專利名稱：基于地塞米松與紫杉醇的雙組分藥物小分子水凝膠及其制備方法
基于地塞米松與紫杉醇的雙組分藥物小分子水凝膠及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明的技術(shù)方案涉及一類同時含有地塞米松和紫杉醇的小分子水凝膠前體分子和制備方法以及用二硫鍵還原這種手段促使前體分子形成類似果凍的水凝膠，具體說是同時含有兩種藥物分子的水凝膠前體分子和其制備方法及其形成水凝膠的方法背景技術(shù)
紫杉醇是20世紀90年代應(yīng)用于臨床的新一代廣譜抗癌藥。由于其水溶性差，目前臨床上使用的紫杉醇制劑多以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和無水乙醇(1 1)混合液作為助溶劑。給藥前用生理鹽水或者5%葡萄糖稀釋到終濃度為0. 4-1. ^imolL—1，這些助溶劑可導致多種不良反應(yīng)，比較明確的包括過敏反應(yīng)和神經(jīng)毒性。另外，聚氧乙烯蓖麻油在血循環(huán)中形成的小微粒能將紫杉醇分子包裹，阻礙了藥物的作用。為了解決紫杉醇水溶性差和現(xiàn)在臨床制劑的毒副作用，許多科學家一直在探索具有毒副作用小，靶向性強且具有緩釋作用的藥物載體。最近美國FDA批準白蛋白結(jié)合紫杉醇納米粒注射混懸液上市用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌聯(lián)合化療失敗后或輔助化療6個月內(nèi)復發(fā)的乳腺癌的治療。雖然國內(nèi)很多科學家都在紫杉醇方面進行了有益的探索，但是現(xiàn)在很多專利都歸國外所有；目前為止，國內(nèi)還沒有自己開發(fā)的關(guān)于紫杉醇等抗癌藥方面的藥物，這些技術(shù)大多為國外所有。因此研究出一種抗癌藥(如紫杉醇)的藥物傳輸系統(tǒng)迫在眉睫。小分子水凝膠是近年來發(fā)展起來的一類新的生物材料，它是由小分子水凝膠成膠因子(hydrogelator)通過非共價鍵力、在一定的外界刺激下自組裝形成的一類果凍狀的物質(zhì)。由于小分子水凝膠成膠因子生物相容性好、易于降解、對外界環(huán)境改變(PH值、溫度等的改變)非常敏感等，小分子水凝膠已經(jīng)在藥物釋放、細胞培養(yǎng)、化學傳感、無機材料合成模板等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。而且基于短肽的小分子水凝膠由于其生物相容性很好，易于合成等優(yōu)點在近幾年的發(fā)展中吸引了很多科學家在這一領(lǐng)域從事研究。因此我們相信把疏水性的抗癌藥物引進小分子水凝膠體系不僅能提高抗癌藥物的溶解性，同時形成的納米自組裝體系通過Era效應(yīng)，還可以被動靶向/主動靶向到腫瘤組織，增加藥物的局部濃度，減少進入正常組織的機會，從而減少副作用(Angew. Chem. Int. Ed. 2003，42，3072-3075 ;J. AM. CHEM. S0C. 2009，131，13576-13577)。 紫杉醇是一種廣譜抗癌藥物，臨床應(yīng)用時為了防止過敏反應(yīng)，經(jīng)常與地塞米松聯(lián)合使用。因此我們認為把紫杉醇與地塞米松同時引入到一個小分子水凝膠體系中，不僅能降低紫杉醇的毒副作用，而且通過它們的協(xié)同作用，可以更好的發(fā)揮藥效。發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的最終目的是發(fā)明一類基于地塞米松與紫杉醇的雙組分藥物小分子水凝膠這一新型藥物傳輸體系及其制備方法。
通過下面的方法可以達到這一目的在該方法中，首先通過化學合成的方法合成丁二酸酐修飾的紫杉醇(見專利，附圖1)、丁二酸酐衍生化地塞米松(附圖2)以3及含二硫鍵的化合物5，然后用固相合成以及溶液相合成的方法合成成膠前體分子 Dex-FFFK (taxol-SA)EssEE，Dex-K (taxol-SA) EssEE，隨后用 DTT 或者 GSH 還原成膠的方法促使成膠前體分子形成小分子水凝膠。在成功得到成膠前體分子的基礎(chǔ)上我們又測試了成膠前體以及小分子水凝膠體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示修飾后的紫杉醇與紫杉醇在藥效上幾乎相當。
本發(fā)明的有益效果是首先本發(fā)明合成簡單，合成步驟和提純方法簡單；用到的原料為20種基本的氨基酸，生物相容性很好；所用的成膠方法為谷胱甘肽或二硫蘇糖醇還原，生物相容性也很好；紫杉醇在該分子中的含量約為32.6%，所形成三維網(wǎng)狀的納米結(jié)構(gòu)不僅能有效的把紫杉醇被動靶向到腫瘤組織，而且本體系為兩種藥物共同形成的水凝膠，能提高化療效果并且降低毒副作用；本體系中所用的藥物與多肽的連接方式均為酯鍵連接，這樣在體內(nèi)能緩慢水解，釋放出紫杉醇和地塞米松藥物，從而達到更好的治療效果。 我們同時研究了兩種藥物在體外的釋放速率，研究表明在M小時內(nèi)，紫杉醇每小時大約釋放0. 15%。這一結(jié)果說明我們的水凝膠能作為紫杉醇的緩釋體系。本發(fā)明的目的在于發(fā)展一類雙藥物的緩釋體系，在腫瘤手術(shù)切除后所形成的空腔中放置小分子水凝膠，防止腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，挽救患者生命。


附圖1 丁二酸酐衍生化的紫杉醇結(jié)構(gòu)式及合成步驟(化合物3)
附圖2 丁二酸酐衍生化的地塞米松(化合物4)結(jié)構(gòu)及合成步驟
附圖3 成膠前體分子1與2的結(jié)構(gòu)式以及合成步驟
附圖4 二硫鍵化合物Fmoc-CS (化合物5)的合成步驟
附圖5 成膠前體分子在還原劑(DTT或者GSH)條件下形成水凝膠的宏觀圖片(A 為成膠前體1形成的水凝膠，B為成膠前體2形成的水凝膠)
附圖6:基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝膠系列化合物體外活性它們的 IC50 分別為紫杉醇 47. 3nM, taxol-SA 188. 8nM,成膠前體 1 (Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE) 75. 8nM,膠體 1 是 96. 4nM,成膠前體 2 (Dex-K(taxol-SA)ESSEE) 96. 3nM,膠體 2 是 87. 38nM.具體實施方式
實施例1
(1) Taxol-SA及Taxol-SA-NHS的合成(化合物3與化合物3a)的合成，合成步驟見說明書附圖1
0. 50g(0. 59mmol)紫杉醇溶于 12mL吡啶中，隨后加入 0. 90g(0. 76mmol) 丁二酸酐， 室溫攪拌3小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液，然后加入20mL雙蒸水，室溫攪拌20分鐘，然后過濾，沉淀溶于丙酮，之后加入水進行結(jié)晶，放置4度過夜，收集晶體，即得產(chǎn)物(產(chǎn)率90% )。 (2) Dex-SA (化合物4)的合成
同上面的反應(yīng)，稱取Ig的地塞米松溶于20mL吡啶中，同時加入3當量的丁二酸酐，0. 1當量的4-二甲氨基吡啶隨后加入，室溫攪拌M小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液，加入 40mL水室溫攪拌20分鐘，除去溶液，沉淀過濾，凍干即得產(chǎn)物(產(chǎn)率87%)。咕NMR(300MHz, DMS0-d6) δ 7. 27 (d, J = 10. 11，1H) ,6. 19-6. 24(q, 1H) ,5. 99 (m, 1H) , 5. 42 (d, 1H)，5. 17 (s，1H)，4. 99-5. 06 (m, 1H)，4. 75-4. 82 (m, 1H)，4. 10-4. 15 (m, 1H)，2. 82-2. 91 (m, 1H)， 2. 58-2. 61 (m, 3H)，2. 26-2. 40 (m, 3H)，2. 09-2. 18 (m, 2H)，1. 53-1. 79 (m, 6H)，1. 05-1. 096 (m, 1H) · MS :calc. M+ = 492. 22，obsvd. (M+l) + = 492. 05.
(3) 二硫鍵化合物Fmoc-CS (化合物5)的合成
參照文獻(Chem. Commun.，2011，47，1619-1621)的合成方法，具體的來說如下2.25g(IOmmol)胱胺二鹽酸鹽和2. 25g(30mmol)的碳酸氫鈉溶于90mL的水，同時加入 35mL的1，4_ 二氧六環(huán)，冰浴10分鐘后，加入1. Og的丁二酸酐。室溫攪拌24小時候，3.373g(IOmmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺與0. 84g碳酸氫鈉同時加入到反應(yīng)液中，室溫攪拌4小時后，過濾，濾液加入0. IM鹽酸，調(diào)節(jié)溶液pH在3左右，4度冰箱放置12小時，收集沉淀，即得產(chǎn)物(產(chǎn)率 48. 0% ) ο 1H NMR(300MHz, DMS0_d6) δ 7. 85-7. 88 (d, J = 7. 38Hz, 2H) ；7. 65-7. 68 (d, J = 7. 22Hz，2H) ；7. 39-7. 42 (t，Jl = 7. 383Hz, J2 = 6. 84Hz，2H)； 7. 34-7. 28(m，2H) ；4. 29-4. 32 (d, J = 6. 762Hz，2H) ；4. 19-4. 23 (m, 1H) ；2. 78-3. 34(m，4H)； 2. 73-2. 78(m，4H) ；2. 40—2. 44 (m，2H) ；2. 28—2. 33 (m，2H). MS :calc. M+ = 474. 1, obsvd. (M+H) +475. 5.
實施例2 :化合物 Dex-FFFKESSEE 與 Dex-KESSEE 的合成
用標準的Fmoc固相合成方法合成，所使用的氨基酸均為氨基端被Fmoc保護的氨基酸，其中最后所加的化合物4可以看成一個氨基酸，連上肽鏈的方式同氨基酸。具體合成步驟如下(以Dex-FFFKESSEE為例)
①稱量Immol樹脂，加入固相合成器中，加入適量DCM浸沒樹脂，在氮氣的鼓吹作用下膨脹5min ；除去溶劑，加入Immol第一個氨基酸(本實驗中為Fmoc保護的谷氨酸，同時側(cè)鏈也被OtBu保護)的DCM溶液，加入2mmol DIEA，反應(yīng)濁；
②洗滌用DCM洗滌，洗5次，每次Imin ；
③封閉用體積比DCM 甲醇DIEA為17 2 1的溶液反應(yīng)lOmin，將樹脂上未反應(yīng)的活性基團封閉；
④洗滌用DCM洗滌，洗5次，每次Imin ；洗滌用DMF洗滌，洗5次，每次Imin ；脫 Fmoc保護基團加入20%哌啶溶液，反應(yīng)30min ；
⑤洗滌用DMF洗滌，洗5次，每次Imin ；加入2mmol第二個氨基酸(本實驗中為 Fmoc保護的谷氨酸，同時側(cè)鏈也被OtBu保護)的DMF溶液，加入4mmol DIEA, 2mmol縮合劑 HBTU，反應(yīng) 2h ；
重復操作步驟④，⑤，將氨基酸依次連接在樹脂上；
⑥切割加入如下比例體積的溶液10mL，三氟乙酸三甲基溴硅烷水= 95 2.5 2. 5 (體積比)，反應(yīng)1小時，收集液體，再用此溶液洗兩遍，每遍1分鐘。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶液，用高效液相分離提純，即得化合物Dex-FFFKESSEE。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 8. 02-8. 17 (m, 9H)，7. 15-7. 31 (m, 15H)，6. 21-6. 25 (m, 1H) ,6. 01 (s, 1H), 5. 40-5. 42 (m, 1H)，5. 16 (s, 1H)，4. 98-5. 03 (m, 1H)，4. 72-4. 77 (m, 1H)，4. 56-4. 59 (m, 1H)，4.45-4. 49 (m, 3H)，4. 24-4. 29 (m, 4H)，4. 13-4. 15 (m, 2H)，2. 95-3. 06 (m, 3H)，2. 84-2. 88 (m, 3H)，2. 72-2. 76 (m, 6H)，2. 62-2. 68 (m, 3H)，2. 41-2. 44 (m, 2H)，2. 22-2. 34 (m, 12H)， 2. 12-2. 19 (m, 3H)，1. 88-1. 93 (m, 3H)，1. 73-1. 81 (m, 3H)，1. 61-1. 68 (m, 3H)，1. 48-1. 56 (m, 7H)，1. 30-1. 34 (m, 3H)，1. 03-1. 09 (m, 1H)，0. 87 (s, 3H)，0. 78 (d, J = 7. 18，3H) · MS :calc. M+5=1682. 69，obsvd. (M+l)+ = 1684. 55.
用同樣的方法可以得到化合物Dex-KESSEE。
實施例3 成膠前體分子 Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE 與 Dex-K (taxol-SA) ESSEE 的合成(以 Dex-FFFK (taxol-SA) ES SEE 為例)
把60mg(0. 06mmol)3a溶解在3mL 二甲基甲酰胺溶劑中，同時加入50μ 1 DIEA， 隨后加入121mg(0. 07mmol)Dex-FFFKE-ss-EE室溫反應(yīng)過夜，用高效液相提純化合物，得到 Dex-FFFK(taxol-SA)ESSEE，產(chǎn)率為 87. 0%。1H NMR(400MHz, DMS0_d6) δ 8. 12-8. 19 (m, 4H)，8. 02-8. 09 (m, 4H)，7. 97-7. 99 (m, 3H)，7. 86 (d, J = 7. 13，1H)，7. 72-7. 76 (m, 1H)， 7. 64-7. 67 (m, 2H)，7. 54-7. 58 (m, 1H)，7. 48-7. 50 (m, 2H)，7. 44-7. 47 (m, 4H)，7. 28-7. 31 (m, 1H) ,7. 24-7. 26(m，4H)，7. 16-7. 20 (m, 12H) ,6. 30 (s，1H)，6· 21-6. 24 (m, 1H)，6· 01 (s, 1H)， 5. 80-5. 85 (m, 1H)，5. 51-5. 55 (m, 1H)，5. 40-5. 42 (m, 2H)，5. 33-5. 35 (m, 1H)，5. 17 (s, 1H)， 4. 99-5. 04 (m, 1H)，4. 90-4. 95 (m, 2H)，4. 73-4. 78 (m, 1H)，4. 64 (s, 1H)，4. 59-4. 61 (m, 1H)， 4. 44-4. 50 (m, 2H)，4. 23-4. 28 (m, 3H)，4. 09-4. 17 (m, 4H)，3. 98-4. 03 (m, 2H)，3. 55-3. 58 (m, 2H)，3. 17 (s，1H)，2. 82-3. 07 (m, 8H)，2. 72-2. 78 (m, 6H)，2. 59-2. 66 (m, 5H)，2. 41-2. 44 (m, 3H)，2. 29-2. 39 (m, 13H)，2. 23-2. 25 (m, 7H)，2. 10 (s, 3H)，1. 88-1. 99 (m, 4H)，1. 72-1. 83 (m, 7H) , 1. 57-1. 74(m，5H) , 1. 49-1. 50 (m, 8H) , 1. 32-1. 36 (m, 3H) , 1. 24-1. 28 (m, 2H)， 0. 99-1. 10 (m, 8H)，0. 88 (s, 3H)，0. 78 (d, J = 7. 10，3H) · HR-MS :calc. M+ = 2619. 03，obsvd. (M+l)+ = 2620. 04.
用同樣的方法得到化合物Dex-K (taxol-SA) ESSEE
實施例4:小分子水凝膠的形成與通過透射電鏡觀察其三維形貌(以化合物 Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE 為例)
(1)小分子水凝膠的形成稱取10. Omg Dex-FFFK (taxol-SA) ESSEE,加入2當量的碳酸鈉，隨后補加適當?shù)腜BS (pH = 7. 4)緩沖液，使化合物的最終濃度為2.0% (7. 34umol) (pH = 7. 4)，取此溶液IOOuL,加入已經(jīng)配好的谷胱甘肽的PBS溶液49umol, pH = 7. 4) lOOuL，室溫靜置，大約7分鐘左右，用倒置觀察法即可見到如果凍一樣的膠體；
(2)透射電鏡樣品的制作與觀察用銅網(wǎng)垂直深入到膠體中，然后取出，用醋酸雙氧鈾染色，放置于干燥器中過夜，然后用透射電鏡觀察。
實施例5 基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝膠系列化合物體外活性測試
取生長狀態(tài)良好的宮頸癌細胞H印G2作為體外活性測試的細胞，加藥物前細胞先種植在96孔板，密度為3000CellS/孔，24小時后加入稀釋好的藥物(共五個梯度)，每個濃度做五個孔，48小時后用MTT發(fā)測定。實驗重復三遍。
權(quán)利要求
1.基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝膠其特征在于該水凝膠前體分子有如下結(jié)構(gòu)，通過小分子短肽FFFKESSEE或者KESSEE把紫杉醇衍生物(在紫杉醇2'位引入1，4_ 丁二酸)和地塞米松衍生物(21位羥基處引入丁二酸酐)連接起來；同時在成膠前體分子中引入二硫鍵化合物，從而使成膠前體分子在谷胱甘肽，二硫蘇糖醇等還原劑作用下形成小分子水凝膠。該藥物傳輸體系不僅解決了紫杉醇溶解度差的問題而且兩種協(xié)同藥物的聯(lián)合使用可以減少毒副作用，以及達到緩釋的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述本發(fā)明所形成的地塞米松-紫杉醇小分子水凝膠，其特征在于使用小分子短肽FFFKESSEE或者itKfiSSEEw (或者類似結(jié)構(gòu)的短脫)連接紫杉醇衍生物和地塞米松衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述本發(fā)明所涉及的地塞米松衍生物是在地塞米松的21位羥基引入的丁二酸酐。其反應(yīng)條件為吡啶作為溶劑，1 5倍的丁二酸酐，催化量的DMAP作為催化劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述本發(fā)明引入了二硫鍵化合物，其結(jié)構(gòu)如下
5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述基于地塞米松-紫杉醇的小分子水凝膠，其成膠方法是用谷胱甘肽或者二硫酸糖醇等還原劑條件下成膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類雙組分藥物的小分子水凝膠前體的合成及成膠方法。即通過短肽把抗炎藥地塞米松和紫杉醇連接起來形成小分子水凝膠前體分子，前體分子的PBS溶液(pH＝7.4)在谷胱甘肽或者二硫蘇糖醇等作用下切斷二硫鍵，從而形成含有兩種藥物組分的水凝膠。這種藥物傳輸體系不僅有效解決了紫杉醇水溶性差的缺點，而且地塞米松作為紫杉醇的協(xié)同藥物可以有效降低紫杉醇的毒副作用。
文檔編號A61K47/48GK102532263SQ20111025031
公開日2012年7月4日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者孔德領(lǐng), 楊志謀, 毛麗娜, 王懷民, 王玲 申請人:南開大學