專利名稱：介入治療肝癌的前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于中藥新藥開發(fā)領域，具體涉及介入治療肝癌的前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver)系原發(fā)于肝實質(zhì)細胞或肝內(nèi)膽管細胞的癌腫，臨床以肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最為多見。因其起病隱匿，發(fā)展迅速，死亡率高，俗稱“癌中之王”，已成為威脅人類健康的大敵。肝癌是世界上最常見的第五大惡性腫瘤，第三大常見的癌癥致死原因，我國是肝癌的高發(fā)區(qū)之一，約50%發(fā)生在中國。歷來治療癌癥的手術(shù)、放射治療(放療)、化學藥物治療(化療)仍是目前治療肝癌的主要手段，但放療、化療因其毒副作用被稱為“既鋤草又除苗”、“敵我不分”、“治病不治人”的治療方法，雖在一定程度上和一定時間內(nèi)能抑制肝癌的發(fā)展，但遠期療效有限，加上治療后患者的生活質(zhì)量差，往往令人望而生畏；肝癌早期手術(shù)治療雖有一定療效(提高5年生存率)，但肝癌發(fā)病十分隱匿，早期診斷困難，一旦發(fā)現(xiàn)多屬中、晚期，只有約20%左右具有手術(shù)治療的機會，約80%左右的患者只能采用非手術(shù)療法，且手術(shù)治療又因其局部治療的不徹底性及術(shù)后高復發(fā)率而限制了其應用。介入治療被認為是肝癌非手術(shù)療法中的首選方法。肝癌介入治療方法可分為經(jīng)皮經(jīng)血管治療技術(shù)和經(jīng)皮非血管治療技術(shù)，前者主要包括經(jīng)肝動脈栓塞化療術(shù)及經(jīng)肝動脈門靜脈結(jié)合栓塞化療術(shù)；后者則指在超聲或CT引導下經(jīng)皮穿刺瘤內(nèi)局部治療，包括瘤內(nèi)藥物注射與物理損傷治療。單純動脈內(nèi)灌注抗癌藥效果不理想，肝動脈化療栓塞術(shù)與非血管介入方法有機的結(jié)合的治療效果亦有待提高。目前，尚無高效安全的介入治療肝癌的理想制劑，現(xiàn)在應用的肝癌介入治療劑均是可用于全身化療的抗癌藥和毒性較大的中藥注射劑，由此導致肝癌介入療法至少存在兩大關(guān)鍵問題一是遠期療效欠佳(癌細胞抑制不徹底，殘存的癌細胞惡性程度更高，較快復發(fā)和轉(zhuǎn)移；供應肝癌的血管新生迅速，肝癌進展更快)，二是介入療法的毒副反應較大(肝損傷、骨髓抑制、免疫功能受損、癌組織壞死后引起的發(fā)熱等術(shù)后綜合征)。采用脂質(zhì)體技術(shù)解決姜黃素口服吸收差、難溶于水和水溶液不穩(wěn)定制劑問題，進些年來進展較快。口服姜黃素脂質(zhì)體新藥開發(fā)研究國內(nèi)有多家單位在開展工作。陰離子脂質(zhì)體姜黃素注射劑亦有廠家開發(fā)研究。但這些脂質(zhì)體姜黃素制劑只部分解決了姜黃素的口服吸收差，生物利用度低，難溶于水 和水溶劑不穩(wěn)定的“瓶頸問題”，卻無法實現(xiàn)將姜黃素直接介入肝癌細胞內(nèi)，甚至肝癌細胞核內(nèi)，提高姜黃素抗肝癌的生物學效應和治療指數(shù)有限，其穩(wěn)定性和臨床療效尚須進一步考查。我們創(chuàng)造性的采用前陽離子/陽離子脂質(zhì)體與姜黃素結(jié)合，利用姜黃素的親脂性與陽離子Liposome所帶脂肪酸的尾結(jié)合形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-姜黃素復合物，該復合物的陽離子與肝癌細胞的負離子相互吸引，通過融合、內(nèi)吞等方式將所攜帶的姜黃素介入肝癌細胞內(nèi)，甚至肝癌細胞核內(nèi)，能顯著增加其生物學效應和提高其治療指數(shù)，作為肝癌介入治療的專門有效制劑，既能增加局部藥物分布量和直接進入肝癌細胞內(nèi)，顯著增強抗肝癌效應，提高臨床療效，又可避免脂質(zhì)體-姜黃素在體循環(huán)中出現(xiàn)的不穩(wěn)定、與血漿蛋白結(jié)合后引起肺栓塞等嚴重問題。具有重大的科學意義和臨床運用價值。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的研究一種高效安全的肝癌介入治療制劑。

2 本發(fā)明的具體技術(shù)方案為解決現(xiàn)有介入制劑治療肝癌所出現(xiàn)遠期療效欠佳和毒副反應較大的問題，本專利采用可食用、無毒性的抗癌中藥姜黃中的有效活性成分——姜黃素等作為介入治療的主要藥物，將其與脂質(zhì)體結(jié)合，通過介入給藥治療肝癌能很好的解決上述問題。姜黃素具有抑制肝癌細胞增殖和誘導其凋亡的作用，由于主要不是通過壞死肝細胞或組織的作用機制，故在抗肝癌的同時對周圍肝細胞、組織及全身機體的危害大大降低。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對多種腫瘤有抑制作用，如肝癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌、食管癌、皮膚癌、淋巴瘤及白血病等。姜黃素具有抑制癌基因表達、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、增加腫瘤細胞對化療的敏感性以及抗氧化損傷等多種抗癌機制。通過姜黃素從分子水平抑制血管生成使血管內(nèi)皮細胞休眠、衰老或凋亡，抑制癌細胞的生長，防止肝癌復發(fā)和進展，提高遠期療效具有十分重要的意義[I]。但未經(jīng)特殊工藝處理的姜黃素口服吸收較差，其水溶劑穩(wěn)定性極差，嚴重阻礙著將姜黃素開發(fā)成中藥新藥制劑。許建華等[2]探討姜黃素對人癌細胞株的體外作用特點及其水溶液的穩(wěn)定性。以MTT法觀察對人胃癌MGC803、人肝癌Be 17402、人紅白血病K562及其耐阿霉素株K562/ADM等的體外殺傷作用，并以體外活性變化為指標觀察姜黃素水溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素8. 5-136. Oiimol L—1對上述細胞的IC_5°分別為13.0，IL 7，62. 6 u mo I L—1 ;低于8. 5 y mo I L—1就能完全對抗41. 5 nmol L—1表皮生長因子(EGF)的促增殖作用。姜黃素水溶液于4°C貯存3-7天體外抗癌活性明顯下降，表明其水溶液的穩(wěn)定性較差。Ammon HP等[3]在研究姜黃素的藥代動力學時發(fā)現(xiàn)，姜黃素在體內(nèi)60%由胃腸道吸收，但口服后，機體內(nèi)不大可能有較高濃度的姜黃素存在，血藥濃度經(jīng)測定不可能高于
0.5 ii g/ml，表明未經(jīng)特殊工藝處理的姜黃素口服吸收差。正是由于姜黃素口服吸收差，生物利用度有限，限制了其口服制劑的開發(fā)；姜黃素又難溶于水，且極不穩(wěn)定的理化特性限制了其注射劑的開發(fā)，以上是姜黃素至今尚無I類新藥制劑的根本原因和“瓶頸問題”。為解決姜黃素應用中出現(xiàn)的“瓶頸問題”，運用脂質(zhì)體的高新技術(shù)是一條重要途徑。脂質(zhì)體(Liposome)是一種定向藥物載體，屬于祀向給藥系統(tǒng)(targeting drugdelivery system)的一種新劑型,具有祀向性、穩(wěn)定性、長效性、降低藥物毒性等優(yōu)點。姜黃素前陽離子/陽離子脂質(zhì)體制備陽離子脂質(zhì)體姜黃素制備方法包括以下步驟精密稱取蛋黃卵磷脂3. 0g、膽固醇
1.0g、十八胺0. 2g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚,振搖,再加入含姜黃素Img的無水乙醇溶液5mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C蒸干成膜，然后加入pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL，旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜，即得陽
離子脂質(zhì)體姜黃素。前陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑的制備方法包括以下步驟精密稱取蛋黃卵磷脂3.0g、膽固醇l.Og、[2-[[4_[(羧甲基)二硫]-1-亞氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸膽固醇酯(CHETA)O. 05g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚，振搖，再加入含姜黃素Img的無水乙醇溶液5mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C蒸干成膜，然后加入pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL，旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜，即得前陽離子脂質(zhì)體姜黃素。通過上述方法制備的陽離子脂質(zhì)體姜黃素，我們進行了抗人肝癌細胞H印G2研究和穩(wěn)定性研究。研究結(jié)果表明，10 u g/ml>5 u g/ml及0. 25 ii g/ml陽離子脂質(zhì)體姜黃素三個有效劑量作用24小時后，其對HepG2細胞增殖均有顯著抑制作用，P < 0. 01，抑制作用隨藥物濃度增高而有加強趨勢，最高抑制率可達40. 897%，且呈量效關(guān)系，三個劑量組間有顯著性差異，P < 0.01。相同濃度的陽離子脂質(zhì)體姜黃素的抑制率顯著高于姜黃素的抑制率，P<0. 05。陽離子脂質(zhì)體姜黃素各劑量組均能有效誘導H印G2細胞凋亡，呈顯著的量效關(guān)系，P < 0. 05。IOii g/ml陽離子脂質(zhì)體姜黃素作用32小時后，其誘導Bel-7402細胞凋亡率達70. 23%，與10iimol/L阿霉素組(76. 43% )比較，無顯著性差異，P > 0. 05。同濃度的陽離子脂質(zhì)體姜黃素與姜黃素比較，有顯著性差異，P < 0. 05。提示陽離子脂質(zhì)體能介導姜黃素進入人肝癌H印G2細胞內(nèi)，顯著提高姜黃素的治療指數(shù)，能在一定程度上增強姜黃素抑制人肝癌細胞的增殖和誘導其凋亡的作用。研究結(jié)果表明，陽離子脂質(zhì)體姜黃素水溶制劑具有很強的穩(wěn)定性，除外觀始終保持均勻透明(沒有結(jié)晶析出)和原有的淡黃色外，更重要的是，在觀察的I年時間以內(nèi)，該制劑抑制人肝癌細胞增殖和誘導其凋亡的生物學效應基本保持不變。IOil g/ml陽離子脂質(zhì)體姜黃素放置1、2、4、8、12個月后對H印G2細胞的抑制率分別為50. 27%,48. 43%,44.68%、51.01%、46. 71%，各時間點的抑制率無顯著性差異。而姜黃素的水溶制劑放置
1、2、4、8、12個月后對人肝癌細胞0fepG2)增殖的抑制作用已顯著減弱，IOii g/ml姜黃素的抑制率分別為10. 46%,8. 13%,6. 87%,2. 56%,3. 12%，各時間點的抑制率與陽離子脂質(zhì)體姜黃素比較，有顯著性差異，P < 0. 01。2. 5 u g/ml>5 u g/ml和10 u g/ml陽離子脂質(zhì)體姜黃素(IOi1 g/ml)放置12個月后對H印G2仍具有誘導其凋亡的作用，其凋亡率分別為33. 21%,41. 23%,68. 12%，與放置 3 小時(29. 26%,46. 54%,70. 99% )比較，無顯著性差異，P > 0. 05。而2. 5 ii g/ml>5 u g/ml和10 u g/ml姜黃素的水溶制劑放置12個月后對HepG2的誘導凋亡的作用已顯著減弱，其凋亡率分別為4. 21 %、6. 43%、9. 98%，與放置3小時(18. 65%,33. 67%,56. 73% )比較，有顯著性差異，P < 0. 01。以上研究表明，陽離子脂質(zhì)體姜黃素能極大地減少姜黃素的用量、顯著增加其生物學效應、提高其治療指數(shù)，且陽離子脂質(zhì)體姜黃素水溶液制劑具有很強的穩(wěn)定性。3 本發(fā)明的有益效果 姜黃素前陽離子/陽離子脂質(zhì)體水溶制劑不僅比單純姜黃素水溶制劑具有更強的抑制人肝癌細胞增殖和誘導其凋亡的作用，而且穩(wěn)定性很好，從而很好的解決姜黃素難溶于水和穩(wěn)定性差的問題，這一研究成果使姜黃素的I類新藥開發(fā)和肝癌介入治療制劑的開發(fā)成為現(xiàn)實。姜黃素前陽離子/陽離子脂質(zhì)體介入治療肝癌采用了非毒性抗肝癌中藥成分介入治療肝癌(毒副反應低)的新策略，通過脂質(zhì)體將姜黃素介入肝癌細胞核(抗癌較徹底，遠期療效較好)和抗肝癌血管新生的作用，采用脂質(zhì)體新技術(shù)解決了姜黃素不溶于水和水溶劑不穩(wěn)定的“瓶頸問題”，這些均充分體現(xiàn)了本藥物制劑的創(chuàng)新性、優(yōu)效性、安全性。通過姜黃素前陽離子/陽離子脂質(zhì)體介入治療肝癌，可解決目前肝癌介入療法遠期療效差和毒副反應大的重大臨床問題，能顯著提高肝癌介入療法的臨床療效，滿足臨床肝癌介入治療的需要。
具體實施例方式實施例1制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素中的藥物由下列組分制成姜黃素0.0001 5%，脂質(zhì)體載體95 100%組成。實施例2制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素中的藥物由下列組分制成姜黃素0. 001
3%，脂質(zhì)體載體97 99 %組成。

實施例3制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素中的藥物由下列組分制成姜黃素0.01 I %，脂質(zhì)體載體98 99 %組成。實施例4制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素中的藥物優(yōu)化配比由下列組分制成姜黃素
0.004 %，脂質(zhì)體載體99. 996 %組成。具體制備方法如下陽離子脂質(zhì)體制備方法包括以下步驟精密稱取蛋黃卵磷脂3. 0g、膽固醇1. 0g、十八胺0. 2g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚,振搖，再加入含姜黃素Img的無水乙醇溶液5mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 °C蒸干成膜，然后加入pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL,旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜，即得陽離子脂質(zhì)體姜黃素。該制劑是通過介入給藥方式治療肝癌的藥物，它對各類各期肝癌的治療效果較高，副作用低。前陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑的制備方法包括以下步驟精密稱取蛋黃卵磷脂3.0g、膽固醇l.Og、[2-[[4_[(羧甲基)二硫]-1-亞氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸膽固醇酯(CHETA)O. 05g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚，振搖，再加入含姜黃素Img的無水乙醇溶液5mL，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C蒸干成膜，然后加入pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL，旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜，即得前陽離子脂質(zhì)體姜黃素。
權(quán)利要求
1.介入治療肝癌的前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑，其特征在于，制劑中的藥物由下列組分制成制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素中的藥物由下列組分制成姜黃素0.001 5%，前陽離子/陽離子脂質(zhì)體載體95 100%組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子脂質(zhì)體姜黃素藥物制劑，其特征在于，制劑中的藥物優(yōu)化配比由下列組分制成姜黃素0. 004%，陽離子脂質(zhì)體載體99. 996%組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素前陽離子脂質(zhì)體藥物制劑，其特征在于，制劑中的藥物優(yōu)化配比由下列組分制成姜黃素0. 004%，前陽離子脂質(zhì)體載體99. 996%組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的陽離子脂質(zhì)體姜黃素藥物制劑，取姜黃素lmg，蛋黃卵磷脂3. 0g，膽固醇1. 0g，十八胺0. 2g，維生素E0. 3g，pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL等為制備原料，其特征在于，制備步驟如下 1)蛋黃卵磷脂3.0g、膽固醇1. 0g、十八胺0. 2g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚，振搖。
2)姜黃素Img溶于無水乙醇溶液5mL中。
3)將2)加入I)中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C蒸干成膜，然后加入pH值為6.6的磷酸緩沖鹽溶液20mL，旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜，即得陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的前陽離子脂質(zhì)體姜黃素藥物制劑，取姜黃素lmg，蛋黃卵磷脂3. 0g，膽固醇l.Og，[2-[[4_[(羧甲基)二硫]-1-亞氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸膽固醇酯(CHETA)O. 05g，維生素E0. 3g，pH值為6. 6的磷酸緩沖鹽溶液20mL等為制備原料，其特征在于，制備步驟如下 1)蛋黃卵磷脂3.0g、膽固醇1.0g、[2-[[4-[(羧甲基)二硫]-1-亞氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸膽固醇酯(CHETA)0.05g、維生素E0. 3g于梨形瓶中，加入IOmL乙醚，振搖。
2)姜黃素Img溶于無水乙醇溶液5mL中。
3)將2)加入I)中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35°C蒸干成膜，然后加入pH值為6.6的磷酸緩沖鹽溶液20mL，旋轉(zhuǎn)20min使膜溶解，放置3h使其充分水合，超聲3min，過0. 22 y m濾膜。即得前陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及介入治療肝癌的前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑及其制備方法。它由姜黃素和藥學上可以制備前陽離子/陽離子脂質(zhì)體載體的多種成分組成。它所含的成分主要由下述重量配比的原料制成姜黃素0.001～5％，前陽離子/陽離子脂質(zhì)體姜黃素載體95～99.999％組成。陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑由蛋黃卵磷脂、膽固醇、十八胺、維生素E、乙醚、無水乙醇及姜黃素等按薄膜分散法制成。前陽離子脂質(zhì)體姜黃素制劑由蛋黃卵磷脂、膽固醇、[2-[[4-[(羧甲基)二硫]-1-亞氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸膽固醇酯(CHETA)、維生素E、乙醚、無水乙醇及姜黃素等按薄膜分散法制成。上述制劑介入治療肝癌高效、安全。
文檔編號A61P35/00GK103054802SQ20111032475
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者李瀚旻, 常明向 申請人:李瀚旻, 常明向