋白的制備。表達(dá)CCL21的桿狀病毒被命名為BV422。其他重組桿狀病毒用同樣的方法制備。例如，制備出表達(dá)胞內(nèi)Raf蛋白的桿狀病毒，命名為BV762。
用感染復(fù)數(shù)(MOI)為2-10的桿狀病毒感染無蛋白培養(yǎng)基內(nèi)的粉紋夜蛾(Tn5)細(xì)胞48小時(shí)以制備蛋白質(zhì)和出芽的桿狀病毒。含有重組CCL21的BV422培養(yǎng)上清通過離心收獲，過濾澄清后通過色譜柱進(jìn)行純化。
實(shí)施例2.肺癌動(dòng)物模型內(nèi)的腫瘤生長抑制9-11周齡的C57BL/6小鼠在接種腫瘤細(xì)胞前最少要適應(yīng)環(huán)境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處于傳代早期(＜10代)的3LL-HM腫瘤細(xì)胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種后7天可以達(dá)到這個(gè)體積)，將小鼠隨機(jī)分組。給荷瘤小鼠的腫瘤內(nèi)注射桿狀病毒表達(dá)的CCL21。調(diào)整給藥劑量和給藥方案以達(dá)到最大的腫瘤抑制效應(yīng)。一旦有任何一組的腫瘤體積達(dá)到3000mm3(對(duì)照組小鼠一般在接種后33-35天可達(dá)到這個(gè)體積)就將小鼠處死。
如圖1所示，瘤內(nèi)注射桿狀病毒表達(dá)的CCL21可導(dǎo)致3LL腫瘤生長的延遲。優(yōu)化CCL21的劑量以達(dá)到完全抑制腫瘤生長的效果。以相對(duì)高的劑量注射2次或3次的給藥方案與以相對(duì)低的劑量注射6次的給藥方案所達(dá)到的效果一致。單次注射也可以觀察到某種程度的腫瘤抑制。
實(shí)施例3.乳腺癌模型內(nèi)的腫瘤生長抑制
9-11周齡的Balb/c小鼠在接種腫瘤細(xì)胞前最少要適應(yīng)環(huán)境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處于傳代早期(＜10代)的4T1細(xì)胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種后7天可以達(dá)到這個(gè)體積)，將小鼠隨機(jī)分組。給荷瘤小鼠的腫瘤內(nèi)注射桿狀病毒。調(diào)整給藥劑量以確定最佳有效劑量。一旦有任何一組的腫瘤體積達(dá)到3000mm3(對(duì)照組小鼠一般在接種后33-35天可達(dá)到這個(gè)體積)就將小鼠處死。如圖2所示，瘤內(nèi)注射CCL21可導(dǎo)致4T1腫瘤生長的延遲。
實(shí)施例4.黑色素瘤模型內(nèi)的腫瘤生長抑制鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-BL6用于在6-8周齡的粉紅色雌性BDF-1小鼠(CharlesRiver Laboratories of Boston，Massachusetts)皮下建立腫瘤模型。為了建立皮膚腫瘤，在第0天將0.2ml含106B16-BL6細(xì)胞的培養(yǎng)基注射到6-8周齡的雌性BDF-1小鼠背部。在細(xì)胞注射之前及之后利用臺(tái)盼藍(lán)排出試驗(yàn)分析細(xì)胞的存活能力。注射之前的死細(xì)胞數(shù)一般不超過細(xì)胞總數(shù)的10％。6天之后腫瘤的直徑一般可達(dá)到5-10mm。
桿狀病毒表達(dá)的CCL21按照實(shí)施例1描述的方法制備。在第3天和第4天，于離每個(gè)腫瘤約3mm的部位皮下注射桿狀病毒。每日測量腫瘤的體積，連續(xù)測量3周。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到4000mm3處死小鼠。
實(shí)施例5.對(duì)再接種腫瘤的抵抗力按照上述方法制備和用桿狀病毒處理荷瘤小鼠。給那些腫瘤完全被抑制的小鼠或在最后一次注射桿狀病毒后2天將未完全抑制的腫瘤手術(shù)切除的小鼠再次接種腫瘤。腹腔注射200μl氯胺酮/賽拉嗪混合物(4∶1的氯胺酮/賽拉嗪，用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍)以麻醉小鼠，切除腫瘤后用釘書釘封閉傷口。切除腫瘤后1到4天在原腫瘤部位以外的其他部位皮下注射2×1054T1細(xì)胞以再次接種腫瘤。每周測量2次再次接種的腫瘤體積。將腫瘤生長被完全抑制的小鼠平均分成兩組。一組在原腫瘤的對(duì)側(cè)腹部皮下注射1×105細(xì)胞再次接種同種腫瘤，另一組在小鼠的左腹部皮下接種1×105不同種的腫瘤細(xì)胞(B16F10)。監(jiān)測再接種部位腫瘤的生長狀況。用桿狀病毒處理小鼠可誘導(dǎo)小鼠對(duì)再次接種的3LL-HM腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抵抗力，但是卻不能誘導(dǎo)小鼠對(duì)不同種的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抵抗力。
實(shí)施例6.抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移
按照實(shí)施例3所描述的方法制備荷瘤小鼠并用桿狀病毒處理。當(dāng)對(duì)照組的小鼠由于肺轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)病危信號(hào)時(shí)處死小鼠。常規(guī)的觀察指標(biāo)包括呼吸困難、毛發(fā)油膩及體重下降。取小鼠的肺并保存在Buoin溶液中。觀察是否發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。圖3顯示桿狀病毒表達(dá)的CCL21可顯著抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例7.桿狀病毒的抗腫瘤活性如實(shí)施例2-3和5-6所描述，桿狀病毒表達(dá)的hCCL21的抗腫瘤活性主要是由于桿狀病毒而不是CCL21。如圖6所示，經(jīng)過濾的桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物不足以影響3LL腫瘤模型的緩解。經(jīng)過過濾以后所有樣品中CCL21的濃度沒有發(fā)生變化。有些但不是所有桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物同樣是無效的。
與體內(nèi)試驗(yàn)所觀察到的療效出現(xiàn)變化相反，所有的CCL21制備物在體外都可以有效誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的趨化作用。見表1和圖7。這些結(jié)果說明桿狀病毒表達(dá)的CCL21內(nèi)的高分子雜蛋白對(duì)于達(dá)到較高的抗腫瘤活性是必需的，但不是CCL21在體外誘導(dǎo)趨化作用所必需的。
表1.重組CCL21制備物的活性
1可從PreproTech EC Ltd.of Rocky Hill，New Jersey購買如實(shí)施例1所描述，桿狀病毒是桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物中的污染物。以能特異性識(shí)別桿狀病毒gp4蛋白的抗體為探針利用蛋白印跡分析桿狀病毒表達(dá)的CCL21。如圖8所示，可以在桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物中檢測到gp64。另外，具有抗腫瘤活性的桿狀病毒表達(dá)的CCL21批次含有的活病毒滴度相對(duì)較高，而無活性的批次含有的活病毒滴度相對(duì)較低(表2)。
表2.病毒滴度與桿狀病毒表達(dá)的CCL21制備物的抗腫瘤活性相關(guān)
1小組分；2大組分；3bv，桿狀病毒圖9顯示在不存在CCL21的情況下，將與CCL21制備物中污染的病毒滴度相同的純化活桿狀病毒注射到腫瘤內(nèi)所達(dá)到的腫瘤抑制效果與污染桿狀病毒的CCL21一樣。
實(shí)施例8.桿狀病毒誘導(dǎo)的體外細(xì)胞毒活性按照實(shí)施例1所描述的方法制備桿狀病毒。以未感染的Sf9細(xì)胞作為對(duì)照。離心以后收集上清和細(xì)胞團(tuán)。樣品用培養(yǎng)基按1∶11稀釋到初始病毒滴度5×106PFU/ml，分析其細(xì)胞毒活性。
人肺上皮細(xì)胞A549接種到96孔組織培養(yǎng)板中，設(shè)3復(fù)孔，與系列稀釋的桿狀病毒感染的或未感染的Sf9細(xì)胞及其上清共孵育。24小時(shí)去掉培養(yǎng)基，細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌。24到48小時(shí)后通過結(jié)晶紫染色分析細(xì)胞的存活能力，用分光鏡定量。
如圖10A所示，細(xì)胞團(tuán)所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)比上清更強(qiáng)。未感染細(xì)胞的上清沒有細(xì)胞毒活性。圖10B顯示桿狀病毒表達(dá)上清用0.2μm的濾膜過濾后(去掉內(nèi)含的桿狀病毒)其細(xì)胞毒活性顯著降低，與體內(nèi)活性的喪失相似。本文所描述的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)可用于預(yù)測體內(nèi)抗癌活性。參見圖13。
實(shí)施例9.桿狀病毒活化樹突細(xì)胞的成熟樹突細(xì)胞(DC)培養(yǎng)物內(nèi)添加野生型的桿狀病毒可誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟，其表現(xiàn)是活化標(biāo)記分子在細(xì)胞表面表達(dá)水平的升高。如圖11A和11B所示，桿狀病毒可活化鼠骨髓衍生的DC和人單核細(xì)胞來源的DC。
按照標(biāo)準(zhǔn)的方法制備骨髓衍生的鼠DC。簡言之，從6-8周齡的雌性Balb/c或C57BI/6(Charles River Laboratories of Holster，Califomia)小鼠體內(nèi)分離其骨髓，用添加10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲亞砜(DMSO)的熱滅活胎牛血清冷凍(-80℃)保存，細(xì)胞密度為2×107細(xì)胞/ml。細(xì)胞凍存管快速解凍后洗滌去除DMSO。將細(xì)胞接種到150mm懸浮培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基用20ml添加200U/ml鼠GM-CSF(PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的補(bǔ)充RPMI培養(yǎng)基(Sigma-ALDRICH of St.Louis，Missouri)。在培養(yǎng)的第3天，再次添加鼠GM-CSF，在第5天，離心去掉一半培養(yǎng)基，用含GM-CSF的新鮮培養(yǎng)基替換。用移液管小心吸取收獲BMDC。
在第6天時(shí)加入桿狀病毒和其他對(duì)照試劑。細(xì)胞繼續(xù)孵育18小時(shí)，然后分析細(xì)胞和上清液。通過FACS分析BMDC表面的分子標(biāo)記，通過測定第6天加入刺激因子前標(biāo)記未成熟DC的標(biāo)記物來確定其成熟情況，其中包括CD11c、CD11b、H-2Kd、I-Ad(表達(dá)低)、CD80(表達(dá)低)和CD86(表達(dá)低)。細(xì)胞與各種刺激因子共孵育過夜后洗滌細(xì)胞，用抗CD11c抗體和抗CD86抗體或抗I-A抗體雙染，然后用流式細(xì)胞儀分析。采用門技術(shù)圈出CD11c陽性的活細(xì)胞群。刺激表達(dá)為平均熒光強(qiáng)度(MFI)除以只用GM-CSF處理的染色細(xì)胞的MFI。圖11A顯示用桿狀病毒刺激后DC活化標(biāo)記分子CD86和MHC II的表達(dá)顯著升高(用抗I-A抗體檢測)。經(jīng)桿狀病毒刺激后CD80和CD40的表達(dá)同樣升高。
人源DC來源于外周血單核細(xì)胞，是用抗CD-14抗體包被的磁珠(Miltenyi Biotecof Auburn，California)從健康志愿者外周血棕黃層中純化出來的。用含白細(xì)胞介素4和GM-CSF(1000U/ml，購自PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的培養(yǎng)基培養(yǎng)3-4天后收獲未成熟的DC。通過FACS(Pharmingen of San Diego，California)分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)物中超過90％的細(xì)胞都是CD1a陽性的。用門技術(shù)(gating)圈出CD11a陽性的活細(xì)胞通過FACS分析DC表面的活化標(biāo)記分子。圖11B顯示桿狀病毒可誘導(dǎo)CD86和HLA-DR++表達(dá)水平升高。
實(shí)施例10.桿狀病毒在體內(nèi)活化CTL用桿狀病毒和可溶性蛋白抗原(HIV p24)免疫小鼠可誘導(dǎo)出很強(qiáng)的抗原特異性CTL反應(yīng)。第三次免疫后2周取免疫小鼠的脾。將所取的脾混合，這樣每個(gè)樣品中有5個(gè)脾。免疫小鼠的脾細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，每孔5×106個(gè)細(xì)胞。將這些細(xì)胞中的1×106細(xì)胞用下列物質(zhì)致敏(1)合成的p7g肽，這是一種H-2Kd限制性CTL表位，相當(dāng)于HIV-1SF2p24gag的199-208位氨基酸；以及(2)pGagb肽，這是一種H-2Db限制性CTL表位，相當(dāng)于HIV-1SF2p55gag的390-398位氨基酸。肽的濃度為10μM，37℃處理1小時(shí)。然后洗滌脾細(xì)胞，與剩余的4×106未處理的細(xì)胞共培養(yǎng)。脾細(xì)胞用2ml脾細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有添加100mM L-谷氨酰胺(Gibco ofGrand Island，New York)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich of St.Louis，Missouri)和α-Mem(最低要求標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基α，添加L-谷氨酰胺、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)(1∶1)、10％熱滅活胎牛血清(Hyclone of Logan，Utah)(在56℃水浴中孵育30分鐘滅活)、100U/ml青霉素、10μg/ml鏈霉素、10ml/L 100mM丙酮酸鈉和50μM 2-巰基乙醇。另外，在細(xì)胞開始培養(yǎng)前以5％大鼠T-Stim IL2(大鼠T-StimCollaborative BiomedicalProducts of Bedford，Massachusetts)作為IL2源添加到培養(yǎng)基中。
經(jīng)過6-7天的刺激，收集脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行鉻釋放試驗(yàn)。約1×106SV/Balb或MC57靶細(xì)胞用200μl含50μCi51Cr的培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入1μM校正肽p7g孵育60分鐘后洗滌，以細(xì)胞-靶位不配對(duì)的肽作為陰性對(duì)照。效應(yīng)細(xì)胞以不同的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例與5×103靶細(xì)胞在200μl培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4小時(shí)，培養(yǎng)板用的是96孔圓底或V形底組織培養(yǎng)板。兩個(gè)復(fù)孔的每分鐘計(jì)數(shù)平均值用于計(jì)算特異性釋放百分率。圖12顯示桿狀病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。
實(shí)施例11.光化學(xué)方法滅活桿狀病毒2升粉紋夜蛾(Tn)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物感染桿狀病毒。在28℃孵育3天后收獲被感染的細(xì)胞，800×g離心10分鐘使上清液澄清。收獲的培養(yǎng)基中的桿狀病毒滴度用草地夜蛾(Tn)細(xì)胞通過噬菌斑形成試驗(yàn)來確定，如King & Possee(1992)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室手冊(The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Manual)，Chapman & Hall，London所描述。
用二甲亞砜(DMSO)制備0.2mg/ml的trioxalen儲(chǔ)存液。感染細(xì)胞懸液中加入約5-10μg/ml的trioxalen，溫和震蕩使其分散到細(xì)胞懸液內(nèi)。然后將細(xì)胞懸液倒入一個(gè)無縫的不銹鋼托盤(如約1cm深)內(nèi)，將托盤置于旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。將一個(gè)長波紫外燈(365nm，6W)直接放到托盤上空，離液面1cm。紫外照射進(jìn)行約15分鐘或足以滅活病毒的時(shí)間。
為了評(píng)價(jià)病毒滅活情況，用昆蟲細(xì)胞測定trioxalen/UV滅活樣品的滴度。例如，從細(xì)胞懸液中取樣，系列稀釋后感染Sf9細(xì)胞。接種后約16小時(shí)換液以使DMSO誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性降到最低。接種后7天在顯微鏡下觀察細(xì)胞以評(píng)價(jià)細(xì)胞的病理狀況，如果是陰性的，將細(xì)胞再傳代2次以進(jìn)一步確定病毒的滅活情況。還可以檢測培養(yǎng)物以評(píng)價(jià)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例12.預(yù)測體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的體外試驗(yàn)用細(xì)胞毒性試驗(yàn)和體內(nèi)鼠腫瘤模型分析各批次的CCL21，下文描述了兩種試驗(yàn)的方法。細(xì)胞毒活性系數(shù)在下文也有描述。通過測定體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤大小來確定哪個(gè)批次是有活性的，哪個(gè)批次是無活性的。
誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞毒活性的試驗(yàn)
誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞毒活性的試驗(yàn)分析的是某種活化物質(zhì)所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒(或細(xì)胞抑制)反應(yīng)，如細(xì)胞因子(IL-2或β-IFN)或抗粘附靶細(xì)胞系(A549或MG-63細(xì)胞)的桿狀病毒(BV)，所用的是效應(yīng)細(xì)胞(PBMC)和靶細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)。孵育以后，通過Alamar blue染色定量檢測靶細(xì)胞的存活能力。試驗(yàn)用的材料包括生長培養(yǎng)基(GM)(含Earle鹽的Eagle′s MEM，2.2g/L碳酸氫鈉，胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素)MEM............................................................................500mlFBS.............................................................................50mlL-谷氨酰胺(200mM)............................................................... 5ml青霉素(10,000U/ml)/鏈霉素(10,000μg/ml)/mix....................................... 5ml生長/分析培養(yǎng)基(GAM)(RPMI 1640w/o pH指示劑，胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺)RPMI 1640.......................................................................500mlFBS............................................................................. 50ml
L-谷氨酰胺(200mM)..................................................... 5mlPBMC制備培養(yǎng)基(RPMI 1640w/o pH指示劑，0.5％BSA成分V)RPMI 1640........................................................... 500mlBSA(7.5％BSA溶液).................................................... 37mlSTV溶液(鹽水A，胰蛋白，依地酸(Na4EDTA))NaCl................................................................ 8.00gKCl................................................................. 0.40gD-葡萄糖1.00gNaHCO3.............................................................. 0.58g胰蛋白1250........................................................ 0.50gNa4EDTA............................................................ 0.20g0.5％酚紅........................................................... 0.9ml玻璃蒸餾水............................................. 添加到總體積為1.0L磷酸緩沖鹽水(PBS，無鈣無鎂)KCl.................................................................. 0.2gNaCIl................................................................ 8.0gKH2PO4...............................................................0.2gNa2HPO4.............................................................1.14g玻璃蒸餾水............................................. 添加到總體積為1.0LAlamar Blue染色培養(yǎng)基添加Alamar blue(Biosource International)的RPMI 1640。
A549細(xì)胞A549人肺癌細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物收集中心，處于第76代(ATCC CCL 185)。擴(kuò)增細(xì)胞，然后將低傳代的細(xì)胞冷凍保存。A549細(xì)胞的主種子用液氮冷凍保存。
A549工作培養(yǎng)物A549細(xì)胞以粘連單層生長，傳代時(shí)必須用胰酶消化。倒掉T-175培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用10-15ml PBS洗滌兩次，然后每瓶中加入3-5ml STV，孵育3-4分鐘直到細(xì)胞開始脫離，溫和吹打脫離的細(xì)胞。每瓶中加入5ml生長培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含新鮮生長培養(yǎng)基的50ml離心管內(nèi)輕輕混合。將不同比例的細(xì)胞混合物(1∶5、1∶10或1∶20的分別培養(yǎng)2、3和4天的細(xì)胞)加入到含40±5ml、37℃預(yù)熱的新鮮生長培養(yǎng)基的T175培養(yǎng)瓶內(nèi)。
MG-63細(xì)胞人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63得自美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC CRL 1427)。MG-63細(xì)胞的主種子用液氮冷凍保存。
MG-63工作培養(yǎng)物工作培養(yǎng)物每3天或4天分裂一次。細(xì)胞生長到融合的單細(xì)胞層后每3天按1∶6的比例傳代或者每4天按1∶8的比例傳代。
傳代過程MG-63以粘連單層生長，傳代時(shí)必須用胰酶消化。吸去T-175培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用10-15ml PBS洗滌兩次，每瓶中加入4±0.1ml STV，然后在37℃±2℃、5±1％CO2中孵育3-5分鐘直到細(xì)胞開始脫離，溫和吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁。
用移液管上下吹打STV內(nèi)的細(xì)胞制備均勻的細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含新鮮生長培養(yǎng)基的50ml離心管內(nèi)輕輕混合。將不同比例的細(xì)胞混合物(1∶6或1∶8)加入到含40±5ml、37℃預(yù)熱的新鮮生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
PBMC細(xì)胞PBMC采自志愿者。
制備A549或MG-63細(xì)胞用于PBMC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)去掉T-175培養(yǎng)瓶內(nèi)A549或MG-63工作培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。細(xì)胞單層用10-15mlPBS洗滌兩次，然后每瓶中加入3-5ml STV，孵育5分鐘或者直到細(xì)胞開始脫離，溫和吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁。每瓶中加入5ml生長培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml圓錐形試管內(nèi)，再加入25ml生長培養(yǎng)基，反轉(zhuǎn)試管以混合細(xì)胞，得到細(xì)胞濃縮物。測定細(xì)胞濃縮物中細(xì)胞的密度。簡言之，將細(xì)胞懸液按1∶3稀釋，然后用Z1型Coulter計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)A549細(xì)胞時(shí)把計(jì)數(shù)儀的閾值設(shè)定為8微米，計(jì)數(shù)MG-63細(xì)胞時(shí)計(jì)數(shù)儀的閾值也設(shè)定為8微米。
用生長分析培養(yǎng)基將A549細(xì)胞濃縮到50,000細(xì)胞/ml，將MG-63細(xì)胞濃縮到65,000細(xì)胞/ml。所需要的總細(xì)胞數(shù)等于所需要的培養(yǎng)基總體積乘以接種密度。所需要的細(xì)胞濃縮物的體積(C)等于所需要的細(xì)胞總數(shù)除以濃縮物的密度。所需要添加的生長/分析培養(yǎng)基的體積(GAM)等于所需要的培養(yǎng)基的體積減去細(xì)胞濃縮物的體積。用于PBMC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)的靶細(xì)胞接種密度由(C)和(GAM)決定。
在一次性Erlenmeyer培養(yǎng)瓶或組織培養(yǎng)玻璃器皿中制備細(xì)胞懸液。在15分鐘內(nèi)將細(xì)胞加到分析板中。每孔內(nèi)加入100μl細(xì)胞懸液(每孔5000個(gè)A549細(xì)胞或者6500個(gè)MG-63細(xì)胞)。分析板加蓋后在濕潤的37℃±2℃、5±0.5％CO2孵育箱中孵育18到24小時(shí)。
在轉(zhuǎn)移板內(nèi)進(jìn)行初始樣品制備和系列稀釋初篩試驗(yàn)為了提高檢測到PBMC細(xì)胞毒活性誘導(dǎo)因子的幾率，先制備相對(duì)較高濃度的樣品。在隨后的試驗(yàn)中根據(jù)樣品的活性逐漸降低樣品的濃度。
低濃度的CCL21樣品用PBS(無鈣無鎂)將低蛋白濃度的CCL21樣品(3000μg/ml以下)稀釋到400到600μg/ml之間。加入FBS和L-谷氨酰胺使樣品中FBS的濃度達(dá)到10％，L-谷氨酰胺的濃度達(dá)到1％。將240μl的樣品加到96孔板的第一孔中。用含10％FBS和1％L-谷氨酰胺的PBS在96孔轉(zhuǎn)移板內(nèi)倍比稀釋樣品。
準(zhǔn)備使用高濃度進(jìn)行試驗(yàn)的樣品(蛋白、活性、細(xì)胞或病毒)按照低濃度蛋白樣品的試驗(yàn)方法進(jìn)行制備，或者直接加入生長/分析培養(yǎng)基進(jìn)行制備。將240μl的樣品加到96孔板的第一孔中。用生長分析培養(yǎng)基在96孔轉(zhuǎn)移板內(nèi)倍比稀釋樣品。
桿狀病毒樣品BV樣品用生長/分析培養(yǎng)基(GAM)稀釋到1∶2到1∶10，按照上述方法用GAM進(jìn)行系列稀釋。
β-IFN或IL-2小玻璃瓶內(nèi)的β-IFN或IL-2樣品用適當(dāng)?shù)南♂寗?注射用鹽水或注射用水)從新配制。0.25mg/ml從新配制的β-IFN等于13.9μM，1.1mg/ml從新配制的IL-2等于64.7μM。用生長分析培養(yǎng)基(GAM)進(jìn)一步稀釋200,000IU/ml的細(xì)胞因子制備成工作液。批號(hào)為IFN-01-001的β-IFN按1∶35.75的比例用GAM稀釋，批號(hào)為MLAPM006的IL-2按1∶91.75的比例用GAM稀釋。然后用GAM稀釋到試驗(yàn)所需的濃度。IL-2的試驗(yàn)濃度為2000IU/ml，β-IFN的試驗(yàn)濃度為2000IU/ml。
高濃度的CCL21樣品上述3mg/ml的CCL21樣品用GAM稀釋到200到600μg/ml的試驗(yàn)濃度。
將稀釋的樣品轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞(分析)板上將稀釋板內(nèi)的樣品轉(zhuǎn)移到分析(細(xì)胞)板內(nèi)。樣品的最終濃度為原稀釋板濃度的1/2。用具有板到板轉(zhuǎn)移程序的移液器進(jìn)行樣品的轉(zhuǎn)移。在制備PBMC的同時(shí)孵育分析板。
用于測定試驗(yàn)樣品對(duì)靶細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性的毒性對(duì)照板取兩個(gè)一樣的轉(zhuǎn)移板(稀釋板)，將培養(yǎng)基加到2個(gè)細(xì)胞板內(nèi)。第一個(gè)板內(nèi)加入50μl PBMC制備物用于誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，第二個(gè)板內(nèi)加入50μl PBMC制備培養(yǎng)基用于測定被測樣品的直接細(xì)胞毒活性。
從人外周血中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備1∶10稀釋的漂白溶液(3升)。所有接觸血的試管和移液管都要漂白過夜。將燒杯干燥并將所有物品棄于收集生物危害品的容器。在處理血液前將50ml試管的蓋子去掉(防止血液污染蓋子)。將血液加入到250ml可降解的聚合羧酸鹽培養(yǎng)瓶內(nèi)，用等量的HBSS稀釋。在加入血液前30分鐘將約17ml ficoll-plaque溶液加到50ml聚苯乙烯試管內(nèi)。血液會(huì)在ficoll-plaque溶液之上分層，并且不會(huì)破壞ficoll層。每3ml ficoll-plaque加入4ml血液/HBSS(即每個(gè)50ml試管內(nèi)加入17ml ficoll和23ml血液/HBSS)。
在室溫下1800rpm(400×g)離心試管30分鐘(Sorval GLC-2B離心機(jī))。用25ml的血清學(xué)移液管盡可能多地吸取頂層的液體，留約5ml的體積在第二層頂部。用5ml血清學(xué)移液管去掉第一層的剩余部分。然后用5ml的無菌血清學(xué)移液管收集含B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的第二層，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50ml試管內(nèi)。收集物用3倍體積的不含添加物的RPMI稀釋，所得到的溶液900rpm(100×g)離心15-20分鐘(第一次洗滌)。用血清學(xué)移液管將上清去掉，細(xì)胞用40ml RPMI重懸，900rpm重復(fù)離心一次(第二次洗滌)。用血清學(xué)移液管將上清去掉，細(xì)胞用40ml PBMC制備培養(yǎng)基(含0.5％BSA的RPMI)重懸。準(zhǔn)確記錄重懸細(xì)胞的總體積。用Coulter計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞的濃度--用PBMC制備培養(yǎng)基按1∶5的比例稀釋濃縮的細(xì)胞用于計(jì)數(shù))。
確定達(dá)到合適細(xì)胞濃度所需要的重懸體積。細(xì)胞毒性試驗(yàn)所需要的細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml，冷凍PBMC理想的細(xì)胞密度為10×106細(xì)胞/ml。最終的重懸體積等于細(xì)胞濃度乘以總體積再除以最終所需的細(xì)胞濃度(2或10×106細(xì)胞/ml)。
剩余的重懸細(xì)胞900rpm再次離心(第三次洗滌)。去掉上清液，將細(xì)胞重新懸浮到終體積。用Coulter計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞的濃度(用PBMC制備培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋濃縮的細(xì)胞用于計(jì)數(shù))。
試驗(yàn)用的PBMC制備物細(xì)胞重懸到PBMC制備培養(yǎng)基內(nèi)直接用于分析試驗(yàn)。將細(xì)胞用PBMC制備培養(yǎng)基按1∶2的比例稀釋使細(xì)胞終濃度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml。將細(xì)胞加到分析板中與50μl/孔的靶細(xì)胞混合(50000PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置于37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用于凍存的PBMC制備物將細(xì)胞重懸到含10％DMSO的FBS(熱滅活的)中，以10×106細(xì)胞/ml的濃度凍存。細(xì)胞分裝到2ml的無菌凍存管中，加入異丙醇后冷凍到-70℃冰箱的凍存盒內(nèi)。用Coulter計(jì)數(shù)器確定最終的細(xì)胞濃度。
解凍凍存的PBMC用于試驗(yàn)在37℃水浴中快速融化PBMC凍存管。細(xì)胞用13ml RPMI 1640重懸，裝入圓錐形離心管后900rpm(100×g)離心15-20分鐘。用血清學(xué)移液管去掉上清，細(xì)胞重懸到13ml PBMC制備培養(yǎng)基中(含0.5％BSA的RPMI)。用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以確定細(xì)胞的濃度(用PBMC制備培養(yǎng)基按1∶5的比例稀釋濃縮的細(xì)胞用于計(jì)數(shù))。
確定達(dá)到合適細(xì)胞濃度所需要的重懸體積。細(xì)胞毒性試驗(yàn)所需要的細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml，冷凍PBMC理想的細(xì)胞密度為10×106細(xì)胞/ml。最終的重懸體積等于細(xì)胞濃度乘以總體積再除以最終所需的細(xì)胞濃度(2或10×106細(xì)胞/ml)。剩余的重懸細(xì)胞900rpm再次離心。去掉上清液，將細(xì)胞重新懸浮到終體積。
用Coulter計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞的濃度(用PBMC制備培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋濃縮的細(xì)胞用于計(jì)數(shù))。將細(xì)胞用生長分析培養(yǎng)基按1∶2的比例進(jìn)一步稀釋使細(xì)胞終濃度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml。將細(xì)胞加到分析板中與50μl/孔的靶細(xì)胞混合(50000 PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置于37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用Alamar Blue染色分析板孵育3到4天后，從分析板上吸去培養(yǎng)基。每孔加入100μl Alamar Blue染色液(含10％Alamar Blue、0.5％BSA的RPMI)，分析板再孵育2到3小時(shí)。用分光光度計(jì)(測定570nm-630nm處的吸光度)或熒光光度計(jì)(測定530nm處的激發(fā)光和590nm處的發(fā)射光)。
檢測活性檢測活性定義為參照孔的反應(yīng)除以PBMC樣品孔的反應(yīng)。在大多數(shù)情況下，參照孔是無PBMC的樣品對(duì)照孔，其中所含的樣品濃度與PBMC樣品孔一樣，通常用最大的樣品濃度(系列稀釋中的第一孔)。在某些情況下，如果樣品量不足以設(shè)無PBMC的對(duì)照板，則參照孔用含或不含PBMC的PBS/生長培養(yǎng)基。
如果有足夠量的樣品來設(shè)置無PBMC的對(duì)照板，則活性設(shè)定為直接的細(xì)胞毒反應(yīng)/誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)。如圖14所示，體外的試驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)的試驗(yàn)結(jié)果一致。
實(shí)施例13.抗-gp64單克隆抗體阻斷桿狀病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)桿狀病毒起始材料(CΔ3)用抗-gp64抗體處理。簡言之，1-500μg純化的抗-gp64鼠單克隆抗體(克隆1.3A，由Dr.DONALD Jarvis，U.of WY提供)或Ig對(duì)照抗體與不同感染復(fù)數(shù)的重組桿狀病毒在一定的體積內(nèi)混合。在室溫下于暗處使抗體與病毒結(jié)合約15小時(shí)，在進(jìn)行噬菌斑形成試驗(yàn)或細(xì)胞毒試驗(yàn)前將樣品冷藏1-2天。按照上面所描述的方法用細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測樣品。見圖15。
實(shí)施例14.滅活桿狀病毒在體外誘導(dǎo)PBMC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用桿狀病毒起始材料(CΔ3)通過trioxalen和紫外線處理加以滅活。桿狀病毒通過補(bǔ)骨脂素和紫外線照射進(jìn)行光滅活(Weightman，S.A.和Banks，M.J.Virol.Met.81179-182(1999))。將含桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基(3ml，約6E7 pfu)轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板(Costar)內(nèi)。用二甲亞砜(DMSO)制備2mg/ml的4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(trioxalen)儲(chǔ)存液，然后加到每個(gè)孔內(nèi)，終濃度達(dá)到100μg/ml。然后在培養(yǎng)板上1.5cm處放置一個(gè)手提燈(Model UVL-56，UVP，Upland，CA)用紫外線(365nm)照射培養(yǎng)板15分鐘。對(duì)照樣品包括不含補(bǔ)骨脂素的DMSO和含補(bǔ)骨脂素但未進(jìn)行紫外線照射的DMSO。照射以后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到10 MWCO透析筒(Slidalyzer，Pierce)內(nèi)，用磷酸緩沖鹽透析。所有樣品都用Sf9細(xì)胞進(jìn)行噬菌斑形成試驗(yàn)。按照上面所描述的方法檢測樣品的細(xì)胞毒活性，結(jié)果見圖16。
實(shí)施例15.腫瘤細(xì)胞是桿狀病毒的主要靶細(xì)胞完整的A549靶細(xì)胞單層培養(yǎng)物經(jīng)桿狀病毒處理3小時(shí)后用生長分析培養(yǎng)基洗滌3次。同時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞(PBMC)也用桿狀病毒處理3小時(shí)后用生長分析培養(yǎng)基洗滌3次。按照如下組合將桿狀病毒處理的和未處理的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞混合1)單獨(dú)的未處理靶細(xì)胞；2)未處理靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞；3)桿狀病毒處理的靶細(xì)胞和未處理的PBMC；以及4)未處理的靶細(xì)胞與桿狀病毒處理的PBMC。
孵育4天后按照SOP中所描述的方法測定靶細(xì)胞的存活能力。利用Alamar Blue熒光確定的細(xì)胞存活能力，取每組中16個(gè)孔平均值(試驗(yàn)在96孔板內(nèi)進(jìn)行)。結(jié)果見圖17。
實(shí)施例16.利用桿狀病毒抑制肺癌動(dòng)物模型內(nèi)腫瘤的生長8-10周齡的C57BL/6小鼠在接種腫瘤細(xì)胞前最少要適應(yīng)環(huán)境7天。在小鼠右腹部皮下接種2×105處于傳代早期(＜10代)的3LL-HM腫瘤細(xì)胞。每周測量兩次腫瘤的大小。腫瘤生長到50-100mm3(一般在接種后7天可以達(dá)到這個(gè)體積)時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組，同一天給小鼠的腫瘤內(nèi)注射第一次桿狀病毒。給藥方案為每日一次，連續(xù)6天。小鼠分為如下4組1)白蛋白陰性對(duì)照，單次劑量為25μg(0.5mg/ml)；2)活病毒陽性對(duì)照(滴度約為1×107/ml)；3)活病毒陰性對(duì)照(滴度約為800/ml)；以及4)滅活病毒(滴度約為800/ml)。每周測量兩次腫瘤的大小，連續(xù)測定4周。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2500mm3或小鼠出現(xiàn)下列任何一種癥狀時(shí)處死小鼠體重下降超過20％；腫瘤潰瘍面積超過腫瘤表面積的30％或者雖然低于30％但是腫瘤出現(xiàn)破潰、出血或流膿；嚴(yán)重的呼吸困難或處于垂死狀態(tài)。
如圖18所示，瘤內(nèi)注射桿狀病毒可導(dǎo)致3LL腫瘤生長的延遲。
實(shí)施例17.利用桿狀病毒在體外和體內(nèi)產(chǎn)生抗感染性因子的保護(hù)作用。
活桿狀病毒已經(jīng)表明可誘導(dǎo)鼠細(xì)胞系和人細(xì)胞系分泌干擾素(IFN)，并且可在鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗腦心肌炎病毒感染的保護(hù)作用。但是用紫外線將桿狀病毒滅活后其感染性和IFN誘導(dǎo)活性喪失(Gronowski等，J Virology，Dec.1999，p.9944-9951卷73，No.12)。
為了研究桿狀病毒對(duì)感染因子的影響，用水泡性口炎病毒(VSV)在體內(nèi)和體外感染細(xì)胞。如圖19所示，用Sf9和桿狀病毒或Sf9和桿狀病毒培養(yǎng)上清處理的細(xì)胞或培養(yǎng)基可在體外產(chǎn)生最大的抗VSV保護(hù)效應(yīng)。如圖19所示，滅活的桿狀病毒在體內(nèi)和體外都可以產(chǎn)生抗致病性病毒感染的保護(hù)效應(yīng)。
實(shí)施例18旁觀者效應(yīng)為了確定腫瘤細(xì)胞的抑制是否是直接的作用(即每個(gè)細(xì)胞必須被非致病性病毒感染)，將感染的腫瘤細(xì)胞與未感染的腫瘤細(xì)胞按不同比例混合。
A549或MG-63細(xì)胞系或PBMC與活化劑量的桿狀病毒接觸3到5小時(shí)，然后將剩余的或未結(jié)合的病毒從應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)洗去。經(jīng)洗滌的BV處理細(xì)胞與未處理的應(yīng)答細(xì)胞按不同比例混合。BV處理的和未處理的PBMC混合物加到未處理的A549或MG-63靶細(xì)胞內(nèi)，另外，BV處理的A549或MG-63細(xì)胞混合物加到未處理的PBMC內(nèi)。BV未處理的細(xì)胞和BV處理的細(xì)胞按照一樣的方法處理。
PBMC在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)不斷振搖使之處于懸浮狀態(tài)才能被BV感染。細(xì)胞經(jīng)離心、倒掉上清、再懸浮(3次)洗滌后與未處理的PBMC混合。BV處理A549和MG-63靶細(xì)胞的方式有兩種，一種是完整單層細(xì)胞用BV處理，再用新鮮的生長培養(yǎng)基溫和洗滌，然后將未處理的靶細(xì)胞加到分析板內(nèi)；另一種方式是如上面所描述的PBMC那樣在懸浮狀態(tài)下處理。
如果將桿狀病毒從A549和MG-63靶細(xì)胞中洗掉后很久再加入PBMC，則細(xì)胞毒試驗(yàn)中所檢測到的細(xì)胞毒反應(yīng)快速消失。對(duì)于A549細(xì)胞來說，去掉桿狀病毒后20小時(shí)細(xì)胞毒反應(yīng)完全消失，對(duì)于MG-63細(xì)胞來說，細(xì)胞毒反應(yīng)基本消失(數(shù)據(jù)未列出)。
原位洗滌桿狀病毒處理的靶細(xì)胞單層，然后與未處理的細(xì)胞混合，立即加入PBMC可對(duì)A549和MG-63細(xì)胞產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)。
在懸浮狀態(tài)下用BV處理PBMC或A549細(xì)胞再經(jīng)過離心洗滌(3個(gè)循環(huán)的離心、去上清、再懸浮)可有效地消除細(xì)胞毒反應(yīng)。
BV處理MG-63細(xì)胞并離心洗滌對(duì)MG-63靶細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)影響較小。
在振搖使之處于懸浮狀態(tài)下用BV處理PBMC再經(jīng)過離心洗滌好像可以非特異性地刺激抗MG-63靶細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)(在含0％BV處理細(xì)胞的孔內(nèi))，但是對(duì)A549細(xì)胞沒有這種作用。
如圖20所示，當(dāng)總細(xì)胞體積是20％的感染細(xì)胞和80％的非感染細(xì)胞時(shí)，可以觀察到最大反應(yīng)。因此，未感染的細(xì)胞可被大家所熟知的旁觀者效應(yīng)殺傷(即靠近靶細(xì)胞可促進(jìn)非靶細(xì)胞(未感染細(xì)胞)的死亡)。
參考文獻(xiàn)下面所列出的參考文獻(xiàn)以及本說明書所引用的所有參考文獻(xiàn)都已納入本文作為參考，其目的在于為本發(fā)明所用的方法、技術(shù)和/或組合物提供背景資料或者說明這些方法、技術(shù)和/或組合物。
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應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明的各種詳細(xì)描述在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可以做出修改。而且，上述的說明書只是為了說明的目的，并不意味著對(duì)權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述動(dòng)物一定量的包含非致病性滅活病毒的組合物以有效地誘導(dǎo)所述動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、病變部位內(nèi)注射、病變部位旁注射或者上述方式的組合給藥。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述非致病性滅活病毒包括病毒顆?；虿《境煞?。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗感染性疾病的保護(hù)作用。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗癌的保護(hù)作用。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞記憶反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答可促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染性疾病是病毒、真菌或細(xì)菌。
12.一種在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括將含有一定量的非致病性病毒的組合物給予所述細(xì)胞以有效地導(dǎo)致所述細(xì)胞死亡。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低于約500,000PFU或500,000PFU等價(jià)濃度時(shí)就可導(dǎo)致體外試驗(yàn)中約50％以上的與其接觸的細(xì)胞死亡。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述桿狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述癌癥是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、腎癌或皮膚癌。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述病毒成分是至少兩種病毒成分，其中所述病毒成分選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)或糖。
22.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒包括非致病性病毒的膜蛋白。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述膜蛋白是gp64。
24.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述滅活是化學(xué)滅活、紫外線滅活、輻射滅活或基因滅活。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述滅活是補(bǔ)骨脂素滅活、紫外線滅活或者二者的結(jié)合。
27.如權(quán)利要求12所述的方法，其中包含非致病性病毒的組合物主要由桿狀病毒家族的病毒組成。
28.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述組合物與其他藥劑一同給藥，其中，所述藥劑是化療藥、抗癌藥、疫苗或其混合物。
29.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述組合物與第二組合物一同給藥，所述第二組合物包含抗原和佐劑。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中，所述組合物和藥劑或所述組合物和第二組合物同時(shí)使用。
31.一種激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)CTL反應(yīng)的方法，所述方法包括將包含一定量的非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)的CTL反應(yīng)，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低于約500,000PFU或500,000PFU等價(jià)濃度時(shí)就可以有效地激發(fā)體外試驗(yàn)中約50％以上與其接觸的細(xì)胞產(chǎn)生CTL反應(yīng)。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述動(dòng)物是人。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
35.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性的昆蟲特異性病毒的組合物以有效地抑制所述動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低于約500,000PFU或500,000PFU等價(jià)濃度時(shí)就可以有效地抑制體外試驗(yàn)中約50％以上與其接觸的細(xì)胞的生長。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述體外試驗(yàn)是軟瓊脂上的細(xì)胞生長試驗(yàn)。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內(nèi)注射和/或瘤旁注射給藥。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人或小鼠。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述組合物是多次給藥。
42.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分包含至少兩種病毒蛋白。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述至少兩種病毒蛋白包括gp64。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
46.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述病毒成分包含核酸、脂質(zhì)或糖中的一種或多種。
47.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述滅活是熱滅活、化學(xué)滅活或紫外線滅活。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述滅活是補(bǔ)骨脂素滅活、紫外線滅活或者二者的結(jié)合。
50.一種治療動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地緩解所述動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤癥狀。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低于約500,000PFU或500,000PFU等價(jià)濃度時(shí)就可以有效地抑制體外試驗(yàn)中約50％以上與其接觸的細(xì)胞的生長。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
54.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)癌轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動(dòng)物體內(nèi)的癌轉(zhuǎn)移。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述包含非致病性病毒的組合物在低于約500,000PFU或500,000PFU等價(jià)濃度時(shí)就可以有效地抑制體外試驗(yàn)中約50％以上與其接觸的細(xì)胞的生長。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
58.一種使動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤產(chǎn)生抵抗力的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制再次接種的腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述動(dòng)物是人或小鼠。
62.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)非腫瘤性增生性疾病的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制動(dòng)物體內(nèi)的非腫瘤性增生性疾病。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述組合物通過病變部位內(nèi)注射、病變部位旁注射給藥或者兩種方式結(jié)合給藥。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，所述動(dòng)物是人。
66.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)增生的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動(dòng)物體內(nèi)的增生。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
69.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述動(dòng)物是人或小鼠。
70.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、病變部位內(nèi)注射、病變部位旁注射給藥或者上述方式結(jié)合給藥。
71.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)化生的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動(dòng)物體內(nèi)的化生。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
74.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述動(dòng)物是人或小鼠。
75.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、病變部位內(nèi)注射、病變部位旁注射給藥或者上述方式結(jié)合給藥。
76.一種抑制癌癥患者的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括給予所述的患者一定量的包含一定量非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述患者的一種或多種癌癥癥狀。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
78.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
79.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述組合物通過瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、病變部位內(nèi)注射、病變部位旁注射給藥或者上述方式結(jié)合給藥。
80.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆?；虿《境煞帧?br> 81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述病毒成分是gp64。
82.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述一種或多種癌癥癥狀是腫瘤生長、異常細(xì)胞增生、癌轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞死亡或細(xì)胞侵潤。
83.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述一種或多種癌癥癥狀是體重下降、出血、呼吸困難、骨折、免疫耐受或疲乏。
84.一種保護(hù)動(dòng)物免受感染性疾病影響的方法，所述方法包括給予所述的患者一定量的包含非致病性滅活病毒的組合物以有效地保護(hù)所述的動(dòng)物不受感染性疾病的影響。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中，所述桿狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
89.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述滅活是基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，或者上述幾種滅活方式的組合。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其中，所述基因滅活是溫度敏感型突變。
91.一種導(dǎo)致一群細(xì)胞中的細(xì)胞死亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞群的一部分細(xì)胞與含一定量非致病性病毒的組合物接觸從而有效地導(dǎo)致所述細(xì)胞群中的細(xì)胞死亡。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
93.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述細(xì)胞群中的所述部分細(xì)胞不超過所述細(xì)胞群的約30％。
94.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述細(xì)胞群中的所述部分細(xì)胞不超過所述細(xì)胞群的約20％。
95.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述桿狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
98.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
99.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述細(xì)胞群包含外周血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
100.一種治療患者的疾病的方法，所述方法包括(a)滅活非致病性病毒，其中，所述非致病性病毒通過加入濃度約為5-10μg/ml的trioxalen并在約365nm和6W的紫外線下照射約15分鐘加以滅活；(b)將所述的滅活的非致病性病毒制備成藥物組合物；以及(c)將所述的藥物組合物給予患者。
101.如權(quán)利要求100所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
102.如權(quán)利要求100所述的方法，其中，所述疾病是癌或感染性疾病。
103.一種預(yù)測化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性的方法，所述方法包括a)使化合物與腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞接觸接觸；以及b)測定所述腫瘤細(xì)胞的死亡率；其中能引起被接觸腫瘤細(xì)胞死亡的化合物被認(rèn)為是具有體內(nèi)活性的化合物。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其中，所述化合物是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
105.如權(quán)利要求103所述的方法，其中，所述化合物來源于桿狀病毒家族。
106.如權(quán)利要求103所述的方法，其中，所述化合物是昆蟲特異性病毒。
107.如權(quán)利要求103所述的方法，其中，所述腫瘤細(xì)胞是A549細(xì)胞、3LL-HM細(xì)胞、4T1細(xì)胞、MT901細(xì)胞、MAT BIII細(xì)胞、B16黑色素瘤細(xì)胞或MG-63細(xì)胞。
108.一種抑制動(dòng)物體內(nèi)的感染性疾病的方法，所述方法包括給予所述的動(dòng)物一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制所述動(dòng)物體內(nèi)的感染性疾病。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
110.如權(quán)利要求109所述的方法，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
111.如權(quán)利要求110所述的方法，其中，所述桿狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
113.如權(quán)利要求91所述的方法，其中，所述非致病性病毒是滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
114.一種含有非致病性病毒和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
115.如權(quán)利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是滅活的病毒。
116.如權(quán)利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。
117.如權(quán)利要求116所述的藥物組合物，其中，所述昆蟲特異性病毒是桿狀病毒家族的病毒。
118.如權(quán)利要求117所述的藥物組合物，其中，所述桿狀病毒家族的病毒是顆粒體病毒或核型多角體病毒。
119.如權(quán)利要求118所述的藥物組合物，其中，所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
120.如權(quán)利要求114所述的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒是無活性的病毒。
121.如權(quán)利要求120所述的藥物組合物，其中，所述滅活是基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，或者上述幾種滅活方式的組合。
122.如權(quán)利要求121所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過下列方法中的兩種方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
123.如權(quán)利要求121所述的藥物組合物，其中，所述基因滅活是溫度敏感型的突變。
124.一種藥物組合物，所述組合物中所包含的非致病性病毒至少用兩種不同的方法滅活。
125.如權(quán)利要求124所述的藥物組合物，其中，所述病毒至少用三種不同的方法滅活。
126.一種含有非致病性病毒和載體的藥物組合物，其中，所述載體是脂質(zhì)體、病毒樣顆粒、病毒體或蛋白運(yùn)送載體。
127.如權(quán)利要求126所述的藥物組合物，其中，所述病毒是無活性的。
128.如權(quán)利要求124所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過選自如下一組的兩種方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
129.如權(quán)利要求125所述的藥物組合物，其中，所述滅活至少通過選自如下一組的三種方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
130.一種含有非致病性病毒和至少一種PBMC的藥物組合物，其中，所述非致病性病毒至少通過選自如下一組的兩種方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
131.如權(quán)利要求130所述的藥物組合物，所述組合物還含有至少一種癌細(xì)胞。
132.一種制備包含非致病性病毒的抗癌或抗感染性疾病組合物的方法，所述方法包括(a)使病毒與第一滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒；(b)使所述病毒與第二滅活劑接觸以有效地滅活有活性的病毒；(c)使所述病毒與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合；以及(d)利用體外試驗(yàn)確定所述病毒已被滅活。
133.如權(quán)利要求132所述的方法，所述方法還包括隨機(jī)采集所述抗癌組合物的部分樣品用于分析該組合物的安全性、有效性或毒性中的一種或多種。
134.如權(quán)利要求133所述的方法，其中，所述第一滅活劑是基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活。
135.如權(quán)利要求133所述的方法，其中，所述第二滅活劑是基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、熱滅活或放射線滅活，但是第一滅活劑與第二滅活劑是不同的。
136.如權(quán)利要求133所述的方法，所述方法還包括將所述抗癌或抗感染性疾病組合物的所述隨機(jī)樣品的安全性、有效性或毒性數(shù)據(jù)中的一種或多種與第二抗癌組合物已有的安全性、有效性或毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
137.如權(quán)利要求132所述的方法，其中，所述病毒是否有活性是通過噬菌斑形成試驗(yàn)確定的。
138.如權(quán)利要求137所述的方法，其中，所述噬菌斑形成試驗(yàn)用的是Sf9細(xì)胞。
139.如權(quán)利要求132所述的方法，所述方法還包括通過EM計(jì)數(shù)非致病性病毒。
140.如權(quán)利要求132所述的方法，其中，在步驟(a)和步驟(b)后都驗(yàn)證所述的病毒是否有活性。
141.如權(quán)利要求136所述的方法，其中，所述比較的結(jié)果在所述抗癌或抗感染性疾病組合物上市前需要匯編。
142.如權(quán)利要求1、12、31、35、50、54、58、62、66、71、76、84、91或108之一所述的方法，其中，所述非致病性病毒制備成藥物組合物。
143.一種包含非致病性的滅活病毒和至少一種抗原以及至少一種佐劑的藥物組合物，其中，所述抗原與非致病性的滅活病毒不同。
144.一種包含佐劑組合物的免疫刺激組合物，所述佐劑組合物包含非致病性的滅活病毒、至少一種抗原，其中，所述抗原與佐劑組合物不同，另外，其中所述免疫刺激組合物能刺激針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
145.如權(quán)利要求144所述的免疫刺激組合物，其中，所述非致病性的滅活病毒包括滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。
146.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述癌細(xì)胞是上皮癌細(xì)胞。
147.一種包含非致病性病毒和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的藥物組合物。
148.一種治療癌的方法，所述方法包括給予需要治療的患者以權(quán)利要求147所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過給予受試者非致病性病毒來治療和/或預(yù)防腫瘤的方法和組合物。本發(fā)明還提供了通過給予受試者非致病性病毒來治療和/或預(yù)防感染性疾病的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1717250SQ200380104308
公開日2006年1月4日 申請日期2003年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月7日
發(fā)明者W·M·卡瓦諾, D·L·斯隆, M·L·麥克占 申請人:希龍公司